ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP NESTED RTPCR PHÁT HIỆN BỆNH HOẠI TỬ CƠ TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) DO VIRUS IMNV (INFECTIOUS MYONECROSIS VIRUS) GÂY RA Ở VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
KHOA THỦY SẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP NESTED RT-PCR
PHÁT HIỆN BỆNH HOẠI TỬ CƠ TRÊN
TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) DO VIRUS
IMNV (INFECTIOUS MYONECROSIS VIRUS) GÂY RA Ở
VIỆT NAM

SINH VIÊN THỰC HIỆN:VÕ THỊ ÁNH LOAN
NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
KHÓA: 2005-2009

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Tháng 9 năm 2009


ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP NESTED RT-PCR
PHÁT HIỆN BỆNH HOẠI TỬ CƠ TRÊN
TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) DO VIRUS IMNV
(INFECTIOUS MYONECROSIS VIRUS) GÂY RA Ở VIỆT NAM

Tác giả

Võ Thị Ánh Loan

Khóa luận được đệ trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng Kỹ Sư Nuôi Trồng Thuỷ Sản

Giáo viên hướng dẫn: ThS. Phạm Văn Nhỏ
ThS. Ong Mộc Quý
ThS. Ngô Xuân Tuyến

Tháng 9/2009
i


TÓM TẮT
Đề tài “Ứng dụng phương pháp nested RT-PCR phát hiện bệnh hoại tử cơ trên
tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) do virus IMNV (Infectious Myonecrosis
Virus) gây ra ở Việt Nam” được tiến hành tại phòng PCR – Bộ môn bệnh và môi
trường – Trung Tâm Quốc Gia Giống Hải Sản Nam Bộ, từ tháng 04/2009 đến tháng
08/2009.
Chúng tôi tiến hành thu mẫu tôm ngẫu nhiên và mẫu tôm dịch bệnh ở 4 tỉnh:
Ninh Thuận, Bình Thuận, Bến Tre và Bạc Liêu.
Kết quả kiểm tra mầm bệnh IMNV trên các mẫu tôm bằng phương pháp
nested RT-PCR:
- Tỷ lệ nhiễm bệnh của tỉnh Ninh Thuận với 46,7%, của Bình Thuận là 33,3%,
của Bạc Liêu là 26,7% và của Bến Tre là 22,2%.
- Tỷ lệ nhiễm bệnh của tháng nuôi đầu tiên là 35,7%, tháng nuôi thứ hai là
40%, hơn 2 tháng nuôi trở đi là 25,9% và trên các mẫu tôm postlarvae là 0%.
- Tỷ lệ nhiễm bệnh ở mật độ nuôi dưới 100 con/m2 là 23,07%, ở mật độ 100 –
150 con/m2 là 29,63 và ở mật độ hơn 150 con/m2 là 52,17%.
Kết quả ứng dụng phương pháp nested RT-PCR trong chẩn đoán mầm bệnh
IMNV trên tôm thẻ chân trắng :
- Kết quả PCR bước 1:có 13 mẫu tôm dương tính với mầm bệnh IMNV trên
tổng số 76 mẫu thu được.
- Kết quả PCR bước 2: có 26 mẫu tôm dương tính với mầm bệnh IMNV trên
tổng số 76 mẫu thu được.

ii


LỜI CÁM ƠN
Chúng tôi xin chân thành cám ơn
- Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
- Quí Thầy Cô Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí
Minh đã tận tâm truyền đạt kiến những kiến thức quý báu trong những năm học vừa
qua.
- Ban lãnh đạo cùng các Kỹ sư, Cán Bộ Trung Tâm Quốc Gia Giống Hải Sản
Nam Bộ đã tạo điều kiện tốt cho chúng tôi thực hiện đề tài.
Xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến
- Thầy Phạm Văn Nhỏ
- Thầy Ong Mộc Quý
Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ chúng tôi hoàn tất khóa luận tốt nghiệp này.
Chân thành cám ơn Thạc sĩ Ngô Xuân Tuyến và toàn thể các Anh Chị phòng
Bệnh Học và Môi Trường – Trung Tâm Quốc Gia Giống Hải Sản Nam Bộ, các bạn
sinh viên trong và ngoài lớp đã tân tình giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian thực
hiện đề tài.
Do thời gian thưc tập ngắn và trình độ bản thân còn giới hạn nên khóa luận
này không thể tránh khỏi những thiếu sót, chúng tôi mong được sự đóng góp ý kiến
của Thầy Cô và các bạn để khóa luận của chúng tôi hoàn chỉnh hơn.

iii


MỤC LỤC
ĐỀ MỤC

TRANG
TÊN ĐỀ TÀI
TÓM TẮT TIẾNG VIỆT
LỜI CÁM ƠN
MỤC LỤC
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH SÁCH CÁC BẢNG
DANH SÁCH HÌNH ẢNH
DANH SÁCH BI ỂU ĐỒ

CHƯƠNG 1
1.1
1.2

2.3.1
2.3.2
2.3.3

1

Đặt vấn đề
Mục tiêu

CHƯƠNG 2
2.1
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.1.4
2.1.5

2.1.6
2.1.7
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.2.4
2.2.5
2.2.6
2.2.7
2.3

MỞ ĐẤU

i
ii
iii
iv
vi
vii
viii
ix

1
2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Đặc điểm sinh học của tôm thẻ chân trắng
Phân loại

Phân bố
Tập tính dinh dưỡng
Đặc điểm tăng trưởng và phát triển của tôm thẻ chân trắng
Đặc điểm sinh sản
Môi trường sống
Hiện trạng nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và Việt Nam
Bệnh hoại tử cơ và virus gây bệnh hoại tử cơ (IMNV)
Các nghiên cứu liên quan về IMNV
Virus IMNV
Mô đích chứa mầm bệnh
Triệu chứng bệnh tích
Vật chủ IMNV
Con đường lây nhiễm
Các phương pháp chẩn đoán
Phương pháp RT-PCR (Reverse Trancriptase Polymerase
Chain Reaction)
Khái niệm
Giới thiệu về Acid nucleic
Nguyên tắc của phương pháp RT-PCR
iv

3
3
3
3
4
4
5
5
5

7
7
7
8
9
10
10
10
10
10
11
11


2.3.4
2.3.5
2.3.6
2.3.7
2.3.8
2.4

Tổng hợp cDNA và quy trình phản ứng PCR
Các thành phần của quy trình phản ứng RT-PCR
Phương pháp tách chiết RNA
Các hạn chế của phương pháp PCR
Ưu điểm của phương pháp PCR
Phương pháp nested PCR

CHƯƠNG 3
3.1

3.1.1
3.1.2
3.2
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.3

Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện
Mẫu xét nghiệm
Nguyên vật liệu, thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng cho
phương pháp nested RT-PCR
Nguyên vật liệu
Thiết bị và dụng cụ
Hóa chất
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu
Phương pháp nested RT-PCR
Phương pháp xử lý số liệu

CHƯƠNG 4
4.1

4.1.1

4.1.2
4.1.3
4.2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả bước đầu đánh giá tình hình xuất hiện mầm bệnh
IMNV ở các tỉnh ĐBSCL và nam trung bộ bằng phương
pháp nested RT-PCR
Kết quả kiểm tra mầm bệnh IMNV trên các mẫu tôm
Kết quả khảo sát mầm bệnh IMNV trên tôm ở các giai
đoạn nuôi khác nhau
Kết quả khảo sát mầm bệnh IMNV trên tôm nuôi ở các mật
độ khác nhau
Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh IMNV giữa
phương pháp nested RT-PCR và phương pháp mô học
truyền thống

12
13
15
16
17
18
19
19
19
19

19
19
19
20
20
21
21
22
24
25

25
25
28
29

30

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

34

5.1
Kết luận
5.2
Đề nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

34

34
35
v


DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
IMNV:

Infectious Myonecrosis Virus (virus gây hoại tử cơ)

TSV:

Taura Syndrom Virus (virus gây hội chứng Taura)

YHV:

Yelow Head Virus (virus gây bệnh đầu vàng)

IHHNV:

Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus (virus
gây nhiễm trùng dưới da và hoại tử)

WSSV:

White Spot Syndrom Virus (virus gây hội chứng đốm trắng)

NCNTTS II: Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II
FAO:

Food and Agriculture Organization (tổ chức Lương thực và Nông
nghiệp Liên Hợp Quốc)

ĐBSCL:

Đồng bằng sông Cửu Long

RT-PCR:

Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

RNA:

Ribonucleic Acid

DNA:

Deoxyribonucleic Acid

DEPC:

Diethylpyrocarbonate

EDTA:

Ethylene Diamine Tetra Acetic

TBE:

Tris-Boric acid-EDTA

ORF:

Open Reading Frame (khung đọc mở)

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

NỘI DUNG

TRANG

Bảng 2.1

Khó khăn trong phương pháp khuếch đại acid nucleic

17

Bảng 4.1

Kết quả phân tích PCR trên các mẫu tôm dịch bệnh

25

Bảng 4.2

Kết quả khảo sát mầm bệnh IMNV trên mẫu tôm thu

ngẫu nhiên

Bảng 4.3

27

Kết quả kiểm tra mầm bệnh IMNV trên các mẫu tôm
bằng phương pháp nested RT-PCR

Bảng 4.4

30

Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh IMNV
giữa phương pháp PCR và mô học truyền thống

vii

31


DANH SÁCH HÌNH ẢNH
HÌNH

NỘI DUNG

TRANG

Hình 2.1

Biểu đồ sản lượng tôm thẻ chân trắng trên thế giới

6

Hình 2.2

Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử của thể virus IMNV

8

Hình 2.3 (a)

Mô cơ bị hoại tử

9

Hình 2.3 (b)

Thể vùi IMNV trong các tế bào cơ

9

Hình 2.4

Tôm thẻ chân trắng bị nhiễm IMNV

9

Hình 4.1

Kết quả chạy điện di gel mẫu tôm dịch bệnh (bước 2)

26

Hình 4.2 (a)

Kết quả điện di gel (bước 1)

31

Hình 4.2 (b)

Kết quả điện di gel (bước 2)

31

Hình 4.3

Tiêu bản mô cơ của mẫu tôm bị đục cơ đuôi

33

viii


DANH SÁCH BIỂU ĐỒ
BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1

Biểu đồ 4.2

NỘI DUNG

TRANG

Tỷ lệ nhiễm mầm bệnh IMNV trên tôm nuôi ở các
giai đoạn khác nhau

28

Tỷ lệ nhiễm IMNV trên tôm nuôi ở các mật độ khác nhau

29

ix


Chương 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, nghề nuôi tôm trên toàn thế giới nói chung và ở
nước ta nói riêng đang phát triển mạnh, nó góp phần vào việc giải quyết việc làm, tăng
thu nhập của người dân và tận dụng triệt để các phần đất ngập mặn không sử dụng
được trong nông nghiệp. Trong đó, tôm sú (Penaeus monodon) là một đối tượng nuôi
chủ lực của ngành nuôi trồng thủy sản nước ta.
Tuy nhiên, sau những thất bại của con tôm sú (Penaeus monodon) trong
những năm gần đây và thị trường thế giới bắt đầu ưa chuộng con tôm thẻ chân trắng
(Penaeus vannamei) do kích thước nhỏ, dễ tiêu thụ. Theo Viện Kinh tế và quy hoạch
thủy sản thuộc Bộ Thủy sản (cũ), tôm thẻ chân trắng có nhiều ưu điểm so với con tôm
sú. Đó là có thời gian nuôi ngắn hơn nhưng năng suất tương đương, có khả năng

chuyển hóa thức ăn rất cao, tốc độ tăng trưởng nhanh, chịu được độ mặn cao và có thể
nuôi được trong cả nước mặn, ngọt và lợ, khả năng kháng chịu bệnh tật cao, giá thành
thấp. Do đó, tôm thẻ chân trắng đã dần dần trở thành đối tượng nuôi chính của các khu
vực nuôi tôm sú trước đây. Cũng giống như con tôm sú, lợi nhuận cao đã tạo ra nhiều
thách thức cho nghề nuôi tôm ở Việt Nam, thiếu kỹ thuật nuôi, chất lượng con giống
kém, tình trạng nuôi tôm tự phát không theo qui hoạch của ngươì dân gây khó khăn
trong quản lý của các cơ quan chức năng địa phương và tăng nguy cơ truyền lan mầm
bệnh, nguy hiểm nhất là các mầm bệnh virus có thể nhiễm sang các đối tượng tôm bản
địa, và có thể gây thiệt hại nghiêm trọng đến sản xuất thủy sản và môi trường tự nhiên.
Cũng như tôm sú, tôm thẻ chân trắng cũng là vật chủ chính cho nhiều loại
mầm bệnh virus nguy hiểm. Ngoài những mầm bệnh đã phổ biến như virus gây hội
chứng Taura TSV (Taura Syndrom Virus ), virus gây bệnh đầu vàng YHV (Yelow
Head Virus), virus gây bệnh nhiễm trùng dưới da và hoại tử IHHNV (Infectious
Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus), virus gây hội chứng đốm trắng
1


WSSV (White Spot Syndrom Virus),…thì vào năm 2002, một lòai virus mới gây bệnh
họai tử cơ IMNV (Infectious Myonecrosis Virus) cũng đã được phát hiện ở Brazil, đã
gây thiệt hại cho nước này khoảng 20 triệu đôla trong năm 2003 theo Nunes và ctv
(2004, trích bởi Pinheirro và ctv, 2007) và đã lây lan sang các nước châu Mỹ,
Inđônêsia,.... Vì vậy việc chẩn đoán nhanh và chính xác mầm bệnh ở đầu vào của qui
trình nuôi, cũng như sự hiện diện của mầm bệnh IMNV trên tôm trong quá trình nuôi
là hết sức cần thiết. Điều này giúp cho người dân kiểm soát được các mối nguy đầu
vào và có các biện pháp kịp thời để khắc phục khi bệnh xảy ra trên tôm đang nuôi.
Cho đến nay, đã có nhiều phương pháp dùng để chẩn đoán các bệnh do virus
gây ra như: phưng pháp mô học truyền thống, các công cụ sinh học phân tử ( kỹ thuật
PCR, lai phân tử, nhuộm miễn dịch,…). Tuy nhiên, đối với mầm bệnh IMNV, đó là
một loại virus nguy hiểm cho tôm thẻ chân trắng và hoàn toàn mới đối với hệ thống
xét nghiệm bệnh thủy sản tại Việt Nam. Vì vậy cần phải nghiên cứu khả năng hiện

diện của IMNV và xây dựng phương pháp xét nghiệm tối ưu vừa nhanh, vừa chính xác
và có độ tin cậy cao.
Được sự phân công của khoa Thủy Sản trường Đại học Nông Lâm và được sự
chấp nhận của Trung Tâm Quốc Gia Giống Hải Sản Nam Bộ thuộc Viện NCNTTS II
chúng tôi tiến hành đề tài: “ Ứng dụng phương pháp nested RT-PCR phát hiện bệnh
họai tử cơ trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) do virus IMNV (Infectious
Myonecrosis Virus) gây ra ở Việt Nam”.
1.2 Mục tiêu
Khảo sát sự hiện diện của mầm bệnh IMNV gây hoại tử cơ trên tôm thẻ chân
trắng ở một số tỉnh Nam Bộ và Nam Trung Bộ.
So sánh khả năng phát hiện mầm bệnh IMNV giữa phương pháp PCR và mô
học truyền thống.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm sinh học của tôm thẻ chân trắng
2.1.1 Phân lọai
Tôm thẻ chân trắng thuộc:
Ngành : Arthropoda
Lớp: Crustacea
Bộ: Decapoda
Họ: Penaeidea
Giống: Penaeus
Loài: Penaeus vannamei (Boone, 1931)
Tên tiếng Việt: Tôm thẻ chân trắng
Tên tiếng Anh: White Leg shrimp
2.1.2 Phân bố

Theo chiều ngang: tôm thẻ chân trắng phân bố nhiều ở vùng biển ven bờ Đông
Thái Bình Dương, từ Nam Mêxico đến Pêru, tập trung nhiều nhất ở vùng biển Ecuador
( Nguyễn Trọng Nho và ctv, 2006).
Theo chiều dọc: giai đoạn ấu trùng và ấu niên P.vannamei sống trôi nổi sau đó
dần chyển sang đời sống đáy. Ở vùng cửa sông, tôm ấu niên và thiếu niên sống ở tầng
mặt, trong khi phần lớn tôm trưởng thành sống ở mực nước sâu khoảng 72 m.
Trong môi trường tự nhiên, tôm thẻ chân trắng phân bố chủ yếu ở độ sâu
0 – 72 m, ở tầng đáy bùn. Vào mùa nước trong, khi độ đục giảm, tôm thẻ chân trắng
thường kết đàn rất đông làm xáo trộn bùn đáy gây đục môi trường để tự vệ. Lòai tôm
này được du nhập vào các quốc gia châu Á như: Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan,
Việt Nam,…để nuôi thương phẩm.

3


2.1.3 Tập tính dinh dưỡng
Tôm thẻ chân trắng có tính ăn tạp thiên về động vật, chúng sử dụng các loại
thức ăn khác nhau tùy theo giai đoạn sinh trưởng:
- Ấu trùng Nauplius có tập tính trôi nổi, hướng quang, dinh dưỡng bằng noãn
hoàng.
- Ấu trùng Zoea có tính ăn lọc, thức ăn ưa thích là các loài tảo khuê
(Skeletonema, Chaetoceros). Ngoài ra, ấu trùng Zoea vẫn có khả năng bắt mồi thụ
động (Nauplius của Artermia, luân trùng,…) nhất là vào cuối giai đoạn Z2, Z3.
- Ấu trùng Mysis bắt mồi chủ động, thức ăn chủ yếu là động vật nổi (Nauplius
của Artermia, luân trùng,…). Mysis sống trôi nổi, đầu chúc xuống dưới, bơi lội kiểu
búng ngược.
- Giai đoạn Postlarvae: phần lớn bắt đầu sống đáy, thức ăn chủ yếu là giun
nhiều tơ, ấu trùng tôm, cua, nhuyển thể, mùn bã hữu cơ.
- Tôm trưởng thành ăn giáp xác, giun nhiều tơ, nhuyễn thể, cá,…(Nguyễn
Trọng Nho và ctv, 2006).

Tôm thẻ chân trắng có khả năng chuyển hóa thức ăn rất cao (FCR = 1,2) và
không đòi hỏi khẩu phần ăn có lượng prôtêin cao, thức ăn phù hợp chứa 25 – 30% chất
đạm.
2.1.4 Đặc điểm tăng trưởng và phát triển của tôm thẻ chân trắng
Trong thiên nhiên, tôm he thành thục và đẻ trứng ở biển, ấu trùng sẽ phát triển
ở đây, ấu trùng trải qua ba thời kỳ biến thái (Nauplius – Zoea – Mysis). Ấu trùng theo
sóng biển dạt vào vùng cửa sông, độ mặn thấp hơn ngoài biển, thích hợp cho sự phát
triển của ấu trùng, đó là vùng nước lợ có độ mặn 15 – 30‰. Tại môi trường nước lợ,
ấu trùng larvae phát triển sang thời kỳ hậu ấu trùng Postlarvae. Sau đó Postlarvae
chuyển sang thời kỳ ấu niên (Juvenile) đồng thời bơi ra biển, tiếp tục tăng trưởng, sinh
sản và tiếp tục chu kỳ sống của chúng (Vũ Thế Trụ, 1994).
Tôm thẻ chân trắng có khả năng tăng trưởng nhanh, mỗi tuần có thể tăng
trưởng 3 g và có thể đạt trọng lượng tối đa là 20 g trong điều kiện nuôi thâm canh với
mật độ lên đến 150 con/m2. Mặc dù tôm sẽ tiếp tục tăng trọng trên 20 g nhưng tốc độ
tăng trưởng có thể châm lại, chỉ còn 1 g/tuần khi trọng lượng đạt trên 20 g (Wyban và
Sweeny, 1991).
4


2.1.5 Đặc điểm sinh sản
Cơ quan sinh dục cái là Thelycum, cơ quan sinh dục đực là Petasma.
Paneus vannamei thuộc nhóm có Thelycum hở, tôm giao vĩ chỉ vài giờ trước khi đẻ
trứng và quá trình sinh sản của tôm thẻ chân trắng tuân theo thứ tự: Lột xác – thành
thục – giao vĩ – đẻ trứng (Nguyễn Trọng Nho và ctv, 2006).
Đối với tôm có Thelycum hở, giao vĩ chỉ xảy ra chủ yếu vào đầu hôm của đêm
đẻ trứng khoảng 19:00 – 21:00. Tôm bố mẹ giao vĩ và sinh sản ở những vùng biển có
độ sâu 70 m, nhịêt độ 26 – 280C, độ mặn khá cao 35‰. Lượng trứng của mỗi lần sinh
sản phụ thuộc vào kích thước tôm mẹ: nếu tôm mẹ cỡ 30 – 45 g, số lượng trứng từ
100.000 – 250.000 trứng, đường kính trứng 0,22 mm (Nguyễn Trọng Nho và ctv,
2006).

2.1.6 Môi trường sống
Sự thích nghi với độ mặn: tôm thẻ chân trắng chịu được sự thay đổi độ mặn
rộng 0,5 – 45‰ và thích hợp ở độ mặn 7 – 34‰, nhưng đặc biệt tăng trưởng tốt ở độ
mặn khoảng 10 – 15‰ (ớ đó môi trường bên ngoài và máu trong cơ thể có áp suất
bằng nhau) (Wyban và Sweeny, 1991). Khả năng này giúp cho tôm thẻ chân trắng
thích nghi được trong các ao nuôi ở vùng triều, nơi có độ mặn thấp.
Sự thích nghi với nhiệt độ: tôm thẻ chân trắng có thể chịu được ngưỡng nhiệt
độ lớn, chúng phát triển tốt ở nhiệt độ từ 23 – 300C, phát triển tối ưu ở nhiệt độ ở nhiệt
độ 300C đối với tôm nhỏ (1 g), và 270C đối với tôm lớn (12 – 18 g).
Sự thích nghi với hàm lượng ôxy hòa tan: ngưỡng ôxy thấp nhất khoảng
1,2 mg/lít, tôm càng lớn ngưỡng ôxy càng cao dần (cỡ tôm dưới 2 – 4 cm ngưỡng ôxy
cần thiết 2 mg/lít, cỡ tôm dưới 2 cm là 1,05 mg/lít) (Nguyễn Trọng Nho và ctv, 2006).
2.1.7 Hiện trạng nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và Việt Nam
Trong những năm gần đây, bên cạnh con tôm sú thì tôm thẻ chân trắng cũng là
một đối tượng được nuôi phổ biến. Xuất xứ của tôm thẻ chân trắng là từ vùng Nam
Mỹ chạy suốt từ Pêru đến Mêxicô. Vào những năm 1970, tôm thẻ chân trắng được đưa
vào các vùng đảo Thái Bình Dương, tới đầu năm 1980 tôm thẻ chân trắng được nuôi
trong các vùng của Châu Mỹ và các khu vực xung quanh. Đối với châu Á thì tôm thẻ
chân trắng được đưa vào qua các nước Trung Quốc và Đài Loan nhưng cho tới mãi

5


năm 1996 mới thực sự đưa vào nuôi đại trà. Các nước châu Á lân cận khác thì vào đầu
năm 2000.

Hình 2.1 Biểu đồ sản lượng tôm thẻ chân trắng trên thế giới (nguồn: FAO, 2004)
Theo thống kê của FAO (Food and Agriculture Organization), thì sản lượng
tôm thẻ chân trắng trên thế giới có sự gia tăng đều đặn từ 8.000 tấn trong năm 1980 lên
194.000 tấn trong năm 1998. Nhưng vào năm 1999 và 2000 thì sản lượng có sự giảm

sút đáng kể do dịch bệnh đốm trắng xảy ra ở khu vực các nước Mỹ Latinh. Đến năm
2004, thì sản lượng đã đạt tới 1.386.000 tấn do loài này đã được nuôi phổ biến ở các
nước châu Á, chủ yếu là Trung Quốc (700.000 tấn), Thái Lan (400.000 tấn), Inđônêsia
(300.000 tấn) và Việt Nam (50.000 tấn).
Đối với Việt Nam, tôm tôm thẻ chân trắng chính thức đến đồng bằng sông
Cửu Long (ĐBSCL) vào năm 2001 khi Bộ Thuỷ Sản (cũ) cho phép Công ty Duyên
Hải Bạc Liêu nhập tôm giống và bố mẹ từ Hawai - Mỹ về nuôi thí nghiệm. Đến tháng
1/2008, sau khi Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn ban hành chỉ thị 228/CNBNN-NTTS cho phép nuôi tôm tôm thẻ chân trắng ở ĐBSCL và một số tỉnh Đông
Nam Bộ thì các tỉnh đã quy hoạch và triển khai ngay diện tích nuôi tôm tôm thẻ chân
trắng. Năm 2008, tổng diện tích nuôi tôm nước lợ của cả nước là hơn 604.528 ha, sản
lượng đã thu hoạch 210.408 tấn, sản phẩm tôm xuất khẩu đạt giá trị 784,3 triệu USD.
Riêng khu vực 7 tỉnh ven biển ĐBSCL, đến hết 8/2008 tổng diện tích thả nuôi là hơn
539.600 ha, chiếm 89,3% diện tích thả nuôi của cả nước. Trong đó tôm sú là 538.800
6


ha, tôm thẻ chân trắng là 807 ha, sản lượng hàng năm đạt trên 160.000 tấn, chiếm 76%
tổng sản lượng tôm thẻ chân trắng cả nước (nguồn: Bộ NN và PTNT, 2008).
2.2 Bệnh hoại tử cơ và virus gây bệnh hoại tử cơ IMNV
Bệnh họai tử cơ trên tôm thẻ chân trắng được phát hiện lần đầu tiên vào năm
2002, tại các ao nuôi thâm canh tôm thẻ chân trắng thuộc vùng Đông Bắc Brazil và
được phân lập và báo cáo đầu tiên vào năm 2004 bởi phòng thí nghiệm bệnh thủy sản
của Đại học Arizona (Lightner và ctv, 2004). Vào tháng 1 năm 2006, tổ chức OIE
(World Organisation for Animal Health) đã bổ sung bệnh này vào danh sách các bệnh
cần theo dõi.
2.2.1 Các nghiên cứu liên quan về IMNV
Năm 2004, Pinheiro và ctv đã tiến hành điều tra dịch tể hội chứng Taura
(TSV) và bệnh hoại tử cơ (IMNV) bằng phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase
Polymerase Chain Reaction) trên tôm thẻ chân trắng được nuôi tại Pernambuco
(Brazil). Mười một nông trại được thu mẫu một cách ngẫu nhiên, các mẫu thu được

đều cho kết quả âm tính với TSV, đối với IMNV thì 9 trong 11 nông trại cho kết quả
dương tính.
Poulos và Lightner (2006) đã ứng dụng phương pháp nested RT-PCR để phát
hiện mầm bệnh IMNV với hai cặp mồi được thiết kế tạo ra sản phẩm khuếch đại có
kích thước 328 bp và 139 bp. RNA (Ribonucleic Acid) sử dụng được tách chiết từ các
hạt virus và từ tôm nhiễm TSV, YHV, IHHNV, WSSV. Kết quả là mồi được thiết kế
là đặc trưng cho IMNV.
Senapin và ctv (2007) ứng dụng phương pháp RT-PCR để phát hiện mầm
bệnh IMNV ở Inđônêsia với 15 cặp mồi được thiết kế theo trình tự bộ gen của virus.
2.2.2 Virus IMNV
Từ kết quả nhuộm âm bảng dưới kính hiển vi điện tử cho thấy hạt virus không
có vỏ bọc, hình khối 20 mặt (icosahedral), có kích thước tương đối đồng nhất với
đường kính khoảng 40 nm. Bộ gen của virus gồm một phân tử RNA sợi đôi có kích
thước 7560 bp gồm 37% A (Adenin), 25% U (Uraxin), 20% G (Guanin) và 18% C
(Cytoxin). Phân tích trình tự bộ gen cho thấy virus mang hai khung đọc mở (ORF –
Opening Reading Frame) riêng biệt không giao nhau. ORF1 ở vùng 136 – 4953 mã
hóa cho phân tử prôtêin có kích cỡ 179 kDa. ORF2 ở vùng 5241 – 7451 mã hóa cho
7


prôtêin kích thước 85 kDa có chứa các motif hoạt động giống của enzyme RNAdependent RNA polymerase (RdRp). Dựa trên phân tích bộ gen, IMNV được phân loại
vào họ virus Totiviridae, nhóm RNA virus sợi đôi (Poulos và ctv, 2006).

Hình 2.2 Ảnh chụp dưới kính vi điện tử của thể virus IMNV (Poulos và ctv, 2006)
2.2.3 Mô đích chứa mầm bệnh
Năm 2006, Poulos và ctv đã tiến hành gây bệnh thực nghiệm trên tôm thẻ chân
trắng bằng cách tiêm virus IMNV đã được ly trích. Sau 5 ngày, các tôm thí nghiệm
đều có những biểu hiện hoại tử trên cơ ở đốt thứ sáu giống với những dấu hiệu của tôm
nhiễm IMNV thu ở Brazil.
Quan sát tiêu bản mô học của tôm được gây bệnh thực nghiệm cho thấy, các

tổn thương đặc trưng bởi sự đông tụ lại của các mô cơ hoại tử cùng với sự tích lũy chất
dịch giữa các sợi cơ. Các thể vùi ưa kiềm được tìm thấy trong tế bào chất của tế bào
cơ, tế bào máu và tế bào mô liên kết, hệ bạch huyết (Poulos và ctv, 2006).

8


Hình 2.3 (a) Mô cơ bị hoại tử (cơ bình thường ở góc phải phía trên)
(b) Thể vùi IMNV trong các tế bào cơ (nguồn: Poulos và ctv, 2006)
2.2.4 Triệu chứng bệnh tích
Tôm nhiễm IMNV có những vùng cơ bị hoại tử, xuất hiện đầu tiên ở đốt bụng
cuối cùng, sau đó lan dần ra toàn thân, có thể nhìn thấy được do vùng cơ bị hoại tử có
màu trắng đục và xuất hiện sắc tố đỏ ở khu đốt bụng cuối cùng và phần mái đuôi
(Lightner và ctv, 2004).
Bệnh tiến triển chậm với tỷ lệ chết thấp nhưng kéo dài trong suốt vụ nuôi và tỷ
lệ chết tích lũy vào cuối vụ có thể lên đến 70 – 80 % (Poulos và ctv, 2006) và làm tăng
hệ số chuyển đổi thức ăn (Andrade và ctv, 2008).
Bệnh xuất hiện ở giai đoạn tôm ấu niên, tôm trưởng thành (60 – 80 ngày tuổi)
(Lightner, 2004).

Hình 2.4 Tôm thẻ chân trắng bị nhiễm IMNV (nguồn: Mei, 2006)
9


2.2.5 Vật chủ IMNV
Theo Tang và ctv (2005) đã tiến hành gây bệnh thực nghiệm cho tôm thẻ chân
trắng, tôm sú (Penaeus monodon) và một loài tôm chân trắng khác là Penaeus
stylirostris. Tất cả đều có biểu hiện bệnh như tôm nhiễm bệnh tự nhiên. Trong ba loài
trên thì tôm thẻ chân trắng, bệnh chủ tự nhiên của IMNV dễ cảm nhiễm và gây tỷ lệ
chết cao nhất.

2.2.6 Con đường lây nhiễm
Theo Flegel (2006), nguồn gốc của sự lây lan IMNV cho các vùng du nhập
nuôi tôm thẻ chân trắng là từ tôm bố mẹ và tôm postlarvae.
Theo Enaca (2007) thì hiện nay bệnh IMNV chỉ truyền lan theo phương nằm
ngang, chưa có thông tin chứng minh bệnh có thể truyền lan theo phương thẳng đứng.
2.2.7 Các phương pháp chẩn đoán
- Phương pháp mô học
- Phương pháp lai tại chỗ ( In situ hybridization)
- Phương pháp RT – PCR.
2.3 Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)
2.3.1 Khái niệm
PCR viết tắt của Polymerase Chain Reaction (chuỗi phản ứng tổng hợp dây
chuyền nhờ polymerase) là phương pháp tạo dòng in vitro theo con đường enzyme. Kỹ
thuật PCR được mô tả bởi Kary Mullis vào năm 1983, cho phép tăng bội các đoạn
DNA (Deoxyribonucleic Acid) cần được nghiên cứu lên nhiều bản sao nhờ hoạt động
của enzyme polymerase và một cặp mồi.
Về nguyên lý, kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction) cũng giống như kỹ thuật PCR thông thường nhưng nhằm mục đích khuếch
đại đoạn gen từ khuôn RNA thay vì DNA. Đầu tiên, RNA tổng số hoặc mRNA được
dùng làm khuôn để tổng hợp sợi đơn cDNA (complemer DNA) nhờ enzyme reverse
trancriptase (enzyme phiên mã ngược). Sau đó các sợi đơn cDNA được tổng hợp thành
sợi kép nhờ Taq polymerase. cDNA dạng sợi kép được sử dụng làm khuôn trong phản
ứng PCR (Nguyễn Như Hiền, 2002).

10


2.3.2 Giới thiệu về Acid nucleic
Acid nucleic là các đại phân tử mang thông tin di truyền, hiện diện trong mọi
tế bào sống ở dạng tự do hay kết hợp với prôtêin để tạo các nucleoprôtêin. Có 2 kiểu

acid nucleic luôn luôn hiện diện trong tế bào sống: DNA (Deoxyribonucleic Acid) chủ
yếu được chứa trong nhân tế bào và RNA (Ribonucleic Acid) được tìm thấy chủ yếu
trong tế bào chất.
Acid nucleic được cấu tạo bởi các đơn vị nucleotide. Mỗi nucleotide gồm ba
yếu tố: base (có nitrogen), đường pentose và phosphoric acid. Các base của phân tử
DNA mang thông tin di truyền trong khi các nhóm pentose và phosphate chỉ có vai trò
cấu trúc (Lê Thị Phương Hồng, 1998).
2.3.2.1 DNA
Năm 1953, James Watson và Francis Crick đề nghị cấu trúc bậc hai của DNA
dựa vào các sự kiện:
- Sự phân tích thành phần base cho thấy số lượng adenine bằng số lượng
thymine và số lượng guanine bằng số lượng cytosine trong DNA (A/T hay G/C đều
bằng 1).
- Sự phân tích ảnh nhiễu xạ tia X (do Franklin và Wilkins thực hiện) chứng tỏ
DNA có hình xoắn ốc.
- Các chuỗi polydeoxyribonucleotide nối nhau nhờ các liên kết hydrogen.
2.3.2.2 RNA
RNA cũng được cấu tạo bởi nhiều nucleotide nối nhau nhờ các liên kết ester.
Có ba điểm khác biệt giữa RNA và DNA:
- Phân tử RNA là chuỗi đơn.
- Đường pentose của RNA là ribose thay vì deoxyribose ở DNA.
- Các base thành phần của nucleotide RNA là A, G, C và U (trong DNA không
tìm thấy U, T thay cho U).
2.3.3 Nguyên tắc của phương pháp RT-PCR
Tất cả những Taq DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA
mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt.
Mồi là những chuỗi nucleotide ngắn có kích thước từ 25 – 30 nucleotide, được
thiết kế dựa theo trình tự DNA của một loại virus cần chẩn đoán. Do đó, trong mẫu
11

chẩn đoán có sự hiện diện của virus này, mồi có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu
của mạch khuôn và enzyme polymerase sẽ nối dài để hình thành mạch mới. Phương
pháp RT-PCR thiết lập dựa vào các đặc tính đó của enzyme polymerase.
Nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình
tự DNA, thì sợi DNA được tổng hợp sẽ nằm giữa hai mồi, điều đó có ý nghĩa để
khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ
để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và
một mồi ngược (antisen primer). Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu theo chiều của phiên
mã gen (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
2.3.4 Tổng hợp cDNA và quy trình phản ứng PCR
cDNA được tổng hợp dựa theo trình tự của RNA được tách chiết từ mẫu thí
nghiệm sinh vật. Thực hiện quy trình tổng hợp cDNA ở nhiệt độ 420C trong 30 phút.
Quá trình này nhằm chuyển toàn bộ RNA thành một phân tử cDNA nhờ enzyme phiên
mã ngược. Kết thúc quá trình phiên mã ngược, phản ứng bị biến tính ở nhiệt độ 940C
trong 2 phút nhằm ức chế enzyme phiên mã ngược.
Sau đó thực hiện quá trình khuếch đại acid nucleic bằng phương pháp PCR.
Trong phản ứng PCR nhiệt độ là yếu tố quan trọng và kèm theo nó là yếu tố thời gian.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
- Bước 1: làm biến tính DNA khuôn, sợi đôi DNA bị tách thành hai sợi đơn ở
nhiệt độ 940C trong vòng 30 giây đến 1 phút. Sự biến tính DNA diễn ra dưới sự có mặt
của hai đoạn mồi và bốn loại dNTP. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation).
- Bước 2: nhiệt độ được hạ thấp cho phép các đoạn mồi gắn với chuỗi đích
theo quy luật bổ sung đôi base. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động khoảng
600C trong khoảng 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai (hybridization).
- Bước 3: nhiệt độ sau đó đươc nâng lên nhiệt độ phản ứng tối ưu để cho các
đoạn mồi được kéo dài nhờ một DNA polymerase. Nhiệt độ lúc này là 720C trong
vòng 30 giây đến nhiều phút. Sau đó chuỗi đích và bản sao của nó được dùng làm
khuôn cho chu kỳ sau. Đây là giai đoạn kéo dài (elongation).
Chu kỳ được lập lại nhiều lần, khoảng 30 – 40 chu kỳ. Chu kỳ cuối cùng có

khoảng thời gian dài hơn để phản ứng tổng hợp được đảm bảo là tổng hợp hoàn toàn
DNA. Sau mỗi chu kỳ, sản phẩm được nghiên cứu tăng gấp hai lần.
12


2.3.5 Các thành phần của quy trình phản ứng RT-PCR
2.3.5.1 Đoạn khuôn (template)
Đoạn khuôn là đoạn RNA đã biết trước trình tự ở hai đầu để thiết kế mồi. Dịch
chiết RNA cho vào hỗn hợp phản ứng PCR tương đối sạch không có lẫn tạp chất khác,
những tạp chất này có khả năng ức chế, ảnh hưởng đến phản ứng PCR.
Lượng RNA mẫu ban đầu có khuynh hướng giảm (từ 1 mg xuống còn 100 ng)
với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Lượng mẫu càng nhỏ thì càng hạn
chế được sự khuếch đại ký sinh tạo những sản phẩm phụ không mong muốn.
2.3.5.2 Đoạn mồi (primer)
Đoạn mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng
và có hiệu quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR và
phải tuân theo một số nguyên tắc:
- Mồi gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược (antisens
primer)
- Trình tự mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa
mồi xuôi và mồi ngược và cũng không có cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ
sung giữa các thành phần khác nhau của mồi
- Tm (nhiệt độ biến tính) của mồi xuôi và mồi ngược không chênh lệch
nhau quá xa. Số lượng bốn loại nucleotide của các mồi nên cân bằng, tránh
những vùng trình tự không bình thường như polypurin hay polypyrimidin
- Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại,
không trùng với các trình tự khác lặp lại trên gen
- Trình tự nằm giữa 2 mồi xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR
sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb (kilo base).
2.3.5.3 Enzyme

• Enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase):
Enzyme này do các retrovirus sản sinh nhằm sao chép bộ gen RNA của chúng
trong tế bào kí chủ. Enzyme phiên mã ngược được ly trích từ hai chủng virus: AMV
(Avian Myeloblastosis virus) và MMLV (Moloney Murine Leukemis virus).

13


• Enzyme Taq polymerase:
Enzyme được Mullis sử dụng đầu tiên để kéo dài đoạn mồi là đoạn Klenow
của DNA polymerase I, nhưng enzyme này không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và
hiệu quả thấp. Việc phát hiện ra enzyme Taq polymerase được tách chiết từ vi khuẩn
suối nước nóng Thermus aquaticus, có thể chịu được nhiệt độ lên đến 900C lập lại
nhiều lần mà không mất khả năng tổng hợp DNA, có độ tinh khiết và năng suất cao.
Đây là bước ngoặt trong quy trình PCR.
Dùng Taq polymerase với nồng độ cao sẽ dẫn đến hiện tượng tổng hợp DNA
do phản ứng của đoạn mồi trên dây đơn. Nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp sẽ
không đủ lượng enzyme xúc tác tạo sản phẩm PCR.
2.3.5.4 Buffer và MgCl2
Buffer là môi trường đệm cần thiết cho phản ứng xảy ra .
Một yếu tố quan trọng trong hỗn hợp phản ứng đó là MgCl2. Nồng độ MgCl2
có ảnh hưởng lớn tới hiệu quả và tính đặc thù của phản ứng. Theo Hồ Huỳnh Thùy
Dương (2008), nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm năng suất khuếch đại còn nồng độ
quá cao sẽ tạo sản phẩm không đặc hiệu. Nhu cầu nồng độ MgCl2 nên được quyết định
cho mỗi phản ứng PCR, thường thì nồng độ này nằm trong khoảng 1 – 5 mM. Theo
Newton và ctv (1994), nếu nồng độ dNTP cao thì nồng độ MgCl2 sẽ tăng lên.
2.3.5.5 Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs)
Bốn dNTPs thường được sử dụng ở nồng độ là 20 – 200 µM cho mỗi loại
nucleotide: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Tuy nhiên với nồng độ thấp (10 – 100 µM) thì
Taq polymerase hoạt động chính xác hơn (Phan Cự Nhân, 2001). Nồng độ cao hơn dễ

dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh”. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm
tăng các lỗi sao chép của polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2008).
Nồng độ dNTPs phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
- Nồng độ MgCl2
- Nồng độ đoạn mồi
- Độ dài của đoạn cần được khuếch đại
- Số chu kỳ của phản ứng PCR.

14


2.3.5.6 Số lượng chu kì của phản ứng
Trong thực tế, số lượng chu kỳ phản ứng không vượt quá 40 chu kỳ cho một
phản ứng PCR. Sở dĩ như vậy vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai
đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó
hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau:
- Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng
- Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng
- Các bản sao vừa được khuếch đại không kết hợp với mồi mà bắt cặp với
nhau,… (Phan Cự Nhân, 2001).
2.3.5.7 Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng
Hiện nay, có rất nhiều kiểu thiết bị và dụng cụ được sử dụng trong phân tích
PCR tùy thuộc vào từng lĩnh vực và mục đích nghiên cứu. Mỗi loại có những đặc điểm
khuếch đại riêng nên mỗi lần tiến hành thí nghiệm của một nghiên cứu cần được tiến
hành trên cùng một loại thiết bị của một hãng sản xuất nhất định. Ống nghiệm sử dụng
cho các phản ứng trong thí nghiệm phải cùng một loại vì đặc tính truyền nhiệt cũng
như độ tiếp xúc giữa các ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị có ảnh hưởng lớn đến
quá trình khuếch đại.
Nguyên lý hoạt động của một thiết bị khuếch đại DNA chỉ cần đáp ứng đủ
điều kiện: sự thay đổi phải thật nhanh và chính xác.

2.3.6 Phương pháp tách chiết RNA
Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme là ribonuclease
(RNase). Hơn nữa, các RNase lại có mặt khắp nơi (có rất nhiều trên đầu ngón tay của
người thao tác,…) có hoạt tính rất cao và rất bền với các tác nhân thường dùng để loại
bỏ enzyme ( việc xử lý nhiệt ở 900C trong một giờ không làm mất hoạt tính Rnase). Vì
những lý do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi phải thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm
bởi các Rnase từ môi trường: thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hóa chất
đều được khử trùng, tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay trần,…(Hồ Huỳnh Thùy
Dương, 2008).
Phương pháp tách chiết RNA toàn phần bao gồm các bước:
Bước 1: Mẫu tôm được nghiền trong dung dịch ly trích RNA nhằm phá vỡ
màng tế bào.
15