Nghiên cứu thu nhận fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ sargassum tại nha trang khánh hòa bằng phương pháp hóa học (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LÊ XUÂN SƠN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN FUCOIDAN KHỐI LƢỢNG
PHÂN TỬ THẤP TỪ RONG MƠ SARGASSUM TẠI NHA
TRANG - KHÁNH HÒA BẰNG PHƢƠNG PHÁP HÓA HỌC
TÓM TĂT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản
Mã số

: 9540105

KHÁNH HÒA - 2018


Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. PGS. TS. Vũ Ngọc Bội
2. TS. Nguyễn Duy Nhứt

Phản biện 1: GS.TS Trần Thị Luyến
Phản biện 2: TS. Khổng Trung Thắng
Phản biện 3: PGS.TS. Nguyễn Hữu Đại

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại Trường
Đại học Nha Trang vào hồi .... giờ .... ngày ..... tháng ..... năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia và Thư viện Trường Đại học
Nha Trang


TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Đề tài luận án: Nghiên cứu thu nhận fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ
Sargassum tại Nha Trang - Khánh Hòa bằng phương pháp hóa học
Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến thủy sản
Mã số:

9540105

Nghiên cứu sinh: ThS. Lê Xuân Sơn
Khóa:

2011

Ngƣời hƣớng dẫn: 1) PGS. TS. Vũ Ngọc Bội
Đại học Nha Trang
2) TS. Nguyễn Duy Nhứt
Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang
Nội dung:
Luận án đã thu được một số kết quả mới bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất
fucoidan và fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ:
1) Luận án đã khảo sát hàm lượng fucoidan từ 5 loài rong mơ Sargassum thu mẫu ở
vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa cho thấy rong mơ S. polycystum có hàm lượng fucoidan
(so với hàm lượng chất khô) cao nhất và đạt mức 3,54 ± 0,02%, tiếp theo thứ tự hàm lượng
fucoidan giảm dần là các loài rong: S. oligocystum với hàm lượng 3,23 ± 0,02%, S. swartzii

với hàm lượng 2,94 ± 0,01%, S. deticarpum với hàm lượng: 2,04 ± 0,00%, S. mcclurei với
hàm lượng 1,34 ± 0,06%.
2) Luận án đã xác định được các điều kiện tối ưu hóa cho quá trình chiết fucoidan từ
rong S. polycystum: chiết bằng dung dịch HCl 2M tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 16/1, pH tối ưu
của dung môi chiết là 3,4, nhiệt độ chiết tối ưu là 770C, trong thời gian chiết tối ưu là 48 phút
và phương thức chiết sử dụng là xay - chiết với hiệu suất chiết đạt 84,17%.
3) Luận án đã xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình phân cắt fucoidan tự
nhiên từ rong S. polycystum tạo thành fucoidan khối lượng phân tử thấp (Khối lượng phân tử
≤100kDa) có hoạt tính làm giảm lipid máu: phân cắt bằng hỗn hợp H2O2/ascorbic acid với
nồng độ tối ưu là 37,5/37,5 (mmol/mmol, ở nhiệt độ tối ưu là 680, thời gian cắt mạch tối ưu là
96 phút và hiệu suất cắt mạch đạt 85,18%.
4) Luận án đã đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của sản phẩm FKLPTT từ rong S. polycystum cho thấy ở liều dùng F-KLPTT 2580 mg/kg/ngày và sử dụng
liên tục trong 7 ngày thì sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp không gây độc với chuột
thí nghiệm, ở liều dùng 1.400mg/kg khối lượng/ngày trong thời gian 90 ngày không gây bất
cứ một ảnh hưởng nào tới trạng thái sinh lý của chuột lang thí nghiệm.
5) Luận án đã đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của fucoidan khối lượng phân tử
thấp từ 05 loài rong mơ (S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei, S. denticarpum, S.
swartzii) ở phân đoạn có khối lượng phân tử 10÷100kDa và phân đoạn có khối lượng phân tử
nhỏ hơn 10kDa cho thấy fucoidan khối lượng phân tử thấp 10÷100kDa từ 03 loài S.
polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei có hoạt tính làm giảm lipid máu của chuột lang sau

1


28 ngày nuôi thử nghiệm.
6) Luận án đã xác định cấu trúc của fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ S.
polycystum sinh trưởng ở vịnh Nha Trang - Khánh Hòa cho thấy cấu trúc một mảnh đại diện
của phân đoạn là: fuc-uro-hexSO3H-hex.
7) Luận án đã nghiên cứu sản xuất thử nghiệm sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử
thấp từ rong mơ S. polycystum sinh trưởng ở vịnh Nha Trang - Khánh Hòa. Kết quả đánh giá

sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp được sản xuất theo quy trình luận án đạt tiêu
chuẩn an toàn thực phẩm về các chỉ tiêu kim loại nặng và vi sinh vật.
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

PGS. TS. Vũ Ngọc Bội

NGHIÊN CỨU SINH

TS. Nguyễn Duy Nhứt

2

Lê Xuân Sơn


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Rong mơ có chứa nhiều hợp chất sinh học có giá trị dược dụng cao. Trong số đó,
fucoidan là polysaccharid có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như hoạt tính chống đông
máu, kháng khuẩn, kháng vi rút, chống ung thư, chống oxy hóa, kháng viêm, miễn dịch và có
hoạt tính làm giảm lipid máu. Nhiều kết quả nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng fucoidan
khối lượng phân tử thấp (F- KLPTT) có hoạt tính sinh học và đặc biệt là hoạt tính làm giảm
lipid máu cao hơn so với fucoidan phân tử lượng lớn.
Từ fucoidan tự nhiên, người ta có thể phân cắt thành (F- KLPTT). Quá trình phân cắt
fucoidan có thể được thực hiện bằng một số phương pháp khác nhau như phương pháp
enzyme, phương pháp hóa học. Trong đó, phương pháp phân cắt fucoidan bằng phương pháp
hóa học sử dụng tác nhân H2O2 kết hợp với axit ascorbic được chứng minh là không ảnh
hưởng đến cấu trúc tự nhiên của fucoidan.
Vùng biển Nha Trang được coi là vùng biển ấm có nguồn lợi rong mơ Sargassum khá
đa dạng về thành phần loài với trữ lượng lớn và có chứa fucoidan với hàm lượng cao. Hiện đã

có một số công trình công bố nghiên cứu về fucoidan từ rong mơ thu mẫu tại vùng biển Nha
Trang. Tuy vậy, chưa có công trình nào công bố về fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong
mơ Nha Trang - Khánh Hòa. Do vậy việc tiến hành nghiên cứu về fucoidan khối lượng phân
tử thấp từ rong mơ Khánh Hòa làm cơ sở cho việc phát triển thương mại hóa sản phẩm
fucoidan khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức năng là hướng nghiên cứu cần
thiết và có triển vọng. Chính vì thế, luận án thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thu nhận fucoidan
khối lượng phân tử thấp từ rong mơ Sargassum tại Nha Trang - Khánh Hòa bằng phương pháp
hóa học”.
2. Mục đích của luận án
Xây dựng qui trình sản xuất fucoidan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính sinh học làm
giảm lipid máu bằng phương pháp hóa học từ nguyên liệu rong mơ Khánh Hòa.
3. Nguyên vật liệu và phạm vi nghiên cứu
3.1. Nguyên vật liệu
+ Nguyên liệu rong: 05 loài rong mơ S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei, S.
denticarpum, S. swartzii thu mẫu tại vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa.
+ Chuột thí nghiệm: Chuột lang (Cavia porcellus), có trọng lượng trung bình 300 ÷
350g/con được sử dụng để đánh giá độc tính và hoạt tính làm giảm lipid máu của sản phẩm FKLPT. Chuột lang do Viện Vaccine và Sinh phẩm Y tế Nha Trang cung cấp.
3.2. Phạm vi nghiên cứu
1) Đánh giá hàm lượng fucoidan của 05 loài rong mơ: S. polycystum, S. mcclurei, S.
oligocystum, S. swartzii, S. denticarpum thu mẫu ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa.
2) Nghiên cứu điều kiện tối ưu tách chiết fucoidan tự nhiên từ loài rong mơ Sargassum
có hàm lượng fucoidan cao nhất trong 05 loài đã được đánh giá.
3) Nghiên cứu điều kiện tối ưu cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành fucoidan khối
lượng phân tử thấp có hoạt tính làm giảm lipid máu bằng tác nhân hỗn hợp hydrogen
peroxide và axit ascorbic.
4) Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của fucoidan khối lượng phân tử thấp thu

3

nhận được trên chuột thí nghiệm.
5) Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của các phân đoạn fucoidan khối lượng phân
tử thấp trên chuột thí nghiệm.
6) Phân tích đặc trưng cấu trúc của fucoidan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính làm
giảm lipid máu.
7) Đề xuất quy trình và sản xuất thử sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp có
hoạt tính làm giảm lipid máu.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại của Việt Nam và thế giới: Xác định hàm
lượng fucoidan bằng phương pháp so màu của Dische và Shettles trên thiết bị ELISA MR96A (Mindray); Xác định thành phần đường đơn của fucoidan bằng phương pháp sắc ký khí
thông qua phản ứng axetyl hóa các sản phẩm thủy phân fucoidan theo kỹ thuật của Nguyễn
Duy Nhứt và cộng sự trên máy GC17A Shimadzu FID; Các phương pháp các định cấu trúc
của fucoidan: Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của fucoidan được đo trên
máy Bruker AVANCE 500, Phổ hồng ngoại IR đo trên máy IMPACT 410 của hãng
NICOLET (Mỹ), Phổ ESI-MS đo trên thiết bị LC/MSD ion trap 1100 tại Viện Hoá Học.
Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn và hoạt tính làm giảm lipid máu của (FKLPTT) trên chuột thí nghiệm. Đồng thời, luận án cũng sử dụng các phương pháp toán học
trong tối ưu hóa quá trình thí nghiệm nhằm đảm bảo kết quả thí nghiệm có độ tin cậy cao.
Các kết quả thí nghiệm đều được xử lý thống kê, kiểm định so sánh các giá trị trung
bình giữa các nhóm bằng phần mềm MS Excel 2010, SPSS 18. Phân tích dữ liệu và tiên đoán
bề mặt đáp ứng bằng phần mềm Modde 5.0
5. Kết cấu của luận án
Luận án bao gồm 170 trang, trong đó: mở đầu: 3 trang, tổng quan: 36 trang, phương
pháp nghiên cứu: 23 trang, kết quả nghiên cứu: 84 trang, kết luận và kiến nghị: 2 trang, danh
mục công trình đã công bố của luận án: 1 trang, tài liệu tham khảo 21 trang. Luận án có 35
bảng, 86 hình, 164 tài liệu tham khảo (tiếng Việt: 13 tài liệu, tiếng Anh: 151 tài liệu) và phụ
lục.

4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ RONG MƠ
1.1.1. Phân loại rong mơ
Ở Việt Nam, có khoảng 147 loài rong nâu, trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum
(rong mơ) có trữ lượng lớn nhất với khoảng 68 loài được phân bố phổ biến ở các vùng ven
biển và đảo. Riêng ở Khánh Hòa, sản lượng khai thác rong mơ tự nhiên ước tính khoảng
7.300 tấn khô/năm trên diện tích phân bố trên 1.167 ha.
Rong mơ Sargassum được phân loại: Ngành Phaeophyta; Lớp: Phaeophyceae; Bộ:
Fucales; Họ: Sargassaceae; Chi: Sargassum.
1.1.2. Cấu trúc thành tế bào rong nâu
Thành phần của thành tế bào rong nâu chủ yếu là cellulose được cấu tạo từ các phân tử
glucose liên kết với nhau nhờ các liên kết β-(1-4)-glucoside. Fucoidan tồn tại trong cấu trúc
thành tế bào rong nâu có thể ở trạng thái tự do hoặc là tạo cầu nối giữa các phân tử cellulose
và alginate bằng các liên kết hydro.
1.2. GIỚI THIỆU VỀ FUCOIDAN
1.2.1. Fucoidan và hoạt tính sinh học
Fucoidan là thuật ngữ gọi tên cho các sulfate polysaccharid có cấu tạo bao gồm 02
thành phần chính là L-fucose và gốc sulfate tồn tại trong thành tế bào của rong nâu. Trong cấu
trúc phân tử fucoidan còn có thể có các gốc đường đơn khác như galactose, glucose, manose,
xylose,… và axit uronic. Hàm lượng fucoidan khoảng từ 2 ÷ 10% so với khối lượng rong khô,
tồn tại trong cấu trúc thành tế bào và không bào của rong nâu, khối lượng trung bình khoảng 7
kDa đến 22.000 kDa tùy thuộc vào từng loài, điều kiện môi địa lý, thời gian thu hoạch của
rong. Hoạt tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của fucoidan rất đa dạng, tùy thuộc vào từng
loài của rong nâu, đặc tính cấu trúc, KLPT,… Fucoidan có khả năng hỗ trợ điều trị rất nhiều
chứng bệnh như kháng rối loạn lipid máu và bệnh vữa xơ động mạch, chống béo phì, kháng
ung thư, điều trị gan, tăng cường hệ miễn dịch, chữa bệnh dạ dày, kháng viêm, chống đông
máu, kiểm soát đường huyết,...
1.2.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam
Ở Việt Nam, fucoidan được các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng
công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam nghiên cứu trong

khoảng hơn 10 năm trở lại đây. Nhìn chung, tình hình nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu
Việt Nam chưa nhiều, các công bố về hoạt tính sinh học cũng mới chỉ được thử nghiệm với
hoạt tính gây độc tế bào, một số ít đặc tính cấu trúc fucoidan của một số loài rong được công
bố. Đặc biệt, việc nghiên điều về F- KLPTT từ các loài rong mơ thu mẫu tại Nha Trang Khánh Hòa và hoạt tính của F- KLPTT hầu như chưa được nghiên cứu và công bố.

5


CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
* Rong mơ nguyên liệu: sử dụng 5 loài rong mơ S. polycystum, S. oligocystum, S.
mcclurei, S. denticarpum, S. swartzii thu mẫu tại vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa.
* Động vật thử nghiệm: chuột lang (Cavia porcellus), có trọng lượng trung bình
300÷350g/con được sử dụng để đánh giá độc tính và hoạt tính sinh học làm giảm lipid máu
của sản phẩm F- KLPTT do đề tài nghiên cứu.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Các phƣơng pháp phân tích
- Định lƣợng fucoidan: phương pháp của Dische và Shettles (1948), fucose được sử
dụng làm chất chuẩn.
- Phƣơng pháp xác định thành phần đƣờng đơn của fucoidan: phương pháp sắc ký
khí thông qua phản ứng axetyl hóa các sản phẩm thủy phân fucoidan theo kỹ thuật của
Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự (2007).
- Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng sulfat và axít uronic: Hàm lượng sulfate và axit
uronic trong phân tử fucoidan được xác định theo phương pháp Scott.
- Phƣơng pháp phân tích đặc tính cấu trúc fucoidan:
+ Phổ hồng ngoại (IR)
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
+ Phổ khối lượng MS
2.2.2. Định lƣợng vi sinh vật
- Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (KL/ g) theo TCVN 4884: 2005

- Xác định Coliforms theo TCVN 6846: 2007
- Xác định E. coli theo TCVN 6848: 2007
- Xác định S. aureus theo TCVN 4830-1: 2005
- Xác định C. perfringens theo TCVN 4991: 2005
- Xác định Salmonella theo TCVN 8342: 2010
- Xác định V. parahaemolyticus theo TCVN 7905-1: 2008
- Xác định tổng số bào tử NM - NM (BT/g) theo TCVN 5166: 1990
2.2.3. Định lƣợng một số thành phần khác
- Xác định độ ẩm theo TCVN 3700: 1990.
- Xác định thủy ngân (Hg) theo TCVN 7604: 2007.
- Xác định Cadmi (Cd) theo TCVN 7603: 2007.
- Xác định chì (Pb) theo TCVN 7602: 2007.
- Xác định Arsen (As) theo TCVN 7601: 2007.
- Xác định thiết (Sn) theo TCVN 7788: 2007.
- Xác định Methyl thủy ngân theo AOAC 988.11.
2.2.4. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm
Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát được thể hiện tại hình 2.1.

6


Rong nguyên liệu
Đánh giá: Hàm lượng fucoidan

Xử lý

Cắt nhỏ

Sấy khô

Nghiên cứu tối ưu hóa
điều kiện tách chiết
fucoidan

Lựa chọn loại rong

Chiết
Lọc lần 1
Bã rong

Dd CaCl2 bão
hòa

Kết tủa aginate canxi
(pH=6,5)

Lọc lần 2
Tạp chất

Lọc lần 3
Ethanol 96%

Kết tủa fucoidan thô
Ly tâm
Sấy

Đánh giá:
Thành phần
hóa học

Fucoidan tự nhiên

Nghiên cứu tối ưu hóa điều
kiện cắt mạch fucoidan tự
nhiên tạo thành fucoidan
KLPT thấp

Cắt mạch
Phân đoạn

Đánh giá chất lượng:
- Thành phần hóa học
- Độc tính của sản phẩm
- Hoạt tính làm giảm lipid máu
- Đặc tính cấu trúc

Fucoidan
KLPT thấp

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Trên cơ sở sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định
các thông số phù hợp cho từng công đoạn.

7


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG FUCOIDAN CÓ TRONG 05 LOÀI RONG MƠ
SARGASSUM THU MẪU TẠI KHÁNH HÕA
Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy hàm lượng fucoidan thu nhận từ loài S.

polycystum tương ứng 3,54±0,02%, cao nhất trong 05 loài rong mơ Sargassum được khảo sát,
thấp nhất là loài rong S. mcclurei (1,34±0,01%). Do vậy, loài rong S. polycystum được luận
án lựa chọn làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu thu nhận F-KLPTT ứng dụng trong hỗ
trợ điều trị làm giảm lipid máu.
3.2. NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT FUCOIDAN TỰ NHIÊN TỪ RONG MƠ S.
POLYCYSTUM
3.2.1. Xác định phƣơng thức chiết fucoidan
Nghiên cứu của Luận án cho thấy sử dụng phương thức xay - chiết với tốc độ quay của
dao 750 vòng/phút trong suốt quá trình chiết cho phép thu fucoidan từ rong S. polycystum với
hiệu suất chiết là 25,84±0,03% cao hơn gấp 1,53 lần so với sử dụng phương thức ngâm chiết
chỉ cho phép thu fucoidan từ rong S. polycystum với hiệu suất là 16,85±0,07%. Do vậy,
phương thức xay – chieetss được Luận án lựa chọn để nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết
fucoidan từ rong mơ S. polycystum.
3.2.2. Xác định tỉ lệ dung môi: nguyên liệu rong (DM/NL)
Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy hiệu suất chiết fucoidan từ rong S. polycystum
tăng khi tỉ lệ DM/NL tăng trong khoảng từ 8/1 (v/w) đến 16/1 (v/w) và đạt giá trị cao nhất tại
tỉ lệ DM/NL là 16/1(v/w), tương ứng với hiệu suất chiết là 29,10±0,29%. Với các tỷ lệ
DM/NL lớn hơn giá trị 16/1, hiệu suất chiết fucoidan tăng ít và không có ý nghĩa thống kê
(p>0,05). Do vậy, Luận án lựa chọn tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu rong là 16/1 (v/w) làm
thông số cố định cho các quá trình nghiên cứu chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum.
3.2.3. Xác định pH dung môi chiết
Nghiên cứu của Luận án cho thấy trong khoảng khảo sát pH có giá trị từ 2 ÷ 9, hiệu suất
chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum đạt giá trị cao nhất 42,94±1,86% tại pH 3 và giá trị
thấp nhất tại pH 9. Do vậy, pH 3 được luận án lựa chọn làm thông số cố định cho các nghiên
cứu tiếp theo và chọn khoảng pH 2 ÷ 5 làm thông số biên cho nghiên cứu tối ưu hóa quá trình
chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum.
3.2.4. Xác định nhiệt độ chiết
Nghiên cứu của Luận án cho thấy trong khoảng nhiệt độ 600C ÷ 900C, nhiệt độ thích
hợp cho quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum là 800C. Vì vậy, luận án lựa chọn
nhiệt độ 800C là thông số cố định cho quá trình nghiên cứu chiết chiết fucoidan từ rong mơ S.

polycystum tiếp theo và chọn khoảng nhiệt độ 600C ÷ 900C làm thông số biên cho nghiên cứu
tối ưu hóa quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum.
3.2.5. Xác định thời gian chiết
Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy trong khoảng thời gian chiết từ 40 ÷ 60 phút,
hiệu suất chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum đạt giá trị cao nhất 82,67% khi thời gian
gian chiết là 50 phút. Vì vậy, luận án lựa chọn khoảng thời gian chiết từ 40 ÷ 60 làm thông số
biên cho nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum.

8


3.3. TỐI ƢU HÓA QUÁ TRÌNH CHIẾT FUCOIDAN TỪ RONG MƠ S.
POLYCYSTUM THEO PHƢƠNG PHÁP BOX-WILSON
Từ kết quả nghiên cứu xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết fucoidan từ
rong mơ S. polycystum, Luận án lựa chọn thông số biên cho quá trình nghiên cứu tối ưu công
đoạn chiết: Nhiệt độ (Z1): 60 ÷ 90 (0C); thời gian xay chiết (Z2): 40 ÷ 60 (phút); pH: (Z3): 2 ÷
5 để tìm điều kiện chiết tối ưu phù hợp với hàm mục tiêu - hiệu suất chiết fucoidan. Kết quả
quy hoạch thực nghiệm được thể hiện tại bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết fucoidan ở các điều kiện khác nhau
Số TN

Z1

Z2

Z3

X1

X2

X3

Y (%)

1

60

40

2,0

-1

-1

-1

70,91

2

90

40

2,0

1

-1

-1

72,39

3

60

60

2,0

-1

1

-1

70,25

4

90

60

2,0

1

1

-1

71,81

5

60

40

5,0

-1

-1

1

70,58

6

90

40

5,0

1

-1

1

71,06

7

60

60

5,0

-1

1

1

69,91

8

90

60

5,0

1

1

1

69,44

9

60

50

3,5

-1

0

0

81,21

10

90

50

3,5

1

0

0

82,11

11

75

40

3,5

0

-1

0

83,63

12

75

60

3,5

0

1

0

81.91

13

75

50

2,0

0

0

-1

76,21

14

75

50

5,0

0

0

1

74,84

15

75

50

3,5

0

0

0

83,63

16

75

50

3,5

0

0

0

83,69

17

75

50

3,5

0

0

0

83,51

Investigation: Chiet (PLS, comp.=2)

Investigation: Chiet (PLS, comp.=2)

Investigation: Chiet (PLS, comp.=2)

Response Surface Plot

Response Surface Plot

Response Surface Plot

Hieu s uat

Hieu
Nhiet
dos=uat
75

Hieu s uat

Thoi gian = 50

Hình 3.1. Mô hình 3D bề mặt đáp ứng tối ƣu hóa của các yếu tố tới hiệu suất chiết
fucoidan từ rong mơ S. polycystum
Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm với sự hỗ trợ của phần mềm Modde 5.0, kết quả
thu được phương trình hồi quy của hiệu suất chiết fucoidan như sau:

9


Y = 84,04 + 0,44X1 - 0,59X2 - 0,64X3 -1,78X12 - 1,15X22- 5,29X32
Kết quả tối ưu hóa công đoạn chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum: Nhiệt độ chiết
77 C, thời gian chiết 48 phút, pH của dung môi chiết: 3,4.
0

3.4. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN TỰ NHIÊN
Kết quả phân tích cho thấy thành phần mol của L-Fucose chiếm tỉ lệ cao nhất 40,48%, kế đến là D
Galactose chiết tỷ lệ 26,75% và D Glucose chiếm tỉ lệ thấp nhất là 6,07%. Hàm lượng sulfate
được quy về SO3Na chiếm tỉ lệ 25,6% (w/w), axit uronic chiếm tỉ lệ 23,74% (w/w) so với
tổng lượng mẫu phân tích.
3.5. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT FUCOIDAN TỰ NHIÊN
Rong khô nguyên liệu

Xử lý
+ Tỉ lệ Dung
môi/rong:16/1
+ pH:3,4
+ Nhiệt độ:770C
+ Thời gian:48 phút

Rửa

Xay chiết

Lọc lần 1
Bã rong
Dd CaCl2 bão hòa

Kết tủa aginate canxi
(pH=6,5)
Alginate canxi
Lọc lần 2
Tạp chất

Lọc lần 3

Ethanol 96%

Kết tủa fucoidan thô

Ly tâm

Sấy

Fucoidan tự nhiên

Hình 3.2. Sơ đồ quy trình thu nhận fucoidan tự nhiên từ rong mơ S. polycystum

10


Thuyết minh quy trình

Từ các kết quả nghiên cứu đã thu được, luận án đề xuất quy trình thu nhận fucoidan tự
nhiên từ rong mơ S. polycystum trình bày ở hình 3.2.
* Rong nguyên liệu: rong mơ S. polycystum sinh trưởng ở vùng biển Nha Trang Khánh Hòa, thời gian thu hoạch rong vào khoảng tháng 4 và tháng 5 hàng năm
* Xử lý: sau khi thu hoạch, rong được rửa sạch tạp chất, chất bẩn bám trên rong bằng
nước biển sạch, phân loại và sấy khô, đạt tiêu chuẩn.
* Rửa: Trước khi tiến hành xay chiết, rong khô được rửa bằng nước ngọt để loại bỏ
muối, vi sinh vật bám trên rong và các tạp chất khác.
* Xay chiết: Chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum trong điều kiện tối ưu: Tỷ lệ
DM/NL 16/1, pH 3,4, nhiệt độ chiết 770C và thời gian xay chiết 48 phút. Phương pháp chiết
ngâm dầm có sử dụng xay chiết với tốc độ 750 v/p.
* Lọc lần 1: sau công đoạn xay - chiết, tiến hành lọc để loại bỏ bã rong bằng vải lọc có
kích thước lỗ 100 micron và thu dịch chiết fucoidan.
* Kết tủa alginat canxi: kết tủa acid alginic bằng dung dịch CaCl2 bão hòa để tạo tủa
alginate.
* Lọc lần 2: sau khi tủa alginate canxi, tiến hành lọc hỗn hợp qua vải để loại bỏ kết tủa
thu dịch lọc.
* Lọc lần 3: lọc dịch qua cột cát và than hoạt tính nhằm loại bỏ các tạp chất, tiếp tục dịch lọc
được cho chảy qua cột nhựa trao đổi cation để loại bỏ các ion kim loại nặng tồn tại trong dịch
rong.
* Kết tủa fucoidan: sử dụng ethanol 96 để kết tủa fucoidan ở nồng độ 65%.
* Ly tâm: tiến hành ly tâm ở 3.000 v/p.
* Sấy: tiến hành sấy khô kết tủa fucoidan ở nhiệt độ 650C trong thời gian 12 giờ, thu
được bột fucoidan tự nhiên.
3.6. NGHIÊN CỨU TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN CẮT MẠCH FUCOIDAN TỰ NHIÊN TẠO
THÀNH FUCOIDAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP
3.6.1. Xác định nồng độ H2O2/ascorbic acid
Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy, nồng độ H2O2/ascorbic acid phù hợp cắt
mạch fucoidan thành F-KLPTT là 35/35 mmol/mmol. Do vậy, Luận án lựa chọn giá trị nồng
độ nồng độ H2O2/ascorbic acid: 35/35 mmol/mmol là thông số cố định cho quá trình nghiên
cứu điều kiện cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành F-KLPTT tiếp theo.

3.6.2. Xác định nhiệt độ
Nghiên cứu của Luận án cho thấy nhiệt độ thích hợp để cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo
thành F-KLPTT là 600C. Do vậy, nhiệt độ 600C được Luận án lựa chọn là thông số cố định
cho quá trình nghiên cứu điều kiện cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành F-KLPTT tiếp theo.
3.6.3. Xác định thời gian cắt mạch fucoidan
Từ kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy thời gian thích hợp cắt mạch fucoidan tự
nhiên thành F-KLPTT là 90 phút.

11


3.7. TỐI ƢU HÓA CÔNG ĐOẠN CẮT MẠCH FUCOIDAN TỰ NHIÊN THÀNH
FUCOIDAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP
Từ kết quả nghiên cứu xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cắt mạch fucoidan,
Luận án lựa chọn các thông số biên cho quá trình nghiên cứu tối ưu công đoạn cắt mạch
fucoidan tự nhiên tạo thành F-KLPTT là nhiệt độ (U1): 50 ÷ 90 (0C); thời gian (U2): 75 ÷ 105
(phút); nồng độ H2O2/ascorbic acid (U3): 30/30 ÷ 40/40(mmol/mmol). Hàm mục tiêu - Hiệu
suất cắt mạch fucoidan tạo thành F-KLPTT, kết quả thực nghiệm được trình bày tại bảng 3.2.
Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm bằng phần mềm Modde 5.0 thu được phương trình
hồi quy thể hiện hiệu suất cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành F-KLPTT như sau:
Y = 82,16 – 0,67X1 + 0,93X2 + 11,36X3 – 2,59X12 – 1,62X22 – 11,41X32
Bảng 3.2. Hiệu suất cắt mạch fucoidan ở các điều kiện khác nhau
Số TN

U1

U2

U3

X1

X2

X3

1

50

75

30

-1

-1

-1

Y
55,08

2

90

75

30

1

-1

-1

53,98

3

50

105

30

-1

1

-1

56,99

4

90

105

30

1

1

-1

54,63

5

50

75

40

-1

-1

1

77,94

6

90

75

40

1

-1

1

75,84

7

50

105

40

-1

1

1

79,88

8

90

105

40

1

1

1

77,78

9

50

90

35

-1

0

0

79,17

10

90

90

35

1

0

0

80,11

11

70

75

35

0

-1

0

79,21

12

70

105

35

0

1

0

82,02

13

70

90

30

0

0

-1

59,39

14

70

90

40

0

0

1

82,25

15

70

90

35

0

0

0

81,75

16

70

90

35

0

0

0

81,58

17

Investigation: Thuy phan (MLR)

90

35

70

Response Surface Plot
Hieu s uat

Investigation: Thuy phan (MLR)

0

Response Surface Plot
Hieu s uat
Nhietdo = 70

0

82,83

Investigation: Thuy phan (MLR)

0

Response Surface Plot
Hieu sThoigian
uat
= 90

Hình 3.3. Mặt đáp tối ƣu thực nghiệm của các yếu tố tới hiệu suất cắt mạch
fucoidan tụ nhiên tạo F- KLPTT

12


Kết quả tối ưu điều kiện cắt mạch fucoidan tạo thành fucoidan KLPTT: Nhiệt độ 680C,
thời gian 96 phút và nồng độ H2O2/ascorbic acid là 37,5/37,5 (mmol/mmol).
3.8. ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI CỦA SẢN PHẨM FUCOIDAN KLPTT TỪ RONG MƠ
S. POLYCYSTUM THEO THỜI GIAN BẢO QUẢN
Kết quả phân tích HPLC của sản phẩm F-KLPTT bảo quản ở nhiệt độ 40C không có sự
biến đổi trong thời gian 24 tháng được thể hiện tại hình 3.4 và hình 3.5

Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT
Hình 3.5. Sắc ký đồ HPLC F-KLPTT sau
ở thời điểm ban đầu
24 tháng bảo quản ở nhiệt độ 40C
Kết quả phân tích HPLC của sản phẩm F-KLPTT bảo quản trong điều kiện bình thường
ở nhiệt độ phòng được thể hiện tại các hình 3.6 ÷ 3.19.

Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của
F-KLPTT tại tháng thứ 2

Hình 3.7. Sắc ký đồ HPLC của
F-KLPTT tại tháng thứ 4

Hình 3.8. Sắc ký đồ HPLC của
F-KLPTT tại tháng thứ 7

Hình 3.9. Sắc ký đồ HPLC của
F-KLPTT tại tháng thứ 9

Hình 3.10. Sắc ký đồ HPLC

của F-KLPTT tại tháng thứ 11

Hình 3.11. Sắc ký đồ HPLC
của F-KLPTT tại tháng thứ 13

Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC
Hình 3.13. Sắc ký đồ HPLC
của F-KLPTT tại tháng thứ 15 của F-KLPTT tại tháng thứ 17

Hình 3.14. Sắc ký đồ HPLC
của F-KLPTT tại tháng thứ 19

13


Hình 3.15. Sắc ký đồ HPLC
của F-KLPTT tại tháng thứ 20

Hình 3.16. Sắc ký đồ HPLC
của F-KLPTTtại tháng thứ 21

Hình 3.18. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại
tháng thứ 23

Hình 3.17. Sắc ký đồ HPLC
của F-KLPTT tại tháng thứ 22

Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của F-KLPTT tại
tháng thứ 24

Fucoidan KLPTT bảo quản ở nhiệt độ 40C không có sự biến đổi trong thời gian 24
tháng, nhưng khi fucoidan KLPTT được bảo quản trong điều kiện bình thường thì tại thời
điểm tháng thứ 19, trên sắc ký đồ xuất hiện peak mới, chứng tỏ đã xảy ra phân rã.
3.9. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CẮT MẠCH FUCOIDAN TỰ NHIÊN TẠO THÀNH
F- KLPTT
Quy trình cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành fucoidan KLPTT được trình bày tại hình 3.20.
Thuyết minh quy trình:
* Chuẩn bị dung dịch fucoidan 1%: Hòa tan fucoidan tự nhiên thu được từ quy trình
thu nhận fucoidan từ rong mơ Sargassum trong nước cất 2 lần, đạt nồng độ dung dịch
fucoidan 1%.
* Cắt mạch: sử dụng thiết bị khuấy từ có gia nhiệt để cắt mạch fucodidan tự nhiên tạo
thành fucoidan KLPTT. Quá trình cắt mạch được thực hiện trong điều kiện tối: nhiệt độ 680C,
nồng độ H2O2/ascorbic acid 37,5/37,5 (mmol/mmol) thời gian cắt mạch 96 phút.
* Bất hoạt bất hoạt H2O2/ascorbic acid: bất hoạt bất hoạt H2O2/ascorbic acid bằng
dung dịch tiến hành điều chỉnh pH của hỗn hợp về 6,5 bằng dd NaOH 30% .
* Lọc rây phân tử kích thƣớc 100kDa: phân đoạn phân tử fucoidan bằng hệ thống lọc
rây phân tử có kích thước rây 100kDa, dung dịch fucoidan KLPT được chia làm 2 phần. Phần
dung dịch chứa fucoidan có KTPT lớn hơn 100kDa cho quay lại công đoạn cắt mạch ở điều
kiện nồng độ H2O2/ascorbic là 37,5mmol/37,5mmol, nhiệt độ: 680C và thời gian 96 phút.
Phần dung dịch fucoidan có KTPT nhỏ hơn 100kDa tiếp tục đi qua hệ thống lọc rây phân tử
kích thước lọc 10kDa.
* Lọc rây phân tử kích thƣớc 10kDa: dung dịch fucoidan KLPTT có KTPT nhỏ hơn
100kDa đi qua hệ thống lọc rây phân tử có kích thước 10kDa.

14


* Kết tủa và ly tâm fucoidan KLPTT: kết tủa fucoidan KLPTT ở mỗi phân đoạn bằng
ethanol 96%. Tiến hành ly tâm thu kết tủa fucoidan KLPTT gồm 02 phân đoạn: fucoidan
KLPTT có KLPT trong khoảng (10 ÷ 100kDa] và fucoidan KLPTT có KLPT nhỏ hơn 10kDa.

* Sấy: Tiến hành sấy fucoidan KLPTT trong điều kiện nhiệt độ sấy 650C trong thời gian
sấy 12 giờ, thu nhận 02 sản phẩm fucoidan KLPTT: fucoidan KLPTT có KLPT lớn hơn
10kDa và fucoidan có KLPT nhỏ hơn hoặc bằng 10kDa.
Dd fucoidan 1%
+ H2O2/ascorbic:37,5mmol/37,5mmol
+ Nhiệt độ:680C
+ Thời gian:96 phút

Cắt mạch
Bất hoạt H2O2/ axit
ascorbic
Lọc rây phân tử kích thước100kDa

Dd fucoidan
KLPT≤100kDa

Dd fucoidan
KLPT>100kDa

Lọc rây phân tử kích thước10kDa

Dd fucoidan
KLPT≤10kDa

Dd fucoidan
KLPT>10kDa

Kết tủa và ly tâm fucoidan KLPT thấp
Fucoidan
KLPT≤10kDa

Fucoidan
KLPT>10kDa
+ Nhiệt độ:650C
+ Thời gian:12 giờ

Sấy

Fucoidan
KLPT≤10kDa

Fucoidan
KLPT>10kDa

Hình 3.20. Quy trình phân cắt fucoidan tự nhiên tạo thành fucoidan KLPTT
3.10. CÁC ĐẶC TÍNH CỦA SẢN PHẨM FUCOIDAN KHỐI LƢƠNG PHÂN TỬ THẤP
3.10.1. Thử nghiệm sản xuất fucoidan khối lƣợng phân tử thấp
Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy các sản phẩm fucoidan KLPTT được sản xuất
từ fucoidan tự nhiên thu nhận từ 05 loài rong mơ Sargassum đều có khối lượng phân tử trung
bình nằm trong khoảng 10kDa trình phân cắt theo quy trình đã đề xuất đều tạo được fucoidan KLPTT theo quan điểm của
Shouzhu HAO (2009).

15


Bảng 3.3. Khối lƣợng phân tử và kí hiệu của các phân đoạn F-KLPTT từ 5 loài rong Sargassum
STT
1

Loài rong
S. polycystum

2
3

S. oligocystum

4
5

S. mcclurei

6
7

S. denticarpum

8
9
10

S. swartzii

Khối lƣợng phân tử

Kí hiệu phân đoạn

10kDa

Pol.H10

KLPT≤10kDa

Pol.L10

10kDa
Oli.H10

KLPT≤10kDa

Oli.L10

10kDa
Mcc.H10

KLPT≤10kDa

Mcc.L10

10kDa
Den.H10

KLPT≤10kDa

Den.L10

10kDa
Swa.H10

KLPT≤10kDa

Swa.L10

3.10.2. Xác nhận sự có mặt của nhóm fucose và sulfate trong phân tử
polysaccharide của sản phẩm F-KLPTT
Luận án đã tiến hành phân tích phổ hồng ngoại IR và phổ cộng hưởng từ 1H-NMR để
xác nhận sự có mặt của nhóm fucose và sulfate trong phân tử polysaccharide.
3.10.2.1. Đặc trƣng cấu trúc từ phổ hồng ngoại IR
Tiến hành phân tích phổ phổ hồng ngoại IR của F-KLPTT từ 05 loài rong mơ
Sargassum (S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei, S. denticarpum, S. swartzii), kết quả
được trình bày tại các hình 3.21 đến hình 3.30.

Hình 3.21. Phổ IR của Pol.H10

Hình 3.22. Phổ IR của Pol.L10

Hình 3.23. Phổ IR của Oli.H10

Hình 3.24. Phổ IR của Oli.L10

16


Hình 3.25. Phổ IR của Mcc.H10

Hình 3.26. Phổ IR của Mcc.L10

Hình 3.27. Phổ IR của Den.H10

Hình 3.28. Phổ IR của Den.L10

Hình 3.29. Phổ IR của Swa.H10

Hình 3.20. Phổ IR của Swa.L10

Từ kết quả phân tích trên phổ IR của 10 mẫu fucoidan cho thấy gốc sulfate gắn ở vị trí
equatorial tại vị trí C2 hoặc/và C3 của vòng α-L-fucose.
Pol.HMW.HNMR
POL.H10.HNMR

3.10.2.2. Các đặc tính cấu trúc thu đƣợc từ phổ cấu trúc 1H-NMR
Kết quả phân tích phổ cấu trúc 1H-NMR của F- KLPTT từ 05 loài rong mơ Sargassum
(S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei, S. denticarpum, S. swartzii) được trình bày tại các
hình 3.31÷3.40 đã chứng tỏ các sản phẩm có mặt gốc đường fucose trong mạch polysaccharid
của 10 mẫu sản phẩm F- KLPTT.
Pol.HMW.HNMR
POL.H10.HNMR

Pol.LMW.HNMR
POL.L10.HNMR

Hình 3.31. Phổ 1H-NMR của Pol.H10

Hình 3.32. Phổ 1H-NMR của Pol.L10

Pol.LMW.HNMR
POL.L10.HNMR

17


Oli.LMW.HNMR

Oli.HMW.HNMR

Mcc.HMW.HNMR

Hình 3.33. Phổ 1H-NMR của Oli.H10

Hình 3.34. Phổ 1H-NMR của Oli.L10

Oli.LMW.HNMR

MCC.LMW.HNMR
Den.HMW.HNMR

Mcc.HMW.HNMR

Hình 3.35. Phổ 1H-NMR của Mcc.H10

Hình 3.36. Phổ 1H-NMR của Mcc.L10

MCC.LMW.HNMR

Den.LMW.HNMR

Den.HMW.HNMR

Swa.HMW.HNMR
SWA.H10.HNMR

Hình 3.37. Phổ 1H-NMR của Den.H10

Hình 3.38. Phổ 1H-NMR của Den.L10

Den.LMW.HNMR

Swa.HMW.HNMR
SWA.H10.HNMR

Swa.LMW.HNMR
SWA.L10.HNMR

Hình 3.39. Phổ 1H-NMR của Swa.H10

Hình 3.30. Phổ 1H-NMR của Swa.L10

Swa.LMW.HNMR
SWA.L10.HNMR

Từ kết quả phân tích phổ hồng ngoại IR và phổ 1H-NMR và của các mẫu F-KLPTT từ 5
loài rong mơ (S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei, S. denticarpum, S. swartzii) đã cho
thấy sản phẩm là polysaccharide có chứa nhóm fucose và sulfate. Trong đó, gốc sulfate gắn ở
vị trí equatorial tại vị trí C2 hoặc/và C3 của vòng α-L-fucose.
3.11. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƢỜNG DIỄN CỦA SẢN PHẨM

F- KLPTT
3.11.1. Đánh giá độc tính cấp của sản phẩm fucoidan KLPTT
* Về cân nặng của chuột thí nghiệm:
Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy không có sự sai khác về khối lượng trung
bình giữa của các nhóm chuột uống fucoidan KLPTT với các liều uống 630mg/kg,

18


1882mg/kg và 2580mg/kg so với nhóm chứng không uống fucoidan KLPTT. Kết quả này
chứng tỏ fucoidan KLPTT không độc với chuột thí nghiệm.
* Về kết quả giải phẫu chuột thí nghiệm:
Kết quả giải phẫu chuột của Luận án cũng cho thấy không có sự sai khác về khối lượng
trung bình của thận, gan, lách giữa các nhóm chuột uống fucoidan với các liều uống
630mg/kg, 1882mg/kg và 2580mg/kg và nhóm chứng không uống fucoidan KLPPT. Chứng
tỏ fucoidan KLPPT không độc với chuột thí nghiệm.
3.11.2. Đánh giá độc tính bán trƣờng diễn
* Đánh giá độ đồng nhất của chuột thử nghiệm
Kết quả phân tích phương sai một yếu tố, kiểm định Duncan cho thấy các chuột sử dụng
trong thí nghiệm không khác nhau về các chỉ số huyết học. Như vậy các nhóm chuột thí
nghiệm đều có trạng thái sinh lý khỏe mạnh trước khi thí nghiệm.
* Đánh giá chỉ số huyết học của chuột lang uống sản phẩm fucoidan KLPTT
Kết quả đánh giá chỉ số huyết học của chuột lang cho uống sản phẩm fucoidan KLPTT
sản xuất theo quy trình của luận án với liều uống trung bình 1.400 mg/kg/ngày và uống liên
tục trong 90 ngày cho thấy chuột lang uống fucoidan KLPTT không có bất cứ một sự thay đổi
bất thường nào về trị số huyết học.
* Đánh giá khối lƣợng cơ thể, nội tạng của chuột uống sản phẩm fucoidan KLPTT
+ Về khối lƣợng cơ thể chuột: Kết quả đánh giá cho thấy chuột lang uống sản phẩm
fucoidan KLPTT từ rong mơ S. polycystum với liều uống trung bình 1.400mg/kg/ngày sau 90
ngày nuôi không có bất kỳ sự thay đổi bất thường về khối lượng. Kết quả này chứng tỏ

fucoidan KLPTT không gây độc đối với chuột lang thí nghiệm.
+ Về khối lƣợng nội tạng chuột: Kết quả đánh giá cho thấy chuột lang uống sản phẩm
fucoidan KLPTT từ rong mơ S. polycystum với liều 1.400mg/kg cơ thể/ngày không có bất cứ
một biến đổi bất thường nào về khối lượng nội tạng sau 90 ngày nuôi. Kết quả này chứng tỏ
fucoidan KLPTT không gây độc đối với chuột lang thí nghiệm.
3.12. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH LÀM GIẢM LIPID MÁU CỦA CÁC PHÂN
ĐOẠN F- KLPTT TỪ CÁC LOÀI RONG KHÁC NHAU
3.12.1. Đánh giá các chỉ số lipid máu của chuột dùng thử nghiệm
Kết quả đánh giá của Luận án cho thấy các nhóm chuột lang được chọn dùng trong đánh
giá hoạt tính làm giảm lipid máu của sản phẩm fucoidan KLPTT đồng nhất về các chỉ tiêu
lipid máu tại thời điểm ban đầu và hoàn toàn bình thường về các chỉ tiêu sinh hóa máu.
3.12.2. Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của F- KLPTT
* Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của F- KLPTT từ rong mơ S. polycystum
Kết quả đánh giá của Luận án cho thấy sản phẩm fucoidan KLPTT Pol.H10 (100
kDa≥KLPT>10kDa) có tác dụng làm giảm lipid máu của chuột lang sau 28 ngày nuôi thử
nghiệm.
* Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của F- KLPTT từ rong mơ S. oligocystum
Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy fucoidan có KLPT trong khoảng (10
÷100kDa] (Oli.H10) có hoạt tính làm giảm lipid máu trên chuột lang và fucoidan có KLPT

19


nhỏ hơn 10 kDa (Oli.L10) không có hoạt tính làm giảm lipid máu trên chuột lang sau 28 ngày
nuôi thử nghiệm.
* Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của F- KLPTT từ rong mơ S. mcclurei
Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy fucoidan có KLPT trong khoảng (10
÷100kDa) cũng có hoạt tính làm giảm lipid máu trên chuột lang và fucoidan KLPT nhỏ hơn
10 kDa (Mcc.L10) không có hoạt tính làm giảm lipid máu trên chuột lang sau 28 ngày nuôi
thử nghiệm.

* Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của F- KLPTT từ rong mơ S.
denticarpum
Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy F-KLPTT từ rong mơ S. denticarpum ở cả 02
phân đoạn có KLPT (10 ÷ 100kDa) và phân đoạn KLPT nhỏ hơn 10kDa không có hoạt tính
làm giảm lipid máu trên chuột lang sau 28 ngày nuôi thử nghiệm.
* Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của F- KLPTT từ rong mơ S. swartzii
Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy cả 02 phân đoạn có KLPT trrong khoảng (10
÷100kDa) và phân đoạn KLPT nhỏ hơn 10kDa từ rong mơ S. swartzii không có hoạt tính làm
giảm lipid máu trên chuột lang sau 28 ngày nuôi thử nghiệm.
3.13. PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH CẤU TRÖC CỦA PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN
Pol.H10 CÓ HOẠT TÍNH LÀM GIẢM LIPID MÁU
3.13.1. Thành phần hóa học của phân đoạn fucoidan Pol.H10 từ rong mơ S.
polycystum
Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy thành phần hóa học của phân đoạn fucoidan
Pol.H10 từ S. polycystum có thành phần gồm các gốc đường như fucose, galactose, glucose,
mannose,... và các nhóm điện tích như sulfate và axit uronic tương tự như mẫu fucoidan tự
nhiên từ rong S. polycystum. Trong đó, thành phần mol của L-Fucose là 41,04%, D galactose
là 26,71% và hàm lượng D glucose chiếm tỉ lệ thấp nhất là 6,01%. Hàm lượng sulfate được
quy về SO3Na chiếm tỉ lệ 24,90% (w/w), axit uronic chiếm tỉ lệ 21,35% (w/w) so với tổng
lượng mẫu phân tích.
3.13.2. Đặc trƣng cấu trúc của phân đoạn fucoidan Pol.H10 thể hiện qua phổ NMR
và phổ IR
* Phổ 13C-NMR và phổ IR
* Phổ 13C-NMR

* Phổ 1H-NMR

Hình 3.31. Phổ 13C-NMR của mẫu Pol.H10

Hình 3.32. Phổ 1H-NMR của mẫu Pol.H10

20


* Phổ 1H-NMR

* Phổ H-HCOSY

Hình 3.33. Phổ H-HCOSY của mẫu Pol.H10


Hình 3.34. Phổ IR của mẫu Pol.H10

Phổ khối MS+n

Phổ +MS cho thấy phân đoạn có mảnh chủ yếu là 251 và 233

Hình 3.35. Phổ MS+n của mẫu fucoidan Pol.H10

Hình 3.36. Phổ khối MS2 của mảnh 251

Hình 3.37. Phổ khối MS2 của mảnh 233

Từ kết quả phân tích thành phần hóa học, phổ NMR, IR, MS cho thấy cấu trúc một
mảnh đại diện của phân đoạn của fucoidan KLPTT từ rong mơ S. polycystum là:
fuc-uro-hexSO3H-hex
Trong đó, thành phần đường chủ yếu trong mạch phân tử polysaccharide là gốc -Lfucose và β-D-Galactose, liên kết đường chủ yếu là (1→3)-α-L-Fucp, một phần liên kết
(1→4)-α-L-Fucp, nhóm sulfate ở vị trí C2 của vòng fucose chiếm ưu thế.
3.14. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT FUCOIDAN KHỐI LƢỢNG PHÂN
TỬ THẤP TỪ RONG NÂU SARGASSUM POLYCYSTUM

21


Từ các nghiên cứu của Luận án cho phép đề xuất quy trình sản xuất (F- KLPTT) từ rong
mơ S. polycystum được trình bày tại hình 3.37.
Rong mơ nguyên liệu

Xử lí

Rửa

+ Dung môi/rong: 16/1(v/w)
+ pH: 3,4
+ Nhiệt độ: 770C
+ Thời gian: 48 phút

Xay - chiết
Lọc lần 1

Dd CaCl2 bão hòa

Bã rong

Kết tủa aginat canxi
(pH=6,5)

Lọc lần 2
Tạp chất

Lọc lần 3
Ethanol 96%

Kết tủa fucoidan

Sấy

Ly tâm

Sản phẩm fucoidan tự nhiên
Hòa tan

+ H2O2/ascorbic acid:
37,5mmol/37,5mmol
+ Nhiệt độ: 680C
+ Thời gian: 96 phút

Cắt mạch fucoidan
Bất hoạt H2O2/ascorbic acid
Lọc rây phân tử kích thước100kDa
lần 1
Dd fucoidan KLPT>100kDa
Lọc rây phân tử kích thước10kDa

Dd fucoidan KLPT≤10kDa
Ethanol 96%

Dd fucoidan KLPT>10kDa

Kết tủa phân đoạn fucoidan KLPTT và Ly tâm

Fucoidan KLPT≤10kDa

Fucoidan KLPT>10kDa

Sấy (t=650C; τ=12 giờ)

Fucoidan
KLPT>10kDa

Fucoidan
KLPT≤10kDa

Hình 3.38. Quy trình sản xuất fucoidan KLPTT từ rong mơ S. polycystum
Thuyết minh quy trình:

22


* Rong nguyên liệu: rong mơ S. polycystum sinh trưởng ở vùng biển Nha Trang Khánh Hòa đã đạt độ trưởng thành.
* Xử lý: sau khi thu hoạch, rong được rửa sạch tạp chất, chất bẩn bám trên rong bằng
nước biển sạch, phân loại và sấy khô, đạt tiêu chuẩn.
* Rửa: rong được rửa bằng nước ngọt nhằm loại bỏ muối, vi sinh vật trên cây rong và
các tạp chất khác.
* Xay chiết: điều kiện chiết tối ưu fucoidan từ rong mơ S. polycystum là tỷ lệ DM/NL
16/1, pH 3,4, nhiệt độ chiết 770C và thời gian xay chiết 48 phút.
* Lọc lần 1: sau công đoạn xay - chiết, tiến hành lọc bằng vải lọc có kích thước lỗ 100
micron và thu dịch chiết fucoidan.
* Kết tủa alginat canxi: Điều chỉnh pH của dịch lọc về pH 6,5 bằng dung dịch NaOH
30% và bổ sung dung dịch CaCl2 bão hòa vào khuấy đều đến khi không còn kết tủa alginat

canxi tạo thành.
* Lọc lần 2: Sau khi tủa alginate canxi tiến hành lọc qua vải lọc có kích thước lỗ 100
micron để loại bỏ kết tủa thu dịch lọc.
* Kết tủa fucoidan: sử dụng ethanol 96% để kết tủa fucoidan ở nồng độ 65%.
* Ly tâm: tiến hành ly tâm thu kết tủa 3.000v/p.
* Sấy: sấy khô ở nhiệt độ 650C trong thời gian 12 giờ, thu được bột fucoidan tự nhiên.
* Hòa tan: Hòa tan fucoidan tự nhiên trong nước cất 2 lần để đạt nồng độ dung dịch
fucoidan 1%.
* Cắt mạch: Quá trình cắt mạch được thực hiện trong điều kiện tối: nhiệt độ 680C,
nồng độ H2O2/ascorbic acid 37,5/37,5 (mmol/mmol) thời gian cắt mạch 96 phút.
* Bất hoạt bất hoạt H2O2/ascorbic acid: Tiến hành bất hoạt bất hoạt H2O2/ascorbic
acid bằng dung dịch tiến hành điều chỉnh pH của hỗn hợp về 6,5 bằng dd NaOH 30%.
* Lọc rây phân tử kích thƣớc 100kDa: phân đoạn phân tử fucoidan bằng hệ thống lọc
rây phân tử có kích thước rây 100kDa, dung dịch fucoidan KLPT được chia làm 2 phần. Phần
dung dịch chứa fucoidan có KTPT lớn hơn 100kDa cho quay lại công đoạn cắt mạch ở điều
kiện tối ưu.
* Lọc rây phân tử kích thƣớc 10kDa: sau quá trình lọc, dung dịch được chia làm 2
phần. Phần dung dịch fucoidan có KLPT trong khoảng (10 ÷ 100kDa] và dung dịch fucoidan
KLPTT có KLPT nhỏ hơn 10kDa.
* Kết tủa và ly tâm fucoidan KLPTT: kết tủa fucoidan KLPTT ở mỗi phân đoạn bằng
ethanol 96%. Tiến hành ly tâm thu kết tủa fucoidan KLPTT gồm 02 phân đoạn: fucoidan
KLPTT có KLPT trong khoảng (10 ÷ 100kDa] và fucoidan KLPTT có KLPT nhỏ hơn 10kDa.
* Sấy: Tiến hành sấy fucoidan KLPTT trong điều kiện nhiệt độ sấy 650C trong thời gian
sấy 12 giờ, thu nhận 02 sản phẩm fucoidan KLPTT: fucoidan KLPTT có KLPT lớn hơn
10kDa và fucoidan có KLPT nhỏ hơn hoặc bằng 10kDa.
3.15. SẢN XUẤT THỬ VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG SẢN PHẨM FUCOIDAN
KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP
3.15.1. Phân tích kim loại nặng và vi sinh của sản phẩm F- KLPTT
Kết quả phân tích sản phẩm F- KLPTT sản xuất theo quy trình của Luận án tại bảng 3.4

23