Bước đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn bacillus spp từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã
đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.
Sinh viên thực hiện luận văn

Trần Chi Phúc


LỜI CÁM ƠN
Đầu tiên, con xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cha mẹ và gia đình đã luôn bên
cạnh, cổ vũ, động viên và giúp đỡ con mỗi khi gặp khó khăn trong suốt quá trình
quá trình học tập và thực hiện Đồ án.
Em xin cám ơn thầy, cô thuộc khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC
PHẨM – MÔI TRƢỜNG, Trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tận
tình chỉ dạy và truyền đạt cho em đầy rất kiến thức trong suốt quá trình học tập tại
trƣờng.
Đặc biêt, em chân thành cám ơn cô Ts. Nguyễn Hoài Hƣơng đã tận tình giúp
đỡ, hƣớng dẫn và truyền đạt cho em rất nhiều kiến thức trong suốt thời gian nghiên
cứu và thực hiện đồ án.
Em cũng xin cám ơn quý thầy, cô phụ trách Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh
học, Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƢƠNG, Trƣờng
Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp cho em
thực hiện và hoàn thành Đồ án tốt nghiệp của mình.
Tôi xin cám ơn sự giúp đỡ rất nhiệt tình của các cộng sự và tất cả các bạn làm
việc tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học đã giúp đỡ cho tôi trong suốt quá
trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp của mình.
TP. Hồ Chi Minh, ngày … tháng … năm 2014.

Trần Chí Phúc


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................... i
DANH MỤC VIẾT TẮT ........................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH ......................................................................................... v
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................... 3
1.1. Độc tố nấm mốc ............................................................................................ 3
1.2. Độc tố aflatoxin............................................................................................ 3
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu ................................................................................. 3
1.2.2. Tính chất vật lý và phân loại .................................................................. 4
1.2.3. Sự tạo thành aflatoxin do nấm mốc ...................................................... 5
1.2.4. Cơ chế gây độc của aflatoxin ................................................................. 7
1.2.5. Độc tính của aflatoxin ............................................................................ 8
1.2.6. Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin ............................................. 10
1.2.7. Tình hình nhiễm độc aflatoxin ............................................................ 11
1.2.8. Phương pháp phát hiện aflatoxin ........................................................ 12
1.3. Phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin ........................................................... 15
1.3.1. Phương pháp vật lý học........................................................................ 15
1.3.2. Phương pháp hóa học .......................................................................... 17
1.3.3. Phương pháp sinh học ......................................................................... 18
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 20
2.1. Thời gian – địa điểm nghiên cứu .............................................................. 20
2.2. Vật liệu - Thiết bị - Hóa chất..................................................................... 20

2.2.1. Vật liệu .................................................................................................. 20
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................... 20
2.2.3. Môi trường – Hóa chất ......................................................................... 20
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 22

i


Đồ án tốt nghiệp

2.3.1. Phương pháp luận ................................................................................ 22
2.3.2. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 23
2.3.3. Một số phương pháp khảo sát sinh hóa vi khuẩn ............................... 34
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 40
3.1. Phân lập các chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận
thứ nhất ................................................................................................................ 40
3.1.1. Khảo sát khả năng đối kháng các chủng khuẩn phân lập với nấm
bằng phương pháp đồng nuôi cấy trên môi trường hỗn hợp ........................ 40
3.1.2. Khảo sát khả năng đối kháng với nấm của dịch ly tâm canh trường
nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường hỗn hợp .................................................. 42
3.2. Phân lập các chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận
thứ hai. ................................................................................................................. 43
3.2.1. Khảo sát khả năng đối kháng các chủng khuẩn phân lập với nấm
mốc trên môi trường PDA ............................................................................... 47
3.2.2. Khảo sát khả năng ức chế khả năng sinh aflatoxin của các chủng
khuẩn phân lập với nấm trên môi trường CCA ............................................. 48
3.3. Khảo sát sinh hóa của chủng khuẩn phân lập đƣợc ............................... 50
3.3.1. Nhuộm bào tử ....................................................................................... 50
3.3.2. Thử nghiệm Simmon citrate ................................................................ 51
3.3.3. Thử nghiệm catalase ............................................................................ 52

3.3.4. Thử nghiệm protease ............................................................................ 52
3.3.5. Thử nghiệm chitinase ........................................................................... 53
3.3.6. Thử nghiệm lên men carbohydrate ..................................................... 53
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ .................................................................... 57
4.1. Kết luận ....................................................................................................... 57
4.2. Đề nghị ........................................................................................................ 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 58
PHỤ LỤC

ii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC VIẾT TĂT

A.O.A.C: Association of Analytical Communities
CCA: coconut cream agar
Ctv: cộng tác viên
ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
FDA: Food and Drug Administration
HPTLC : high ferformane thin layer chromatography TLC
NA: Nutrient agar
NB: Nutrient broth
PDA: Potato dextrose agar
PDB: Potato dextrose broth
ppb: parts per billion
TFA: Tryfloacetic acid
TLC: Thin layer chromatographi
UV: Ultraviolet

iii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

TRANG
Bảng 1.1. Tính chất hóa lý một số aflatoxin .............................................................5
Bảng 1.2. Một số loài nấm có khả năng sinh aflatoxin .............................................6
Bảng 1.3. Ảnh hƣởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý
ở vật nuôi ...................................................................................................................9
Bảng 1.4. Giới hạn aflatoxin ở 1 số nƣớc theo tiêu chuẩn FDA .............................10
Bảng 1.5. Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên
liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam ..................................................................11
Bảng 1.6. Các phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đƣờng sinh học .........16
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái và nguồn gốc các chủng vi khuẩn phân lập ............40
Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn CS1b. ........................................51

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

TRANG
Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của aflatoxin B1 ở mức tế bào gan. .................................. 7
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm

sinh aflatoxin ............................................................................................................. 23
Hình 2.2. Sơ đồ trình bày chi tiết phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng
nấm mốc theo cách tiếp cận thứ nhất ........................................................................ 24
Hình 2.3. Sơ đồ trình bày chi tiết phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng
nấm mốc theo cách tiếp cận thứ hai .......................................................................... 29
Hình 3.1. Kết quả đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng
hỗn hợp. ..................................................................................................................... 41
Hình 3.2. Kết quả đối kháng nấm của các dịch tăng sinh trên môi trƣờng PDA ...... 44
Hình 3.3. Chủng vi khuẩn CS1a phân lập từ trái cà phê. .......................................... 45
Hình 3.4. Chủng vi khuẩn CS1b phân lập từ trái cà phê........................................... 46
Hình 3.5. Kết quả đối kháng nấm của các dịch ly tâm canh trƣờng với nấm mốc trên
môi trƣờng PDA. ....................................................................................................... 48
Hình 3.6. Kết quả ức chế sự phát triển và khả năng tổng hợp aflatoxin của nấm mốc
bởi dịch ly tâm canh trƣờng vi khuẩn trên môi trƣờng CCA. ................................... 49
Hình 3.7. Kết quả nhuộm bào tử khuẩn CS1b .......................................................... 51
Hình 3.8. Thử nghiệm Simmon citrate. CS1b cho kết quả dƣơng tính..................... 51
Hình 3.9. Thử nghiệm catalase. CS1b cho kết quả dƣơng tính. ............................... 52
Hình 3.10. Thử nghiệm protease. Chủng CS1b cho kết quả dƣơng tính. ................. 52
Hình 3.11. Kết quả thí nghiệm chintinase. Chủng CS1b cho kết quả âm tính. ........ 53
Hình 3.12. Kết quả lên men Glucose. Chủng CS1b cho kết quả dƣơng tính............ 54
Hình 3.13. Kết quả lên men Lactose. Chủng CS1b cho kết quả âm tính .................. 54
Hình 3.14. Kết quả lên men Sucrose. Chủng CS1b cho kết quả âm tính. ................ 55
Hình 3.15. Kết quả lên men Sucrose. Chủng CS1b cho kết quả âm tính ................. 55

v


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

1.
-

Mycotoxin hay độc tố nấm mốc là nhóm độc chất tự nhiên do nấm mốc sản

xuất ra trong quá trình phát triển. Ngƣời ta đã phát hiện ra hàng ngàn loại
mycotoxin (đƣợc sinh ra chủ yếu bởi 3 nhóm nấm mốc chính là Aspergillus,
Penicillium và Fusarium), trong đó phải kể đến là aflatoxin. Aflatoxin vừa gây độc
cấp tính (ở liều lƣợng lớn có thể gây chết một số loài gia súc, gia cầm) vừa gây độc
mãn tính (ở liều lƣợng thấp tích tụ ở gan, gây rối loạn chức năng, suy giảm miễn
dịch, thoái hóa gan thận…). Một số nghiên cứu cũng chứng minh rằng aflatonxin là
nguyên nhân gây ung thƣ cho động vật thí nghiệm, do đó có thể rất nguy hiểm đối
với con ngƣời. Nhóm độc tố aflatoxin sinh ra chủ yếu bởi hai loài nấm mốc là
Aspergillus flavus và Aspergillus parisiticus. Các loài nấm mốc này có mặt rất
nhiều ở một số loại lƣơng thực nhƣ ngô, lạc… và một vài loại hạt có chứa dầu.
Trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm tƣơng đối cao nhƣ nƣớc ta, việc bảo quản nguồn
lƣơng thực sau thu hoạch cũng nhƣ các nguồn nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi là
hết sức cần thiết. Nếu không có điều kiện bảo quản thích hợp sẽ là điều kiện rất
thuận lợi cho sự xâm nhập và phát triển của nấm mốc sinh aflatoxin. Ngoài việc làm
giảm chất lƣợng dinh dƣỡng cho lƣơng thực là nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi,
mà còn gây tích tụ độc tố trong chính các nguồn này. Điều này sẽ gây ra những tổn
thất rất lớn cho ngành chăn nuôi nói chung và cho ngƣời nông dân nói riêng. Bên
cạnh đó, việc sử dụng các nguồn lƣơng thực và thực phẩm có tích tụ độc tố
aflatoxin sẽ ảnh hƣởng không nhỏ đến sức khỏe ngƣời tiêu dung.
-

Nhận ra đƣợc tình hình thực tế đó, các nhà khoa trong nƣớc và thế giới đã có

rất nhiều nghiên cứu nhằm giải quyết vấn đề này. Các tác nhân nhƣ vật lí, hóa học
đã đƣợc đƣa ra thí nghiệm nhằm làm mất hiệu lực của aflatoxin. Đặc biệt, xu hƣớng
đang đƣợc chú trọng hiện nay là dựa vào các tác nhân vi sinh vật. Các loài nấm mốc
(Rhizopus stolonifer, Rhizopus arrhizus), vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus
pulimus…) đã đƣợc thử nghiệm khả năng làm giảm aflatoxin và đã thu đƣợc những
kết quả khá khả quan.

1


Đồ án tốt nghiệp

-

Vì những lí do thực tiễn nhƣ trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “ Bƣớc

đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. từ phụ phế phẩm
có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin.” Trong khóa luận tốt nghiệp này.
Mục đích

2.
-

Phân lập và tuyển chọn đƣợc các vi khuẩn có khả năng kháng nấm.
Mục tiêu đề tài

3.
-

Bƣớc đầu phân lập tuyển chọn Bacillus spp. từ phụ phế phẩm có khả năng

kháng nấm sinh aflatoxin.
Nôi dung đồ án

4.
-

Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc sinh aflatoxin.

-

Sàng lọc và tuyển chọn vi khuẩn dựa trên hoạt tính đối kháng và hoạt tính ức

chế sinh tổng hợp aflatoxin của nấm mốc.
-

Định danh sơ bộ vi khuẩn và xác định cơ chế kháng nấm mốc sinh aflatoxin

bằng các thử nghiệm sinh hóa.
Kết cấu đồ án

5.
-

Chƣơng I: Tổng quan tài liệu – nội dung chƣơng đề cập đến các nội dung

liên quan đến tài liệu nghiên cứu.
-

Chƣơng II: Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu – nội dung chƣơng đề cập

đến các dụng cụ, thiết bị và các phƣơng pháp nghiên cứu trong đồ án.
-

Chƣơng III: Kết quả và thảo luận – nội dung chƣơng đƣa ra những kết quả

mà đề tài thực hiện đƣợc và đƣa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu
đƣợc.
-

Chƣơng IV: Kết luận và đề nghị - nội dung chƣơng tóm lại những kết quả mà

đề tài đạt đƣợc và đề nghị cho những hƣớng cần cải thiện thêm trong đề tài.

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.
-

Độc tố nấm mốc:
Độc tố nấm mốc hay còn gọi là mycotoxin là những hợp chất có phân tử nhỏ,

khá bền trong các điều kiện, là sản phẩm của sự trao đổi chất thứ cấp trong quá trình
phát triển của loài vi nấm. Các mycotoxin dễ dàng xâm nhập và giữ đƣợc độc tính
trong các chuỗi thức ăn do cực kỳ khó khăn để loại bỏ hoặc tiêu diệt.
-

Độc tố nấm mốc đƣợc phát hiện lần đầu liên vào năm 1960, sau cái chết

hàng loạt của hàng trăm cá thể tại các trang trại gà tây ở Anh. (T. Asao và ctv,1963;
F.Wu và P. Khlangwiset, 2010)
-

Cho đến nay có trên 300 loại độc tố nấm mốc đã đƣợc phát hiện và nghiên

cứu. Nhƣng chỉ có 20 loại độc tố nấm mốc có độc tính gây hại.
-

Bệnh nấm mốc ở ngƣời và động vật đều không có khả năng lây lan vì chúng

do tác nhân độc tố (hóa học) gây ra.Tuy nhiên, hầu nhƣ tất các sản phẩm thực vật
đều có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo,
và vì thế nó có khả năng nhiễm trực tiếp cho thực phẩm của con ngƣời. Khi gia súc
ăn các thức ăn có nhiễm mycotoxin, chúng không chỉ chịu tác dụng trực tiếp mà còn
là nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt, và nhƣ vậy tạo sự nhiễm mycotoxin tiếp
theo cho con ngƣời.
1.2.

Độc tố aflatoxin:

1.2.1. Lịch sử nghiên cứu:
-

Aflatoxin là mycotoxin đƣợc phát hiện sớm nhất vào năm 1961 bởi nhà khoa

học Butler. Qua việc xác định đƣợc loài Aspergillus flavus tiết ra độc tố gây chết

hàng loạt gà tây ở Anh, ông đặt tên cho độc tố này là aflatoxin (độc tố sinh ra bởi
Aspergillus flavus). (W.H Butler, 1964)
-

Các công trình nghiên cứu sau đó đã xác nhận rằng Aflatoxin đƣợc tạo bởi

nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây khối u ở gan động vât.
(Halver, 1969; Wales, 1970; New, 1987 trích dẫn bởi Chaver-Sanchelez, 1994).

3


Đồ án tốt nghiệp

-

Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố Aflatoxin. Các nhà

khoa học cũng đã xác định đƣợc công thức phân tử và công thức cấu tạo của
Aflatoxin.
1.2.2. Tính chất vật lý và phân loại:
-

Aflatoxin là một nhóm khoảng 20 chất là sản phẩm trao đổi bởi nấm

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Bốn nhóm aflatoxin chính đƣợc tạo ra
trong tự nhiên là B1, B2, G1 và G2. Bốn chất đƣợc phân biệt trên cơ sở màu phát
quang của chúng. B là chữ viết tắt của Blue (màu xanh nƣớc biển), và G là chữ viết
tắt của Green (màu xanh lá cây). Aflatoxin B1 và B2 trong sữa bò đƣợc chuyển hóa
và gọi là aflatoxin M1 và aflatoxin M2 (M là chữ viết tắt của Milk). (F. Wu và P.

Khlangwiset, 2010)
-

Trong bốn loại aflatoxin, aflatoxin, aflatoxin B1 đƣợc tìm thấy ở nồng độ cao

nhất, sau đó là G1, còn B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn chúng có công thức cấu
tạo nhƣ sau:
O

O

O
O

O

O

O

OCH3

O

O

Aflatoxin B1
O

O

O

O

O

OH

OH

OCH3

O

O

O

Aflatoxin M2
O

O

O

OCH3

O

Aflatoxin M1

O

OCH3

Aflatoxin B2
O

O

O

O

O

O

O

O

OCH3

O

Aflatoxin G2

Aflatoxin G1

4

O

OCH3


Đồ án tốt nghiệp

-

Các aflatoxin tan trong methanol, acetone và chloroform, không tan trong

dung môi không phân cực. Aflatoxin tƣơng đối không ổn định khi tiếp xúc với ánh
sáng, đặc biêt là khi tiếp xúc với tia cực tím, các tác nhân oxy hóa, trong các dung
môi phân cực hay trong các dung dịch có pH nhỏ hơn 3 hay lớn hơn 10. Aflatoxin
có nhiệt độ nóng chảy từ 2370C (G1) đến 2990C (M1), nhƣng không bị phá hủy
trong điều kiện nấu ăn bình thƣờng. Có thể phân hủy hoàn toàn chúng bằng nồi hấp
tiệt trùng có bổ sung thêm ammoniac hoặc xử lý bằng chất tẩy rữa.
Bảng 1.1 Tính chất hóa lý của một số aflatoxin.
Công

Trọng

thức phân

lƣợng

tử

phân tử

B1

C17H12O6

312

268-269

Xanh lam

B2

C17H14O6

314

268-289

Xanh lam

G1

C17H12O7

328

244-246

Xanh lục

G2

C17H14O7

330

229-231

Xanh lục

M1

C17H12O7

328

299

Xanh lam tím

M2

C17H14O7

320

293

Tím

Aflatoxin

Điểm nóng
chảy (0C)

Huỳnh quang

Nguồn: Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003
1.2.3. Sự tạo thành aflatoxin do nấm mốc:
-

Sự tạo thành aflatoxin chủ yếu đƣợc tìm thấy ở hai chủng nấm mốc

Asp.flavus và Asp. parasiticus. Các chủng tạo aflatoxin của Asp. flavus là rất phổ
biến và thƣờng đƣợc phân lập từ các nguồn khác nhau nhƣ lạc, hạt bông, hạt gạo,
lúa... Theo số liệu của Schoroder và Boller (1976), có từ 20-98% các chủng phân
lập của Asp. flavus có khả năng tạo aflatoxin.
-

Ngoài hai loài Asp. flavus và Asp. parasiticus còn có một số loài khác cũng

có khả năng sinh aflatoxin nhƣng yếu hơn nhƣ Asp. nominus (C.P. Kurtzman và ctv,
1987) và Asp. bombycis (S.W. Peterson và ctv,2001).

5

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.2 Một số loài nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin.
Loài nấm mốc

Aflatoxin
G1

Tác giả

B1

B2

G2

Aspergillus flavus

+

+

Aspergillus parasiticus

+

+

+

+

Coduer và ctv, 1963

Aspergillus nomius

+

+

+

+

Kurzman vad ctv, 1987

Aspergillus oryzae

+

Basappa và ctv, 1967

Aspergillus niger

+

Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus wentii

+

Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus ruber

+

Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus ostianus

+

Aspergillus orchraceus

+

Penicillium puberulum

+

Penicillium variabile

+

Kulik và Holaday, 1967

Penicillium frequentans

+

Kulik và Holaday, 1967

Penicillium citrinum

+

Kulik và Holaday, 1967

Rhizopus sp.

+

Van Walbeck và ctv, 1968

Sargeant và ctv, 1961

+

Scot và ctv, 1968
Van Walbeck và ctv, 1968

+

+

+

Kulik và Holaday, 1967

Nguồn: Phạm Hoàng Thái, 2007.
-

Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh độc tố aflatoxin nhƣ chủng

nấm mốc, nhiệt độ, hoạt độ của nƣớc, các yếu tố môi trƣờng…
-

Các nhiệt độ cực tiểu, tối thích, và cực đại cho sự tạo aflatoxin là 120C, 270C

và 40 – 420C theo thứ tự. Một số chủng nấm mốc bị mất hoạt tính sau nhiều lần cấy
chuyển liên tiếp trên môi trƣờng không thích hợp, nhƣng khả năng sinh độc tố cũng
có thể tăng khi chủng nấm mốc đƣợc cấy chuyển trên môi trƣờng thích hợp.
-

Môi trƣờng có bổ sung nấm men hoặc peptone hoặc là các axit amin cùng

với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH=5 – 5,4; nhiệt độ 26 – 280C) là điều kiện
tốt nhất cho sự tạo thành độc tố aflatoxin.

6


Đồ án tốt nghiệp

1.2.4. Cơ chế gây độc của aflatoxin.
-

Aflatoxin có khả năng liên kết với DNA trong nhân tế bào. Sự liên kết này

gây ức chế enzym polymerase của RNA. Nó gây tác dụng hạn chế trong tổng hợp
RNA và ức chế polymerase t-RNA. Đây là nguyên nhân gây hạn chế sự tổng hợp
protein trong tế bào. Ngƣời ta cũng đã chứng minh rằng vòng α,β -lacton không
bão hòa có trong phân tử aflatoxin làm cho hợp chất này có hoạt tính gây ung
thƣ và cũng chính vòng lacton này gây ức chế tổng hợp DNA trong nhân tế bào,
do đó nó làm rối loạn tăng trƣởng bình thƣờng của tế bào (M.F.Nexterin và V.I.A.
Vixarinova, 1971, trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001).
-

Để có thể gây độc với tế bào gan cũng nhƣ tạo khối u, aflatoxin phải trải qua

một quá trình biến đổi sinh học phức tạp, tạo thành dạng 2,3 – dihydrodiol
(aflatoxin B1 – dhd) ở trong gan. Theo Neal và cộng sự (1981), hợp chất này là
nguyên nhân gây hủy hoại gan rất nhanh. Nhóm dialdehyde phản ứng với nhóm
amin của protein để tạo thành kiềm ship (Shiff’s base), gây ức chế sinh sinh tổng
hợp DNA và gây nhiễm độc cấp tính. (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cơ chế tác dụng của aflatoxin B1 ở mức tế bào gan.
(Cliford và Rces,1967 trích dẫn bởi bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003)

7


Đồ án tốt nghiệp

1.2.5. Độc tính của aflatoxin:
Theo Dƣơng Thanh Liêm (2002), aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho cơ
thể con ngƣời và động vật. Những tác hại đó nhƣ sau:
-

Gây tổn thƣơng tế bào gan: tất cả các trƣờng hợp xác nhận sự ngộ

độc aflatoxin đều có bệnh tích giống nhau là gan của động vật bị nhiễm đều hƣ hại
nặng. Tùy theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích trên gan có
biểu hiện khác nhau. Biểu hiện chung là: ban đầu gan biến thành màu vàng tƣơi,
mật sƣng. Sau đó gan sƣng to lên, mật căng phồng và bắt đầu nổi mụt nhỏ trên bề
mặt gan làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng. Sau cùng do
nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể.
-

Thận cũng bị sƣng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên

khó khăn. Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng.
-

Bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả năng tiêu hóa các chất dinh dƣỡng

trong thức ăn. Đôi khi cũng thấy tổn thƣơng ở miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn.
-

Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể.

Do đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các bệnh thông thƣờng, có thể
gây tử vong cho thú.
-

Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thƣờng, gây rối loạn sinh sản.

-

Làm giảm sự thèm ăn đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm mất

mùi thức ăn.
-

Làm thay đổi thành phần dinh dƣỡng có trong thức ăn, giá trị dinh dƣỡng bị

hạ thấp, làm vật nuôi chậm phát triển.
-

Làm giảm thấp sự sinh trƣởng và giá trị kinh tế của vật nuôi. Hậu quả cuối

cùng là có thể gây chết cho vật nuôi.

8


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.3. Ảnh hƣởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý
ở vật nuôi. (Allcroff, 1969 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003)

Loại gia súc

Lợn
(20-70kg)
Lợn
(40-100kg)
Lợn

(70-100kg)
Lợn nái
(có chửa)
Gà tây
(1 ngày tuổi)
Gà thịt
(1 ngày tuổi)
Vịt
(7 ngày tuổi)
Bê
(4 ngày tuổi)

Lƣợng

Thời

aflatoxin

kỳ

trong thức ăn

nuôi

hằng ngày

dƣỡng

(mg/kg)

(tuần)

0.14

12

Trung bình

Bình thƣờng

0.28

12

Nhẹ

Giảm sút

0.41

12

Nhẹ

Giảm sút

0.28 và 0.41

20

Nhẹ

Giảm sút

0.69

7

Trung bình

Bình thƣờng

0.3-0.55

4

Rõ

0.25

4

Rõ

0.2

7

Nhẹ

0.42

7

Nhẹ

0.5

7

Nặng

0.03

4

0.2

16

Ảnh hƣởng tới
Tổn thƣơng gan

phát triển và hiệu
quả thức ăn

Suy giảm và một
số con chết
Chậm phát triển và
giảm trọng lƣợng.

Giảm trọng lƣợng
trong 3 tuần.

Đặc điểm điển hình

Giảm trọng lƣợng,

nhiễm aflatoxin.

chết 50%.

Trung bình

Giảm trọng lƣợng
từ 0-3 tháng.
Giảm lƣợng sữa.

Bò sữa

1.5

4

Trung bình

Aflatoxin M1 có
mặt trong sữa

9

Đồ án tốt nghiệp

1.2.6. Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin.
Trƣớc thực trạng nhiễm aflatoxin trên lƣơng thực, thực phẩm ở mức độ cao

-

cũng nhƣ tính độc của aflatoxin đối với động vật kinh tế và ảnh hƣởng của nó đối
với sức khỏe con ngƣời, nhiều quốc gia trên thế giới đã có những quy định giới hạn
aflatoxin nhiễm trong lƣơng thực, thực phẩm.
Bảng 1.4. Giới hạn aflatoxin ở một số nƣớc theo tiêu chuẩn của FDA
Giới han Aflatoxin
cho phép

Nƣớc

20 ppb

Loại thức ăn
Bột ngô sử dụng làm thức ăn cho gia súc,
gia cầm ở tất cả các giai đoạn khác nhau.
Hàm lƣợng tối đa cho phép trong thức ăn

Mỹ
20 ppb

cho gia súc, gia cầm hoặc trong nguyên
liệu bột ngô.

Châu Âu

5 ppb

Thực phẩm sử dụng cho ngƣời.
Thực phẩm chế biến từ lạc bao gồm tổng số

Canada

15ppb

tất cả các loại độc tố aflatoxin B1, B2, G1,
G2

Úc

15 ppb
10 ppb

Nhật

Châu Á

-

100 ppb

Thực phẩm chế biến từ dầu đậu tƣơng và
lạc.
Cho tất cả các loại thực phẩm chứa B1.

Cho các loại nguyên liệu chế biến thức ăn
chăn nuôi.

30 ppb

Tất cả các loại lƣơng thực, thực phẩm.

120 ppb

Trong các sản phẩm từ lạc.

Tại Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn cũng đã ra quy định

về hàm lƣợng tối đa aflatoxin B1 và hàm lƣợng tổng số các aflatoxin (B1+ B2 + G1+
G2) đƣợc tính bằng mg trong 1kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc, gia cầm
(ppb).

10


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.5. Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên
liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam. (Tài liệu của Vụ KHKT và CLSP Bộ Nông
nghiệp và PTNT)
Lƣợng Aflatoxin

Nguyên liệu

B1 tối đa (ppb)

Tổng số Aflatoxin
B1 + B2 + G1 +
G2 (ppb)

Ngô hạt

100

150

Sắn khô

50

100

Đậu tƣơng

50

100

Cám gạo

50

100

Bột cá

10

20

Thức ăn cho gà (1 – 21 ngày tuổi)

10

30

Thức ăn cho gà (nhóm còn lại)

30

50

Thức ăn cho vịt (1 – 21 ngày tuổi)

5

10

Thức ăn cho vịt (nhóm còn lại)

10

20

Thức ăn cho lơn con (1 – 60 ngày tuổi)

20

50

Thức ăn cho lợn (nhóm còn lại)

100

200

Bò nuôi lấy sữa

20

50

1.2.7. Tình hình nhiễm độc aflatoxin.
-

Aflatoxin có mặt trong rất nhiều sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt là các loại

hạt có dầu nhƣ lạc, đậu tƣơng và ngô (Blaney, 1985 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và
Lê Thị Ngọc, 2003). Ở vùng Đông Nam Á và ở Úc, tỷ lệ nhiễm aflatoxin trong sản
phẩm nông nghiệp là rất đáng kể.
-

Nhiễm aflatoxin là do điều kiện bảo quản kém, việc xâm nhập của sâu mọt

trong bảo quản cũng tạo điều kiện thuận lợi cho sự lây lan và phát triển nhanh

chóng của Aspergillus flavus. Trong điều kiện thuận lợi, Asp. flavus có thể tăng
nhanh chỉ sau 3 – 7 ngày bảo quản.

11


Đồ án tốt nghiệp

-

Nhiễm độc aflatoxin ở lợn là một vấn đề quan trọng, gây thiệt hại khá lớn

cho ngành chăn nuôi. Tại miền Bắc Carolina – Mỹ, theo nghiên cứu của Smith
(1976) trong số 94 trƣờng hợp phát hiện aflatoxin có trong thức ăn chăn nuôi thì có
đến 83 trƣờng hợp gây ngộ độc ở lợn, 7 trƣờng hợp ở bò và 4 trƣờng hợp ở gia cầm.
Hàm lƣợng aflatoxin trung bình có trong thức ăn chăn nuôi là 389 ppb và ở ngô
nguyên liệu làm thức ăn là 518 ppb. (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc
Diệp, 2003)
-

Ở khu vực Đông Nam Á, theo nhận xét của Ginting (1985) và Widiastut

(1988), ngô và thức ăn cho gia cầm nhiễm aflatoxin với hàm lƣợng lên tới 200 ppb.
Ở Úc, theo Barry J. Balaney, trong 161 mẫu thức ăn cho gia cầm đƣợc phân tích thì
có 13 mẫu chứa aflatoxin, trong đó có 4 mẫu nhiễm aflatoxin với hàm lƣợng lên đến
50 ppb. (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003).
1.2.8. Phƣơng pháp phát hiện aflatoxin:
1.2.8.1.
-

Phương pháp phát quang sinh học :

Dùng tia cực tím tạo ra huỳnh quang màu vàng xanh sáng từ acid kojic (acid

này đƣợc tạo ra do cùng một loại nấm sản sinh aflatoxin, chỉ gián tiếp phát hiện sự
có mặt của aflatoxin). Phƣơng pháp này không thông du ̣ng vì it́ chin
́ h xác .
1.2.8.2.
-

Phương pháp "ELISA test":

Dƣ̣a trên nguyên tắ c kháng thể kháng nguyên p hát hiện aflatoxin (và các độc

tố khác) thông qua những phƣơng tiện phát hiện nhanh, rẻ, dễ thực hiện, sử dụng
kháng thể để "bắt" (có lựa chọn) độc tố đặc biệt đã đƣợc tách chiết từ hạt hay các
thành phần của thƣ́c ăn . Sau khi chiết, sẽ sử dụng bộ kiểm tra và thêm chất chỉ thị
màu. Cƣờng độ màu sắc sẽ chỉ thị có độc tố hay không.
1.2.8.3.

-

Phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí.
Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromatographi-TLC )

Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng đƣợc sử dụng rộng rãi để xác định hàm lƣợng

aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960. Ngƣời ta sử dụng các bản mỏng đƣợc
tráng bởi silicagel để xác định aflatoxin.

12


Đồ án tốt nghiệp

-

Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là chloroforin: methnol và

choloroform: aceton. Việc thêm nƣớc vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng
hòa tan aflatoxin.
-

Hệ dung môi gồm nƣớc: aceton: chloroform (1.5:12:88 v/v) đƣợc đánh giá

có khả năng hòa tan aflatoxin tốt nhất. Các bản mỏng đã đƣợc chảy qua các dung
môi chạy đƣợc đƣa vào bởi đèn tử ngoại (UV) 365nm. Các vết mẫu phân tích tạo
màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây. Và có độ dài Rf đƣợc so sánh với
các vết của aflatoxin tiêu chuẩn. Phƣơng pháp này có thể đƣợc xác định lƣợng từ
0.3-0.4 mg.
-

Nhƣợc điểm của phƣơng pháp là phụ thuộc vào ngƣời phân tích. Khi so sánh

giữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả từ 20-30%.
-

Hội hóa học phân tích (A.O.A.C-1980) đã lƣu ý tới phƣơng pháp phân tích

định lƣợng sử dụng TLC. Phƣơng pháp này đƣợc mở rộng thành chƣơng trình phân

tích mẫu của tổ chức nghiên cứu ung thƣ thế giới. Các kết quả của chƣơng trình
phân tích trên đã chứng nhận sự chính xác của phân tích bằng TLC vì sai số rất cao.
Khẳng định sự có mặt của aflatoxin:
-

Một số chất đƣợc tách ra từ mẫu đôi khi dễ nhầm lẫn với aflatoxin, dẫn đến

sự khẳng định sai lệch. Phƣơng pháp khẳng định sự có mặt của aflatoxin trực tiếp
thực hiện trên bản sắc kí. Dựa vào sự biến đổi của aflatoxin thành các đồng phân có
màu huỳnh quang khác so với huỳnh quang ban đầu, cả aflatoxin chuẩn và aflatoxin
có trong mẫu phân tích đều chuyển sang cùng một đồng phân.
-

Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin trong mẫu phân tích đƣợc

phát hiện bởi Przybylski (1975) và Verhulsdonk (1977) và đƣợc hội phân tích hóa
học Hoa Kì (A.O.A.C) công nhận.
-

Aflatoxin B1 đƣợc đƣợc acid hóa để trở thành đồng phân aflatoxin B2a.

Đồng phân này có màu huỳnh quang màu xanh và có độ dài Rf thấp hơn so với độ
dài Rf của aflatoxin B1. Theo phƣơng pháp của Przybylski, aflatoxin Bi đƣợc
chuyển thành aflatoxin B2a nhờ acid Tryfloacetic (TFA) phun trực tiếp lên các bản
mỏng trƣớc khi chạy trong dung môi.

13


Đồ án tốt nghiệp

Acid sufuric làm thay đổi màu huỳnh quang xanh da trời của aflatoxin B1

-

thành màu vàng. Thử nghiệm này nhằm khẳng định sự không có mặt của aflatoxin
nếu vết nghi ngờ không chuyển thành màu vàng.


Sắc kí lớp mỏng hiệu suất cao (high ferformane thin layer

chromatography-HPTLC):
Do những khiếm khuyết trong phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng đơn thuần ở các

-

khâu nhƣ chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phƣơng pháp HPTLC
có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: đƣa mẫu lên bản mỏng một cách tự
động, cải thiện đƣợc sự đồng nhất cả lớp hấp phụ, chạy bản mỏng trong dung môi
có kiểm soát.
Quá trình đƣa mẫu vào bản mỏng đƣợc tự động hóa, do đó các vết đƣợc định

-

đúng vị trí và đo lƣờng độ huỳnh quang của vết cũng bằng máy densitometess.
Thể tích mẫu đƣợc dùng trong HPTLC có thể bằng 1l so với 5-10l mẫu

-

trong phƣơng pháp TLC, nhƣ vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích của vết

(=1mm). Nồng độ chất chuẩn có thể cần 5 pg trong phân tích bằng HPTLC, do đó
có thể xác định tới 30 pg (0.03 g) aflatoxin B1 ở lạc.
Sử dụng kĩ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phƣơng pháp TLC

-

nhƣ một phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin có hiệu quả nhất.


Phƣơng pháp sắc kí lỏng cao áp (high ferformane liquid

chromatogaphy - HPLC):
-

Hệ thống phân tích high ferformane tự động HPLC là hệ thông phân tích đắt

tiền, chọn lọc, dùng định lƣợng Aflatoxin. Phƣơng pháp HPLC sử dụng cả hai pha:
Pha bình thƣờng và pha phản.
-

Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia tím (UV) và xác định cƣờng độ huỳnh

quang.
-

Mẫu phân tích đƣợc tách bằng chloroform: nƣớc. Ly tâm chất tác dụng

làm sạch qua silicagel pha bình thƣờng sử dụng cột nhồi silicagel 0.5m và pha
động sử dụng benzen: acetonitrit: acid formic. Giới hạn xác định là 0.5 m/kg.

14


Đồ án tốt nghiệp

-

Husst (1984) đã sử dụng pha phản kết hợp với TFA đồng phân để xác định

đƣợc các Aflatoxin B1, B2, G1, G2 ở nồng độ 5pg.
-

Davis (1980) cũng sử dụng pha phản để xác định huỳnh quang của đồng

phân iot của Aflatoxin B1.

-

Phƣơng pháp sắc kí cột.

Phƣơng pháp cột mini nhằm xác định nhanh aflatoxin có trong mẫu. Phƣơng

pháp này đơn giản, ít tốn kém, chỉ xác định định tính.
-

Kĩ thuật nhồi cột mini là cột sắc kí bằng hạt thủy tinh hay chất dẻo có kích

thƣớc khoảng 3-6 mm chiều rộng và 20 cm chiều dài. Dung dịch chiết tách đƣợc
làm sạch bằng dung môi, dung môi và hòa tan trong một lƣợng nhỏ benzen hay
chloroform. Cột đƣợc nhồi silicagel nhƣ một chất hấp thụ và quan sát dƣới ánh sáng

tử ngoại (uv) để xác định màu huỳnh quang xanh chỉ ra sự có mặt của aflatoxin.
-

Nhiều tác giả nhƣ Davis và cộng sự (1981), Holaday (1976), Holaday và

Lansden(1975) đã cải tiến phƣơng pháp này nhằm phát hiện nhanh aflatoxin trong
mẫu. Phƣơng pháp cột mini của Romes (1975) đã đƣợc A.O.A.C (1980) công nhận.
Aflatoxin đƣợc tách bằng aceton và nƣớc (85: 45), các chất tạp đƣợc loại trên gel
cacbonat đồng và chloric sắt. Sau đó, aflatoxin đƣợc tách ra bằng một pha nƣớc với
chloroform.
-

Chloroform tách đƣợc đƣa vào cột có chứa một lớp bột nhôm trung tính,

silicagel và florisil ở phía dƣới, sunfat canxi khô ở cả trên và dƣới. Cột đƣợc chạy
trong choloroform và aceton (9:1) để giữ aflatoxin trên đỉnh của lớp flosisil.
1.3.

Phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin:

1.3.1. Phương pháp vật lý học:
-

Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: dùng không khí nóng thổi

qua nguyên liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lƣợng aflatoxin đã đƣợc nhiều
tác giả nghiên cứu, phƣơng pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể. Nếu nhiệt
độ không khí nóng đƣa vào là 100 - 1450C ở ngô hạt thì lƣợng aflatoxin B1 có thể
giảm từ 877 ppb còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb.

15


Đồ án tốt nghiệp

-

Nếu tăng nhiệt độ lên tới 1650C có thể làm cho lƣợng aflatoxin B1 giảm từ

66 - 67%.(Lee, 1969; Waltking, 1971; Elkady, 1981; Frank, 1974; trích dẫn bởi Đậu
Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
-

Phân hủy aflatoxin bằng hấp ƣớt ở áp suất cao: phƣơng pháp hấp ƣớt ở nhiệt

độ cao dƣới áp lực hơi nƣớc đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này
phá hủy nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Theo
Rehana (1979) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 400 - 4000 ppb đƣợc hấp ƣớt
trong 5 phút ở 1200C (thêm nƣớc vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lƣợng
aflatoxin đến 68%. Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 đƣợc
hấp ƣớt ở 1200C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb. Ở hàm lƣợng aflatoxin thấp (760
ppb) đƣợc hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin.
(Rehana, 1979 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)
-

Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: các chất hấp

phụ thƣờng là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề
mặt cao. Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: than hoạt tính, một số
polymer hữu vô cơ có bản chất aluminosilicat nhƣ bentonite, HSCAS (Hydrated

sodium calcium alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite,
clinoptilolite, zeolite), một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo
(nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone). Những chất này không đƣợc hấp
phụ qua ruột mà đƣợc bài thải ra ngoài. (Charmley, 1994; trích dẫn bởi Đậu Ngọc
Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)
-

Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: đây là phƣơng pháp có thể áp dụng

đối với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản
phẩm khác có hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi đƣợc dung môi mà không ảnh
hƣởng đến thành phần dinh dƣỡng của thức ăn.
-

Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu đƣợc bằng việc dùng hệ thống

chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan – metanol, hexan – etanol, hexan – etanol - nƣớc,
và hexan –aceton - nƣớc. Hệ thống bao gồm 54% aceton, 44% hexan và 2% nƣớc
(tính theo trọng lƣợng) là hệ thống thành công nhất đƣợc tìm thấy, có thể đồng thời

16


Đồ án tốt nghiệp

loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dƣ lƣợng lipid gần
bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40μg/kg.
-

Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực

tím. Ở bƣớc sóng 365 nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại. Okonkwo
(1978) nhận thấy, lƣợng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30%
và 16% trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời. (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị
Ngọc Diệp, 2003).
1.3.2. Phương pháp hóa học:
-

Phƣơng pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: các chất oxy hóa-khử nhƣ

natrihypochloride (NaOCl), hydroperoxide (H2O2) đƣợc sử dụng để làm mất độc
tính của aflatoxin. Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể
làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin. Khí ozon (O3) cũng đƣợc thử
nghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt đƣợc hiệu quả tốt, song có
bằng chứng là chất lƣợng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein,
vitamin.
-

Phƣơng pháp sử dụng các chất kiềm: hydroxit amon (NH4OH) và hyroxit

natri (NaOH) là 2 chất kiềm đƣợc sử dụng làm vô hoạt afaltoxin. Các chất này đều
có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin.
-

Phƣơng pháp sử dụng khí NH3: nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả

của việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin. Xử lý ngô bằng khí NH3 đƣợc đặc
biệt quan tâm ứng dụng hơn cả. Ngƣời ta nhận thấy, nếu hàm lƣợng NH3 là 0,5 1,5% và nhiệt độ bên ngoài là 250C, trong 14 ngày tiếp xúc, lƣợng aflatoxin từ
200ppb có thể giảm xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp,
2003).

17


Đồ án tốt nghiệp

1.3.3. Phương pháp sinh học:
-

Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã đƣợc khuyến

cáo áp dụng, nhƣng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao quá giới hạn là
không thể tránh đƣợc trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm
aflatoxin bằng con đƣờng sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm
aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lƣợng lƣơng
thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản đƣợc chứng minh là các phƣơng pháp
hứa hẹn nhất. Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phƣơng pháp sinh học có thể đƣợc
định nghĩa nhƣ sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh của các độc tố nấm
mốc trực tiếp nhờ vi sinh vật.
Bảng 1.6. Các phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đƣờng sinh học.
Tên vi khuẩn
Bacillus pumilus

Đối tƣợng

Cơ chế khử nhiễm

Tác giả

Aspergillus

Sử dụng các sản phẩm trao đổi

parasiticus

chất ngoại bào, sinh ra trong quá và

C. Munimbazi

trình nuôi cấy B. pumilus, ức chế LB.Bullerman,
sự phát triển và quá trình tổng

1997.

hợp độc chất aflatoxin của nấm
Asp. parasiticus.
Streptomyces sp.

Aspergillus

Streptomyces sp. tổng hợp đƣợc

M. Ono và

parasiticus

Aflastatin A, là hợp chất có bản

ctv ,1996.

chất là protein, ức chế 1 số

T. Kondo và

enzyme esterase tham gia quá

ctv, 2001.

trình tổng hợp độc chất aflatoxin
của nấm Asp. parasiticus.
Achromobacter

Aspergillus

A. xylosoxidan tổng hợp

PS. Yan và

xylosoxidans

parasiticus

Cyclo(L-leucyl-L-prolyl), là 1

ctv, 2004.

cyclodipeptide, ức chế sự phát
triển và sự tổng hợp aflatoxin
của nấm Asp. parasiticus.

18