Phân tích đa dạng di truyền của ba loài cây bố mẹ (Eucalyptus urophylla, E. camaldulensis, E. exserta) làm cơ sở để xây dựng các tổ hợp bạch đàn lai khác loài (Luận văn thạc sĩ)

i

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ THU HÀ

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA LOÀI CÂY BỐ MẸ
(EUCALYPTUS UROPHYLLA, E. CAMALDULENSIS, E. EXSERTA)
LÀM CƠ SỞ ĐỂ XÂY DỰNG CÁC TỔ HỢP BẠCH ĐÀN LAI KHÁC LOÀI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2017


ii

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ THU HÀ

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA LOÀI CÂY BỐ MẸ
(EUCALYPTUS UROPHYLLA, E. CAMALDULENSIS, E. EXSERTA) LÀM
CƠ SỞ ĐỂ XÂY DỰNG CÁC TỔ HỢP BẠCH ĐÀN LAI KHÁC LOÀI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

\

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. Nguyễn Việt Cƣờng

Hà Nội - 2017


i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Việt Cƣờng - Bộ
môn Lai giống – Viện NS Giống và CNSH lâm nghiệp, ngƣời đã tận tình giúp
đỡ, chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo của Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật; Ban lãnh đạo Viện NC Giống và CNSH lâm nghiệp cùng các
đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi gửi lời cảm ơn đến bạn bè và ngƣời thân trong gia đình đã động
viên, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua.
Cuối cùng tôi xin kính chúc quý thầy, cô, anh, chị và gia đình dồi dào
sức khỏe, thành công trong sự nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 16 tháng 10 năm 2017
Học viên

Trần Thị Thu Hà


ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... vii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ......................... 3
1.1. Một số nghiên cứu trong chọn giống cây bạch đàn ................................... 3
1.1.1. Trên thế giới .......................................................................................... 3
1.1.2. Tại Việt Nam ........................................................................................... 6
1.2. Các loại chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật ADN ........................................ 8
1.3. Ƣu điểm của chọn giống bằng chỉ thị phân tử ......................................... 13
1.4. Một số nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong phân tích đa dạng di
truyền và chọn giống cây lâm nghiệp ............................................................. 15
1.4.1. Trên thế giới .......................................................................................... 15
1.4.2. Tại Việt Nam ......................................................................................... 20
CHƢƠNG 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 25
2.1. Mục tiêu.................................................................................................... 25
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 25
2.3. Đối tƣợng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu ............................................. 25
2.3.1. Đối tượng .............................................................................................. 25
2.3.2. Các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 27
2.3.3. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 27
2.3.4. Hóa chất ................................................................................................ 27
2.3.5. Thiết bị................................................................................................... 28

iii

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 28
2.4.1. Các phương pháp sử dụng trong phòng thí nghiệm ............................. 28
2.4.2. Các phương pháp ngoài hiện trường .................................................... 35
2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 37
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 40
3.1. Phân tích đa dạng di truyền của các cây bố mẹ đã chọn .......................... 40
3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ............................................................ 40
3.1.2. Kết quả phản ứng PCR từ ADN tổng số của các mẫu bạch đàn với các
mồi SSR ........................................................................................................... 40
3.1.3. Kết quả phân tích quan hệ di truyền giữa các cây bố mẹ chọn lai
giống................................................................................................................41
3.2. Xây dựng các tổ hợp lai ........................................................................... 45
3.2.1. Xác định thời điểm nở hoa, kết quả của các cây bố mẹ tham gia lai giống 45
3.2.2. Lai giống ............................................................................................... 46
3.2.3. Khảo nghiệm các tổ hợp bạch đàn lai tại Trường Sơn – Lương Sơn Hòa Bình ......................................................................................................... 48
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 55
4.1. Kết luận .................................................................................................... 55
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 56
Tiếng Việt:....................................................................................................... 56
Tiếng Anh:....................................................................................................... 58
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 62


iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN

Acid Deoxyribonucleic

AFLP

Amplified fragment length polymorphism

APS

Amonium Persulfate

ARN

Axit Ribonucleic

bp

Base pair

cM

Centi Morgan

CTAB

Cetyltrimethyl Amonium Bromide

CTPT

Chỉ thị phân tử

cs

Cộng sự

CU

Dòng bạch đàn lai E. camaldulensis x E. urophylla

dNTPs

Deoxynucleotide triphosphate

EDTA

Ethylenediaminetetra Acetic Acid

ISSR

Inter-Simple sequence repeat

kb

Kilo base

MAS

Marker Assisted Selection

Nu

Nucleotide

PCR

Polymerase chain reaction.

PU

Dòng bạch đàn lai giữa E. pellita và E. urophylla

QTL

Quantitative trait locus

RAPD

Random Amplified Polymosphic DNA

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

RNase

Ribonuclease

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate


v

SNP

Single nucleotide polymorphism

SSR

Simple sequence repeats

STS

Sequence Tagged Sites

TBE

Tris-Boric Acid-EDTA

TE

Tris-EDTA

UC

Dòng bạch đàn lai giữa E. urophylla và E. camaldulensis

UE

Dòng bạch đàn lai E. urophylla và E. exserta

UP

Dòng bạch đàn lai giữa E. urophylla và E. pellita


vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
TT

Tên bảng

Trang

Bảng 2.1. Danh mục các cây bạch đàn bố mẹ đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
..............................................................................................................................26
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR.............................................................. 31
Bảng 3.1. Khoảng cách di truyền giữa 19 cây bạch đàn ................................. 41
Bảng 3.2. Vật hậu học của các loài cây tham gia lai giống ............................ 45
Bảng 3.3. Danh mục 61 tổ hợp lai giữa 3 loài bạch đàn ................................. 46
Bảng 3.4. Sinh trƣởng các tổ hợp bạch đàn lai Hòa Bình.. ............................. 48
Bảng 3.5. Sinh trƣởng của các tổ hợp bạch đàn lai thuận nghịch ................... 51
Bảng 3.6. Đánh giá hình thái các tổ hợp bạch đàn lai Hòa Bình .................... 51


vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
TT

Tên hình

Trang

Hình 2.1. Cây bố mẹ U4 (D1.3=17,9 cm) (U4 - sinh trƣởng chậm) .......................27
Hình 2.2. Cây bố mẹ U3 (D1.3=39,8cm) (U3 – sinh trƣởng nhanh)……………….27
Hình 2.3. Mẫu lá bảo quản ........................................................................................29
Hình 2.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR ...................................................................32
Hình 2.5. Lắp đặt dàn giáo lai giống .........................................................................36
Hình 2.6. Chọn hoa và khử đực …………………………………………………...36
Hình 2.7. Chụp bao cách ly …………………………………………………………36
Hình 3.1. Kết quả điện di tinh sạch ADN tổng số 19 cây bạch đàn .........................40
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR-SSR của mồi EMBRA229 và EMBRA165
với 19 mẫu bạch đàn trên gel polyacrylamide 4,5% .................................................41
Hình 3.3. Cây phân loại di truyền của 19 cây bạch đàn ............................................42
Hình 3.4. Quan hệ di truyền giữa 19 cây bạch đàn ...................................................42
Hình 3.5. Tổ hợp bạch đàn lai C4U4 ở Hòa Bình .....................................................53


1

MỞ ĐẦU
Bạch đàn là cây lâm nghiệp sinh trƣởng nhanh, có khả năng thích nghi
với nhiều vùng sinh thái nên đƣợc xem là một trong những loài cây dẫn đầu
về trồng rừng sản suất trên thế giới với tổng diện tích đạt 20,07 triệu ha vào
năm 2014. Gỗ bạch đàn đƣợc sử dụng cho ngành xây dựng, đóng đồ nội thất,
nguyên liệu chế biến ván ép, ván dăm và ngành công nghiệp giấy cũng nhƣ

sản phẩm sinh khối cho ngành năng lƣợng.
Nghiên cứu chọn giống bạch đàn là một khâu quan trọng trong chƣơng
trình cải thiện giống cây rừng, với mục tiêu chính là tăng nâng cao chất lƣợng
sản phẩm gỗ, cải thiện các đặc tính sinh học nhƣ: tính chống chịu điều kiện
ngoại cảnh bất lợi, chống chịu sâu, bệnh…
Hiện nay, ứng dụng chỉ thị phân tử trong phân tích đa dạng di truyền làm
cơ sở cho quá trình chọn giống là hƣớng nghiên cứu có triển vọng. Có nhiều
loại chỉ thị phân tử nhƣ: AFLP, RFLP, RAPD, SSR, STS, SNP,…mỗi kỹ
thuật có ƣu nhƣợc - điểm riêng, trong đó đƣợc sử dụng phổ biến là chỉ thị
RAPD và SSR.
Chỉ thị RAPD phù hợp cho nghiên cứu những loài mới chƣa biết rõ
thông tin về trình tự ADN và chƣa có nghiên cứu nào phát triển bộ chỉ thị cho
loài này. Do chỉ thị RAPD là mồi đơn với trình tự là một chuỗi nucleotide
ngắn (5-12 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên ở nhiều vị trí nên khi sử dụng chỉ
thị RAPD trong nghiên cứu, kết quả của mỗi lần thí nghiệm có thể khác nhau,
vì vậy cần phải có sự lặp lại các thí nghiệm. Trong khi đó, chỉ thị SSR là các
cặp mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế dựa trên hai đầu của các đoạn lặp lại có trình
tự rất đặc hiệu và thống nhất chung cho cùng một đoạn ADN không phân biệt
các cá thể trong cùng một loài, nhƣng giữa các cá thể trong cùng một loài thì
số lần lặp lại là khác nhau. Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị SSR cho kết quả chính
xác hơn so với chỉ thị RAPD và thƣờng đƣợc sử dụng cho nghiên cứu các loài


2

đã có những bộ chỉ thị phát triển riêng cho loài hoặc những loài trong cùng
một chi.
Năm 2001, tại trƣờng Đại học Tasmania của Úc, Steane và cs đã sử dụng
12 cặp mồi có kí hiệu EMCRC dùng để nhân bản các chỉ thị SSR ở cây bạch
đàn. Ngoài ra còn khoảng 30 cặp mồi mang các đoạn lặp lại (CA)n và

(CAG)n cũng đƣợc tạo ra bằng việc sử dụng thƣ viện bộ gen [41].
Cho đến nay với đối tƣợng cây bạch đàn, số lƣợng chỉ thị SSR đã lên
đến hàng nghìn, nhƣng bộ chỉ thị phân tử SSR đang đƣợc sử dụng trong
nghiên cứu phổ biến nhất là EMBRA, có 300 mồi SSR với tên gọi EMBRA
đã đƣợc các nhà khoa học tại Braxin phát triển [25].
Trong khuôn khổ luận văn thạc sĩ “Phân tích đa dạng di truyền của ba
loài cây bố mẹ (Eucalyptus urophylla, E. camaldulensis, E. exserta) làm cơ
sở để xây dựng các tổ hợp bạch đàn lai khác loài”, học viên đã ứng dụng
phƣơng pháp chỉ thị phân tử SSR để phân tích đa dạng di truyền cho 19 cây
bố mẹ tham gia lai giống của 3 loài bạch đàn (E. urophylla, E. exserta,
E. camaldulensis), là cơ sở để cho các nhà lai tạo giống biết bản chất quan hệ
di truyền giữa các cây trong loài và giữa các loài với nhau để chọn đƣợc bố
mẹ lai thích hợp nhất.
Luận văn này là một phần của đề tài “Nghiên cứu chọn giống bạch đàn
lai bằng chỉ thị phân tử” giai đoạn 2012-2016, do TS. Nguyễn Việt Cƣờng
làm chủ nhiệm đề tài và tôi có tham gia thực hiện một số phép lai giống và
phân tích đa dạng di truyền các loài cây bố mẹ trong phòng thí nghiệm.


3

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Một số nghiên cứu trong chọn giống cây bạch đàn
1.1.1. Trên thế giới
Bạch đàn (Eucalyptus) là một chi thực vật thuộc bộ Sim (Myrtales), họ
Sim (Myrtaceae). Hiện nay, chi này gồm hơn 700 loài, hầu hết có nguồn gốc
từ Úc, còn một số loài khác có xuất xứ từ New Guinea và Indonesia. Các loài
bạch đàn đã đƣợc trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới gồm châu
Mỹ, châu Âu, châu Phi, vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Trung Quốc, bán

đảo Ấn Độ, Đông Nam Á…[45].
Bạch đàn là cây sinh trƣởng nhanh, gỗ đƣợc dùng làm nguyên liệu giấy,
ván dăm, ván sợi ép, đồ mộc, gỗ xây dựng, cột chống... Ngoài ra, lá của một
số loài bạch đàn còn đƣợc sử dụng để tách chiết tinh dầu và chế biến dƣợc
phẩm. Trên thế giới, bạch đàn là cây trồng rừng sản xuất chính với diện tích
ngày càng đƣợc mở rộng. Theo số liệu công bố, rừng trồng bạch đàn đến năm
2009 đã đạt khoảng 19,5 triệu ha tại 3 châu lục lớn là Châu Phi, Châu Mỹ và
Châu Á-Thái Bình Dƣơng. Ấn Độ là nƣớc có diện tích rừng trồng bạch đàn
lớn nhất thế giới, năm 2009 ƣớc tính có khoảng 3,9 triệu ha [46].
Nghiên cứu chọn giống bạch đàn là một khâu quan trọng trong chiến
lƣợc cải thiện giống cây rừng. Các chƣơng trình khảo nghiệm giống bạch đàn
ở một số quốc gia đã và đang đƣợc chú trọng.
Tại Nam Phi, từ năm 1973 đến năm 1983, Darrow đã tiến hành 9 khảo
nghiệm phối hợp 26 xuất xứ Bạch đàn caman (E. camaldulensis), 23 xuất xứ
Bạch đàn tere (E. tereticornis) và 23 xuất xứ Bạch đàn grandis (E. grandis).
Kết quả cho thấy, ở những vùng ẩm thì Bạch đàn grandis cho năng suất cao
nhất, sau đó đến Bạch đàn tere. Còn ở những vùng khô hạn và có sƣơng giá
thì Bạch đàn caman lại cho năng suất cao hơn [30].


Luận văn đủ ở file: Luận văn full