Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn serratia marcescens SH1

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.82 MB, 101 trang )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU
KIỆN NUÔI CẤY SẢN XUẤT SINH KHỐI VI KHUẨN
SERRATIA MARCESCENS SH1

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Ts. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Tâm

MSSV: 1051110142

Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan cuốn đồ án này là kết quả nghiên cứu của em, được tiến hành tại

phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học thuộc khoa Công nghệ Sinh học - Thực
phẩm - Môi trường, Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Các kết quả, số
liệu trong đồ án là hoàn toàn trung thực, chưa từng có ai công bố.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Tâm

Đồ án tốt nghiệp

Để có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này em xin gửi lời cảm ơn chân thành
đến các quý Thầy cô Trường Đại Học Công Nghệ TpHCM, đặc biệt là các Thầy cô
trong Khoa Môi trường và Công nghệ sinh học đã tận tình dạy bảo cho em bao
năm qua, trang bị cho em những kiến thức quý giá và tạo dựng cho em nhiều kinh
nghiệm trong suốt quá trình học tập.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Hoài Hương, Cô đã luôn bên cạnh
giúp đỡ chỉ bảo, hướng dẫn cho em trong suốt quá trình triển khai nghiên cứu và
hoàn thành đề tài tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy trong phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện và
cung cấp hóa chất để em có thể thực hiện được các thí nghiệm.
Và cuối cùng em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân
đã luôn ở bên em động viên, ủng hộ em trong suốt thời gian học tập nghiên cứu
vừa qua.
Kiến thức còn nhiều hạn chế, chắc chắn sẽ không tránh khỏi những sai sót, em rất
mong được sự thông cảm và góp ý chân thành của thầy cô và các bạn.
Xin chân thành cảm ơn!
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Tâm

Đồ án tốt nghiệp

Trang

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................. vi
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
1.6.

Đặt vấn đề .................................................................................................... 1
Mục đích của để tài ...................................................................................... 3
Mục tiêu, nhiệm vụ của đề tài ...................................................................... 3
Nội dung của đề tài ....................................................................................... 3
Phƣơng pháp xử lí số liệu ............................................................................. 3
Các kết quả đạt đƣợc của đề tài .................................................................... 3

CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu về thuốc bảo vệ thực vật sinh học ............................................... 5
2.1.1. Khái niệm và phân loại ....................................................................... 5

2.1.2. Ứng dụng của tuyến trùng trong diệt sâu............................................ 6
2.1.3. Ứng dụng của vi khuẩn trong diệt sâu ................................................ 7
2.2. Mối quan hệ giữa vi khuẩn và tuyến trùng EPN .......................................... 9
2.2.1. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp tuyến trùng và vi khuẩn
............................................................................................................. 10
2.2.2. Vi khuẩn cộng sinh tạo ra các độc tố diệt côn trùng ........................... 11
2.3. Giới thiệu về Serratia marcescens ............................................................... 12
2.3.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens ............................................... 12
2.3.2. Phân loại Serratia marcescens............................................................ 13
2.3.3. Đặc điểm sinh lí .................................................................................. 13
2.3.4. Đặc điểm sinh hóa............................................................................... 14
2.3.5. Đặc điểm phân bố ............................................................................... 17
2.3.6. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens ........................................ 19
2.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens ............................ 20
2.4.1. Sắc tố .................................................................................................... 20
2.4.2. Enzyme ................................................................................................ 21
2.4.3. Biosurfactants ...................................................................................... 22
2.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens ................................................ 23
2.6. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men thu sinh khối ......................... 25
2.6.1.
Quá trình lên men.............................................................................. 25
2.6.2.
Ảnh hƣởng của môi trƣờng và điều kiện lên men ............................ 27

i

Đồ án tốt nghiệp

2.6.2.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng .................................. 29

2.6.2.2. Ảnh hƣởng của điều kiện lên men ........................................... 30
CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHÊN CỨU
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 32
3.2. Vật liệu – môi trƣờng – thiết bị sử dụng nghiên cứu ................................... 32
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................. 32
3.2.2. Môi trƣờng ........................................................................................... 32
3.2.3. Hóa chất................................................................................................ 32
3.2.4. Dụng cụ ................................................................................................ 33
3.2.5. Thiết bị ................................................................................................. 33
3.3. Phƣơng pháp luận ......................................................................................... 34
3.4. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 34
3.5. Phƣơng pháp khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh chủng
SH1 ............................................................................................................... 38
3.5.1. Phƣơng pháp quan sát hình thái sinh lý .............................................. 38
3.5.2. Thử nghiệm sinh hóa và định danh chủng SH1 bằng bộ Kit API 20E
.............................................................................................................. 39
3.5.3. Thử nghiệm hoạt tính enzyme.............................................................. 42
3.6. Phƣơng pháp khảo sát môi trƣờng nuôi cấy chủng Serratia marcescens
SH1 ............................................................................................................... 42
3.6.1. Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng trên môi trƣờng cơ bản Nutrient
broth ..................................................................................................... 43
3.6.2. Xác định nguồn Nitơ tốt nhất cho sự phát triển của Serratia
marcescen SH1
.............................................................................................................. 44
3.6.3. Xác định nguồn Cacbon tốt nhất sự phát triển của Serratia
marcescens SH1
............................................................................................................... 45
3.7.

Phƣơng pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy S. marcescens SH1 ................... 46

3.7.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH lên sự phát triển của S. marcescensSH1
....................................................................................................... 47
3.7.2. Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện oxy lên sự phát triển của S.
marcescens SH1 .................................................................................. 47
3.7.3. Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ cấy giống lên sự phát triển của S.
marcescens SH1 .................................................................................. 47

ii

Đồ án tốt nghiệp

3.7.4.
3.7.5.

Khảo sát ảnh hƣởng của việc bổ sung đệm lên sự phát triển của S.
marcescens SH1 .................................................................................. 48
Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcescens SH1 trên môi
trƣờng mớivà điều kiện nuôi cấy mới ................................................. 49

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BỆNH LUẬN
4.1. Kết quả quan sát hình thái sinh lý và các thử nghiệm hóa sinh ..................... 50
4.1.1. Quan sát hình thái, sinh lý .................................................................... 50
4.1.2. Kết quả hóa sinh với bộ Kit API 20E .................................................. 51
4.1.3. Kết quả thử nghiệm enzyme ................................................................ 53
4.2. Kết quả khảo sát môi trƣờng nuôi cấy S. marcescens SH1......................... 56
4.2.1. Đƣờng cong tăng trƣởng trên môi trƣờng Nutrient broth .................... 56
4.2.2. Ảnh hƣởng của nguồn Nito lên sự phát triển của S. marcescens SH1
.............................................................................................................. 57
4.2.3. Ảnh hƣởng của nguồn Cacbon lên sự phát triển của S. marcescens

SH1 ....................................................................................................... 58
4.3. Kết quả khảo sát điều kiện nuôi cấy S. marcescens SH1 ........................... 59
4.3.1. Ảnh hƣởng của pH lên sự phát triển của S. marcescens SH1 .............. 59
4.3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện Oxy sự phát triển của S. marcescens SH1
.............................................................................................................. 61
4.3.3. Ảnh hƣởng của mật độ cấy giống lên sự phát triển của S.
marcescens SH1 ................................................................................... 62
4.3.4. Ảnh hƣởng của việc bổ sung đệm lên sự phát triển của S.
marcescens SH1 ................................................................................... 63
4.3.5. Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcescens SH1 trên môi
trƣờng mới và điều kiện nuôi cấy mới ................................................. 65
CHƢƠNG 5: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ
5.1.
5.2.

Kết quả ............................................................................................................... 69
Kiến nghị ............................................................................................................ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 70
PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG
PHỤ LỤC B: XỬ LÝ THỐNG KÊ

iii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens .................................... 15
Bảng 2.2 Đặc điểm các loài thuộc chi Serratia ............................................................ 16

Bảng 2.3. Tỉ lệ các loài Serratia phân lập đƣợc từ các môi trƣờng khác nhau............. 18
Bảng 2.4. Tỉ lệ các chủng Serratia marcescens phân lập đƣợc từ các môi trƣờng
khác nhau....................................................................................................................... 18
Bảng 3.1. Các chỉ tiêu định danh S. marcescens SH1 bằng bộ Kit API 20E................ 40
Bảng 3.2. Hàm lƣợng % nitơ tổng của các nguồn nitơ ................................................. 44
Bảng 3.3. Thành phần môi trƣờng và các nguồn nitơ khảo sát..................................... 44
Bảng 3.4. Thành phần môi trƣờng và các nguồn cacbon khảo sát................................ 45
Bảng 3.5. Tỉ lệ và mật độ giống khảo sát

................................................................. 48

Bảng 4.1. Kết quả sinh hóa của bộ Kit API đối với chủng S. marcescens SH1 ........... 52
Bảng 4.2. Mật độ tế bào (cfu/ml) khi sử dụng các nguồn nitơ ..................................... 57
Bảng 4.3. Mật độ tế bào (cfu/ml) khi sử dụng các nguồn Cacbon................................ 59
Bảng 4.4. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các độ pH........................................................... 60
Bảng 4.5. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các điều kiện lắc ............................................... 61
Bảng 4.6. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các tỉ lệ cấy giống .............................................. 63
Bảng 4.7. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các nồng độ đệm của môi trƣờng nuôi cấy ....... 64
Bảng 4.8. Các thông số động học nuôi cấy S. marcescens SH1 trên 2 môi trƣờng ...... 66
Bảng 4.9. Tính toán giá thành của 2 môi trƣờng .......................................................... 67
Bảng 4.10. Chi phí sản xuất sinh khối của 2 môi trƣờng .............................................. 67

iv

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi ......................................................... .13
Hình 2.2. Khuẩn lạc của S.marcescens trên môi trƣờng XLD ..................................... 17

Hình 2.3. Khuẩn lạc của S. marcescens trên NA .......................................................... 17
Hình 2.4. Quy trình công nghệ lên men thu sinh khối .................................................. 24
Hình 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của S.
marcescens SH1 ............................................................................................................ 35
Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát, chọn các thành phần cho môi trƣờng tốt
nhất cho sự phát triển của S. marcescen SH1 ............................................................... 36
Hình 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm, khảo sát các điều kiện nuôi cấy ............................ 37
Hình 4.1. Khuẩn lạc của S. marcescens SH1 trên môi trƣờng NA ............................... 50
Hình 4.2. Kết quả nhuộm Gram .................................................................................... 51
Hình 4.3. Kết quả sinh hóa bằng bộ Kit API 20E ......................................................... 52
Hình 4.4. Thử nghiệm hoạt tính lipase của SH1 trên Tween 20 ................................... 54
Hình 4.5. Thử nghiệm hoạt tính protease ...................................................................... 54
Hình 4.6. Khả năng phân giải chitin ............................................................................. 55
Hình 4.7. Đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcesces SH1 trên môi trƣờng NB .......... 56
Hình 4.8. Ảnh hƣởng của các nguồn Nitơ lên sự phát triển của S. marcescens SH1 ...
....................................................................................................................................... 57
Hình 4.9. Ảnh hƣởng của các nguồn Cacbon lên sự phát triển của S. marcescens
SH1................................................................................................................................58
Hình 4.10. Ảnh hƣởng của pH lên sự phát triển của S. marcescens SH1 ..................... 60
Hình 4.11. Ảnh hƣởng của Oxy lên sự phát triển của S. marcescens SH1 ................... 61
Hình 4.12. Ảnh hƣởng của tỉ lệ cấy giống lên sự phát triển của S. marcescens SH1
....................................................................................................................................... 62
Hình 4.13. Ảnh hƣởng của việc bổ sung đệm lên quá trình lên men và phát triển của
S. marcescens SH1 ........................................................................................................ 64

v

Đồ án tốt nghiệp

Hình 4.14. Đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcescens SH1 môi trƣờng NB và môi
trƣờng mới ..................................................................................................................... 65

vi

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Từ xa xưa con người đã biết sử dụng vi sinh vật trong đời sống hằng ngày.

Các quá trình làm rượu, làm giấm, làm tương, muối chua… đều ứng dụng các đặc
tính sinh học của các nhóm vi sinh vật. Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò của
vi sinh vật thì việc ứng dụng nó trong sản xuất và đời sống ngày càng rộng rãi và có
hiệu quả hơn. Ví dụ như việc chế vắc xin phòng bệnh, sản xuất kháng sinh. Sử dụng
vi sinh vật trong việc tạo phân bón sinh học, thuốc bảo vệ thực vật không gây hại
môi trường, làm cân bằng sinh thái.
Trong tự nhiên, ngoài những vi sinh vật có lợi còn có những vi sinh vật gây
hại, ví dụ như các nhóm vi sinh vật gây bệnh cho con người, động vật và thực vật,
các loài gây ô nhiễm nước, thực phẩm. Nhưng nếu ta nắm vững được các mặt lợi
hay hại của nó, ta sẽ đưa ra được các biện pháp khoa học để phát huy những mặt lợi
và hạn chế những mặt hại do chúng gây ra.
Serratia marcescens được biết đến là một loài vi khuẩn cơ hội, nhưng bên
cạnh đó nó cũng được biết đến với nhiều khả năng ứng dụng trong công nghệ sinh
học như khả năng diệt sâu, và khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp
chất thứ cấp do nó sinh ra…
Ngày nay để tăng năng suất và sản lượng trong trồng trọt thì người dân thường

sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học. Tuy nhiên, việc sử
dụng này chỉ đem lại lợi ích trước mắt mà không đảm bảo thâm canh bền vững, bên
cạnh đó, những sản phẩm này làm cho đất đai ngày càng bị ô nhiễm, diệt trừ nhiều
loài thiên địch có lợi cho cây trồng, mất cân bằng sinh thái trong đất và một số vi
sinh vật trong đất có thể bị tiêu diệt. Các thuốc trừ sâu hóa học này tồn dư rất lâu,
chúng không dễ dàng bị phân hủy dẫn đến tình trạng tồn dư và tích đọng lại, ngấm
sâu vào trong lòng đất và nước sẽ gây hại không những cho động vật, cây trồng mà
cả con người sống sống gần đó. Nếu con người hoăc các loài động vật ăn những loại

1

Đồ án tốt nghiệp

cây trồng còn tồn đọng một lượng không nhỏ thuốc trừ sâu hóa học thì lâu dần sẽ
ảnh hưởng rất tai hại đến sức khỏe của chính họ.
Các ngành hoá học và công nghiệp hoá chất không ngừng phát triển và ngày
càng sản xuất ra nhiều loại sản phẩm với mục đích diệt sâu – bệnh hại cây trồng.
Nhưng hiệu quả chỉ được trong một thời gian ngắn. Sau đó, liều lượng do con người
pha ngày càng tăng, các loại sâu bệnh thì ngày càng thích nghi được và lại có một
cuộc tìm kiếm loại thuốc mới để diệt chúng. Vòng tuần hoàn này cứ tiếp tục, lâu
dần, hệ sinh thái nông nghiệp sẽ bị phá hủy và giết chết các loai thiên địch có ích và
làm ô nhiễm môi trường sống của con người cũng như các loài động vật khác.
Trước tình hình đó, các biện pháp phòng trừ bệnh hại cây trồng bằng phương
pháp sinh học “thân thiện với con người và môi trường” được các nhà khoa học
quan tâm nghiên cứu và cũng đã sản xuất được các loại sản phẩm xuất phát từ sinh
học. Việc sử dụng các tác nhân sinh học trong bảo vệ thực vật có tác dụng tiêu diệt
côn trùng gây hại, giảm thiểu bênh hại cho cây trồng, cân bằng hệ sinh thái (các loài
thiên địch, vi sinh vật có lợi, dinh dưỡng…) trong môi trường đất nói riêng và trong
môi trường sống nói chung mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các

thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học khác. Không gây ảnh hưởng tiêu cực
đến sức khỏe con người và cây trồng về trước mắt và cả lâu dài.
Do đó việc ứng dụng Serratia marcescens trong bảo vệ thực vật là một triển
vọng to lớn đối với nền nông nghiệp.
Bên canh đó vi khuẩn Serratia marcescens còn được biết đến với khả năng sản
xuất sắc tố tự nhiên (prodigiosin). Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính
kháng vi sinh vật đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút được
nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh
vực bảo vệ thực vật cũng như hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u
(D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000;
Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992;

2

Đồ án tốt nghiệp

Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Ngoài ra, prodigiosin còn có thể sử dụng để
tạo mùa tự nhiên trong nghành dệt may (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).
Dựa trên cơ sở những lợi ích quan trọng của chủng Serratia marcescens cũng
như các sản phẩm trao đổi chất của Serratia marcescens mà em chọn đề tài: “Thiết
lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn
Serratia marcescens SH1”.
Mục đích của đề tài

1.2.

Xác định môi trường và điều kiện nuôi cấy chủng Serratia marcescens SH1 để
thu sinh khối cực đại.
Nội dung của đề tài

1.3.
-

Định danh và khảo sát một số hoạt tính enzyme của chủng SH1.

- Khảo sát các nguồn cacbon và nitơ phù hợp với sự phát triển của Serratia
marcescens SH1
- Khảo sát các điều kiện lên men (pH, điều kiện Oxy, mật độ cấy giống, thời
gian thu sinh khối) thích hợp với sự phát triển của Serratia marcescens SH1.
Phƣơng pháp xử lí số liệu

1.4.
-

Sử dụng phần mềm excel để tính toán và biểu diễn đồ thị

-

Sử dụng phần mềm staghaphics để xử lí số liệu
Các kết quả đạt đƣợc của đề tài

1.5.
-

Chọn được môi trường tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescens
SH1.

-

Khảo sát được điều kiện nuôi cấy (pH, điều kiện Oxy, mật độ cấy giống) tốt
nhất cho sự phát triển của Serratia marcescens SH1.

1.6.

Kết cấu đồ án tốt nghiệp
Đồ án tốt nghiệp gồm có 5 chương:


Chương 1: Mở đầu



Chương 2: Tổng quan



Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3

Đồ án tốt nghiệp



Chương 4: Kết quả và thảo luận



Chương 5: Kết luận và đề nghị

4

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1.

Giới thiệu về thuốc bảo vệ thực vật sinh học

2.1.1. Khái niệm và phân loại
Khái niệm: Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc
sinh học sản xuất ra từ các loại thảo dược hay các chủng vi sinh vật được nuôi cấy
trong môi trường dinh dưỡng khác nhau theo phương pháp thủ công, bán thủ công
hoặc phương pháp lên men công nghiệp để tạo ra những chế phẩm có chất lượng
cao, có khả năng phòng trừ các loại sâu bọ gây hại cây trồng nông, lâm nghiệp.
Thành phần giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi
khuẩn, virus) và các chất do vi sinh vật tiết ra, các chất có trong cây cỏ (là chất độc
hoặc dầu thực vật). Với các thành phần trên, thuốc trừ sâu sinh học có thể chia
thành hai nhóm chính là:
- Nhóm thuốc vi sinh: Thành phần giết sâu là các vi sinh vật như nấm, vi
khuẩn, virus.
- Nhóm thuốc thảo mộc: Thành phần giết sâu là các chất độc có trong cây cỏ
hoặc dầu thực vật.
Như chúng ta đã biết, các thuốc trừ sâu hóa học có ưu điểm rõ rệt là hiệu quả
diệt sâu nhanh nhưng có nhược điểm quan trọng là có độ độc cao với người và các
động vật có ích (trong đó có các loài thiên địch), gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy,
do yêu cầu bảo vệ sức khỏe con người và sự trong sạch của môi trường, các thuốc

trừ sâu hóa học cần được hạn chế sử dụng dần và thay vào đó là các thuốc trừ sâu
sinh học.
Ưu điểm nổi bật nhất của thuốc trừ sâu sinh học là ít độc với người và môi
trường. Các chế phẩm vi sinh vật dùng trừ sâu và dầu thực vật hầu như không độc
với người và các sinh vật có ích. Do ít độc với các loài thiên địch nên thuốc sinh
học bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và
sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát sâu hại. Do thời gian cách ly ngắn nên rất thích
hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè… Muốn

5

Đồ án tốt nghiệp

có nông sản sạch và an toàn, một biện pháp quan trọng là sử dụng các thuốc bảo vệ
thực vật sinh học.
2.1.2. Ứng dụng của tuyến trùng trong diệt sâu
Tuyến trùng sống trong đất có thể ký sinh trên côn trùng đất, nên chúng là
nguyên liệu tuyệt vời để sản xuất các thuốc trừ sâu vi sinh. Sau khi vào đất, tuyến
trùng phân tán và tấn công ngay côn trùng.
Tuyến trùng xâm nhập vào cơ thể côn trùng hoặc cùng thức ăn hoặc qua lỗ thở
và hậu môn côn trùng. Ở trong ruột côn trùng, tuyến trùng chui qua vách ruột đi vào
hệ tuần hoàn. Ở đây, tuyến trùng sinh trưởng và phát triển khá nhanh, gây chết cho
côn trùng trong 1-2 ngày.
Trừ một số ít tuyến trùng sống được trong điều kiện khô dưới dạng bào nang,
còn hầu hết tuyến trùng hoạt động trong điều kiện có màng nước bao quanh. Vì thế,
tuyến trùng chỉ tác động đến các loài côn trùng sống trong đất, nơi chúng sống lâu
hơn.
Trong số hàng nghìn loài tuyến trùng ký sinh ở côn trùng thì chỉ có nhóm
Entomopathogenic nematodes (EPN) có khả năng vừa ký sinh vừa gây bệnh cho

côn trùng, do vậy được gọi là tuyến trình ký sinh gây bệnh côn trùng. Bao gồm 2
giống là Steinernema và Heterorhabditis. Bình thường thì EPN sống tự do trong đất
và mang theo vi khuẩn cộng sinh. Khi tìm được vật chủ (sâu hại), tuyến trùng sẽ
thâm nhập vào xoang máu qua các lỗ mở tự nhiên hoặc trực tiếp qua lớp vỏ và giải
phóng vi khuẩn. Vi khuẩn sinh sôi, tiết protein độc, giết chết vật chủ trong vòng 24
- 48 giờ. Do vậy, những tuyến trùng này được sử dụng làm tác nhân sinh học để sản
xuất thuốc sinh học tuyến trùng. Hiện đã có 17 loài tuyến trùng thuộc giống
Steinernema và 7 loài thuộc giống Heterorhabditis thuộc bộ Rhabditida có khả
năng này. Sau khi xâm nhập, chúng có khả năng gây bệnh và làm chết vật chủ trong
48 giờ. Các EPN có khả năng ký sinh trên 200 loài côn trùng thí nghiệm (có một
phần đời sống trong đất) .

6

Đồ án tốt nghiệp

2.1.3. Ứng dụng của vi khuẩn trong diệt sâu
Côn trùng chết trong tự nhiên chiếm khoảng 80-90%, trong đó hầu hết là chết
do vi sinh vật mà vi khuẩn là loài vi sinh vật chiếm đa số. Do đó, trong điều kiện tự
nhiên, vi khuẩn có tác dụng không nhỏ trong việc điều chỉnh số lượng quần thể sâu
hại. Trong đó một số quần thể vi khuẩn đã được sản xuất thành chế phẩm dùng để
phòng trừ sâu hại rừng.
Người ta đã phát hiện hàng trăm loài vi khuẩn có quan hệ với côn trùng, trong
đó có 90 loài gây bệnh cho côn trùng.
Trong tự nhiên, những loài vi khuẩn gây bệnh không phải đều có thể tạo thành
chế phẩm trừ sâu và cần có một số tính chất cơ bản về độ độc, tính ổn định, khả
năng lây lan, tác dụng nhanh, chọn lọc tốt, có thể sản xuất hàng loạt, kinh tế và an
toàn.


Một số loài vi khuẩn sinh bào tử điển hình có khả năng diệt sâu hại
-

Clostridium brevifaciens

-

Clostridium malacosomae

-

Bacillus cereus

-

Bacillus thuringienis

-

Bacillus papillae.



Một số loài vi khuẩn không sinh bào tử điển hình có khả năng diệt sâu
hại
-

Serratia marcescens

Giới thiệu về chế phẩm thuốc trừ sâu sản xuất từ vi khuẩn Bacillus
thuringienis (Bt)
Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) : Phân lập lần đầu năm 1870 và trừ côn
trùng năm 1915. Đến 1971, đã có hơn 30 chủng Bt, chia thành 20 serotyp khác
nhau gây hại cho 400 loài côn trùng. Sản phẩm Bt diệt côn trùng có trên thị trường
từ đầu những năm 60 của thế kỷ 20. Bt là nhóm vi khuẩn háo khí, gram dương,
bào tử hình que, kích thước 3-6 x 0,8-13µ, đơn hay xếp chuỗi. Vi khuẩn di chuyển
nhờ roi dài 6 - 8µ. Bào tử hình trứng, chịu nhiệt, có kích thước 1-1,5 x 0,8 - 0,9µ.

7

Đồ án tốt nghiệp

Trong môi trường, bào tử sinh tế bào dinh dưỡng hình que. Hầu hết các chủng
Bt trong thời gian hình thành bào tử, đều sản sinh ra tinh thể độc delta-endotoxin (
tiền độc tố) và độc tố này được hoạt hoá trong ruột giữa do các men phân giải
protein. Ngoài ra, delta-endotoxin còn gây rối màng biểu mô ruột giữa, làm mất cân
bằng tính thấm của tế bào, côn trùng bị liệt và chết.
Delta-endotoxin còn tương tác với các liposome của màng tế bào biểu mô, làm
tăng sự rối loạn màng biểu mô ruột giữa. Delta-endotoxin có hiệu lực trừ sâu non
cánh phấn Lepidoptera và một số loài của Diptera và Coleoptera. Các thuốc thương
phẩm của Bacillus thuringiensis đều chứa bào tử và delta-endotoxin có hiệu lực trừ
nhiều loài dịch hại trong nông và lâm nghiệp.
Phương thức tác động: Bacillus thuringiensis sản sinh bào tử bên, các protein
kết tinh và tạo bào tử ra trong quá trình bào tử nảy mầm. Khi vào bụng côn trùng, vi
khuẩn thể hiện hoạt tính trừ sâu với sâu non và trưởng thành bộ cánh vảy
Lepidoptera và một số loài thuộc bộ cánh cứng Coleoptera. Trong cơ thể côn trùng,
tinh thể protein bị hoà tan và men protease trong ruột côn trùng biến tinh thể
độc(tiền độc tố) thành 4 chất độc nhỏ hơn. Các chất độc bị thuỷ phân bao vây tế bào

ruột giữa côn trùng, đặc biệt phía chất nhận, nơi tạo các amino axit. Quá trình này
phụ thuộc vào hàm lượng của ion kali. Sự tác động này tạo lỗ hổng, cho phép lựa
chọn cation, làm tăng tính thấm của màng tế bào. Tính thấm nước tăng, tế bào bị
phồng lên thậm chí bị vỡ, phá vỡ thành ruột giữa. Tính chọn lọc đặc trưng của các
chủng Bt với các loài côn trùng phụ thuộc vào cường độ các chất độc bao vây các
chất nhận. Ngoài ra, các bào tử của Bt trong ruột côn trùng cũng tiếp tục phát triển
và sản sinh ra tinh thể độc và bào tử mới, làm tăng hiệu lực của Bt.
Bt là thuốc trừ sâu có tác động đường ruột; không có tác động tiếp xúc, xông
hơi và nội hấp. Vào trong cơ thể côn trùng, các tinh thể nội độc tố bị hoà tan, huỷ
hoại các tế bào biểu mô (epithelial cell) ruột côn trùng, côn trùng chán hay ngừng
ăn và tử vong.

8

Đồ án tốt nghiệp

2.2. Mối quan hệ giữa vi khuẩn cộng sinh và tuyến trùng
Theo Gouge và Snyder (2006), EPN (Entomopathogenic nematodes) là những
động vật không xương sống, thuộc ngành giun tròn (Nematoda), thường được
gọi là “roundworms”. EPN có khả năng ký sinh gây chết côn trùng đặc biệt là côn
trùng sống trong môi trường đất (do đó được gọi là tuyến trùng ký sinh gây bệnh
côn trùng), đúng như tên gọi chúng chỉ gây bệnh cho côn trùng, vô hại với con
người, cây trồng và vật nuôi. EPN sống bên trong cơ thể vật chủ nên được
gọi là “nội ký sinh”. Chúng lây nhiễm cho rất nhiều loại côn trùng khác nhau
sống trong đất, bao gồm cả những dạng ấu trùng của bướm, ngài, bọ cánh cứng,
ruồi, dế trũi và châu chấu trưởng thành, ngay cả một số ấu trùng côn trùng có kích
thước nhỏ, có vòng đời ngắn như ấu trùng muỗi, rầy nâu hại lúa. Tiêu biểu là hai
họ Steinernematidae và Heterorhabditidae hiện được sử dụng như một nhóm tác
nhân phòng trừ sinh học sâu hại rất có hiệu quả trên thế giới (Poinar, 1966). Cả 2

họ này được đánh giá lây nhiễm cao, đa dạng ký chủ (Gaugler và Kaya, 1990) và
với vi khuẩn cộng sinh trong ruột của chúng có khả năng gây ra nhiễm trùng huyết
cho ký chủ. Các vi khuẩn cộng sinh của chi Steinernema và Heterorhabditis
tương ứng thuộc chi Xenorhabdus và Photorhabdus (Boemare và cộng sự, 1997).
Ở giai đoạn IJs (infective juveniles) tuyến trùng xâm nhập vào xoang máu côn
trùng và giải phóng vi khuẩn cộng sinh gây nhiễm trùng huyết ký chủ. Vi khuẩn sẽ
phân hủy ký chủ tạo ra thức ăn cho tuyến trùng và sản xuất các kháng sinh chống lại
sự xâm nhập của các vi sinh vật khác. Các kháng sinh của vi khuẩn cộng sinh sản
xuất như xenorhabdins, xenocoumacins, hydroxystilbens và antraquinons (Li và
cộng sự, 1998; Fodor và cộng sự, 2010).
Mặc dù mối quan hệ rất cụ thể và phụ thuộc lẫn nhau giữa tuyến trùng EPN
và vi khuẩn cộng sinh của nó nhưng một số vi khuẩn phụ thuộc đã được báo cáo có
liên quan đến tuyến trùng và ký chủ bị nhiễm tuyến trùng EPN. Poinar (1966) đã
phân lập được Achromobacter nematophilus từ Galleria mellonella bị lây
nhiễm bởi S.(Neoplectana) carpocapsae và cũng tìm thấy trong đó Alcaligenes

9

Đồ án tốt nghiệp

sp., Aerobacter sp., Proteus sp. và Pseudomonas aeruginosa. Thêm Alcaligenes
dorans, Pseudomonas

fluorescens,

P.

maltophilia,

P.

alcaligenes

và

Acinetobacter sp. cũng được phân lập từ loài tuyến trùng này (Lysenko và
Weiser, 1974). Các vi khuẩn khác như Escherichia coli, Ochrobactrum anthropi,
Paracoccus denitrificans, Pseudomonas aureofaciens, P. fluorescens Biovar B và
Xanthomonas maltophilia

đã được tìm thấy liên

quan

đến

S.

scapterisci

(Aguilera và Smart, 1993; Aguilera và cộng sự, 1993). Ngoài ra, với chi
Heterorhadibditis đã được tìm thấy có vi khuẩn khác cộng sinh với nó, bao gồm
Providencia rettgeri (Jackson và cộng sự, 1995), Ochrobactrum anthropi và O.
Intermedium (Babic và cộng sự, 2000).
Một loài vi khuẩn không cộng sinh từ chi Serratia, như S. liquefaciens, cũng
được phát hiện liên quan đến Steinernema spp. và Heterorhabditis spp. (Boemare
và cộng sự, 1997). Ngoài S. proteomaculans thì S. marcescens cũng được tìm
thấy trong các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006).
Mặc dù tất cả các nghiên cứu, báo cáo sự kết hợp của vi khuẩn không cộng sinh

với tuyến trùng EPN không có mô tả độc lực của các vi khuẩn liên quan, sự vận
chuyển vi khuẩn của tuyến trùng vào bên trong côn trùng, làm thế nào chúng được
vận chuyển hoặc mức độ liên kết giữa tuyến trùng và vi khuẩn. Trong báo cáo
mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa
Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae.
2.2.1. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp tuyến trùng và vi khuẩn
Trong tổ hợp cộng sinh vi khuẩn có vai trò rất lớn đối với tuyến trùng, thể hiện
qua các mặt sau:
- Sản sinh độc tố giết chết côn trùng bị nhiễm: Độc tố do vi khuẩn cộng sinh
tiết ra một số protein độc có khả năng nhiễm xoang máu côn trùng vật chủ và làm
cho côn trùng chết một cách nhanh chóng trong vòng 24 - 48 giờ. Như vậy, thời
gian chết của côn trùng vật chủ khác nhau còn tùy loại tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn

10

Đồ án tốt nghiệp

thuộc và cũng phụ thuộc vào loại côn trùng vật chủ nhưng thường không chậm hơn
48 giờ.
- Cung cấp nguồn thức ăn cho tuyến trùng: Tuyến trùng sử dụng vi khuẩn
cộng sinh vừa được giải phóng từ cơ thể chúng và sinh sôi trông xoang máu côn
trùng như nguồn dinh dưỡng của chúng. Nhờ đó mà IJs cũng nhanh chóng phát
triển sang tuổi 4 và đạt đến tuổi trưởng thành. Từ thế hệ 2, tuyến trùng chuyển sang
dinh dưỡng hoạt hóa xác chết con trùng. Nhờ các enzyme do vi khuẩn tiết ra mà các
mô cơ thể côn trùng trở thành nguồn thức ăn thích hợp cho tuyến trùng. Từ đó thế
hệ thứ 2 của tuyến trùng tiếp tục phát triển, sinh khối các thế hệ tiếp theo. Thông
thường trong cơ thể công trùng, tuyến trùng có thể phát triển 2 đến 4 thế hệ, phụ
thuộc vào sinh khối côn trùng làm nguồn thức ăn cho chúng.
- Ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vào xác chết côn trùng: vi khuẩn

cộng sinh có khả năng sinh ra các hoạt chất kháng sinh để ngăn cản tác nhân sinh
học khác như nấm, vi khuẩn xâm nhập và phát triển trên xác côn trùng. Nhờ vậy mà
chúng bảo vệ nguyên vẹn nguồn thức ăn giành cho tuyến trùng cộng sinh của
chúng.
2.2.2. Vi khuẩn cộng sinh tạo ra các độc tố giết chết côn trùng
Mỗi tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn có thể tiêu diệt một phổ khá lớn các loài côn
trùng vật chủ do chúng có khả năng vượt qua các hệ thống bảo vệ của côn trùng và
sản xuất các chất độc tố (toxin) để giết côn trùng bị nhiễm.
Cũng giống như các vi khuẩn gram âm khác các loài Xenorhabdus spp. và
Photorhabdus spp có khả năng sản sinh ra nội độc tố. Nội độc tố do X. poinarii sinh
ra là các hợp chất lipopolisacharide của thành tế bào, các chất này gây độc đối với
huyết cầu (haemocytes) của côn trùng. Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa rõ ràng là chỉ
một mình nội độc tố có hiệu lực giết chết côn trùng vật chủ hay còn nhiều yếu tố
khác nữa. Sự gây nhiễm huyết cầu vật chủ cho phép X. enorhabdus nhân nhanh số
lượng và sản sinh ra ngoại độc tố (exotoxin), các ngoại độc tố được chứng minh
trong P. Luminescens (Bowen và cộng sự, 1998) và X. Nematiphilus bằng cách tiêm
các dịch nuôi cấy vi khuẩn vào cơ thể côn trùng thì côn trùng sẽ chết nhanh chóng.

11

Đồ án tốt nghiệp

Các vi khuẩn này sản sinh các enzyme ra ngoài tế bào, các chất này chủ yếu là
protease, lipase, chitinase.
2.3.

Giới thiệu về Serratia marcescens

2.3.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens

Serratia marcescens bắt nguồn từ sắc tố màu đỏ trên thực phẩm được nhìn
thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trước công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về
“máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đó, năm 332 trước công nguyên,
những người lính của quân đội Macedonian của Alexander thấy rằng bánh mì
của họ đôi khi xuất hiện máu trên đó.
Năm 1800, Christian Gottfried Ehrenberg (1795–1876) phát hiện gần 100 tài
liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm.
Nhà sử học và vi sinh vật học ERL Gaughran (1969) đã phát hiện hơn 35 báo
cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó sự việc như vậy ghi nhận lần đầu
vào năm 1169 tại Đan Mạch.
Trong bong tối và sự ẩm ướt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh
được sử dụng trong thánh lễ thường xuyên bị nhiễm Serratia. Tuy nhiên điều này
lại khiến nhiều người nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ
(Gillen và Gibbs, 2011). Bartholomeo Bizio, một dược sĩ ở Padua (Italya) là
người đầu tiên phát hiện và đặt tên là Serratia marcescens cho nguyên nhân của
sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu.
Ban đầu Bizio mô tả S. marcescens như là một loại nấm do ông nhìn thấy
những đốm đỏ dưới kính hiển vi. Sau đó vào những năm 1850, các nhà khoa học đã
phân loại lại S. marcescens là vi khuẩn.
Từ những năm 1906, các bác sĩ dùng Serratia marcescens như là một điểm
đánh dấu sinh học để nghiên cứu về sự di truyền của vi sinh vật vì cho đến những
năm 1950 thì S. marcescens vẫn được xem là một mầm vô hại và cũng vì màu hồng
đặc trưng của S. marcescens.
Đến năm 1960 thì Serratia marcescens được công nhận là tác nhân gây
bệnh cơ hội ở người bởi giáo sư Scheurlen của trường đại học Strasbourg.

12

Đồ án tốt nghiệp

2.3.2.

Phân loại Serratia marcescens
Theo Bizio (1823), Serratia marcescens được phân loại như sau:

- Giới: Bacteria
- Ngành: Proteobacteria
- Lớp: Gamma Proteobacteria
- Bộ: Enterobacteriales
- Họ: Enterobacteriaceae
- Chi: Serratia
- Loài: Serratia marcescens
2.3.3. Đặc điểm sinh lí
Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi, có đường kính
khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm (David R.C., 2012).

Hình 2.1. Serratia marcescens dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011)
Serratia marcescens có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng từ 5 - 400C
và trong ngưỡng pH từ 5 - 9 .
Serratia marcescens có thể dễ dàng tìm thấy trong nước, đất, trên thực vật,
trong côn trùng, trong cơ thể người và động vật. Được tìm thấy nhiều trong thực

13

Đồ án tốt nghiệp

phẩm, nhất là trong tinh bột biến tính vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăng
trưởng của S. marcescens.

S. marcescens có thể dễ dàng di động bằng tiên mao và tiêm mao. Chúng có
thể bám dính với nhau trên môi thạch thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 - 0,8%).
Các cụm tế bào có chiều dài từ 5 – 30µm . S. marcescens cũng có thể tạo thành
một màng sinh học. S. marcescens có thể phát triển trong sự hiện của oxy hoặc
trong trường hợp không có oxy. Chủ yếu sử dụng quá trình lên men để lấy
năng lượng, có các enzyme (superoxide dismutase, calatase và peroxides) bảo vệ
nó khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi trường oxy hóa.
2.3.4. Đặc điểm sinh hóa
Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ
Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNase, lipase, chitinase và
gelatinase (Giri và cộng sự, 2004). Bên cạnh đó, các đặc điểm khác để xác định
Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào
như nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997).
Thủy phân casein là một đặc điểm chung của S. marcescens. Casein là một
protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. S.
marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide
(CO-NH) trong casein. Ngoài ra, S. marcescens còn có enzyme gelatinase ngoại
bào phân hủy gelatine.
Các sắc tố màu đỏ được sản xuất bởi S. marcescens được biết đến như là một
yếu tố đặc biệt mà điển hình là prodigiosin, nhưng chỉ xuất hiện trong một
số chủng.
Prodigiosin có thể kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế
bào T), vì vậy có thể S. marcescens sống trong cơ thể người sẽ không tổng hợp
prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và
Falkiner, 1997).

14

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.1. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens (Tariq và John,
2010)
STT

Đặc điểm sinh hóa

Kết quả

1

Di động

+

2

Indole

-

3

Methyl red

-

4

Voges Proskauer

+

5

Citrate

+

6

Dnase

+

7

Catalase

+

8

Oxidase

-

9

Urease

-

10

Gelatinase

+

11

Chitinase

+

12

Triple sugar iron

Môi trường chuyển
sang acid, không sinh khí
và không sinh H2S

13

Hydrogen sulphide peoduction

-

14

Lyine decarboxylase

+

15

Ornithine decarboxylase

+

16

Lên men glucose

+

17

Lên men sucrose

+

18

Lên men fructose

+

19

Lên men xylose

-

20

Lên men rhaminose

-

21

Lên men lactose

-

22

Lên men arabinose

-

15

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.2. Đặc điểm các loài thuộc chi Serratia (F. Grimont and P.A.D. Grimont,
2006)

S. fonticola

S. rubidaea

S. odorifera

S. plymuthica

S. entomophila

S. glossinae

S. nematodiphila

S. ureilytica

S. ficaria

S. quinivorans

S. grimesii

S. proteamaculans

s. liquefaciens

+

+