Điều tra ca bệnh melioidosis trên lâm sàng và nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn burkholderia pseudomallei ngoài môi trường ở bắc miền trung việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hoàng Sỹ Tiếp

ĐIỀU TRA CA BỆNH MELIOIDOSIS TRÊN LÂM SÀNG VÀ
NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA VI KHUẨN BURKHOLDERIA
PSEUDOMALLEI NGOÀI MÔI TRƯỜNG Ở BẮC MIỀN TRUNG
VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hoàng Sỹ Tiếp

ĐIỀU TRA CA BỆNH MELIOIDOSIS TRÊN LÂM SÀNG VÀ
NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA VI KHUẨN BURKHOLDERIA
PSEUDOMALLEI NGOÀI MÔI TRƯỜNG Ở BẮC MIỀN TRUNG
VIỆT NAM
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
Cán bộ hướng dẫn: TS. Trịnh Thành Trung
TS. Phạm Đức Ngọc

Hà Nội - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài luận văn, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
TS. Trịnh Thành Trung, Ths. Bùi Nguyễn Hải Linh cùng toàn bộ các cán bộ Viện Vi
Sinh Vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội (IMBT) đã tận tình hướng
dẫn và giúp đỡ cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành đề
tài luận văn tốt nghiệp này.
Đồng thời, tôi cũng muốn gửi những lời cảm ơn tới TS. Phạm Đức Ngọc và các
quý thầy cô của bộ môn Vi sinh vật - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội đã
động viên và hỗ trợ tôi rất nhiều trong qua trình thực hiện.
Ngoài ra, tôi cũng muốn cảm ơn những người bạn, những người luôn sát cánh
bên tôi những lúc khó khăn và giúp tôi vượt qua để hoàn thành luận văn một cách tốt
nhất.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi luôn biết ơn và ghi nhớ những sự giúp đỡ hết
sức quý báu đó.
Hà Nội, ngày tháng năm 2017
Học viên

Hoàng Sỹ Tiếp


MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................... 1
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................ 4
CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ............................................................................................. 5
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 6
Chương 1- TỔNG QUAN ................................................................................................ 7
1.1.Giới thiệu về bệnh melioidosis ................................................................................ 7

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu. .............................................................................................. 7
1.1.2.

Dịch tễ học ......................................................................................................... 7

1.1.3.

Con đường lây nhiễm ........................................................................................ 9

1.1.4.

Đặc điểm lâm sàng........................................................................................... 10

1.1.5.

Chuẩn đoán ...................................................................................................... 12

1.1.6.

Điều trị lâm sàng ............................................................................................. 14

1.2. Chi Burkholderia .................................................................................................. 15
1.2.1.

Giới thiệu về chi Burkholderia........................................................................ 15

1.2.2.

Vi khuẩn Burkholderia pseudomallei ............................................................ 18

CHƯƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 23
2.1. Nguyên vật liệu ...................................................................................................... 23
2.1.1.

Mẫu bên ngoài môi trường ............................................................................ 23

2.1.2.

Chủng vi sinh vật ............................................................................................. 23

2.2. Hóa chất, thiết bị ................................................................................................. 24
2.2.1.

Hóa chất ........................................................................................................... 24

2.2.2.

Thiết bị ............................................................................................................ 24

2.2.3.

Môi trường nuôi cấy sử dụng.......................................................................... 24

2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 25
2.3.1.

Điều tra các ca bệnh lâm sàng. ....................................................................... 25

2.3.2.

Thu thập mẫu đất ngoài môi trường .............................................................. 25


2.3.3.

Phương pháp tách chiết ADN từ mẫu đất ...................................................... 26

2.3.4.

Phương pháp phát hiện vi khuẩn B. pseudomallei bằng realtime

PCR................ ................................................................................................................ 26
2.3.5.

Phương pháp nuôi cấy để phát hiện vi khuẩn B. pseudomallei từ mẫu đất 27

2.3.6.

Multilocus sequence typing (MLST) ............................................................... 27

CHƯƠNG III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 30
3.1. Điều tra các ca bệnh melioidosis trên lâm sàng ở Bắc Miền Trung Việt Nam
tháng 06 - 12/2015......................................................................................................... 30
3.1.1.

Số lượng ca bệnh và thông tin nhân khẩu học .............................................. 31

3.1.2.

Đặc điểm lâm sàng và điều trị ......................................................................... 33

3.1.3.

Phân bố nơi cư trú của bệnh nhân ................................................................. 36

3.2. Điều tra sự phân bố của vi khuẩn Burkholderia pseudomallei ngoài môi
trường ............................................................................................................................ 36
3.2.1.

Bản đồ phân bố vi khuẩn được phát hiện bằng kỹ thuật realtime PCR ....... 36

3.2.2.

Bản đồ phân bố vi khuẩn được phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy ...... 42

3.3. Phân tích dịch tễ học phân tử ............................................................................. 43
3.3.1.

Phân tích Multilocus sequence typing (MLST).............................................. 43

3.3.2.

Mối quan hệ kiểu gen của các chủng B. pseudomallei ở Bắc Miền Trung

Việt Nam và các khu vực khác trên thế giới. ............................................................... 45
KẾT LUẬN .................................................................................................................... 49
KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................................... 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 51
PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 54

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Sự phân bố của vi khuẩn B. pseudomallei và vị trí các ca bệnh

8

melioidosis theo dữ liệu thu được từ 1910 - 2014
Hình 1.2. Hình thức nhiễm bệnh thông qua tiếp xúc với nguồn đất nước

9

chứa B. pseudomallei
Hình 1.3. Tổn thương các cơ quan do vi khuẩn B. pseudomallei gây ra

12

Hình 1.4. Phản ứng dương tính với oxidase của các chủng vi khuẩn

13

Burkholderia pseudomallei
Hình 1.5. Đặc tính sinh học của vi khuẩn B. pseudomallei

13

Hình 1.6. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Burkholderia pseudomallei BG

14

02 sau 4 ngày nuôi cấy ở 37°C trên môi trường Ashdown Agar
Hình 1.7. Cây phân loại dựa trên trình tự rARN 16S của các loài thuộc chi

17

Burkholderia
Hình 1.8. Hình thái tế bào của vi khuẩn B. pseudomallei

19

Hình 1.9. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trên môi

19

trường Ashdown Agar
Hình 1.10. Sự xâm nhập và sinh trưởng của Burkholderia pseudomallei
trong nội bào.

21

Hình 2.1. Bản đồ vị trí mẫu đất thu thập ở 5 tỉnh thuộc Bắc Miền Trung Việt

23

Nam vào tháng 09 năm 2016

1


Hình 3.1. Biểu đồ thể hiện số lượng ca bệnh được xét nghiệm chuẩn đoán

31

nhiễm bệnh melioidosis tại 5 bệnh viện tham gia cuộc khảo sát từ 06 –
12/2015
Hình 3.2. Biểu đồ nghề nghiệp của bệnh nhân nhiễm bệnh melioidosis tại

32

Bắc Miền Trung Việt Nam
Hình 3.3. Biểu đồ độ tuổi bệnh nhân nhiễm bệnh melioidosis tại Bắc Miền

32

Trung Việt Nam.
Hình 3.4. Biểu đồ thể hiện số lượng ca bệnh xuất hiện ở các tháng trong

33

khoảng từ 6 - 12/2015
Hình 3.5. Bản đồ phân bố các ca bệnh melioidosis ở 5 tỉnh Bắc Miền Trung

37

Việt Nam theo báo cáo của 5 bệnh viện tham gia quá trình khảo sát dựa trên
thông tin địa chỉ của các bệnh nhân
Hình 3.6. Hình ảnh môi trường chọn lọc Ashdown Agar khi cấy trải dịch

40

nổi được làm giàu lần 2 với môi trường Galimand Broth biến đổi
Hình 3.7. Số lượng điểm dương tính tương ứng với số mẫu dương tính trên

41

từng điểm lấy mẫu theo phương pháp phát hiện bằng kỹ thuật realtime PCR
Hình 3.8. Bản đồ phân bố vi khuẩn B. pseudomallei trong đất dựa trên kết

41

quả realtime PCR ở 5 tỉnh thuộc Bắc Miền Trung Việt Nam
Hình 3.9. Bản đồ phân bố của vi khuẩn B. pseudomallei trong đất nông
nghiệp tại 5 tỉnh thuộc Bắc Miền Trung Việt Nam dựa trên kết quả nuôi cấy

2

42


Hình 3.10. Số lượng điểm dương tính tương ứng với số mẫu dương tính trên

43

từng điểm lấu mẫu theo phương pháp phát hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy
Hình 3.11. Tổ hợp dòng (Clonal Complex) của B.pseudomallei trên toàn thế

46

giới được xác định bằng goeBURST
Hình 3.12. Sự phân bố của các ST có nguồn gốc từ Việt Nam (A, B, C, D)

bên cạnh sự phân bố của các ST thuộc vùng khác như Australia, Thái Lan

3

48


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Ước tính số ca bệnh melioidosis năm 2015

8

Bảng 2.1. Trình tự các mồi và kích thước các mảnh gen được khuếch đại

28

Bảng 3.1. Thông tin lâm sàng của các ca bệnh ở Bắc Miền Trung Việt Nam

34

Bảng 3.2. Giá trị Ct của các mẫu đất dương tính ở các giai đoạn làm giàu.

37

Bảng 3.3. Kết quả phân tích Multilocus sequence typing (MLST)

44

.

.

.

4


CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Bcc: Burkholderia cepacia complex
CF: Cystic fibrosis (Chứng xơ nang)
CDC: U.S. Centers for Disease Control and Prevention
MALDI-TOF MS: Matrix - assisted laser desorption/ionization of time - of - flight
mass spectrometry
MHA: Mueller Hinton Agar
CLSI: The Clinical & Laboratory Standards Institute
TSB: Tryptone Soya Broth
MRI: Magnetic Resonnace Imaging
TTSS1: The type three secretion system 1
ADN: Acid deoxyribonucleic
ARN:Acid ribonucleic
TBSS - C50: Threonine-basal salt solution plus colistin at 50 mg/liter
ST: Sequence Type
MLST: Multilocus Sequence Typing

5


MỞ ĐẦU
Bệnh melioidosis (hay còn gọi là bệnh whitmore) là một bệnh truyền nhiễm cấp
tính nguy hiểm ở người và động vật do vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây nên.

Đây là căn bệnh có bệnh cảnh lâm sàng đa dạng và phức tạp, do đó dễ bị chuẩn đoán
nhầm thành các bệnh khác, bệnh melioidosis có diễn tiến lâm sàng nhanh và có thể
gây tử vong nếu không áp dụng phác đồ kháng sinh điều trị phù hợp. Từ lâu, Việt Nam
là nước nằm trong tâm điểm của dịch bệnh nhưng số liệu báo cáo về ca bệnh vẫn còn
rất ít. Đến nay, chỉ có hai báo cáo ở một bệnh viện phía Bắc và một bệnh viện phía
Nam. Do đó, toàn bộ dịch tễ học về ca bệnh cũng như sự phân bố của vi khuẩn B.
pseudomallei ở miền Trung Việt Nam vẫn còn bỏ ngỏ. Bên cạnh đó, xét nghiệm nuôi
cấy B. pseudomallei từ mẫu bệnh phẩm gặp rất nhiều khó khăn, các máy xét nghiệm
định danh thường quy như Phoenix 100 hay API 20NE thường định danh sai vi khuẩn
gây bệnh melioidosis. Điều này gây ra tình trạng chuẩn đoán nhầm bệnh và điều trị
kháng sinh không đúng, làm tăng nguy cơ tử vong.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Điều tra ca bệnh melioidosis trên lâm
sàng và nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn Burkholderia pseudomallei ngoài môi
trường ở Bắc Miền Trung Việt Nam” với nội dung:
-

Ứng dụng kỹ thuật định danh vi khuẩn đơn giản để phát hiện ca bệnh
whitmore ở Bắc Miền Trung Việt Nam.

-

Lập bản đồ để xác định sự phân bố của vi khuẩn B. pseudomallei trong đất.

6


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về bệnh melioidosis
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu.
Bệnh melioidosis là bệnh truyền nhiễm cấp tính được gây ra bởi vi khuẩn

Gram âm Burkholderia pseudomallei. Nó được phát hiện lần đầu tiên với tên
Bacillus pseudomallei bởi Alfred Whitmore và C.S. Krishnaswami trong số
những người nghiện morphine ở Rangoon, Myanmar (Burma) năm 1911 [6, 20].
Ban đầu, bệnh xuất hiện với tên “glanders - like”. Nhưng đến năm 1932, Stanton và
Fletcher đề xuất tên “melioidosis” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, mô tả tình trạng
tương tự với bệnh Glanders - Một bệnh truyền nhiễm ở ngựa [3].
1.1.2. Dịch tễ học
Melioidosis là một bệnh truyền nhiễm xuất hiện phổ biến ở Đông Nam Á,
Bắc Australia, và các quốc gia đang phát triển ở khu vực nhiệt đới, tương ứng với
vùng nhiệt đới giữa vĩ độ 20oN và 20oS [3]. Ở Đông bắc Thái Lan, có khoảng 2000
ca bệnh melioidosis được ghi nhân mỗi năm với tỷ lệ tử vong lên đến 40%, tỷ lệ
này cao thứ 3 trong các bệnh gây tử vong nơi đây (sau HIV/AIDS và lao). Còn tại
Singapore (một đất nước phát triển với tỷ lệ nông dân thấp) cũng đã xác nhận có
550 ca trong suốt 10 năm qua và trong đó 1/5 bị tử vong [14]. Trong năm 2015, ước
tính có khoảng 165.000 ca bệnh trong 3 tỷ người sống ở những vùng đất có nguy cơ
nhiễm B. pseudomallei (tỷ lệ 5.0 trên 100.000 có nguy cơ mắc bệnh mỗi năm) và
được tổng hợp ở bảng 1.1 [16].
Tất cả các nhóm tuổi đều có nguy cơ mắc bệnh melioidosis, nhưng tỷ lệ
nhiễm bệnh nhiều nhất là trong khoảng 40 - 60 tuổi. Bệnh có sự phân hóa theo mùa
rõ rệt và theo các công trình nghiên cứu có 75% ca bệnh xuất hiện vào mùa mưa
[14].
Ngoài ra, tỷ lệ mắc bệnh melioidosis ở Thái Lan và các nước lân cận xuất
hiện tương đồng với sự hiện diện của vi khuẩn B. pseudomallei ở trong đất. Tỷ lệ có
thể tăng lên ở một khu vực nhất định sau các thảm họa thiên nhiên như trận sóng
thần năm 2004 hay cơn bão Haitang làm tăng tỷ lệ mắc bệnh từ 0.7 – 70 trên
100.000 người một năm tại Tây Nam Đài Loan năm 2005 [14].

7

Bảng 1.1. Ước tính số ca bệnh melioidosis năm 2015 [16]
Dân số có nguy
cơ

Số ca bệnh
melioidosis

Số ca tử vong vì
melioidosis

Triệu người
(khoảng tin cậy)

Nghìn người
(khoảng tin cậy)

Nghìn người
(khoảng tin cậy)

1525 (1402-1595)

73 (31-171)

42 (18-101)

Đông Á và TBD

858 (795-920)

65 (28-161)

31 (13-77)

Cận Sahara Châu Phi

602 (482-695)

24 (8-72)

15 (6-45)

Mỹ Latin và Caribe

246 (153-334)

2 (1-7)

1 (<1-3)

49 (29-80)

<1

<1

Châu Âu và Trung Á

0

0

0

Bắc Mỹ

0

0

0

Toàn cầu

3280 (2862-3624)

165 (68-412)

89 (36-227)

Vùng

Nam Á

Trung Đông và Bắc Phi

Hình 1.1. Sự phân bố của vi khuẩn B. pseudomallei và vị trí các ca bệnh
melioidosis theo dữ liệu thu được từ 1910 – 2014 [16]

8

Theo các báo cáo công bố từ năm 1910 - 2014, 22.338 vị trí địa lý ghi nhận
sự hiện diện của melioidosis ở người và động vật cũng như sự hiện diện của B.
pseudomallei ngoài môi trường, dữ liệu này được tổng hợp ở hình 1.1.
1.1.3. Con đường lây nhiễm
Vi khuẩn B. pseudomallei sống chủ yếu trong đất và nước, cho nên những
người tiếp xúc thường xuyên với hai nguồn này có nguy cơ nhiễm bệnh cao. Vi
khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể thông qua con đường tiếp xúc và hô hấp. Quan
sát cho thấy rằng, người lao động nông nghiệp đặc biệt là người nông dân những
người thường xuyên tiếp xúc với đất và nước trong thời gian dài, nếu có vết thương
trên da nhưng không được các thiết bị bảo vệ, có thể tiếp xúc vùng da bị tổn thương
với nguồn đất nước ô nhiễm thì nguy cơ nhiễm bệnh tương đối cao (Hình 1.2) [3,
4].
A

B

Hình 1.2. Hình thức nhiễm bệnh thông qua tiếp xúc với nguồn đất nước chứa B.
pseudomallei (A: Người nông dân trồng lúa ở Campuchia, B: tiếp xúc với nguồn
nước ô nhiễm tại Bắc Australia) [3,4]
Đối với con đường hô hấp, vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể thông qua
việc hít các tác nhân gậy bệnh. Dựa trên các nghiên cứu của quân đội Mỹ, thì nhiều
cựu binh Mỹ đặc biệt là không quân, sau khi chiến đấu ở Việt Nam trở về cũng biểu
hiện các triệu chứng lâm sàng nhiễm bệnh melioidosis do vi khuẩn B. pseudomallei
có khả năng tiềm ẩn trong cơ thể người bệnh. Nên melioidosis còn được gọi với cái
tên “Vietnamese Time Bomb” để chỉ ra đây là bệnh truyễn nhiễm nguy hiểm nhiễm

9

tại Việt Nam, sau đó ủ bệnh và khởi phát các triệu chứng lâm sàng khi hệ thống
miễn dịch của các cựu binh Mỹ bị suy yếu. Quá trình lây nhiễm qua cơ chế này
được phát hiện năm 1950, cùng với đó là sự tăng nguy cơ mắc bệnh trong giai đoạn
mùa mưa, khi mà cơ thể hít phải không khí trong thời tiết khắc nghiệt. Trong một
số nghiên cứu cho rằng, các bệnh nhân nhiễm bệnh tại Singapore, có biểu hiện bệnh
trong thời kỳ mưa lớn, đều là người lớn tuổi và không có tiền sử tiếp xúc với đất
hoặc nước [3].
1.1.4. Đặc điểm lâm sàng
1.1.4.1. Các yếu tố nguy cơ
Tỷ lệ mắc bệnh melioidosis cao ở những người bị suy giảm miễn dịch và có
tiền sử mắc bệnh đi kèm. Đái tháo đường là nguy cơ quan trọng và phổ biến nhất,
một nghiên cứu đã chỉ ra 60,9% bệnh nhân bị đái tháo đường. Các nhóm có nguy
cơ cao khác bao gồm người bị suy thận mãn tính (chiếm 12% số ca), bệnh phổi
(27% số ca), bệnh tan máu bẩm sinh - thalassaemia, bệnh suy tim xung huyết, điều
trị bằng corticosteroid, khối u ác tính (đặc biệt là bệnh máu trắng và u bạch huyết),
và suy giảm miễn dịch. Nó còn kết hợp với việc uống rượu trong một thời gian dài
và có tiền sử nghiện rượu. Điều này thể hiện rõ ở 39% các ca bệnh ở Bắc Australia
và 12% ca bệnh melioidosis ở Thái Lan. Ngoài ra, việc ăn kava (cây bụi nhỏ thuộc
họ hồ tiêu có nguồn gốc từ Nam Thái Bình Dương) cũng đã được liên hệ với việc
tăng nguy cơ mắc bệnh melioidosis, 8% ca bệnh ở Bắc Australia do tiêu thụ một
lượng lớn kava.
Những người tiếp xúc thường xuyên với đất và nước cũng có nguy cơ mắc
bệnh cao, đặc biệt là nông dân trồng lúa và người lao động [6].
1.1.4.2.

Biểu hiện lâm sàng

Thời gian phơi nhiễm B. pseudomallei và bắt đầu biểu hiện các triệu chứng
lâm sàng của bệnh là rất khác nhau và khó xác định. Trong một nghiên cứu, 25%
các trường hợp nhớ lại các sự kiện nhiễm bệnh cụ thể có khoảng thời gian ủ bệnh là

từ 1 - 21 ngày (trung bình là 9 ngày). Nếu hít vào hoặc nhiễm một lượng lớn vi
khuẩn gây bệnh thì thời gian ủ bệnh sẽ rất ngắn. Tuy nhiên, thời gian ủ bệnh cũng
có thể rất dài (lên đến 62 năm). Thời gian khởi đầu các triệu chứng lâm sàng thể

10


hiện phạm vi rộng mức độ nghiêm trọng của bệnh. Ở miền Bắc Australia, 13%
bệnh nhân có biểu hiện triệu chứng đầu tiên trong hơn 2 tháng [6, 14].
Biểu hiện lâm sàng phổ biến và thường gặp nhất của bệnh là nhiễm khuẩn
huyết và viêm phổi (Hình 1.3A). Bên cạnh đó, bệnh nhân có thể bị áp xe da, áp xe
nội tạng, viêm tủy xương, khớp thậm chí là viêm não [1]. Nhiều hệ thống cơ quan
đều bị ảnh hưởng bao gồm phổi, thận, tuyến tiền liệt, da, tuyến mang tai, não (Hình
1.3 B). Trong các ca nhiễm bệnh, nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi chiếm 50% số
ca. Mầm bệnh chủ yếu theo đường máu vào phổi hơn là đường hô hấp (hít phải
mầm bệnh). Mức độ nghiêm trọng cũng rất khác nhau, bệnh nhân viêm phổi, nhiễm
khuẩn huyết có thể biểu hiện từ ho nhẹ, sốt cao, đau màng phổi đến ho nhiều hơn
kèm theo khó thở.
Bên cạnh đó, áp xe ở một hoặc nhiều vị trí có thể xảy ra ở gan hay lách. Sự
hình thành áp xe gan xuất hiện ở 1/4 bệnh nhân nhiễm melioidosis ở Thái Lan,
nhưng chỉ chiếm 6% bệnh nhân ở Australia. Viêm tủy xương và viêm khớp nhiễm
trùng do vi khuẩn B. pseudomallei cũng đã được ghi nhận. Xuất hiện mụn mủ ở bên
ngoài, áp xe dưới da, viêm cơ mủ (pyomyositis) là những biểu hiện tương đối phổ
biến (15 - 25%). Có thể là cơ quan nhiễm nhiễm trùng ban đầu hay thứ cấp mà từ
đó lây lan theo đường máu. Nhiễm trùng tiết niệu là một biểu hiện thường gặp của
bệnh melioidosis ở Australia, với áp xe tuyến tiền liệt (Hình 1.3B) xảy ra ở 18%
bệnh nhân nam, áp xe thận có thể được kết hợp với sỏi. Nhiễm trùng đường tiết
niệu bắt gặp ở ít nhất 1/4 bệnh nhân ở Thái Lan được nuôi cấy nước tiểu và cho kết
quả dương tính với B. pseudomallei [14].
Ngoài ra, tác động của bệnh melioidosis lên hệ thân kinh thông qua biểu hiện

viêm não, chứng liệt nhũn hai chi dưới (paraparesis) xuất hiện trên 4% bệnh nhân ở
Bắc Australia, nhưng không biểu hiên trên bệnh nhân ở Đông Bắc Thái Lan - Nơi
sự ảnh hưởng tới hệ thần kinh trung ương xảy ra trên 2% số ca và thường gắn với
hình thành áp xe. Viêm tuyến mang tai mưng mủ là một biểu hiện cấp tính phổ biến
ở trẻ em Thái Lan nhưng không phổ biến ở người lớn. Bên cạnh đó, nhiễm trùng ở
các vùng khác nhau cũng đã được mô tả như viêm hạch, áp xe tuyến thượng thận,
nhiễm trùng trung thất, viêm màng ngoài tim, viêm tai giữa cấp tính, viêm loét giác
mạc, áp xe vú, áp xe bìu [14].

11


A

B

Hình 1.3. Tổn thương các cơ quan do vi khuẩn B. pseudomallei gây ra. (A): Ảnh
chụp X – quang cho thấy viêm phổi thùy bên trái do vi khuẩn B. pseudomallei, (B):
Ảnh chụp cộng hưởng từ MRI cho thấy vi khuẩn B. pseudomallei gây áp xe tuyến
tiền liệt [6]
1.1.5. Chuẩn đoán
Trong chuẩn đoán lâm sàng, các bác sỹ cần để ý bệnh nhân có biểu hiện sốt
hay các biểu hiện lâm sàng đáng nghi ngờ. Bên cạnh đó xem xét các yếu tố nguy cơ
như có tiền sử nghiện rượu, có bệnh nền như đái tháo đường, bệnh thận, hay bệnh
phổi, nơi cư trú, liên quan đến sự hiện diện của vi khuẩn B. pseudomallei và nghề
nghiệp có nguy cơ tiếp xúc với đất và nước. Tuy nhiên, những biến đổi trong đặc
điểm lâm sàng của bệnh nhiễm trùng thường rất khó để chuẩn đoán vì rất dễ nhầm
với bệnh khác nên melioidosis còn có một thuật ngữ “the great mimicker” để chỉ
bệnh có triệu chứng lâm sàng không điển hình nên dễ bị chuẩn đoán nhầm với các
bệnh truyền nhiễm khác [14].

Vậy nên, nuôi cấy được xem là tiêu chuẩn vàng trong chuẩn đoán bệnh
melioidosis. Trên môi trường không chọn lọc, hình thái khuẩn lạc vi khuẩn nhỏ,
mịn, ánh kim loại và có mùi đất ải sau 24 - 48 giờ. Sau 3 - 5 ngày, khuẩn lạc trở nên
khô và nhăn (Hình 1.5A) giống với Pseudomonas stutzeri. Dương tính với oxidase
test (Hình 1.4), có hình kim băng khi nhuộm Gram và soi tế bào. B. pseudomallei
nhạy với augmentin (amoxicillin/clavulanate), kháng colistin và gentamicin (Hình
1.5B).

12


Bên cạnh đó, trên môi trường chọn lọc phổ biến nhất là môi trường
Ashdown Agar, sau 3 - 5 ngày được ủ ở 37°C, khuẩn lạc có màu tím, khô, nhăn
(Hình 1.6).

Hình 1.4. Phản ứng dương tính với oxidase của các chủng vi khuẩn B.
pseudomallei (1, 2, 3, 4) so với đối chứng âm Escherichia coli (5).
A

B

Hình 1.5. Đặc tính sinh học của vi khuẩn B. pseudomallei (A): Hình thái khuẩn lạc
của vi khuẩn B. pseudomallei trên môi trường thạch máu sau vài ngày nuôi cấy [1].
(B) Khả năng nhạy/kháng kháng sinh của B. pseudomallei với (1): Amoxicillin +
Clavunanic acid (20/10 μg), (2): Colistin (10 μg) và (3): Gentamicin (30 μg).

13


MALDI-TOF MS và phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng cũng đang

cho thấy tín hiệu tích cực với việc phát hiện nhanh và độ chính xác cao. Hơn nữa,
Tap Realtime PCR cũng chứng minh sự hiệu quả thông qua độ nhạy vượt trội.
Ngoài ra, trong xác định vi khuẩn B. pseudomallei còn sử dụng API 20NE,
Vitek 2 hay hệ thống WalkAway 96 nhưng đem lại kết quả không cao khi 37% kết
quả API 20NE định danh ra được xác định là B. pseudomallei bằng sinh học phân
tử.

Hình 1.6. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn B. pseudomallei BG 02 sau 4 ngày nuôi
cấy ở 37°C trên môi trường Ashdown Agar
1.1.6. Điều trị lâm sàng
Quá trình điều trị gồm 2 pha: Pha điều trị chuyên sâu thông qua tiêm tĩnh mạch
dùng để điều trị các bệnh nhân cấp tính, và tiếp theo là pha duy trì.
1.1.6.1.

Pha điều trị chuyên sâu

Hiện nay, tiêm tĩnh mạch ceftazidime (2 g, 6 giờ) hoặc meropenem (1 g, 8
giờ) cộng với liều cao cotrimoxazole là thuốc được lựa chọn ở Australia, nó thường
được dùng cho ít nhất 14 ngày. Một điều đặc biệt ở bệnh melioidosis là tác nhân

14


gây bệnh có thể kháng lại các loại kháng sinh thông thường như penicillin,
ampicillin, gentamicin, streptomycin, cephalosporin thế hệ thứ nhất và thứ hai. Tuy
nhiên phần lớn các chủng nhạy với nhóm kháng sinh phổ rộng beta-lactams,
ceftazidime, imipenem, meropenem,
ceftriaxone và cefotaxime [6].
1.1.6.2.

piperacillin,

amoxycillin-clavulanate,

Pha điều trị duy trì

Ba tháng điều trị kháng sinh bằng đường uống thường là thời gian tối thiểu
cho giai đoạn tiêu diệt mầm bệnh, và việc này được tiếp tục kéo dài trong trường
hợp nhiễm khuẩn nặng. Trước đây, phác đồ điều trị gồm bốn loại thuốc
(trimethoprim, sulfamethoxazole, doxycycline, chloramphenicol) đã được sử dụng
nhưng mang lại hiệu quả không cao. Các nhóm nghiên cứu đã chỉ ra rằng ở những
bệnh nhân sống sót sau điều trị bệnh ban đầu, sự lựa chọn và thời gian điều trị
kháng sinh là yếu tố quan trọng nhất quyết định khả năng tái phát, có thể giảm nguy
cơ tái phát lên đến 90% đối với những người tuân thủ phác đồ thích hợp trong 12 16 tuần so với 8 tuần. Ở Australia, điều trị bằng đường uống với cotrimoxazole liều
cao (320 mg trimethoprim và 1600 mg sulphamethoxazole, 12 giờ). Trong khi ở
Thái Lan, việc điều trị thực hiện theo cân nặng (<40 kg thể trọng, 160/800 mg; 4060 kg, 240/1200 mg; > 60 kg, 320/1600 mg - 12 giờ/trên một lần uống), cùng với
đó là sự kết hợp với doxycycline (100 mg, 12 giờ/trên một lần uống). Nếu việc điều
trị này không thể thực hiện được do chống chỉ định thì có thể sử dụng amoxicillin clavulanate (500 và 125 mg tương ứng, 8 giờ) để thay thế, theo cân nặng (20 mg và
5 mg tương ứng / kg, ba lần mỗi ngày) [6].
1.2. Chi Burkholderia
1.2.1. Giới thiệu về chi Burkholderia
1.2.1.1. Lịch sử nghiên cứu
Chi Burkholderia là một chi rất đa dạng bao gồm các loài là nguyên nhân
quan trọng gây nhiều bệnh nguy hiểm ở người và động vật cũng như các loài vi
khuẩn có ích góp phần vào sự tăng trưởng của thực vật và xử lý sinh học [27].
Chi Burkholderia thuộc lớp Betaproteobacteria trong nghành
Proteobacteria. Lần đầu tiên được mô tả vào năm 1992 bởi Yabuuchi và cộng sự,

15

gồm các loài ban đầu thuộc chi Pseudomonas. Dựa vào trình tự rARN 16S, giá trị
tương đồng ADN - ADN, lipid tế bào, thành phần acid béo, và các đặc điểm hình
thái, chi Burkholderia được thành lập với 7 loài mới là: Burkholderia cepacia
(Palleroniand Holmes, 1981), Burkholderia mallei (Zopf, 1885), Burkholderia
pseudomallei (Whitmore, 1913), Burkholderia caryophilli (Burkholder, 1942),
Burkholderia gladioli (Severini, 1913), Burkholderia picketii (Ralston et al.,1973),
và Burkholderia solanaceareum (Smith, 1896). Dựa vào các đặc tính sinh hóa,
miễn dịch và thông tin di truyền, B. pseudomallei, B. mallei, B. cepacia và B.
thailandensis có quan hệ gần gũi]. Tuy nhiên, sau đó hai loài Burkholderia
pickettiia và B. solanacearum và một loài thuộc chi Alcaligenes đã được phân loại
thành một chi mới Ralstonia [27].
1.2.1.2.

Hệ thống phân loại

Trong suốt hơn 2 thập kỷ qua, nhiều loài mới thuộc chi Burkholderia đã
được mô tả và công bố. Đến nay (2016), chi Burkholderia có 90 loài trong hệ thống
phân loại vi khuẩn [27].
Đây là chi rất đa dạng gồm nhiều nhóm các loài có quan hệ gần gũi (Hình 1.7).
Nhóm đầu tiên của chi Burkholderia bao gồm loài Burkholderia cepacia cùng với
các loài thuộc nhóm Bcc (Burkholderia cepacia complex), trong đó Burkholderia
cenocepacia là nguyên nhân chính của chứng xơ nang, nhưng gần đây đã có công
trình chứng minh vai trò tăng khả năng sinh trưởng ở thực vật , một nhóm là những
loài gây bệnh cho cây trồng như B. gladioli, B. plantarii và B. glumae, một nhóm
gồm những loài có quan hệ gần gũi với nhau và là những tác nhân gây bệnh B.
mallei và Burkholderia pseudomallei, nguyên nhân gây ra bệnh “glanders” ở ngựa
hay melioidosis ở người. Không chỉ có vậy, ở nhóm này còn có các loài có khả
năng sinh các chất kích thích sinh trưởng cho thực vật và kiểm soát sinh học như là
Burkholderia vietnamiensis và Burkholderia ambifaria, chúng giúp năng suất lúa

gạo tăng 13 - 22%, khi được phân lập trên rễ của cây đậu Hà Lan, phát hiện khả
năng kháng lại Pythium aphanidermatum và Aphanomyces euteiches (2 tác nhân
gây bệnh héo rủ và thối rễ ở đậu) [27].

16


Hình 1.7. Cây phân loại dựa trên trình tự rARN 16S của các loài thuộc chi
Burkholderia [5]

17


Burkholderia glathei và 11 loài mới được lập thành một nhóm trên cây phát
sinh chủng loại. Một số loài được phân lập từ đất ô nhiễm như Burkholderia udeis
có khả năng phân hủy naphthalene phân lập từ đất đồi bị ô nhiễm. Các loài khác
trong nhánh này đã được phân lập từ các nguồn ít nghiên cứu hơn như sợi nấm và
rêu (Burkholderia sordidicola và Burkholderia grimmiae). Và đến nay, chưa có
công trình nào ghi nhận khả năng gây bệnh của các loài thuộc nhóm này.
Nhóm thứ ba của chi Burkholderia gồm 40 loài chủ yếu ở ngoài môi trường
và ở trên thực vật. Phần lớn thì chúng được ghi nhận là có lợi cho vật chủ của
chúng. Tuy nhiên, trong số các loài, Burkholderia fungorum là một ngoại lệ đáng
chú ý vì nó được phân lập trên người và các mẫu thú y như máu, dịch não tủy, dịch
tiết âm đạo, đờm, mẫu rửa của bệnh nhân CF, thân não của con nai bị thương và
mũi chuột. Ngoài ra, Burkholderia tropica còn được phân lập từ bệnh nhân sơ sinh
bị viêm ruột hoại tử.
Ngoài ba nhóm chính nêu trên, có một số loài đại diện khá độc đáo như
Burkholderia rhizoxinica và Burkholderia endofungorum (hai vật thể sống ký sinh
ở nấm gây bệnh thực vật Rhizopus microsporus), một nhóm gồm Burkholderia
caryophylli (tác nhân gây bệnh ở hoa cẩm chướng và hành tây), Burkholderia

symbiotica (một loài cộng sinh trong nốt rễ ở các loài Mimosa), và Burkholderia
soli (một vi khuẩn sống trong đất) [5].
1.2.2. Vi khuẩn Burkholderia pseudomallei
B. pseudomallei là trực khuẩn Gram âm, có khả năng di động nhờ vào sợi
actin (Hình 1.8C) [28], sống trong đất và mặt nước ở các quốc gia nóng và ẩm, đặc
biệt là khu vực Đông Nam Á và Bắc Australia. Chúng được Trung tâm kiểm soát và
phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) liệt vào tác nhân tiềm năng gây khủng bố
sinh học bời vì là nguyên nhân gây ra bệnh melioidosis – bệnh truyền nhiễm gây
nhiễm trùng máu rất nguy hiểm ở người [10].
Chủng vi khuẩn được mô tả lần đầu tiên với tên Bacillus pseudomallei,
Bacillus whitmorii (hoặc Bacille de Whitmore), Malleomyces pseudomallei,
Pseudomonas pseudomallei, và từ năm 1992 mang tên Burkholderia pseudomallei.
Đây là vi khuẩn hình que, kích thước rất nhỏ (0,8-1,5 μm), khi nhuộm bắt màu đậm

18


ở hai cực (hình kim băng) vì trong tế bào có sự tích lũy acid β-hydroxy butyric
(Hình 1.8A, 1.8B) [1, 20].

Hình 1.8. Hình thái tế bào của vi khuẩn B. pseudomallei. Vi khuẩn hình que,
nhuộm Gram bắt màu đậm ở hai cực với hình thái kim băng (A, B), và sự hình
thành đuôi actin (màu đỏ) trong tế bảo của vi khuẩn B. pseudomallei (màu xanh)
(C) [1, 20, 28].

Hình 1.9. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn B. pseudomallei trên môi trường Ashdown
Agar: (a) hình thái khuẩn lạc trên môi trường thạch, (b): B. pseudomallei NCTC
13177 biểu hiện hình thái có nhiếu nếp nhăn, (c): chủng B. pseudomallei BCC 11
có bề ngoài trơn, bóng. Thước đo có giá trị 0,5 cm [10].
Vi khuẩn có phản ứng dương tính với oxidase và sinh trưởng trong điều kiện

hiếu khí. Tuy nhiên, khi có mặt nitrat hoặc acginine, vi khuẩn có thể sống trong
điều kiện kỵ khí. Khuẩn lạc có một mùi hương đất ải (ngọt) đặc trưng.
Bên cạnh đó, nó có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau để sinh tổng
hợp, từ đó có thể thích ứng với nhiều môi trường sống. Điều đáng lưu ý, B.

19


pseudomallei không có khả năng sử dụng đường L - arabinose, trong khi B.
thailandensis có thể sử dụng để sinh trưởng. Khi nuôi cấy trên môi trường thạch
rắn, vi khuẩn có hình thái đặc trưng, ban đầu bề mặt trơn mịn, nểu được nuôi cấy
thêm thì bề mặt khô và nhăn (Hình 1.9) [10].
Thời gian tồn tại của B. pseudomallei rất dài, trong nước ở nhiệt độ phòng nó
có thể sống 8 tuần, trong bùn nước có thể lên đến 7 tháng, còn ở trong đất phòng thí
nghiệm có thể được 30 tháng. Ngoài ra, chiếu xạ UV hay ánh sáng mặt trời cũng
ảnh hưởng rất nhiều đến sự sinh trưởng của vi khuẩn. Do đó, ở trong đất, thường
bắt gặp với nồng độ cao ở độ sâu 25 - 120 cm.
1.2.2.1.

Yếu tố gây bệnh

Hệ gen của vi khuẩn B. pseudomallei tương đối lớn chứa 2 chromosomes
với chromosomes I có kích thước 4.07 megabase pairs và chromosomes II là 3.17
megabase pairs[2]. Chúng mã hóa cho một số lượng lớn các yếu tố gây bệnh.
Trong số này bao gồm các polysaccharide bề mặt như polysaccharide bao vi khuẩn
(capsular polysaccharide-CPS) và lipopolysaccharide (LPS), hay hệ thống tiết
chuyên biệt, đặc biệt là cụm 3 hệ thống tiết loại III (T3SS-3) và 1 cụm hệ thống tiết
loại VI (T6SS-1), chúng tạo điều kiện thuận lợi cho sự tồn tại và sinh trưởng trong
tế bào vật chủ. Ngoài ra các yếu tố độc lực còn bao gồm adhesins, roi, và các
protein tiết khác ( phospholipases, proteases) và các chất chuyển hóa thứ cấp.

Nhiều hệ thống liên quan đến độc lực biểu hiện ở B. pseudomallei được quy định
bởi hệ thống hai thành phần (TCSs) hoặc bộ phận cảm ứng (Quorum sensing) [21].
1.2.2.2.

Cơ chế gây bệnh của Burkholderia pseudomallei

B. pseudomallei không phải là tác nhân gây bệnh sống nội ký sinh bắt buộc,
nếu hệ thống phòng thủ của tế bào bị vượt qua, nó mang nhiều thuận lợi hơn một
kiểu sống ngoại ký sinh. Ví dụ như tránh hệ thống miễn dịch của cơ thể, giảm thiểu
sự tiếp xúc với chất kháng sinh từ đó tăng thời gian ủ bệnh và chậm phát tác bệnh.
Lối sống nội ký sinh là điều rất quan trọng cho sự lây lan từ vị trí nhiễm trùng đến
các vị trí khởi phát bệnh sau cùng [25].
B. pseudomallei có thể xâm nhập, sống, và nhân lên ở cả tế bào thực bào lẫn
tế bào không thực bào, và hoạt động nội bào của nó được xem là quan trọng đối

20