Nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh vibrio choleare trong nguồn nước sinh hoạt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trần Thị Thanh Quỳnh

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH
Vibrio cholerae TRONG NGUỒN NƢỚC SINH HOẠT

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trần Thị Thanh Quỳnh

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH Vibrio
cholerae TRONG NGUỒN NƢỚC SINH HOẠT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Tâm Thƣ
GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa

Hà Nội - 2018
ii

LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành đề tài nghiên cứu này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.
Nguyễn Thị Tâm Thƣ và GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn,
giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô giáo thuộc Khoa Sinh học, Trƣờng
Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô giáo thuộc Bộ môn Sinh lý
thực vật và Hóa sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời
gian học tập.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thủ trƣởng Viện Công nghệ mới,
các cán bộ ở các Phòng, Ban đặc biệt là các đồng chí thuộc Phòng Công nghệ sinh
học và và Phòng Công nghệ Hóa sinh những ngƣời đã tạo điều kiện thuận lợi và
giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành luận văn nghiên cứu này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những ngƣời đã quan
tâm, ủng hộ để tôi hoàn thành luận văn nghiên cứu này.
Luận văn nghiên cứu đƣợc thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài thuộc
chƣơng trình AN-QP Thành phố Hồ Chí Minh năm 2015: "Nghiên cứu chế tạo kit
phát hiện nhanh một số vi sinh vật gây bệnh đƣờng ruột trong nguồn nƣớc sinh
hoạt, ứng dụng cho bộ đội đóng quân trên đảo và lực lƣợng tàu ngầm".
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2018

Học viên

Trần Thị Thanh Quỳnh

iii


MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG .............................................................................. iii
BẢNG VIẾT TẮT ................................................................................................... v
MỞ ĐẦU .................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về Vibrio cholerae .................................................................. 3
1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm sinh học ................................................................ 3
1.1.2. Khả năng gây bệnh ............................................................................................ 4
1.1.3. Tình hình dịch bệnh tả ...................................................................................... 6
1.2. Các phƣơng pháp xác định Vibrio cholerae ........................................................ 8
1.2.1. Phƣơng pháp soi kính ........................................................................................ 9
1.2.2. Phƣơng pháp nuôi cấy phân lập ......................................................................... 9
1.2.3. Phƣơng pháp xác định nhóm huyết thanh ....................................................... 10
1.2.4. Phƣơng pháp PCR........................................................................................... 11
1.2.5. Phƣơng pháp lai khuẩn lạc với đầu dò DNA hoặc RNA ................................. 12
1.2.6. Phƣơng pháp lai huỳnh quang tại chỗ ............................................................. 12
1.2.7. Phƣơng pháp xét nghiệm kháng thể huỳnh quang trực tiếp - Đếm trực
tiếp.............................................................................................................................. 13
1.2.8. Phƣơng pháp xét nghiệm kháng thể huỳnh quang gián tiếp ............................ 13
1.2.9. Phƣơng pháp ELISA ........................................................................................ 14
1.2.10. Phƣơng pháp sắc ký miễn dịch ...................................................................... 14
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 19
2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu .................................................................... 19
2.2. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị ...................................................................... 19
2.2.1. Nguyên liệu ...................................................................................................... 19
2.2.2. Hóa chất ........................................................................................................... 19
i

2.2.3. Thiết bị ............................................................................................................. 19
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................. 20
2.3.1. Lấy mẫu để phân lập vi khuẩn ......................................................................... 20
2.3.2. Phân lập Vibrio cholerae ................................................................................. 20
2.3.3. Xác định trình tự gen 16S rARN của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc ............. 20
2.3.4. Xác định môi trƣờng dùng để tăng sinh tế bào vi khuẩn V. cholerae ............. 22
2.3.5. Đánh giá phản ứng giữa V. cholerae - kháng thể bằng phƣơng pháp
ELISA ........................................................................................................................ 22
2.3.6. Phƣơng pháp cố định kháng thể lên màng nitrocellulose ................................ 23
2.3.7. Phƣơng pháp cộng hợp vàng vào kháng thể .................................................... 23
2.3.8. Xác định nồng độ tối ƣu của kháng thể gắn lên màng nitrocellulose .............. 24
2.3.9. Phân tích mẫu bằng que thử ............................................................................ 24
2.3.10. Phƣơng pháp xác định ngƣỡng phát hiện của que thử ................................... 25
2.3.11. Phƣơng pháp xác định độ đặc hiệu của que thử ............................................ 25
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 26
3.1. Phân lập vi khuẩn V. cholerae.......................................................................... 26
3.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn V. cholerae từ một số nguồn ô nhiễm................... 26
3.1.2. Xác định trình tự gen 16S rARN của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc ............. 26
3.2. Xác định môi trƣờng dùng để tăng sinh tế bào vi khuẩn V. cholerae .................. 30
3.3. Nghiên cứu lựa chọn cặp kháng thể phù hợp bằng phƣơng pháp ELISA để
phát hiện vi khuẩn V. cholerae ............................................................................... 32
3.4. Chế tạo que thử phát hiện V. cholerae trong nguồn nƣớc sinh hoạt .................... 33
3.4.1. Cố định kháng thể lên màng nitrocellulose ..................................................... 33
3.4.2. Tạo dung dịch hạt vàng có kích thƣớc nano và cộng hợp vào kháng thể ........ 34
3.4.3. Tối ƣu nồng độ kháng thể gắn lên vạch kiểm chứng ....................................... 37
3.4.4. Tối ƣu nồng độ kháng thể gắn lên vạch thử nghiệm ....................................... 38
ii

3.4.5. Đánh giá một số chỉ tiêu kỹ thuật của que thử ................................................ 39
3.4.5.1. Ngưỡng và thời gian phát hiện .................................................................. 39
3.4.5.2. Đánh giá độ đặc hiệu của que thử ............................................................ 41
KẾT LUẬN .......................................................................................................... 44
HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 45

iii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Hình ảnh tế bào vi khuẩn Vibrio cholerae

3

Hình 1.2 Cấu tạo độc tố của Vibrio cholerae

6

Hình 1.3 Cơ chế gây bệnh của Vibrio cholerae

6

Hình 1.4 Vibrio cholerae trên các môi trƣờng chọn lọc

9

Hình 1.5 Cấu tạo que thử dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch

15

Hình 1.6 Bộ kit dùng để phát hiện nhanh E. coli O157 của Hãng DuPont

18

Hình 1.7 Quy trình sử dụng bộ kit phát hiện nhanh E. coli O157 của Hãng
DuPont

18

Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

22

Hình 3.1 Sự phát triển của vi khuẩn V. cholerae trên môi trƣờng thạch TCBS

26

Hình 3.2 Kết quả tách chiết DNA tổng số

27

Hình 3.3 Kết quả nhân bản gen 16S rRNA của vi khuẩn V. cholerae

28

Hình 3.4 Kết quả so sánh trình tự nucletide của gen 16S rRNA từ các mẫu vi
khuẩn phân lập đƣợc với trình tự nucleotide tƣơng ứng trên ngân
hàng gen thế giới (sử dụng phần mềm ClustalW)

28

Hình 3.5 Sự tăng sinh tế bào của Vibrio cholerae chuẩn (ATCC 9458) trong
các môi trƣờng khác nhau

31

Hình 3.6 Sự tăng sinh tế bào của Vibrio cholerae O1 trong các môi trƣờng
khác nhau

31

Hình 3.7 Sự tăng sinh tế bào của Vibrio cholerae HP trong các môi trƣờng
khác nhau

32

Hình 3.8 Hình ảnh ELISA đánh giá sự bắt cặp giữa Vibrio cholerae và
kháng thể đặc hiệu

33

Hình 3.9 Hình ảnh cố định kháng thể KT3 lên màng nitrocellulose

34

Hình 3.10 Quá trình tạo dung dịch hạt vàng có kích thƣớc nano

34

Hình 3.11 Hình ảnh hạt vàng soi dƣới kính hiển vi điện tử

35

Hình 3.12 Phản ứng giữa kháng thể cộng hợp vàng và vạch kiểm chứng trên
màng nitrocellulose

37

Hình 3.13 Kết quả tối ƣu lƣợng kháng thể cố định tại vị trí vạch kiểm chứng
iii

38


Hình 3.14 Kết quả tối ƣu lƣợng kháng thể cố định tại vị trí vạch thử nghiệm

39

Hình 3.15 Kết quả đánh giá ngƣỡng phát hiện của que thử loại 1

40

Hình 3.16 Kết quả đánh giá ngƣỡng phát hiện của que thử loại 2

40

Hình 3.17 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của que thử phát hiện V. cholerae

42

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Số trƣờng hợp mắc bệnh và tử vong do dịch bệnh tả theo công bố
của WHO năm 2011

7

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá ngƣỡng phát hiện của que thử loại 1 đối với 03
chủng V. cholerae

41

Bảng 3.2 Độ đặc hiệu của que thử phát hiện V. cholerae

iv

42


BẢNG VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

BSA

Bovine serum albumin

Abumin huyết thanh bò

cAMP

Cyclic adenosine monophosphate

AMP vòng

Cystic fibrosis transmembrane

Nhân tố điều hòa vận chuyển

regulator

màng xơ nang

CFU

Colony forming unit

Khuẩn lạc

DNA

Deoxyribonucleic acid

ADN

ELISA

Enzyme linked immunosorbent assay

ELISA

HRP

Horseradish peroxidase

Peroxidase củ cải ngựa

Anti-Vibrio Cholerae antibody

Kháng thể đơn dòng kháng

(ABIN1825015)

V. cholerae

Anti-Vibrio Cholerae antibody

Kháng thể đơn dòng kháng

(ABIN1825014)

V. cholerae

Goat anti-mouse IgG (HRP)

Kháng thể đa dòng kháng IgG

(Ab6789)

của chuột có gắn HRP

PBS

Phosphate buffered saline

Đệm photphat

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

ARN ribosome

SDS

Sodium dodecyl sulfate

Natri laureth sunfat

TMB

3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine

Cơ chất TMB

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế thế giới

CFTR

KT1
KT2
KT3

v


MỞ ĐẦU
Vi khuẩn tả Vibrio cholerae đƣợc Robert Koch tìm ra năm 1884 ở Đức
[27]. Thế kỷ XIX đã xảy ra 6 vụ dịch lớn ở châu Á, Âu, Phi, Mỹ làm hàng triệu
ngƣời tử vong. Ở Việt Nam, bệnh tả cũng đã xuất hiện từ năm 1850 và bùng phát
thành dịch ở nhiều tỉnh, thành trong nhiều năm khiến hàng trăm ngƣời tử vong.
Năm 2007 dịch lại bùng phát ở 19 tỉnh/thành phố phía Bắc và có hàng ngàn trƣờng
hợp mắc bệnh. Ngày nay, vi khuẩn này cũng là một trong những tác nhân chính gây
ngộ độc thực phẩm và nƣớc uống. Hàng năm, trên thế giới ƣớc tính khoảng 3 - 5
triệu trƣờng hợp mắc bệnh và 100.000 - 120.000 trƣờng hợp tử vong do bệnh tả
[51]. Thời gian ủ bệnh ngắn khoảng từ 2 giờ đến 5 ngày, nhiều khả năng bùng phát

dịch bệnh.
Bệnh tả dễ truyền nhiễm qua phân và chất nôn của ngƣời bệnh hoặc từ các ổ
chứa thiên nhiên nhƣ một số động vật thủy sinh, nhất là các loài nhuyễn thể (cá,
cua, trai sò, ngao...) ở vùng cửa sông và ven biển. Vi khuẩn tả gây tiêu chảy cấp
tính, nếu không phát hiện và chữa trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong. Vì vậy, việc
phát hiện sự có mặt của vi khuẩn tả V. cholerae trong nguồn nƣớc và thực phẩm là
hết sức cần thiết.
Hiện nay ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới có rất nhiều phƣơng pháp phát
hiện vi khuẩn tả nhƣ: soi tƣơi, phân lập vi khuẩn, xét nghiệm huyết thanh học, PCR,
ELISA, sắc ký miễn dịch...[4, 5, 12, 21, 40]. Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu nhƣợc
điểm riêng. Trong đó phƣơng pháp PCR là phƣơng pháp đƣợc áp dụng khá phổ
biến, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hiện nay trên thị trƣờng đã có các bộ kit phát
hiện vi khuẩn tả V. cholerae bằng phƣơng pháp PCR nhƣ bộ kit của hãng:
VeTeKTM, Genesig. Tuy nhiên, phƣơng pháp này đòi hỏi máy móc, trang thiết bị hiện
đại và kỹ thuật viên có trình độ chuyên môn cao, khó áp dụng ngoài hiện trƣờng. Mặt
khác, tình trạng ngộ độc thực phẩm đang có nguy cơ xảy ra rất cao và ảnh hƣởng
nghiêm trọng đến sức khỏe của con ngƣời do thực phẩm ô nhiễm ngày càng nhiều và
việc kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm còn chƣa thực sự chặt chẽ. Chính vì vậy,
những phƣơng pháp đơn giản, có thể áp dụng trực tiếp ngay tại hiện trƣờng hay các

1


bếp ăn để phát hiện các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm nói chung và vi khuẩn tả nói
riêng là rất cần thiết. Tuy nhiên, các phƣơng pháp này vẫn phải đảm bảo độ nhạy và
độ đặc hiệu cao. Do đó, sắc ký miễn dịch là phƣơng pháp phù hợp.
Một số công trình nghiên cứu đã chế tạo thành công que thử phát hiện V.
cholerae trong các mẫu nƣớc dựa trên phƣơng pháp sắc ký miễn dịch. Que thử cho
phép phát hiện vi khuẩn ở nồng độ 106 - 107 CFU/ml với độ nhạy và độ đặc hiệu cao
[12, 21]. Tuy nhiên, ở Việt Nam chƣa có công trình nghiên cứu nào về việc tạo que

thử phát hiện nhanh vi khuẩn tả V. cholerae bằng phƣơng pháp sắc ký miễn dịch,
đây là lý do để chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài này nhằm phát hiện nhanh vi
khuẩn tả V. cholerae trong nguồn nƣớc sinh hoạt.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về Vibrio cholerae
1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm sinh học
Vị trí phân loại
Vibrio cholerae thuộc:
Giới (regnum):

Bacteria

Ngành (phylum):

Proteobacteria

Lớp (class):

Gamma Proteobacteria

Bộ (ordo):

Vibrionales

Họ (familia):

Vibrionaceae

Chi (genus)

Vibrio

Loài (species):

Vibrio cholerae

Hình 1.1: Hình ảnh tế bào vi
khuẩn Vibrio cholerae [57]

Vibrio cholerae còn gọi là vi khuẩn tả hay phẩy khuẩn tả, là vi khuẩn gram
âm, có hình que hơi cong nhƣ dấu phẩy (Hình 1.1), có kích thƣớc khoảng 0,3 x 3
µm, di chuyển nhanh nhờ roi ở đầu, không có vỏ và không sinh bào tử.
Vibrio cholerae có khả năng chuyển hóa hô hấp và lên men, các xét nghiệm
sinh hóa và các nghiên cứu tƣơng đồng DNA về V. cholerae đã đƣợc xác định rõ
[8]. Vi khuẩn này có phản ứng oxidase dƣơng tính, làm giảm nitrat, lên men không
sinh hơi glucose, saccharose, D-mannitol, maltose, không lên men arabinose, phản
ứng indol dƣơng tính... [11].
Vi khuẩn tả rất hiếu khí, sự phát triển của chúng đƣợc kích thích khi bổ sung
NaCl 1%. Tuy nhiên, một sự khác biệt quan trọng của V. cholerae so với các vi
khuẩn thuộc cùng một chi là khả năng sinh trƣởng trong môi trƣờng dinh dƣỡng
không thêm NaCl [56]. Vì vậy, vi khuẩn tả mọc đƣợc dễ dàng trong môi trƣờng
nuôi cấy bình thƣờng ở phòng thí nghiệm, không đòi hỏi các yếu tố tăng trƣởng đặc
biệt, ƣa pH từ 8 - 9,5, sống ở nhiệt độ 16 - 42 oC, nhiệt độ tối ƣu là 37 oC. Thông
thƣờng các môi trƣờng nhƣ pepton pH 8,5, thạch TCBS (thiosulfate - Citrate - Bile
salt) pH 8,6 hay TTGA (Taurocholate - Tellurite - Gelatin Agar) pH 8,5 đƣợc dùng
để nuôi cấy phân lập vi khuẩn tả [15].

3


Vi khuẩn tả chết ở nhiệt độ 100 oC hoặc 80 oC trong 5 phút và dễ bị tiêu diệt
bởi các chất tẩy uế nhƣ cloramin, cresyl, vôi cục..., chết rất nhanh trong môi trƣờng
acid, đặc biệt nhạy cảm với sự khô hanh và ánh nắng mặt trời cũng làm vi khuẩn dễ
chết, chỉ tồn tại 10 phút ở 55 oC. Tuy nhiên có thể sống 4-7 ngày trên rau trái tƣơi để
nơi mát và ẩm, trong nƣớc đá, nƣớc biển, nƣớc ao hồ vi khuẩn sống đƣợc vài ngày.
V. cholerae có khoảng 200 nhóm huyết thanh và đƣợc chia thành V.
cholerae-O1, V. cholerae non-O1 (dựa trên sự ngƣng kết hay không ngƣng kết giữa
kháng thể và kháng nguyên nhóm O1) [36].
Vibrio cholerae O1: thuộc nhóm huyết thanh O1 có khả năng sinh độc tố
ruột và gây ra bệnh dịch tả. V. cholerae O1 bao gồm type sinh học cổ điển và type
sinh học El Tor. Các sinh type này ngƣng kết với kháng huyết thanh nhóm O1.
Trong nhóm này có 3 type huyết thanh là Ogawa, Inaba và Hikojima [36].
Vibrio cholerae non-O1/ non-O139: bao gồm các nhóm huyết thanh từ O2 O138 không có khả năng gây dịch tả. Có tính chất sinh hóa tƣơng tự nhƣ V.
cholerae O1 nhƣng không ngƣng kết với kháng huyết thanh O1. Các nhiễm trùng
do nhóm này thƣờng liên quan đến viêm ruột cấp nhƣng cơ chế gây bệnh vẫn chƣa
đƣợc giải thích [36].
Vibrio cholerae O139: là tác nhân gây ra bệnh dịch tả đƣợc phát hiện lần đầu
tiên vào năm 1992 tại Ấn Độ và Bangladesh [36].
1.1.2. Khả năng gây bệnh
Trong điều kiện tự nhiên bình thƣờng, V. cholerae chỉ gây bệnh tả cho ngƣời
và là một trong số tác nhân gây bệnh phổ biến. Bệnh tả là một bệnh nhiễm trùng,
nhiễm độc cấp tính, lây lan rất nhanh, gây bùng phát các trận dịch tiêu chảy. Vi
khuẩn tả dễ truyền nhiễm qua phân và chất nôn của ngƣời bệnh hoặc từ các ổ chứa
thiên nhiên nhƣ một số động vật thủy sinh, nhất là các loài nhuyễn thể (cá, cua, trai
sò, ngao...) ở vùng cửa sông và ven biển. Thời gian ủ bệnh ngắn từ 2 đến 5 ngày.
Dấu hiệu đặc trƣng của thời kỳ toàn phát của bệnh là tiêu chảy và nôn, phân lỏng và

trắng nhƣ nƣớc vo gạo. Bệnh nhân mất nƣớc, mất muối rất nhanh, có thể mất 1 lít
nƣớc trong 1 giờ do đó chỉ vài giờ là xuất hiện hội chứng mất nƣớc cấp tính làm cho

4


toàn thân sút đi rất nhanh và nguy hiểm. Nếu không đƣợc điều trị, tỷ lệ chết rất cao
(50% đến 60%). Bệnh tả có nhiều biểu hiện lâm sàng rất khác nhau từ thể nhẹ dễ bỏ
qua cho đến thể nặng với hội chứng tả điển hình [52].
Các vi khuẩn tả xâm nhập cơ thể bằng đƣờng tiêu hóa, chúng phải vƣợt qua
hàng rào dịch vị của dạ dày có pH axit để xuống ruột non là nơi có pH thích hợp
cho sự phát triển của vi khuẩn. Độ axit bình thƣờng của dịch vị là một cản trở rất
lớn đối với quá trình sinh bệnh của vi khuẩn tả. Vào đến ruột non, V. cholerae bám
dính vào tế bào niêm mạc ruột nhờ có các yếu tố bám dính nhƣ kháng nguyên TCP,
kháng nguyên ngƣng kết hồng cầu nhạy cảm với mannose..., vi khuẩn nhân lên và
tiết ra độc tố ruột. Các vi khuẩn không xâm nhập vào trong các tế bào niêm mạc
ruột. Độc tố ruột của vi khuẩn tả (Cholera toxin viết tắt là CTX, Ctx hoặc CT) (Hình
1.2) là một protein gồm 2 tiểu phần A (Active_28 kDa) và B (Binding_11 kDa) có
chức năng riêng biệt, có cấu trúc tƣơng tự nhƣ ngoại độc tố chịu nhiệt của E. coli
gây tiêu chảy, chỉ bị phá vỡ cấu trúc khi đun nóng ở 121oC trong 30 phút [34]. Tiểu
phần A có hai tiểu đơn vị A1 và A2, tiểu phần B có 5 tiểu đơn vị B1, B2, B3, B4 và
B5. Tiểu phần B có chức năng gắn độc tố ruột vào thụ thể ganglioside GM1 ở trên
màng của tế bào niêm mạc ruột, còn tiểu phần A mà chủ yếu là A1 xâm nhập vào
bên trong tế bào hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm tăng nồng độ AMP vòng
nội bào làm cho tế bào niêm mạc ruột giảm hấp thu Na+, tăng tiết nƣớc và Cl-, gây
ra ỉa chảy cấp tính (Hình 1.3). Nếu không đƣợc điều trị tích cực bệnh nhân sẽ chết
vì kiệt nƣớc và mất các chất điện giải. Độc tố tả còn gây nên ức chế miễn dịch tế
bào bằng cách tác động trực tiếp lên macrophage và tế bào lympho T [58].

5

Hình 1.2: Cấu tạo độc tố của Vibrio cholerae [44]

Hình 1.3: Cơ chế gây bệnh của Vibrio cholerae [58]

1.1.3. Tình hình dịch bệnh tả
Vi khuẩn tả V. cholerae đƣợc Robert Koch tìm ra năm 1884 ở Đức [27]. Thế
kỷ XIX đã xảy ra 6 vụ dịch lớn ở châu Á, Âu, Phi, Mỹ làm hàng triệu ngƣời tử
vong. Năm 2011, các trƣờng hợp mắc bệnh tả đã đƣợc công bố từ tất cả các nƣớc
trên thế giới. Tổng cộng có 58 quốc gia xuất hiện dịch bệnh tả với tổng số tích luỹ
589.854 trƣờng hợp mắc bệnh trong đó 7.816 ngƣời tử vong (tỷ lệ tử vong là 1,3%),
số trƣờng hợp mắc bệnh tăng 85% so với năm trƣớc. Châu Phi là một trong số

6


những khu có số ca tử vong do bệnh tả chiếm tỷ lệ cao nhất (Bảng 1.1). Sự gia tăng
nhanh chóng số trƣờng hợp mắc bệnh trên toàn cầu so với năm 2010 là kết quả của
một đợt dịch lớn, bắt đầu vào tháng 10 năm 2010 tại Haiti (một quốc gia thuộc
Châu Mỹ) và vẫn đang tiếp diễn [51].
Bảng 1.1. Số trƣờng hợp mắc bệnh và tử vong do dịch bệnh tả
theo công bố của WHO năm 2011 [51]

TT

Khu vực

1

Châu Phi

2

Châu Á

3

Tổng số trƣờng hợp
mắc bệnh và tử
vong
188.678

Số ngƣời
nhập cƣ

Số ngƣời
chết

Tỷ lệ tử
vong (%)

0

4.183

2,22

38.298

134

426

1,11

Châu Âu

71

38

0

0

4

Châu Mỹ

361.266

146

3.205

0,89

5

Châu Úc

1.541

6

2

0,13

589.854

324

7.816

1,33

Tổng

Gần đây nhất, theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO), vụ dịch tả với
quy mô lớn nhất đã xảy ra ở Yemen (một quốc gia nằm ở Tây Á) vào tháng 10 năm
2016. Sự bùng phát dịch tả chết ngƣời ngày là hậu quả trực tiếp của hai năm suy
thoái nặng nề do chiến tranh, khiến 14,5 triệu ngƣời rơi vào tình trạng thiếu nƣớc
sạch, chất lƣợng vệ sinh kém và hệ thống y tế giảm sút làm tăng khả năng lây lan
của bệnh. Tính đến ngày 14 tháng 8 năm 2017, tổng số ca mắc bệnh tả ở Yemen
trong năm đạt tới nửa triệu và gần 2.000 ngƣời chết kể từ khi dịch bùng phát lan
rộng [55]. Theo thống kê của trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa bệnh năm 2016,
ƣớc tính trên thế giới mỗi năm có khoảng 3 - 5 triệu trƣờng hợp mắc bệnh và
100.000 - 120.000 trƣờng hợp tử vong do dịch/ bệnh tả. Điều này cho thấy rằng

dịch tả đã và đang là mối đe dọa nguy hiểm đối với sức khỏe con ngƣời [59].
Ở Việt Nam, bệnh tả lần đầu tiên xuất hiện vào năm 1850 và đã khiến 2 triệu
trƣờng hợp mắc bệnh. Khoảng 28 năm từ năm 1910, số bệnh nhân mắc bệnh tả mỗi
năm thông báo dao động từ 5.000 - 30.000 ngƣời. Bệnh tả El Tor đã bắt đầu xuất
hiện ở miền Nam năm 1964 với 20.009 ngƣời mắc bệnh bao gồm 821 ngƣời tử

7


vong. Từ đó đến năm 1975, ở miền Trung và miền Nam, các trƣờng hợp mắc bệnh
tả mỗi năm đều thƣờng xuyên đƣợc ghi nhận với hàng trăm bệnh nhân bị bệnh tả
đƣợc thông báo. Cụ thể, vào năm 1994, có 1.459 ngƣời đã mắc bệnh tả ở Tây
Nguyên. Sau năm 1975, bệnh tả đã lây lan ra miền Bắc do việc thông thƣơng giữa
hai miền Nam-Bắc, và gây ra những vụ dịch tả rải rác ở Hải Phòng. Từ năm 1993 2004, dịch tả đã xảy ra ở cả ba miền Bắc, Trung, Nam với khoảng vài nghìn ca bệnh
đƣợc báo cáo hàng năm. Tuy nhiên, bệnh không bùng phát thành dịch lớn, có rất ít
trƣờng hợp tử vong. Sau đó vào năm 2005-2006, cả nƣớc không ghi nhận trƣờng
hợp nào mắc bệnh tả. Đến cuối 2007, dịch tả lại bùng phát ở 19 tỉnh/thành phố phía
Bắc, khiến hàng ngàn trƣờng hợp mắc bệnh [54]. Những năm gần đây, số ca mắc
bệnh tả đã giảm xuống đáng kể và chỉ xuất hiện rải rác ở một số tỉnh, thành. Tuy
nhiên, dịch tả là một trong số những bệnh khó kiểm soát và có khả năng bùng phát
bất cứ lúc nào. Vì vậy, việc cung cấp nƣớc sạch, đảm bảo vệ sinh môi trƣờng và
tăng cƣờng kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm, đặc biệt là tại các cơ sở chế biến
thực phẩm, chợ, nhà hàng, bếp ăn tập thể,... là những biện pháp phòng chống dịch
rất cần thiết.
1.2. Các phƣơng pháp xác định Vibrio cholerae
Mặc dù các phƣơng pháp phát hiện V. cholerae đã đƣợc phát triển từ nhiều
thập kỷ trƣớc, nhƣng các phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống vẫn đƣợc tiếp tục cải
thiện để phát hiện V. cholerae từ các mẫu môi trƣờng với kết quả đáng tin cậy hơn.
Quá trình này liên quan trực tiếp đến việc phân lập mẫu trên môi trƣờng nhƣ TCBS,
TTGA hoặc CHROMAgar hoặc làm giàu mẫu trƣớc bằng pepton kiềm rồi mới phân

lập trên một hoặc kết hợp cả 3 môi trƣờng thạch trên. Đối với mẫu môi trƣờng,
bƣớc làm giàu trƣớc thƣờng đƣợc sử dụng để làm tăng khả năng phát hiện. Sau khi
phân lập V. cholerae trên các môi trƣờng chọn lọc, có thể tiếp tục kiểm tra bằng các
xét nghiệm hóa sinh [26] hoặc sử dụng phƣơng pháp PCR [17, 26, 35]. Sự phân lập
có thể chia thành các nhóm O1, O139 hoặc non-O1/non-139 bằng phản ứng ngƣng
kết với kháng huyết thanh của O1 và O139 hoặc PCR với mồi đặc hiệu cho các
vùng mã hóa của O1 và O139.

8


1.2.1. Phương pháp soi kính
Mẫu đƣợc hòa vào nƣớc muối sinh lý và 1 giọt mẫu đƣợc nhỏ lên lam kính.
Tiêu bản đƣợc soi trực tiếp trên kính hiển vi thấy vi khuẩn tả di động rất nhanh theo
những đƣờng thẳng từ đầu đến cuối vi trƣờng hoặc 1 giọt mẫu đƣợc nhỏ lên lam
kính với 1 giọt kháng huyết thanh tả. Nếu là vi khuẩn tả thì vi khuẩn sẽ bị bất hoạt,
không di động nữa. Soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen, vi khuẩn tả di động nhƣ
sao đổi ngôi [11]. Phƣơng pháp soi kính cho kết quả nhanh tuy nhiên độ chính xác
không cao.
1.2.2. Phương pháp nuôi cấy phân lập
Mẫu sau khi đƣợc chuyển đến phòng thí nghiệm đƣợc làm giàu trong môi
trƣờng pepton kiềm rồi cấy trải trên môi trƣờng chọn lọc TCBS, TTGA hay
CHROMagar. V. cholerae xuất hiện dƣới dạng các khuẩn lạc trong, phẳng và có
màu vàng trên đĩa thạch TCBS; đối với môi trƣờng TTGA các khuẩn lạc không màu
và thƣờng có màu đen đặc trƣng ở trung tâm sau hai ngày tăng trƣởng, đƣợc bao
quanh bởi một quầng sáng xuất hiện do quá trình thủy phân gelatin; các khuẩn lạc
có màu lam ngọc trên CHROMagar (Hình 1.4) [15].

a

b

c

Hình 1.4: Vibrio cholerae trên các môi trƣờng chọn lọc [15]
a. Vibrio cholerae trên môi trƣờng TCBS
b. Vibrio cholerae trên môi trƣờng TTGA
c. Vibrio cholerae trên môi trƣờng CHROMagar

Kết quả xác định V. cholerae sẽ cho độ chính xác cao nếu sử dụng kết hợp cả
3 loại môi trƣờng. Đây là phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng trong xét nghiệm đầu

9


tiên và làm cơ sở cho các xét nghiệm tiếp theo. Phƣơng pháp này đòi hỏi thời gian
tiến hành xét nghiệm lên đến vài ngày thậm chí vài tuần.
1.2.3. Phương pháp xác định nhóm huyết thanh
Hơn 200 nhóm huyết thanh của V. cholerae đã đƣợc xác định dựa trên tính
chất kháng nguyên của các polysaccharide trên bề mặt tế bào vi khuẩn, nhóm huyết
thanh O1 và O139 có liên quan đến dịch bệnh dịch tả, trong khi các nhóm huyết
thanh non-O1/non-O139 đƣợc biết là chỉ gây ra các đợt dịch lẻ tẻ. Tuy nhiên, nhóm
huyết thanh O37 đã gây ra cho một vụ dịch tả ở Tiệp Khắc và Sudan. Các nhóm
huyết thanh còn lại thƣờng đƣợc gọi chung là non-O1/non-O139, chiếm ƣu thế hơn
các nhóm còn lại khi phân lập V. cholerae từ môi trƣờng nƣớc [42]. Mặc dù báo cáo
về các xét nghiệm lâm sàng chủ yếu là O1 và O139 nhƣng gen mã hóa cho độc tố
cholera có thể đƣợc tìm thấy ở các nhóm non-O1/non-O139 từ môi trƣờng nƣớc
trên toàn cầu cũng nhƣ các loài Vibrio khác [13]. Những phƣơng pháp xác định V.
cholerae dựa trên nhóm huyết thanh đã đƣợc công bố chủ yếu liên quan đến O1 và
O139. Nếu muốn xác định nhóm huyết thanh non-O1 hoặc non-O139 thƣờng phải

gửi đến Trung tâm nghiên cứu chuyên sâu vì kháng huyết thanh đối với những
nhóm này không có sản phẩm thƣơng mại. Phƣơng pháp xác định nhóm huyết thanh
khá đơn giản và nhanh tuy nhiên cần phải sử dụng kính hiển vi để có thể quan sát rõ
phản ứng ngƣng kết.
Các phƣơng pháp nuôi truyền thống không có hiệu quả khi các tế bào vi
khuẩn rơi vào trạng thái có thể sinh sản nhƣng không thể nuôi cấy. Do đó, phát hiện
trực tiếp trở nên cực kỳ quan trọng. Mặc dù, các phƣơng pháp truyền thống đƣợc
dùng khá phổ biến để phân lập và xác định V. cholerae nhƣng cũng gặp khó khăn vì
những phƣơng pháp này dựa vào nuôi cấy tế bào vi khuẩn. Những khó khăn trong
việc phát hiện V. cholerae phát sinh từ nhiều yếu tố nhƣ: mật độ tế bào vi khuẩn
thấp, cạnh tranh giữa các đối tƣợng cụ thể hay trạng thái tế bào. Việc phát hiện ra
kháng thể đơn dòng vào những năm 1980 và sau đó, sự phát triển của một kháng thể
đơn dòng kháng lại V. cholerae O1 thúc đẩy sự phát triển của các phƣơng pháp phát
hiện trực tiếp cho các loài vi khuẩn này [25, 53]. Sử dụng các phƣơng pháp miễn

10


dịch liên quan đến việc không có khả năng nuôi cấy của V. cholerae trong các mẫu
môi trƣờng đã đƣợc áp dụng trong suốt thời kỳ dịch bệnh ở Bangladesh [28, 41].
Ngoài ra, các phƣơng pháp PCR cũng có thể đƣợc áp dụng để phát hiện trực tiếp V.
cholerae trong mẫu.
1.2.4. Phương pháp PCR
Gần đây, phƣơng pháp PCR, Multiplex-PCR và Real- time PCR đã sử dụng
phổ biến để xác định các chủng V. cholerae. Phƣơng pháp này đƣợc dựa trên các
đoạn DNA đặc hiệu trong hệ gen của vi khuẩn. Sự gia tăng của các trình tự gen
cung cấp một hệ thống dữ liệu có sẵn đã cho phép phát triển các chƣơng trình máy
tính phân tích các biến thể của các chủng, gen và các yếu tố di truyền di động, bao
gồm các vùng gen gây bệnh. Đây là phƣơng pháp có độ nhạy cao và cho kết quả
chính xác, là cơ sở để xác định chủng loại vi khuẩn và đã đƣợc áp dụng trong nhiều

công trình nghiên cứu trên thế giới [17, 22, 26, 30, 40, 44]. Ở Việt Nam, năm 2004,
Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng sự [1] đã nghiên cứu thành công kit phát hiện một
số vi khuẩn gây bệnh nhƣ bệnh than, tả, lỵ, thƣơng hàn từ nƣớc và không khí bằng
phƣơng pháp PCR. Một nghiên cứu khác cũng đã đã ứng dụng kỹ thuật sinh học
phân tử trong việc xác định typ vi khuẩn V. cholerae đƣợc phân lập, đồng thời đã
tạo ra bộ kit phát hiện V. cholerae mang gen gây độc bằng chuỗi phản ứng PCR. Bộ
kit đƣợc sản xuất trên cơ sở ứng dụng kỹ thuật PCR khuếch đại gen mã hóa độc tố
enterotoxin đặc hiệu với vi khuẩn tả. Kết quả nhận đƣợc cho thấy có thể phát hiện
nhanh vi khuẩn tả sau 12 giờ với độ nhạy > 90% và độ đặc hiệu 95% [4, 5]. Năm
2007, nhóm nghiên cứu của Trần Linh Thƣớc và cộng sự [6] thuộc Trƣờng Đại học
Khoa học Thành phố Hồ Chí Minh đã chế tạo thành công 12 quy trình và bộ kit
PCR xét nghiệm nhanh 12 vi khuẩn gây ngộ độc, gây bệnh qua thực phẩm (gồm có
E. coli, E. coli O157:H7, Salmonella spp, Shigella spp, Vibrio cholerae, V.
parahaemo-lyticus, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, C. perfringens,
Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp). Bƣớc đầu bộ kit này
đã đƣợc thử nghiệm kiểm tra xác định nguyên nhân một số vụ ngộ độc thực phẩm
tại TP.HCM, kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm trên địa bàn TP.HCM và Hà Nội

11


(cho kết quả kịp thời và khá chính xác). Đặc biệt, bộ kit cũng đã đƣợc đƣa vào sử
dụng tại một số công ty chế biến thủy sản ở TP.HCM, Bà Rịa - Vũng Tàu (các bộ
kit đã đƣợc ứng dụng là bộ kit xét nghiệm E. coli, Staphylococcus aureus,
Salmonella spp, Vibrio cholerae) [6]. Hiện nay trên thị trƣờng đã có các bộ kit phát
hiện vi khuẩn tả V. cholerae bằng phƣơng pháp PCR nhƣ bộ kít của hãng: Qiagen,
VeTeKTM, Genesig. Tuy nhiên, phƣơng pháp này đòi hỏi máy móc, trang thiết bị
hiện đại và trình độ thao tác của kỹ thuật viên.
1.2.5. Phương pháp lai khuẩn lạc với đầu dò DNA hoặc RNA
Phƣơng pháp lai khuẩn lạc đƣợc sử dụng để phát hiện V. cholerae và liên

quan chặt chẽ đến V. mimicus. Mặt khác, phƣơng pháp này chỉ nhắm mục tiêu đến
các chủng gây bệnh của V. cholerae. Sự hiện diện của gen gây độc ctxA đƣợc xác
nhận bằng cách lai bằng cách sử dụng đầu dò đặc hiệu cho ctxA, có thể có một số
phản ứng chéo của đầu dò với độc tố chịu nhiệt (LT) của E. coli [19]. Phƣơng pháp
thƣờng ít đƣợc áp dụng.
1.2.6. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence In Situ
Hybridization_ FISH)
Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) cho phép phát hiện trực tiếp axit nucleic đặc
hiệu của V. cholerae bằng cách sử dụng kính hiển vi, cung cấp một phƣơng pháp
phân tử thay thế phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống và phƣơng pháp miễn dịch.
Phƣơng pháp này định lƣợng trực tiếp tế bào vi khuẩn mà không cần phải làm giàu
và nuôi cấy, có thể mang lại những ƣớc tính chính xác và nhanh chóng về mật độ
đặc trƣng của vi khuẩn. Lại huỳnh quang tại chỗ sử dụng một đầu dò
oligonucleotide có gắn huỳnh quang đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quét huỳnh
quang hoặc kính hiển vi quét đồng vị. Đây là phƣơng pháp đáng tin cậy để ƣớc tính
chính xác các tế bào V. cholerae trong môi trƣờng vì nó cho phép xác định cả số
lƣợng cả tế bào V. cholerae nuôi cấy và không nuôi cấy đƣợc. Tuy nhiên phƣơng
pháp này khá phức tạp và mất nhiều thời gian [29].

12


1.2.7. Phương pháp xét nghiệm kháng thể huỳnh quang trực tiếp - Đếm trực tiếp
(Direct Fluorescent Antibody – Direct Viable Count _ DFA-DVC)
Phƣơng pháp xét nghiệm kháng thể huỳnh quang trực tiếp để phát hiện
nhanh chóng nhóm V. cholerae O1 và O139 rất hiệu quả. Cùng với phƣơng pháp
đếm trực tiếp [33], nó có thể phân biệt đƣợc các tế bào có khả năng nuôi cấy và
những tế bào sống sót nhƣng không thể nuôi cấy [16].
Đây là một phƣơng pháp gồm hai bƣớc chính, đầu tiên các tế bào của vi
khuẩn đƣợc ủ với sự có mặt axit nalidixic, sau đó các tế bào đáp ứng với cơ chất sẽ

trở nên lớn và kéo dài hơn [33]. Tiếp theo, một phần của hỗn hợp này đƣợc làm khô
bằng không khí trên lam kính và nhuộm với kháng thể gắn huỳnh quang kháng yếu
tố 'A' của lipopolysaccharide của V. cholerae O1 phản ứng với cả hai nhóm huyết
thanh, Ogawa và Inaba [18, 23], cũng có các kháng thể chống lại V. cholerae O139
[24]. V. cholerae O1 và O139 DVC-DFA dƣơng tính có thể đƣợc xác nhận bằng
PCR [9]. DFA-DVC là một phƣơng pháp xác định sự có mặt của V. cholerae nhanh
chóng trong vòng 8 giờ. Các bộ xét nghiệm DFA của V. cholerae O1 (Cholera
DFA) và O139 (Bengal DFA) đã có sẵn thƣơng mại (New Horizon Diagnostics,
Columbia, MD).
1.2.8. Phương pháp xét nghiệm kháng thể huỳnh quang gián tiếp (InDirect
Fluorescent Antibody_IFA)
Phƣơng pháp xét nghiệm kháng thể huỳnh quang gián tiếp để phát hiện V.
cholerae nhóm O1 trong các mẫu môi trƣờng nƣớc [47]. Kháng huyết thanh đặc
hiệu cho kháng nguyên O1 đƣợc sản xuất ở thỏ đƣợc, sử dụng kháng thể kháng từ
dê kháng thỏ cộng hợp fluoresceinisothiocyanate (FITC) và albumin huyết thanh bò
cộng hợp rhodamine isothiocyante (RITC) làm chất nhuộm nền. Phƣơng pháp này
rất hữu ích cho việc phát hiện các sinh vật trong các mẫu mà phƣơng pháp nuôi cấy
cho kết quả âm tính [10, 28] và đƣợc áp dụng để tạo bộ kit xét nghiệm kháng thể
huỳnh quang cho V. cholerae O1 bởi Hasan và cộng sự [23].

13


1.2.9. Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
ELISA là kỹ thuật phân tích sử dụng enzyme liên kết với kháng thể để nhận
diện và liên kết kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn. Kháng thể đặc hiệu với kháng
nguyên đƣợc gắn vào đáy bản nhựa 96 giếng, chất cần phát hiện nằm trong mẫu thử
đƣợc trộn lẫn cùng chất chuẩn có liên kết enzyme. Khi cho hỗn hợp vào các giếng
trên đĩa, giếng nào có chất cần phát hiện trong mẫu sẽ cạnh tranh với chất chuẩn
làm cho giếng đó sau khi bắt màu sẽ nhạt hơn. So kết quả với giếng chuẩn chỉ có

chất chuẩn sẽ biết đƣợc lƣợng chất cần phát hiện trong mẫu thử là bao nhiêu.
ELISA đƣợc sử dụng nhiều trong chẩn đoán Y học, VSV học. Phƣơng pháp ELISA
có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cần phải thao tác trong
phòng thí nghiệm, chi phí hoá chất xét nghiệm đắt và đòi hỏi ngƣời xét nghiệm phải
có trình độ chuyên môn cao.
1.2.10. Phương pháp sắc kí miễn dịch
Hiện nay, các test dựa trên phƣơng pháp sắc ký miễn dịch
(Immunochoromatography test hay lateral flow test strip) đã đƣợc ứng dụng rộng
rãi để phát hiện nhanh và khá chính xác các tác nhân sinh học ngay tại hiện trƣờng,
cụ thể là vi khuẩn, virus, các bào tử vi khuẩn... [32, 45, 47, 50]. Đây cũng là dạng
test đƣợc sử dụng phổ biến trong nhiều lĩnh vực nhƣ chẩn đoán bệnh trong Y học,
phát hiện các chất gây nghiện, dấu vết trong khoa học hình sự, phát hiện chất độc
sinh học...[14, 38, 43].
Nguyên lý của phản ứng sắc ký miễn dịch là phản ứng đặc hiệu giữa kháng
nguyên và kháng thể của nó. Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể phụ thuộc
vào cấu trúc bề mặt của kháng nguyên và kháng thể. Sự kết hợp này xảy ra giữa một
phần rất giới hạn giữa phân tử kháng nguyên (nhóm quyết định) và một phần rất
giới hạn của phân tử kháng thể (trung tâm hoạt động). Phân tử kháng thể thƣờng
hóa trị hai nghĩa là cùng một lúc có thể kết hợp với hai phân tử kháng nguyên. Còn
kháng nguyên đa hóa trị nên cùng một lúc có thể kết hợp với nhiều phân tử kháng
thể. Cho nên kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau để tạo thành một phức
hợp hình mạng lƣới trong không gian ba chiều. Sự kết hợp giữa phân tử kháng

14


nguyên và kháng thể xảy ra nhờ các lực nhƣ: lực liên kết ion (lực tĩnh điện
Coulomb) giữa các nguyên tử hoặc các nhóm hoá học mang điện trái dấu, lực liên
kết của các cầu nối hydro giữa các nguyên tử hydro mang điện tích dƣơng với các
nguyên tử mang điện tích âm, lực Van der Walls giữa hai phân tử.

Que thử dạng sắc kí miễn dịch (Hình 1.5) dựa trên cơ sở là phản ứng đặc
hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu của nó. Phản ứng đƣợc thực hiện
trên màng mỏng theo kiểu sắc k‎í nên dạng que thử này đƣợc gọi là sắc kí miễn dịch.
Trong đó kháng nguyên cần phát hiện là yếu tố đặc hiệu của vi khuẩn hay bào tử vi
khuẩn. Kháng thể phát hiện (detector) thƣờng là một kháng thể đơn dòng di động
trên màng. Một kháng thể khác có thể là kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng cố định
trên màng. Phản ứng kết hợp giữa phức hợp – kháng nguyên - kháng thể di động và
kháng thể cố định trên màng để tạo thành vạch T (Test line), vạch C (control line)
theo dạng “bánh kẹp thịt” (Sandwich assay).
Mẫu cần phát hiện

Kháng thể phát hiện

Màng hút mẫu

Màng cộng hợp

Màng nitrocellulose

Vạch thử
nghiệm

Vạch đối
chứng

Màng hút trên

Hình 1.5: Cấu tạo que thử dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch
Kết quả là khi mẫu cần phát hiện có vi khuẩn, trên que thử sẽ xuất hiện hai
vạch màu đỏ gạch tại vị trí vạch thử nghiệm (test line "T") và trên vạch kiểm chứng

“C”, nếu không có vi khuẩn trên que thử chỉ xuất hiện một vạch tại vùng “C”.
Ưu điểm của que thử sắc kí miễn dịch:
Trong số các phƣơng pháp phân tích kể trên, các loại Test trên cơ sở sắc ký
miễn dịch hiện đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ: chẩn đoán
bệnh trong Y học, dƣợc học, trong vệ sinh an toàn thực phẩm, trong kiểm tra chất

15


ma tuý, chất độc chiến tranh và các tác nhân sinh học. Đây là dạng test có cấu tạo và
cách sử dụng rất đơn giản chỉ dƣới dạng một “que nhúng” có kích thƣớc 2 mm x 7
cm, cho kết quả nhanh (không quá 10 phút) với độ nhạy cỡ ng/ml và độ đặc hiệu cao.
- Về thời gian:
Que thử miễn dịch đƣợc sử dụng để sàng lọc các mẫu phẩm với thời gian đọc
kết quả từ 5 -10 phút trong khi đó, các phƣơng pháp khác mất nhiều thời gian hơn.
- Độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
- Tính tiện lợi: Que thử miễn dịch áp dụng kiểm tra mẫu tại chỗ, có thể vận
chuyển một cách dễ dàng.
- Giá thành: Giá thành rẻ so với các phƣơng pháp phân tích khác
- Phạm vi áp dụng: Que thử miễn dịch có thể áp dụng trong nhiều lĩnh vực, Y,
Dƣợc, khoa học hình sự, kiểm tra các chất gây nghiện. Đặc biệt là với công tác phát
hiện các vi sinh vật trong phòng chống chiến tranh sinh học thì đây là một giải pháp
lí tƣởng để phát hiện nhanh các tác nhân sinh học ngay tại hiện trƣờng.
Do yêu cầu trong đấu tranh phòng chống khủng bố bằng vũ khí sinh học, việc
phát hiện sự có mặt của các tác nhân gây bệnh nguy hiểm là yếu tố quan trọng và rất
cần thiết. Đối với đối tƣợng nghiên cứu của đề tài là E. coli và V. cholerae (hai
nhóm vi khuẩn có điều kiện sống phù hợp với khí hậu và thời tiết vùng biển đảo, có
mặt nhiều ở vùng biển đảo), các kỹ thuật PCR, ELISA cho kết quả chính xác nhƣng
không thể đáp ứng đƣợc yêu cầu về thời gian và điều kiện hiện trƣờng của công tác
phát hiện nhanh tác nhân sinh học.

Do vậy, để chế tạo que thử phát hiện nhanh V. cholerae chúng tôi đã chọn
phƣơng án que thử nhanh. Đây là que thử dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch cho
phép phát hiện trực tiếp vi khuẩn thông qua protein đặc trƣng trên vỏ của chúng.
Với phƣơng tiện này ta có thể phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong khoảng 10-15
phút. Que thử có cấu tạo rất gọn nhẹ, kích thƣớc chỉ 2-4 mm x 7 cm đảm bảo tính
cơ động và cho phép thử ngay tại hiện trƣờng. Kết quả thể hiện bằng sự xuất hiện
vạch màu trên que thử và có thể đọc bằng mắt thƣờng. Do dựa trên phản ứng miễn
dịch nên que thử đảm bảo độ đặc hiệu và tính chính xác cao.

16