Xác định một số điều kiện nuôi cấy tối ưu nấm trichoderma harzianum để thu nhận enzyme chitinase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỐI
ƯU NẤM Trichoderma harzianum ĐỂ THU NHẬN
ENZYME CHITINASE

Ngành: Công nghệ sinh học
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hai
Sinh viên thực hiện:

Trần Đức Vinh

MSSV: 1051110243

Lớp: 10DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 7/2014


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công nghệ
Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố Hồ Chí
Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt
4 năm đại học.

Tôi xin bày tỏ lòng cám ơn chân thành cô Nguyễn Thị Hai, người đã nhiệt tình,
tận tụy dẫn dắt, động viên, tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi những kiến thức chuyên
ngành để tôi có thể hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cám ơn đến thầy Thành, người đã nhiệt tình hỗ trợ về thiết bị, vật
tư giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp.
Tôi cũng cám ơn các bạn ở phòng thí nghiệm và đặc biệt là những người bạn trong
nhóm ESS đã động viên, giúp đỡ tôi.
Và cuối cùng, hơn ai hết, con xin cám ơn ba và mẹ, người đã hết lòng lo lắng, vất
vả để tạo điều kiện cho con đi học đến hiện nay và thực hiện ước mơ của mình. Con xin
cám ơn ba mẹ rất nhiều.


Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên cứu
và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công
trình nào trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan
này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Trần Đức Vinh


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................4
1.1. Giới thiệu về Trichoderma ...............................................................................4
1.1.1. Phân loại ...................................................................................................5
1.1.2. Lịch sử phát triển ......................................................................................5
1.1.3. Đặc điểm chung của Trichoderma ............................................................6
1.1.3.1. Đặc điểm hình thái .............................................................................6
1.1.3.2. Đặc điểm sinh trƣởng .........................................................................8
1.1.3.3. Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma ....................................9
1.1.4. Vai trò sinh thái .......................................................................................10
1.1.5. Tính ứng dụng của Trichoderma trên thế giới và Việt Nam ...................10
1.1.6. Ứng dụng của Trichoderma trong nông nghiệp .....................................12
1.1.6.1. Bảo vệ thực vật.................................................................................12
1.1.6.2. Cải thiện năng suất cây trồng ...........................................................12
1.1.6.3. Trong xử lí môi trƣờng.....................................................................13
1.1.6.4. Trong công nghiệp thực phẩm .........................................................13
1.1.6.5. Bổ sung thức ăn cho chăn nuôi ........................................................14
1.2. Cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma spp. ........................................14
1.2.1. Cạnh tranh ..............................................................................................14
1.2.2. Kí sinh .....................................................................................................15
1.2.3. Bất hoạt enzyme của nấm bệnh ...............................................................16
1.2.4. Tăng khả năng kháng của thực vật .........................................................16
1.3. Những nghiên cứu về enzyme chitinase ........................................................17
1.3.1. Giới thiệu về chitin ..................................................................................17
1.3.1.1. Cấu trúc và tính chất của chitin ........................................................17
i


Đồ án tốt nghiệp

1.3.1.2. Lịch sử phát hiện của chitin .............................................................18

1.3.1.3. Sự phân bố của chitin trong tự nhiên ..............................................19
1.3.1.4. Điều chế chitin .................................................................................20
1.3.2 Giới thiệu về enzyme chitinase .................................................................20
1.3.2.1 Đặc điểm và sự phân bố ....................................................................20
1.3.2.2 Cơ chế hoạt động của chitinase .........................................................22
1.3.2.3 Các nguồn thu nhận chitinase ...........................................................23
1.3.2.4 Lịch sử nghiên cứu về chitinase ........................................................25
1.3.2.5 Ứng dụng của enzyme chitinase .......................................................26
1.3.2.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến enzyme chitinase và sự sinh tổng hợp
enzyme chitinase từ vi sinh vật .....................................................................28
1.3.2.7 Những nghiên cứu về tối ƣu hóa điều kiện thu nhận enzyme chitinase
từ Trichoderma harzianum ở Việt Nam và trên thế giới ...............................30
1.4 Sơ lƣợc về bệnh thán thƣ trên cây ớt và tác nhân gây bệnh Collectotrichum sp
...............................................................................................................................32
1.4.1 Bệnh thán thư trên ớt ...............................................................................32
1.4.1.1 Triệu chứng .......................................................................................32
1.4.1.2 Nguyên nhân gây bệnh ......................................................................33
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ......................................................34
2.1 Thời gian và địa điểm......................................................................................34
2.1.1 Thời gian ..................................................................................................34
2.1.2 Địa điểm ...................................................................................................34
2.2 Thiết bị- dụng cụ- vật liệu ...............................................................................34
2.2.1 Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................34
2.2.1.1 Thiết bị ..............................................................................................34
2.2.1.2 Dụng cụ .............................................................................................34
2.2.2 Giống vi sinh vật sử dụng nghiên cứu ......................................................35
2.2.3 Môi trường sử dụng để nghiên cứu ..........................................................35
2.2.3.1 Môi trƣờng PDA ...............................................................................35
2.2.3.2 Môi trƣờng định tính sự sinh tổng hợp chitinase ..............................36

ii


Đồ án tốt nghiệp

2.2.3.3 Môi trƣờng sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase ...36
2.3 Phƣơng pháp thí nghiệm .................................................................................38
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của
Trichoderma ......................................................................................................38
2.3.1.1 Phƣơng pháp nuôi cấy Trichoderma trên môi trƣờng thạch PDA ....38
2.3.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của
Trichoderma trên môi trƣờng thạch .............................................................38
2.3.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu .......40
2.3.3 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma để sản xuất chitinase.....................41
2.3.4 Phương pháp thu nhận dịch môi trường chứa chitinase .........................42
2.3.5 Xác định hoạt tính enzyme chitinase bằng phương pháp DNS ................42
2.3.6 Phương pháp tủa enzyme bằng cồn .........................................................45
2.3.7 Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp
chitinase của Trichoderma harzianum .............................................................46
2.3.8 Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn cơ chất chitin đến sự sinh tổng hợp
chitinase của Trichoderma harzianum .............................................................46
2.3.9 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp
chitinase của Trichoderma harzianum .............................................................48
2.3.10 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến sự sinh tổng
hợp chitinase của Trichoderma harzianum ......................................................49
2.3.11 Khảo sát sự ảnh hưởng các nguồn đường và hàm lượng đến sự sinh
tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum ..............................................51
2.3.12 Phương pháp thử nghiệm khả năng ức chế nấm bệnh Collectotrichum
sp .......................................................................................................................52
2.3.13 Phương pháp xử lí số liệu ......................................................................53

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN..............................................................53
3.1 Kết quả khả năng phân giải chitin của Trichoderma harzianum trên môi
trƣờng thạch có cơ chất cảm ứng chitin 1% ..........................................................53
3.2 Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
chitinase của Trichoderma harzianum ..................................................................55
3.3 Ảnh hƣởng của nguồn cơ chất chitin đến sự sinh tổng hợp chitinase của
Trichoderma harzianum ........................................................................................60
iii


Đồ án tốt nghiệp

3.4 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của
Trichoderma harzianum ........................................................................................62
3.5 Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp chitinase
của Trichoderma harzianum .................................................................................65
3.6 Ảnh hƣởng của nguồn đƣờng bổ sung đến sự sinh tổng hợp chitinase của
Trichoderma harzianum ........................................................................................67
3.7 Hiệu quả khống chế nấm gây bệnh thán thƣ ớt của chitinase thu từ
Trichoderma harzianum. .......................................................................................68
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................72
4.1 Kết luận ...........................................................................................................72
4.2 Kiến nghị .........................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................73

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DNS

Dinitrosalicylic acid

GlacNac

N-acetyl glucosamine

kDa

Kilo Dalton

MT

Môi trƣờng

NSC

Ngày sau cấy

PDA

Potato D-glucose agar

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
STT

BẢNG

NỘI DUNG

TRANG

khả năng phân giải chitin của Trichoderma
1

3.1

harzianum trên môi trƣờng định tính sinh tổng hợp

56

chitinase.
Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh môi

2

3.2

3

3.3

4

3.4

5

3.5

6

3.6

7

3.7

Đƣờng kính vòng melanin qua các ngày nuôi cấy ở 2
mẫu thí nghiệm

70

8

3.8

Tỉ lệ phần trăm tản nấm bị phân giải qua các ngày

80

trƣờng nuôi cấy.
Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng

của nguồn cơ chất cảm ứng
Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng
ngày nuôi cấy
Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng
của pH môi trƣờng nuôi cấy
Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng
của nguồn dƣờng và tỷ lệ đƣờng bổ sung.

vi

58

63

65

71

74


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH
STT

HÌNH

NỘI DUNG

1

1.1

2

1.2

3

1.3

4

1.4

5

1.5

Cấu trúc phân tử của chitin

20

6

1.6

Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase

26

7

1.7

8

2.1

Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi
trƣờng thạch dịch chiết khoai tây (PDA).
Sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma harzianum
Bào tử của Trichoderma harzianum quan sát dƣới kính
hiển vi quang học x100
Một số sản phẩm thƣơng mại ứng dụng của
Trichoderma spp. ở Việt Nam và trên thế giới.

Quả ớt bình thƣờng và quả ớt bị bệnh thán thƣ do
Collectotrichum spp.
Buồng đếm hồng cầu Neubauer

TRANG

9

10

11

14

35

43

Vòng phân giải chitin của T. harzianum trên môi
9

3.1

trƣờng dinh dƣỡng chứa chitin 1% sau 2 ngày nuôi

54

cấy.

10

3.2

11

3.3

Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của hoạt tính chitinase
theo môi trƣờng nuôi cấy.
Môi trƣờng A, B trƣớc khi ủ và sau khi ủ 5 ngàyvới
bào tử Trichoderma harzianum.

vii

55

58


Đồ án tốt nghiệp

12

3.4

13

3.5

14

3.6

15

3.7

16

3.8

17

3.9

Môi trƣờng C, D trƣớc khi ủ và sau khi ủ 5 ngày với
bào tử Trichoderma harzianum.
Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của hoạt tính chitinase
theo cơ chất cảm ứng.
Biều đổ đƣờng thể hiện sự biến đổi của hoạt tính
chitinase theo thời gian nuôi cấy
Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của chitinase theo pH
môi trƣờng ban đầu
Mặt sau (a) và mặt trƣớc (b) của tản nấm
Collectotrichum sp sau 3 ngày ủ với enzyme chitinase.
Mặt sau (c) và mặt trƣớc (d) của tản nấm
Collectotrichum sp sau 6 ngày ủ với enzyme chitinase.

viii

59

60

63

65

77

77

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1.Tính cấp thiết của đề tài
Trichoderma spp. là tác nhân kiếm soát sinh học có hiệu quả, đã có nhiều
nghiên cứu cho thấy khả năng đối kháng của chúng với các loài nấm hại thực vật
bằng các cơ chế khác nhau. Trong số đó, cơ chế sinh tổng hợp enzyme ngoại bào có
một vai trò quan trọng, đặc biệt là hệ enzyme chitinase. Đây là hệ enzyme có khả
năng phân hủy chitin- thành phần cấu tạo nên vách tế bào của đa số loài nấm hại
cây trồng và kể cả côn trùng, từ đó ức chế sự phát triển của dịch bệnh. Ngoài ra,
chitinase còn nhiều ứng dụng có ý nghĩa khác nhƣ là dùng để xúc tác để tạo ra các
hợp chất có tác dụng giúp tăng sản xuất dịch nhầy, cải thiện khả năng bôi trơn khớp
để giảm triệu chứng của thoái hóa khớp, để tổng hợp các hợp chất
chitooligosaccharides… Trong các loài Trichoderma spp. thì Trichoderma
harzianum đƣợc chứng minh là có khả năng sinh tổng hợp chitinase tốt hơn cả.
(Theo M.H. Et-Katatny, 2000)
Hiện nay, dân số ngày càng gia tăng một cách nhanh chóng, đi cùng là nhu
cầu về lƣơng thực cũng gia tăng theo. Song đối với khu vực khí hậu nhiệt đới gió
mùa nhƣ Việt Nam lại rất đa dạng về các loại nấm bệnh gây hại thực vật và chúng
phát triển rất nhanh trong nhiệt độ và độ ẩm thuận lợi thế này, gây rất nhiều khó
khăn cho việc trồng trọt và ảnh hƣởng đến bảo quản sau thu hoạch. Để bảo vệ năng
suất cây trồng và chất lƣợng nông sản sau thu hoạch, nông dân sử dụng các chất
hóa học để ngăn cản sự tấn công của nấm bệnh. Ngay cà khi dùng thuốc diệt nấm
chuyên dụng thì hàng năm trên thế giới nấm bệnh thực vật vẫn gây ra thiệt hại 15%
sản lƣợng thu hoạch. Hơn nữa, khi sử dụng thuốc hóa học một cách chủ quan lại
chính là con dao hai lƣỡi, bởi các chất hóa học là nguy cơ tiềm tàng mà ngày nay
các nhà khoa học phát hiện ra chính chúng gây ra các bệnh ung thƣ và một số bệnh
lý nguy hiểm khác.
Để khắc phục vấn đề này, các nhà khoa học đã nghiên cứu một thời gian dài

và đã tìm ra đƣợc một chìa khóa thích hợp nhất. Đó chính là những hợp chất sinh

1


Đồ án tốt nghiệp

học, thân thiện với môi trƣờng cũng nhƣ không ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời.
Và hợp chất sinh học có thể ứng dụng đó chính là enzyme chitinase, đƣợc sinh ra từ
một số vi sinh vật nhất định.
Xuất phát từ vấn đề trên, sinh viên quyết định thực hiện đề tài “Xác định
một số điều kiện nuôi cấy tối ƣu nấm Trichoderma harzianum để thu nhận
enzyme chitinase.”
2. Mục đích nghiên cứu
Tìm ra đƣợc điều kiện nuôi cấy tối ƣu để thu nhận enzyme chitinase từ
Trichoderma harzianum.
3. Nội dung nghiên cứu
Định tính khả năng sinh tổng hợp chitinase từ chủng Trichoderma
harzianum.
Khảo sát sự ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng, thời gian nuôi cấy đến sự
tổng hợp chitnase từ Trichoderma harzianum .
Khảo sát ảnh hƣởng của một số nguồn cơ chất cảm ứng, pH môi trƣờng,
nguồn đƣờng bổ sung đến khả năng sinh hoạt tính enzyme chitinase.
Hiệu quả khống chế nấm gây bệnh thán thƣ ớt của chitinase thu từ
Trichoderma harzianum.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
4.1 Phần mềm thống kê, tính toán
-

Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010.

-

Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lý số liệu.

4.2 Kết quả đạt được của đề tài
-

Tìm ra đƣợc các điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho chủng Trichoderma
harzianum sinh tổng hợp chitinase.

2


Đồ án tốt nghiệp

5. Kết cấu đồ án
-

Chƣơng 1: Tổng quan

-

Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp

-

Chƣơng 3: Kết quả và biện luận

-

Chƣơng 4: Kết luận và đề nghị

3


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về Trichoderma
Trichoderma là một trong số ít những vi nấm có lợi, điều này đã đƣợc chứng
minh và chúng đã đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học đối với những
nấm gây bệnh (Chet, 1987; Chet et al., 1998). Trichoderma có thể phát triển mạnh
trong các thảm thực vật.
Trichoderma là một chi nấm hiện diện trong đất, chúng phát triển trên nhiều
loại cơ chất khác nhau (gỗ, các loài nấm khác…), nhiều loài trong chi này có khả
năng sống cộng sinh với cây. Có thể nói Trichoderma là một trong số những loài vi
nấm đƣợc nuôi cấy thông dụng nhất. Chúng đƣợc tìm thấy ở khắp nơi trừ những vĩ
độ cực Nam và cực Bắc. Nấm Trichoderma phổ biến ở những khu rừng nhiệt đới
ẩm hay cận nhiệt đới, chúng hiện diện trên rễ cây, trong đất hay xác sinh vật đã
chết, xác bã hữu cơ hay kí sinh trên các loài nấm khác. Mỗi dòng nấm Trichoderma
khác nhau sẽ yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Harman, 2000).
Khi cộng sinh với cây, Trichoderma sẽ giúp cây tránh đƣợc khỏi sự xâm hại
của các loài nấm gây bệnh khác bằng các cơ chế nhƣ tấn công, ký sinh và lấy chất
dinh dƣỡng từ các loài nấm hại khác. Và yếu tố quan trọng để giúp chúng có thể
xâm nhập vào bên trong nấm hại chính là khả năng sinh tổng hợp các hệ enzyme
ngoại bào.

4

Đồ án tốt nghiệp

1.1.1. Phân loại
Giới (Kingdom):

Nấm (Fungi)

Ngành (Phylum):

Nấm túi (Ascomycota)

Lớp (Class):

Sordariomycetes

Phân lớp (Subclass): Hypocreomycetidae
Bộ (Order):

Hypocreales

Họ (Family):

Hypocreaceae

Chi (Genus):

Trichoderma

Loài (Species) :

Trichoderma spp.

1.1.2. Lịch sử phát triển
Chủng nấm Trichoderma đƣợc phát hiện đầu tiên bởi Persoon vào năm 1794,
vào thời điểm đầu tiên này ông đã mô tả đƣợc 3 loài:
1- Trichoderma caesium Pers. (1794).
2- Trichoderma nigrescens Pers. (1794).
3- Trichoderma viride var. viride Pers. (1794).
Cho đến năm 1801, Persoon và Gray đã mô tả chi tiết đƣợc 7 loài
nấm Trichoderma đó là:
1- Trichoderma caesium Pers. (1794).
2- Trichoderma nigrescens Pers. (1794).
3- Trichoderma viride var. viride Pers. (1794).
4- Trichoderma aureum Pers. (1796).

5


Đồ án tốt nghiệp

5- Trichoderma laeve Pers. (1796).
6- Trichoderma dubium Pers. (1801).
7- Trichoderma fuliginoides Pers. (1801).
Trong suốt 2 thế kỷ tiếp theo đến năm 1999 các nhà khoa học trên thế giới đã
phát hiện thêm khoảng 90 loài.
Từ năm 2000 trở lại đây đã phát hiện thêm khoảng 50 loài mới. Cho đến
năm 2013, đã có trên 150 loài nấm Trichoderma đƣợc mô tả.
1.1.3. Đặc điểm chung của Trichoderma
1.1.3.1. Đặc điểm hình thái

Hình 1.1: Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trƣờng thạch dịch
chiết khoai tây (PDA).
(Nguồn: )
Chủng nấm Trichoderma spp. thuộc nhóm nấm bất toàn (là những nấm sinh
sản vô tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp
thành chuỗi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử), có khuẩn lạc màu lục khi
tăng trƣởng có sự hiện diện của ánh sáng mặt trời. Sợi nấm của Trichoderma phân
nhánh mạnh, thƣờng hình thành ở dạng gần nhƣ vòng tròn đồng tâm. Các sợi nấm
thƣờng mọc tạo góc với trục chính khoảng 90 độ.

6


Đồ án tốt nghiệp

Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở
cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn,
không màu và liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy.

Hình 1.2: Sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma harzianum
(Nguồn: />Bào tử của nấm Trichoderma mịn, trơn láng có màu xanh lá cây hoặc màu
vàng. Bào tử của hầu hết các loài có hình elip, 3-5 x 2-4 µm (L/W=1.3), bào tử hình
cầu (L/W<1,3) rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài.

7


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3: Bào tử của Trichoderma harzianum quan sát dƣới kính hiển vi quang học
x100
1.1.3.2. Đặc điểm sinh trưởng
Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn
hợp nguồn carbon và nitrogen. Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng đƣợc
là monosaccharide, disaccharide, polysaccharide… NH3 là nguồn đạm mà nấm
Trichoderma dễ sử dụng nhất, nên thƣờng có mặt trong môi trƣờng nuôi cấy loài
nấm này, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trƣờng có nhiều
dinh dƣỡng. Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hƣởng lớn đến khả năng sinh
trƣởng của Trichoderma. Nhƣng muối NaCl sẽ làm giảm sự sinh trƣởng và phát
triển của một số loài Trichoderma, do đó trong môi trƣờng nuôi cấy không nên có
sự có mặt của NaCl. Nồng độ CO2 cũng ảnh hƣởng phần nào đến sự sinh trƣởng của
Trichoderma. Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 300C [13], có một vài loài
Trichoderma tăng trƣởng đƣợc ở 350C. Một số ít phát triển tốt ở 400C (Samuels,
2000). Trichoderma phát triển tốt ở đất có độ pH từ 3,5 - 7,0 nhƣng không thể phát
triển trong điều kiện pH < 3,5, phát triển tốt ở pH trung tính. Các chủng
Trichoderma có tốc độ tăng trƣởng nhanh, đƣờng kính khuẩn lạc đạt trung bình 2
cm – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy (Bùi Xuân Đồng, 1982).
Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác
nhau. Ví dụ Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống
trong môi trƣờng có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum

8


Đồ án tốt nghiệp

thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thƣờng phân bố ở vùng có khí
hậu ấm áp.
Phần lớn các loài Trichoderma có tính cảm quang, dễ nảy mầm ở nhiều điều

kiện môi trƣờng tự nhiên và nhân tạo dƣới điều kiện tối sáng lẫn lộn hay bào tử xuất
hiện trong điều kiện sáng. Bào tử trên môi trƣờng thạch agar dƣới ánh sáng 85 Lux
trong 20 - 30 giây sẽ làm tăng hiệu quả nẩy mầm. Đối với thể bào tử phialiconidio
cảm ứng với ánh sáng nhất, chúng sẽ xuất hiện nhiều dƣới ánh sáng ban ngày trong
khoảng 3 phút hoặc dƣới tia cực tím ở 10 - 30 giây. Một số tác giả đã công bố
Trichoderma hình thành bào tử nhiều nhất ở bƣớc sóng từ 380 nm - 440 nm, và
không hình thành bào tử ở bƣớc sóng dƣới 254 nm và trên 1100 nm. Các bào tử
cảm quang bị hạn chế phát triển dƣới sự có mặt của các hóa chất nhƣ: azaguanine,
5-fluorouracil, actiomycin D, Cycloheximide, phenethyl alcohol và ethidum
bromide,… các hóa chất này sẽ ngăn chặn sự hình thành của các hậu mô bào tử, đây
là một cấu trúc rất đặc biệt, có tiềm năng trong phòng trừ sinh học. T. hamatum, T.
hazianum, T. viride và T. virens ở trong cả môi trƣờng lỏng và rắn có acide thích
hợp cho sự nảy mầm bào tử hơn là môi trƣờng trung tính.
1.1.3.3. Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma
Weidling là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm trao đổi chất của
Trichoderma. Weidling và Emerson đã phân lập đƣợc chất độc kết tinh từ sản phẩm
trao đổi chất của Trichoderma, đó là: gliotoxin (C13H14N2S2O4).
Chất độc thứ hai do Brian và Mc. Growan công bố là virindin (C9H16O6),
đƣợc sản xuất từ T. viride. Dennis và Webstre ghi nhận Trichoderma spp., còn sinh
tổng hợp một sản phẩm trao đổi chất khác gliotoxin và virindin, đó là kháng sinh:
trichlorofore từ T. viride và T. polysporum, kháng sinh peptide từ T. harzianum.
Bên cạnh sản phẩm trao đổi chất là chất độc và kháng sinh, Trichoderma còn
sinh tổng hợp đƣợc một số các enzyme có hoạt tính sinh học mạnh nhƣ: exo và
endoglucanse, cellobiose và chitinase.

9


Đồ án tốt nghiệp

1.1.4. Vai trò sinh thái
Ngoài tự nhiên Trichoderma thể hiện rất rõ vai trò sinh thái của chúng nhƣ:
ức chế sự phát triển của các loài nấm bệnh nhờ cơ chế kí sinh, phân giải các nguồn
chất thải hữu cơ nhƣ cellulose từ gỗ, lá,…
Theo Garret (1956), Trichoderma có đƣợc những khả năng trên là do các đặc
tính sau:
 Sinh trƣởng mạnh và bào tử nảy mầm nhanh.
 Có khả năng sinh tổng hợp enzyme phân giải cao.
 Có khả năng tạo kháng sinh, chịu đƣợc cả kháng sinh.
1.1.5. Tính ứng dụng của Trichoderma trên thế giới và Việt Nam
Nấm Trichoderma đã đƣợc biết đến từ những năm 1920 và đƣợc xem là yếu
tố kiểm soát sinh học chống lại mầm bệnh trên cây trồng. Cho đến gần đây, các cơ
chế để kiểm soát đã đƣợc biết đến, bao gồm khả năng kí sinh, kháng nấm, cạnh
tranh về dinh dƣỡng, khả năng tiết enzyme phân hủy vách tế bào nấm bệnh. Nấm
Trichoderma xâm chiếm các lớp biểu bì rễ, lớp vỏ bên ngoài và đồng thời giải
phóng các phân tử chất có hoạt tính sinh học. Trichoderma spp. bắt đầu đƣợc ứng
dụng trong nông nghiêp để kiểm soát dịch bệnh. Các nghiên cứu về tính kí sinh
cũng đã chứng minh rằng loài nấm này tạo ra một hỗn hợp đa dạng các enzyme
kháng nấm, bao gồm: chitinase và β-1,3-glucanase. Các enzyme này cùng với một
số enzyme khác, cùng với hợp chất kháng nấm hỗ trợ nhau trong quá trình chống lại
các loài nấm bệnh.
Trên thế giới có một số sản phẩm nấm Trichoderma đƣợc đƣa vào ứng dụng
tính đối kháng nấm bệnh trên một số cây trồng. Sản phẩm Trichoderma 2000
(Israel) chứa Trichoderma harzianum trong phòng chống nấm Rhizoctonia solani,
Sclerotium rolfssim Pythium. Sản phẩm Trichopel (New Zealand) chứa nấm
Trichoderma harzianum đối kháng với nhiều nấm bệnh. Sản phẩm Ecofit (India)
chứa nấm Trichoderma viride trong phòng chống nấm Fusarium, Pythium,

10

Đồ án tốt nghiệp

Rhizoctonia, Macrophomia, Phytophthora trên cây bông vải, thuốc lá, cao su,.. và
nhiều loại rau. Sản phẩm BINAB-T-WP (Thụy Điển) chứa 2 loại nấm Trichoderma
harzianum và Trichoderma polysporum trong phòng chống các bệnh ở rễ cây.
Ngoài ra, còn có rất nhiều sản phẩm khác ở nhiều nƣớc trên thế giới đƣợc ứng dụng
rộng rãi trong phòng chống nhiều loại bệnh do nấm gây ra trên cây trồng (CABI,
2001).
Ở Việt Nam, các tỉnh phía nam đang lƣu hành khoảng 30 sản phẩm có chứa
Trichoderma của nhiều công ty khác nhau, các sản phẩm này đã và đang góp phần
hạn chế các nấm bệnh trên cây trồng nhƣ hồ tiêu, ca cao, cà chua, dua hấu, dƣa leo,
cam quýt (Quang Ngọc, 2009). Nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Cần Thơ đã phối
hợp các chủng nấm Trichoderma thành các sản phẩm phòng trừ bệnh hiệu quả theo
đối tƣợng nhƣ: Tricô-ĐHCT có khả năng phòng trừ bệnh thối rễ trên cây ăn trái, rau
màu do Fusarium; Tricô-Lúa Von phòng trừ bệnh lúa Von do Fusarium
moniliforme; Tricô- Nấm Hồng trị bệnh do Phytophthora trên sầu riêng, tiêu, cao
su,.. Tricô- Khóm trị bệnh do Phytophthora, Fusarium gây ra (Dƣơng Minh và cộng
sự, 2010).

Hình 1.4: Một số sản phẩm thƣơng mại ứng dụng của Trichoderma spp. ở Việt
Nam và trên thế giới.

11


Đồ án tốt nghiệp

1.1.6. Ứng dụng của Trichoderma trong nông nghiệp
1.1.6.1. Bảo vệ thực vật

Một số bệnh liên quan đến các bộ phận rễ cây rất khó trị bằng biện pháp hóa
học truyền thống, vì không thể tác động lên toàn bộ rễ bằng thuốc diệt nấm.
Trichoderma spp. đƣợc biết đến nhƣ là một tác nhân đối kháng lại với các nấm bệnh
của cây trồng và đã đƣợc ứng dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học cho cây trồng
trong nhà kính và ngoài ruộng, chúng có khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh
khác nhau nhƣ: Phytophthora spp., Rhizoctonia solani, Pythium spp., Slecrotium
rofsii.
Một số loài Trichoderma đƣợc sử dụng phổ biến trong kiểm soát sinh học là
T. koningii, T. harzianum, T. viride, T. hamatum,...
1.1.6.2. Cải thiện năng suất cây trồng
Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nảy mầm và ra hoa. Đã có
những công trình khoa học chứng minh rằng T. harzianum và T. koningiii kích thích
sự nảy mầm và tăng trƣờng của cây. Đối với các loài đƣợc trồng trong nhà kính, T.
harzianum đẩy nhanh sự ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lƣợng
hoa.
Trichoderma đẩy mạnh tốc độ tăng trƣởng của cây trồng nhờ khả năng giúp
cây trồng tạo ra hệ rễ cứng cáp hơn. Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng bắp
đƣợc bổ sung T. harzianum T-22 hỗ sinh ở rễ thì cần lƣợng đạm ít hơn 40% so với
rễ không có T-22.
Trichoderma cải thiện cấu trúc đất và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát
triển của vi sinh vật nốt sần cố định Nitơ trong đất, duy trì sự cân bằng của các vi
sinh vật hữu ích trong đất, tăng độ phì nhiêu và dinh dƣỡng cho cây trồng.
Tăng sức đề kháng cho cây trồng, một số chủng T. harzianum còn có thể
xâm nhập vào mô tế bào cây, làm tăng khả năng chống chịu bệnh của cây.

12


Đồ án tốt nghiệp

Các chủng nấm Trichoderma spp.trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh
không những cung cấp một nguồn phân bón xanh, hiệu quả mà còn góp phần kiểm
soát các bệnh hại cây trồng và tạo ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên.
1.1.6.3. Trong xử lí môi trường [17]
T. harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất rừng, đã
đƣợc chứng minh có khả năng phân giải hiệu quả ciliatin, glycophosphat và amino
methylphosphonic.
T. harzianum 2023 (Khoa sinh lý thực vật trƣờng đại học California) có thể
phân giải DDT, endosulfan, pentachloronitrobenzen và pentachlorophenol.
T. harzianum CCT-4790 có thể phân giải 60% thuốc diệt cỏ Durion trong đất
sau 24 giờ, đây đƣợc xem nhƣ là một liệu pháp rất có tiềm năng trong việc xử lí các
hóa chất gây độc hại trong đất và trong đầm lầy.
1.1.6.4. Trong công nghiệp thực phẩm
Enzyme của chủng Trichoderma longibrachiatum đã đƣợc khảo sát và cho
thấy có thể làm tăng hƣơng vị của men rƣợu. Đồng thời, các loại enzyme glucanase
và glucosidase đƣợc tiết ra có khả năng thủy phân các liên kết glycoside trong liên
kết glycoside-terpen từ đó giải phóng các hợp chất terpen, tạo mùi thơm đặc trƣng
cho sản phẩm.
Bột lúa mì để sản xuất bánh mì thƣờng chứa đầy đủ hàm lƣợng β-amylase
nhƣng lại thiếu α-amylase, cho nên ngƣời ta phải bổ sung vào bột một lƣợng αamylase nhất định có thể lấy từ đại mạch nảy mầm, vi khuẩn hay nấm. Trong đó
nấm đƣợc xem là nguồn α-amylase phong phú và tốt nhất. Các nhà khoa học đã
chuyển thành công gen mã hóa α-amylase từ Trichoderma vào nấm men bánh mì
dƣới sự kiểm soát của promoter ACT1. Bánh mì tạo ra có kích thƣớc lớn hơn và ruột
bánh mì cũng mềm hơn, chậm cứng hơn làm kéo dài thời gian bảo quản.

13


Đồ án tốt nghiệp

1.1.6.5. Bổ sung thức ăn cho chăn nuôi
Hiện nay trên thị trƣờng có chế phẩm EconaseTM với các enzyme có nguồn gốc
từ Trichoderma reesei bổ sung vào thức ăn của gia súc, với các ƣu điểm:
-

Thành phần dinh dƣỡng linh động hơn.

-

Sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền.

-

Dễ tiêu hóa

-

Làm tăng giá trị năng lƣợng của ngũ cốc

-

Giảm lƣơng rác thải cho môi trƣờng
Ngoài ra còn có chế phẩm AvizymeTM cũng chứa nhƣng ƣu điểm tƣơng tự

EconaseTM thích hợp cho gia cầm trong giai đoạn đẻ trứng. PorzymeTM là thƣơng
hiệu của một hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase, protease, amylase bổ
sung vào khẩu phần ăn của lợn con vừa thôi bú. Tất cả enzyme này đều bắt nguồn
từ Trichoderma.
1.2. Cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma spp. [17]
Trichoderma spp. Phát triển nhiều cơ chế để ngăn chặn sự tấn công của các

loài nấm khác và hỗ trợ cho cây và rễ cây phát triển. Các cơ chế này bao gồm cạnh
tranh về không gian và dinh dƣỡng (Elad et al., 1999), kí sinh (Haran et al., 1996;
Lorito et al., 1996), sản sinh ra những hợp chất mang tính ức chế (Sivasithamparam
và Ghisalberi, 1998), bất hoạt các enzyme của tác nhân gây bệnh (Roco và Perez,
2001) và tăng khả năng kháng của thực vật (Kapulnik và Chet, 2000).
1.2.1. Cạnh tranh
Các loài Trichoderma thƣờng đƣợc xem là những đối thủ cạnh trạnh mạnh
mẽ (Samuels, 1996), chúng phát triển mạnh và nhanh chóng sử dụng các nguồn cơ
chất dinh dƣỡng để ức chế khả năng phát triển của nấm bệnh, ví dụ nhƣ Fusarium
spp. (Papavizas, 1985). Những loài Trichoderma, có thể bổ sung trực tiếp vào đất,
hay xử lí với hạt giống sẽ phát triển theo sự sinh trƣởng của hệ thống rễ của cây
đƣợc xử lí (Ahmad và Baker, 1987). Đất đƣợc xử lí với bào tử nấm T. harzianum sẽ

14