Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu và cảm ứng tạo protocom của loài lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum)

1

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BAP
CT
KC

Benzylaminopurine
Công thức
Môi trường Knudson C

MS
NAA
NXB
MT
½ MS

Môi trường Murashige and Skoog
Naphthalene Acetic Acid
Nhà xuất bản
Môi trường
Môi trường ½ Murashige & Skoog


2

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.

Trang

8

Bảng 3.1.
Bảng 3.2.
Bảng 3.3.
Bảng 3.4.
Bảng 3.5.

Một số loại hóa chất thường dùng trong khử trùng bề
mặt mẫu cấy
Số lượng mẫu nhiễm trong công thức khử trùng 1
Số lượng mẫu nhiễm trong công thức khử trùng 2
Số lượng mẫu nhiễm trong công thức khử trùng 3
Số lượng mẫu nhiễm trong công thức khử trùng 4
Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống của

Bảng 3.6.

hạt lan Sơn Thủy Tiên sau 4 tuần nuôi cấy
Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên trên công thức

29

Bảng 3.7.

môi trường MT1
Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên trên công thức

29

Bảng 3.8.

môi trường MT2
Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên trên công thức

30

Bảng 3.9.

môi trường MT3
Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên trên công thức

30

môi trường MT4
Bảng 3.10. Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên trên công thức

31

môi trường MT5
Đặc điểm protocom lan Sơn Thủy Tiên trên công thức

31

Bảng 3.11.

23
23
23
24

25

môi trường MT6
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến tỷ lệ tạo

32

protocom
Bảng 3.13. Đặc điểm chiều cao chồi lan Sơn Thủy Tiên ở các môi

37

trường sau 8 tuần cấy chuyển


3
Bảng 3.14. Số lá lan Sơn Thủy Tiên ở các môi trường sau 8 tuần cấy

39

chuyển
Bảng 3.15. Số rễ lan Sơn Thủy Tiên ở các môi trường sau 8 tuần cấy

40

chuyển


4
DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 2.1.
Hình 2.2.
Hình 3.1.

Lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium Chrysotoxum)
Qủa lan Sơn Thủy Tiên
Biểu đồ ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến tỷ lệ sống

17
17
25

Hình 3.2.
Hình 3.3.
Hình 3.4.

của hạt lan Sơn Thủy Tiên sau 4 tuần nuôi cấy.
Mẫu tái sinh sau 4 tuần nuôi cấy
Mẫu nhiễm sau 4 tuần nuôi cấy
Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến tỷ lệ tạo
protocom

27
28
33

Hình 3.5. Hình thái protocom sau 5 tuần nuôi cấy
Hình 3.6a. Hình thái protocom nuôi cấy trong MT1, MT2, MT3 sau

34
35

5 tuần được soi dưới kính hiển vi
Hình 3.6b. Hình thái protocom nuôi cấy trong MT4, MT5, MT6 sau
5 tuần được soi dưới kính hiển vi
Hình 3.7. Biểu đồ chiều cao trung bình của chồi lan Sơn Thủy Tiên

36
38

Hình 3.8.

ở các môi trường sau 8 tuần cấy chuyển
Biểu đồ số lá trung bình của lan Sơn Thủy Tiên ở các

39

Hình 3.9.

môi trường sau 8 tuần cấy chuyển
Biểu đồ số rễ trung bình của lan Sơn Thủy Tiên ở các

41

môi trường sau 8 tuần cấy chuyển
Hình 3.10. Chồi lan Sơn Thủy Tiên sau 8 tuần theo dõi

42

MỤC LỤC
PHẦN 1:MỞ ĐẦU............................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài...........................................................................................1


5
2. Mục tiêu nghiên cứu......................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.......................................................................2
3.1. Ý nghĩa khoa học...............................................................................2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn...............................................................................2
PHẦN 2: NỘI DUNG.......................................................................................3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU...................................3
1.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái học của loài lan Sơn Thủy Tiên................3
1.1.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại.............................................................3
1.1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học................................................3
1.2. Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào...........................................4
1.2.1. Định nghĩa......................................................................................4
1.2.2. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào............................................4
1.2.3. Ưu điểm, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro........5
1.2.4. Quy trình nhân giống in vitro.........................................................7
1.3. Một số nghiên cứu nhân giống hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam........10
1.3.1. Trên thế giới.................................................................................10
1.3.2. Ở Việt Nam...................................................................................13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............17
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................17
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu...................................................................17
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu.....................................................................17
2.2. Nội dung nghiên cứu................................................................................18
2.3. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................18

6
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết...............................................18
2.3.2. Phương pháp luận........................................................................18
2.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm....................................................18
2.3.4. Phương pháp thu thập số liệu......................................................20
2.3.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu.......................................20
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................22
3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng tới tỷ lệ tạo mẫu sạch
in vitro.................................................................................................................22
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo
protocom..............................................................................................................28
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng trong giai
đoạn tạo chồi.......................................................................................................37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................................43
1. Kết luận.......................................................................................................43
2. Kiến nghị.....................................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................44


7
PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Phong lan được biết đến là một loài hoa đẹp mang nhiều ý nghĩa, thường
được dùng làm cảnh và trang trí, một số loài có tác dụng chữa bệnh. Lan Hoàng
Thảo (Dendrobium) là một chi lớn trong họ Lan (Orchidaceae) có khoảng 1400
loài, ở Việt Nam có 107 loài, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và cả trên
một số đảo ven biển [2].
Lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum), thuộc chi Hoàng Thảo, là

loài lan rừng Việt Nam phân bố chủ yếu ở Tây Nguyên [5]. Hoa có hình thái
đẹp, hương thơm nhẹ nhàng, tươi mát, dễ chăm sóc, và là một trong số các loài
lan Hoàng Thảo rất được ưa chuộng. Hiện nay loài lan này trong tự nhiên đang
bị suy giảm nghiêm trọng do khai thác để trồng, bán làm cây cảnh, đôi khi làm
thuốc và do chặt phá rừng gây hủy hoại nơi cư trú.
Để hạn chế việc khai thác quá mức lan Sơn Thủy Tiên ngoài tự nhiên cũng
như để bảo tồn loài lan này, việc nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào
thực vật (in vitro) được quan tâm. Công nghệ nhân giống in vitro là công cụ đắc
lực trong việc bảo tồn và phát triển các loài lan quý. Phương pháp này mang lại
nhiều ưu điểm như hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng đều về mặt di
truyền, sạch bệnh, đồng thời có tiềm năng sinh học cao.
Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu (khử trùng) và cảm ứng tạo protocom (mô
sẹo) thông qua các môi trường khác nhau của loài lan Sơn Thủy Tiên
(Dendrobium chrysotoxum) hiện tại vẫn còn rất ít các công trình nghiên cứu
[9;10]. Tại Việt Nam vẫn chưa có đề tài nào nghiên cứu, so sánh về tạo vật liệu
khởi đầu và cảm ứng tạo protocom thông qua các môi trường khác nhau của loài
lan này. Xuất phát từ những lý do trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên
cứu tạo vật liệu khởi đầu và cảm ứng tạo protocom của loài lan Sơn Thủy
Tiên (Dendrobium chrysotoxum)”.


8
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định công thức khử trùng mẫu quả tối ưu nhất cho cây lan Sơn Thủy
Tiên trong giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu.
- Xác định môi trường nuôi cấy phù hợp nhất với đối tượng cây lan Sơn
Thủy Tiên đến giai đoạn in vitro tạo protocom.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học giúp hoàn

thiện quy trình nhân giống in vitro giống lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium
chrysotoxum) mở ra hướng nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống đối với
các giống hoa lan khác ở nước ta.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài có thể ứng dụng vào quá trình nhân giống in vitro giống
lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) tại trường Đại học Hùng Vương.


9
PHẦN 2: NỘI DUNG
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái học của loài lan Sơn Thủy Tiên
1.1.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại

Cây lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) thuộc họ Orchidaceae bộ Orchidales - phân lớp Ngọc lan Magnoliidae - lớp Ngọc lan Magnoliopsida Ngành hạt kín Magnoliophyta [1].
1.1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học
Lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) là loài lan rừng Việt Nam.
Chúng có giả hành hình dùi bắp, hẹp ở đáy, lớn mập ở giữa rồi thon lại, có nhiều
sóng dọc thấp, màu vàng khi già, cao đến 30cm, mập ú to 3–5cm đường kính;
mang 6-7 lá ở đỉnh, dài 8–15cm, rộng 2.5-3cm. Chùm hoa mọc mạnh, nghiêng
xéo ra rồi cong xuống, dài đến 20cm với nhiều hoa thưa. Hoa to cỡ 5cm, thơm,
màu vàng đậm, ánh như sáp, trung tâm môi vàng cam, có lông và rìa mép. Loài


10
này có hoa khoảng tháng 2 (âm lịch), tái sinh bằng chồi và hạt, mọc bám trên
các cây gỗ lớn trong rừng, ở độ cao 600-1200m. Do có hoa đẹp nên được dùng
làm cảnh, ngoài ra còn có giá trị về dược phẩm.
Trên thế giới, lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) có ở Ấn Độ,
Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào. Còn ở Việt Nam chúng phân bố chủ yếu ở

Nghệ An (Vinh), Kontum (Đắklei, Đắk Uy), Gia Lai (Chư Pah), Đắk Lắk (Buôn
Ma Thuột), Lâm Đồng (Đà Lạt).
Loài có khu phân bố và nơi cư trú chia cắt. Hiện đã bị suy giảm nghiêm
trọng do khai thác để trồng, bán chủ yếu làm cây cảnh, đôi khi làm thuốc và chặt
phá rừng hủy hoại nơi cư trú [9].
1.2. Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào
1.2.1. Định nghĩa
Nhân giống cây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là phương pháp nuôi cấy
mô tế bào trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng và tái
sinh chúng thành cây con [14].
Nhân giống cây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là phương pháp mới bổ
sung cho các kỹ thuật nhân giống truyền thống nhiều kỹ thuật tiến bộ, có thể
khắc phục được những hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống.
1.2.2. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học thuyết về
tính toàn năng của tế bào. Theo Haberlandt G (1902), nhà thực vật học người
Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ thông tin di truyền của cơ thể,
khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển
thành các cơ thể hoàn chỉnh. Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một
cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ. Hàng trăm loài cây trồng đã
được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường


11
nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn
(Murashige, 1980).
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là quá
trình phân hóa và phản phân hóa. Tất cả các tế bào trong cơ quan khác nhau của
cơ thể thực vật đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh
thành các tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là

sự phân hóa tế bào. Còn quá trình phản phân hóa thì ngược lại với quá trình
phân hóa, có nghĩa là tế bào phân hóa thành mô chức năng không hoàn toàn mất
đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp cúng có thể trở về dạng phôi
sinh và tái phân sinh.
Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Trong
quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất
định được hoạt hóa cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt
động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc
phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể
thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi nằm trong khối mô bình thường, tế
bào luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh. Khi tế bào được tách riêng rẽ,
tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các gen được hoạt
hóa và quá trình phân hóa sẽ xảy ra theo một quá trình định sẵn [3].
1.2.3. Ưu điểm, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro
* Ưu điểm:
Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở ngại
mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp. Sau đây là những ưu điểm
chính:
- Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát
triển và năng suất cao.


12
- Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã
-

chọn lọc.
Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao.
Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen.
Có khả năng sản xuất quanh năm.

Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái

nhất định hoặc hạt nảy mầm kém.
- Hệ số nhân giống cao, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất
đại trà.
* Nhược điểm:
Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị
tiên tiến và kỹ thuật cao nên chỉ hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc
không nhân giống được bằng phương pháp khác. Ngoài ra phương pháp này còn
có những bất lợi sau:
- Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây con kích thước
-

nhỏ đòi hỏi phải có kỹ thuật chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm.
Cây có thể có những đặc tính không mong muốn.
Khả năng đột biến cao.
Khả năng tái sinh có thể mất đi do cấy chuyển nhiều lần.
Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt.

Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi
để phục vụ cho những mục đích sau:
- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các
loài cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa...của
nhóm cây thân thảo.
- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý hiếm của giống cây công nghiệp
và gốc ghép cho nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh của nhóm cây thân gỗ.
- Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với
làm sạch virut.
- Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài giao
phấn trong ngân hàng gen.

13
1.2.4. Quy trình nhân giống in vitro
Gồm 5 giai đoạn [4]:
- Giai đoạn chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là chuẩn bị được nguồn nguyên liệu thực
vật cho quá trình nuôi cấy. Khâu đầu tiên của giai đoạn này có thể coi như một
bước thuần hóa vật liệu nuôi cấy. Cây mẹ (là cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) được
đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi trường mới, đồng thời
giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ động nguồn mẫu trong
công tác nhân giống. Cây mẹ phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virut và ở giai đoạn
sinh trưởng mạnh. Thông thường, cây mẹ là cây có những tính trạng tốt, đạt tiêu
chuẩn của các nhà chọn giống hoặc là những đối tượng đang có nguy cơ tuyệt
chủng. Trong trường hợp cần thiết có thể làm trẻ hóa vật liệu giống.
- Giai đoạn nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Khi đã có nguồn
nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu và xử lý mẫu cấy trong những điều kiện
vô trùng. Khi lấy mẫu cần chọn loại mẫu cấy phù hợp (đúng loại mô, đúng giai
đoạn phát triển: thường lấy chồi đỉnh, chồi nách hay đoạn thân, mảnh lá...).
Người ta thường khử trùng mẫu cấy bằng một số loại hóa chất như: HgCl 2 0,1%,
cồn 70%, H2O2, Ca(OCl)2.... Để tăng tính linh động của hóa chất diệt khuẩn,
người ta thường sử dụng thêm các chất làm giảm sức căng bề mặt như tween 20,
tween 80, teepol... Mẫu sau khi được khử trùng được cấy vào môi trường nuôi
cấy khởi động.
Bảng 1.1: Một số loại hóa chất thường dùng trong khử trùng bề mặt mẫu cấy:
Hoá chất
Calci hypochlorite
Nước Javel hoặc

Nồng độ áp dụng
9-10%
2% của dung dịch tẩy rửa

Thời gian áp dụng
(phút)
5-30
5-30


14
Clorox (NaOCl)
Nước Brom
H2O2
AgNO3
HgCl2
Kháng sinh

(20% NaOCl)
1-2%
10-20%
1%
0.1-1%
400-500 mg/l

2-10
5-15
5-30
2-10
30-60

Một số vấn đề phát sinh trong khử trùng bề mặt mẫu cấy:
- Virus: Virus là tác nhân gây hại nguy hiểm trong nông nghiệp. Một mẫu cấy
nhiễm virus có thể tạo ra vô số cây con nhiễm. Vì vậy để tạo cây giống không
nhiễm virus thì mẫu cấy ban đầu phải đảm bảo không bị nhiễm virus.
- Vi khuẩn: Nhiễm do vi khuẩn thường gặp trong nuôi cấy mô. Vi khuẩn có
thể sống tự do trong không khí, sự hiện diện của chúng trong môi trường nuôi
cấy gây nhiều bất lợi, có thể gây chết cây hoặc làm chậm sinh trưởng của mẫu
nuôi cấy.
Trong thực tế, việc quản lý mẫu cấy và môi trường nuôi cấy vô trùng là
rất khó khăn. Đôi khi triệu chứng nhiễm xuất hiện chậm trong môi trường nuôi
cấy hoặc sau vài lần cấy chuyền. Các vi khuẩn gây nhiễm thường gặp trong quá
trình nuôi cấy là Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus,
Staphylococus. Biện pháp khắc phục phổ biến là cấy đỉnh sinh trưởng hoặc dùng
kháng sinh.
- Nấm: Nấm rất dễ nhiễm trong quá trình nuôi cấy làm hạn chế sự phát triển
của mẫu cấy, làm chết mẫu cấy. Nhiều loại nấm thường gặp trong nuôi cấy mô là
Aspergillus, Candida, Microsprium, Phialopora. Sự nhiễm nấm thường dễ phát
hiện sau 1 đến 2 tuần cấy mẫu, nguyên nhân gây nhiễm là do khử trùng bề mặt
mẫu cấy chưa sạch hoặc hoá chất khử trùng chưa thíchhợp, nhiễm do thao tác
cấy chuyền hoặc bởi côn trùng nhỏ...
Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ sống
cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt [19].


15
- Giai đoạn nhân nhanh
Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro so với
các phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao. Vì vậy, giai
đoạn nhân nhanh được coi là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân

giống. Phải xác định được môi trường dinh dưỡng và môi trường vật lý phù hợp
để đạt hiệu quả cao nhất. Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng, chất phụ gia
(nước dừa, khoai tây...) là đặc biệt quan trọng. Tăng cường chiếu sáng là yếu tố
quan trọng kích thích mô phân hóa mạnh. Bảo đảm chế độ nhiệt 20-30 0C. Yêu
cầu cần đạt trong giai đoạn này là tạo được hệ số nhân cao.
- Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn các chồi đã đạt kích thước nhất định và được chuyển từ môi
trường ở giai đoạn 3 sang môi trường nuôi cấy tạo rễ để hình thành cây hoàn
chỉnh. Ở giai đoạn này, môi trường cần giảm lượng cytokinin và tăng lượng
auxin để rễ phát triển (Pierik, 1987). Các chất α – NAA, IBA, IAA thường được
sử dụng ở nồng độ 1-5 mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loại cây trồng. Từ những
chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Lúc này cây con
rất nhạy cảm với độ ẩm và bệnh tật do hoạt động của lá và rễ mới sinh rất yếu,
cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng. Yêu cầu cần đạt được trong giai đoạn
này là cây con tạo ra đủ tiêu chuẩn về chiều cao, số lá và số rễ.
- Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm
Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài
trời để tạo điều kiện cho cây con tự dưỡng hoàn toàn và thích nghi dần với môi
trường tự nhiên. Khi cây đủ tiêu chuẩn cứng cáp thì mang trồng. Để đưa cây từ
ống nghiệm ra môi trường bên ngoài đạt tỷ lệ sống cao cần đảm bảo một số yêu
cầu: cây trong ống nghiệm đạt những tiêu chuẩn về hình thái nhất định, có giá
thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp, phải giữ ẩm cho cây khi mới đưa cây từ ống
nghiệm ra, duy trì độ ẩm trên 50% để cây con không mất nước đặc biệt trong 2-3


16
tuần đầu, tránh ánh sáng quá mạnh gây cháy lá, tránh nhiễm khuẩn và nấm gây
thối nhũn. Điều kiện môi trường trong giai đoạn này là rất quan trọng, cần tạo
điều kiện cho bộ rễ phát triển, Cây cứng cáp và phòng bệnh cho cây. Đây được
xem là công đoạn quyết định khả năng ứng dụng quy trình này trong thực tiễn

sản xuất.
1.3. Một số nghiên cứu nhân giống hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Trên thế giới
Trên thế giới, phong lan là loài hoa đẹp và rất được ưa chuộng, hiện có
khoảng 25.000 loài hoa lan khác nhau. Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thế giới
rất cao, nghề nuôi trồng hoa lan đã trở thành một bộ phận chủ yếu của ngành
trồng hoa xuất khẩu của nhiều nước. Trong điều kiện tự nhiên, sự phát triển về số
lượng lan bằng con đường sinh sản sinh dưỡng rất chậm. Mặt khác, một số loài
lan có hạt bản thân hạt lại rất khó nảy mầm như các loài lan thuộc chi
Phaphiopelium, Dendrobium, Cymbidium, Vanda.... Đứng trước những vấn đề
trên cùng với nhu cầu thường thức hoa lan ngày càng cao, ngày nay với sự tiến bộ
của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ khoa học thực vật đã làm thay đổi
hoàn toàn kỹ thuật nhân giống lan. Với kỹ thuật nhân giống in vitro không những
tạo được số lượng cây giống lớn đồng nhất trong một thời gian ngắn mà còn ngăn
cản sự thoái hóa giống.
Haberlandt (1898) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế
bào thực vật. Ông đã tìm cách nuôi cấy tế bào đã phân hóa tách từ lá một số cây
một lá mầm nhưng không thành công. Hơn thế, ông lại dùng tế bào đã mất hết
khả năng tái sinh [2].
Năm 1904, Noel Benarrd và Burgeff người Đức cộng tác với nhau để đưa ra
phương pháp gieo hạt lan có nhiễm trong chai thạch. Phương pháp này đã làm
gia tăng số lượng lớn cây con trồng từ hạt.


17
Vào những năm 1930, Schmacker (1929), Schitterer (1931), Laurue (1933)
đã bước đầu nuôi cấy thành công đầu rễ phân lập trong môi trường nhân tạo.
Đây là những tiến bộ rất có ý nghĩa [2].
Năm 1931, White và Gautheret đã nghiên cứu thành công môi trường nuôi
cấy phong lan. Trên môi trường của White và Gautheret, hạt lan có thể nảy mầm

không cần sự có mặt của nấm Rhiroctonia.
Georges Morel, học trò của R.J.Gautheret đã áp dụng phương pháp nuôi cấy
mô vào cây lan từ năm 1956. Ông công bố thành công ấy trên A.O.S (American
Orchid Society) vào năm 1960 và giống lan đầu tiên ông áp dụng thành công là
giống lan Cymbidium.
Một số nghiên cứu về chi Dendrobium:
Với cây hoa lan, việc sử dụng các hình thức sinh sản vô tính như ươm, giâm
cây keiki rất ít được áp dụng. Phương pháp nhân giống vô tính bằng nuôi cấy
mô tế bào thực vật ra đời đã nhận được nhiều sự quan tâm và được áp dụng vào
nhân giống cây hoa lan để tạo số lượng lớn. Môi trường dinh dưỡng sử dụng cho
việc nuôi cấy mô hoa lan được sử dụng chủ yếu là môi trường MS (Murashige –
Shoog, 1962), 1/2 MS, V.W (Vacine – Went, 1949), KC (Knudson’s C medium,
1921), N6 (Chu’s, 1975),... [5]; [7].
Trong thời gian qua đã có một số tác giả nghiên cứu nhân giống bằng hạt ở
các loài lan khác nhau trong chi Hoàng Thảo (Dendrobium) như: lan Đơn Cam
(Dendrobium unicum) được cho nảy mầm từ hạt 180 ngày tuổi, Hoàng Thảo Đùi
Gà (Dendrobium nobile), lan Trúc Phật Bà (Dendrobium pendulum) từ hạt
trưởng thành; lan Tam Bảo Sắc (Dendrobium devonianum) được cho nảy mầm
từ hạt giống ở các lứa tuổi khác nhau, lan Vảy Rồng (Dendrobium aggregatum)
được cho nảy mầm từ hạt 3-4 tháng tuổi,...[16].
Gần đây nhất (năm 2015) một bài báo tổng quan về nuôi cấy in vitro từ hạt
quả của chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) đã chỉ ra một số môi trường để khử


18
trùng quả lan được sử dụng nhiều nhất là: EtOH (cồn) và HgCl2 (28,3%), EtOH
và NaOCl (15,1%), EtOH và đốt nhanh trên ngọn lửa đèn cồn (15,1%); trong đó
nồng độ các chất thường được sử dụng là: EtOH 70%, HgCl 2 0,1-1%, NaOCl 110%. Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra một số môi trường nuôi cấy hạt lan
được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu là: MS (30,2%), ½ MS (13,2%),
KC (11,3%), N6 (11,3%). Phần lớn các môi trường đều được bổ sung

phytohoocmon với nồng độ 0,1-2 mg/l [16].
Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) là một loài lan đẹp, tuy nhiên trên
thế giới cũng chưa có nhiều công trình nghiên cứu. Roy và cộng sự (2007)
nghiên cứu sự hình thành mô sẹo từ đỉnh chồi sử dụng môi trường Knudson’s C
(KC) sửa đổi, có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như Thidiazuron (TDZ),
N6-benzylaminopurine (BAP) và α-Naphthaleneacetic acid (NAA) ở các nồng
độ khác nhau [17]. Nhóm tác giả người Ấn Độ (2014) nghiên cứu sự nảy mầm
của hạt lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) trong môi trường Mitra
(M) có bổ sung với nồng độ khác nhau của auxin và cytokinin. Nghiên cứu chỉ
ra rằng, sự nảy mầm hạt lan tốt nhất khi môi trường M có bổ sung 0.4% than
hoạt tính (AC), 2mg/l 6-benzyl amino purine (BAP), và 2 mg/l indole-3-acetic
acid (IAA) [18].
1.3.2. Ở Việt Nam
Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, có nhiều điều kiện tự nhiên thích
hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nhiều giống lan. Bênh cạnh đó, công
nghệ nuôi cấy mô cũng đã được nghiên cứu khá lâu, đến nay đã thu được một số
kết quả tiêu biểu.
Theo các chuyên gia về hoa của trường Đại học Nông nghiệp I, với khoảng
755 loài lan hiện có, với khí hậu thích hợp và nguồn nguyên liệu làm giá thể
phong phú, Việt Nam có thể trở thành một nước sản xuất hoa phong lan lớn
trong khu vực.


19
Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam bước đầu cũng đã có những thành
công trong việc nuôi cấy phong lan theo công nghệ được chuyển giao từ Thái
Lan. Một số địa phương khác như Sa Pa, Phú Yên bước đầu đã khảo sát và
nghiên cứu phương pháp nhân giống, hoàn thiện quy trình sản xuất phong lan.
Tháng 9 năm 2004, Tiến sĩ Dương Tấn Nhựt đã nhân giống vô tính thành
công loài lan Hài Hồng, đây là một trong những loài đặc hữu của Việt Nam [8].

Năm 2006 đến 2008, trường Đại học An Giang thực hiện đề tài với 2 quy
trình vi nhân giống lan Dendrobium anosmum và Dendrobium mini, thử nghiệm
ra cây lan Dendrobium mini trên nhiều loại giá thể khác nhau [15].
Kết quả trên giống lan Dendrobium anosmum là:
- Quả lan Dendrobium anosmum sau khi được tự thụ 4 tháng, đem khử trùng
và gieo cấy hạt vào môi trường thích hợp. Sau 3 tháng gieo cấy thì tất cả các hạt
đều nảy mầm tốt, tỷ lệ đạt được là ≥ 85% trên môi trường MS + 1mg/l NAA và
môi trường MS + 1mg/l BAP + 0,2mg/l NAA.
- Sau giai đoạn nhân nhanh: Chồi lan Dendrobium anosmum phát triển và
nảy chồi rất tốt trên môi trường MS + 2mg/l BAP, ở thời gian 3 tháng sau khi
cây đạt 3,17 chồi, chồi cao 20,6mm. Môi trường MS không bổ sung BAP cho
kết quả nhân chồi thấp. Đồng thời khi sử dụng BAP ở nồng độ cao (10mg/l) vào
môi trường nhân chồi cũng cho kết quả tạo chồi thấp (1,5 chồi), xuất hiện chồi
dị dạng, cây phát triển yếu.
Kết quả trên giống lan Dendrobium mini là:
- Chồi lan Dendrobium mini phát triển và nảy chồi rất tốt trên môi trường có
bổ sung 1mg/l BAP. Xét về tính kinh tế thì môi trường 1/2MS + 1mg/l BAP cho
hiệu quả cao hơn trong việc nhân nhanh chồi lan Dendrobium mini. Sau 2 tháng
nhân chồi thì hệ số nhân chồi đạt 3,8 lần, chiều cao chồi đạt 1,26cm [13].
Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ đã nghiên cứu và hoàn
thiện được nhiều quy trình vi nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy
mô các giống cây ăn quả, cây công nghiệp, cây hoa cảnh có giá trị kinh tế cao,


20
phù hợp với điều kiện lập địa ở Bình Định và các tỉnh vùng Nam Trung Bộ và
Tây Nguyên như: chuối, đu đủ, dứa, mía, bạch đàn, keo lai và một số loài phong
lan, lay ơn, hoa cúc, hoa huệ.... Hầu hết các loại cây này đều đã hoàn thiện quy
trình, đủ tiêu chuẩn trồng cây thương phẩm ngoài đồng ruộng và đã chuyển giao
cho người dân.

Như vậy, nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt
Nam ngày càng được áp dụng rộng rãi đối với nhiều loài cây trồng nói chung và
cây hoa lan nói riêng. Nhiều loài lan trong chi Hoàng Thảo ( Dendrobium) đã
được nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Năm 2009, Nguyễn Văn Minh và Nguyễn Hữu Lễ đã tiến hành nghiên cứu về
ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự phát sinh chồi và rễ cây
loài lan Giã Hạc (Dendrobium anosmum) [6].
Năm 2011, Nguyễn Văn Song và cộng sự đã nghiên cứu nhân giống in vitro
lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum). Kết quả cho thấy nguyên liệu sử
dụng là hạt của quả lan 3 tháng tuổi, môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát
sinh protocorm của hạt là MS cơ bản có 20g/l saccarose, 8g/l agar, 15% nước
dừa và 2,0mg/l BAP; môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là MS cơ bản
có 20g/l saccarose, 8g/l agar, 15% nước dừa và 2,0mg/l BAP; môi trường MS cơ
bản có 30g/l saccarose, 8g/l agar, 1g/l than hoạt tính, 15% nước dừa, 2,0mg/l
BAP và 1,0mg/l NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ protocorm và sinh
trưởng của chồi in vitro [11].
Năm 2012, Vũ Thanh Sắc và cộng sự nghiên cứu về nhân giống in vitro lan
Hoàng Thảo Trầm Trắng (Dendrobium anosmumvar.alba) [10].
Cùng năm đó, Nguyễn Thị Sơn và cộng sự cũng đã nghiên cứu về nhân giống
in vitro loài lan Hoàng Thảo Long Nhãn (Dendrobium fimbriatum hook) từ quả
với mục đích bảo tồn và phát triển nguồn gen loài lan quý. Kết quả nghiên cứu
đã chỉ rõ: Nguyên liệu sử dụng là quả lan 3 tháng tuổi; môi trường thích hợp cho
nảy mầm và phát sinh protocom của hạt là môi trường MS + 100ml nước dừa +


21
10g saccarose + 6,0g agar/lít môi trường; môi trường nhân nhanh protocorm tốt
nhất là môi trường KC + 100ml nước dừa + 10g saccarose + 60g khoai tây +
6,0g agar/lít môi trường; môi trường MS + 100ml nước dừa + 20g saccarose +
60g chuối chín + 6,0g agar/lít môi trường là thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi

in vitro [12].
Năm 2013,Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh nghiên cứu về nhân giống
in vitro loài Lan bản địa Thạch Hộc (Dendrobium nobile lindl) nhằm mục đích
để bảo tồn và phát triển loài lan quý chi Hoàng Thảo, có giá trị thẩm mỹ và dược
liệu cao, đang có nguy cơ tuyệt chủng. Kết quả cho thấy nguyên liệu sử dụng
thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi, môi trường gieo hạt là MS + (100ml nước dừa
+ 10g saccarose + 6,0g agar)/lít môi trường [5].

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Giống lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) thu hái từ cây ngoài
tự nhiên.
- Vật liệu vào mẫu: Qủa lan


22

Hình 2.1: Cây lan Sơn Thủy Tiên

Hình 2.2: Quả lan Sơn Thủy Tiên

(Dendrobium chrysotoxum)
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu các hóa chất khử trùng và sự nảy mầm
của cây lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum) thông qua các môi
trường nuôi cấy khác nhau đến giai đoạn tạo protocom.
- Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm được tiến hành tại Trung tâm
nghiên cứu công nghệ sinh học của khoa Khoa học tự nhiên và phòng

thực hành Sinh học khoa Khoa học tự nhiên trường Đại học Hùng Vương
- Thị xã Phú Thọ - Tỉnh Phú Thọ.
- Chỉ tiêu đánh giá: Độ nhiễm mẫu, khả năng nảy mầm của hạt lan Sơn
Thủy Tiên.
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2016 đến tháng 5/2017
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu công thức khử trùng mẫu quả tối ưu nhất cho cây lan Sơn
Thủy Tiên trong giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu.
- Nghiên cứu môi trường nuôi cấy phù hợp nhất với đối tượng cây lan Sơn
Thủy Tiên đến giai đoạn tạo protocom.


23
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
Nghiên cứu một số tài liệu tham khảo như sách, báo, tạp chí, internet trong
và ngoài nước về cây lan Sơn Thủy Tiên, về các cây lan thuộc chi Hoàng Thảo
và các tài liệu liên quan đến nuôi cấy mô tế bào thực vật.
2.3.2. Phương pháp luận
- Các nhân tố chỉ tiêu nghiên cứu phải chia thành các công thức khác nhau (04
công thức khử trùng; 06 công thức môi trường).
- Số mẫu (số bình nuôi cấy ) của mỗi công thức thí nghiệm phải đủ lớn (18
bình/công thức khử trùng, 12 bình/công thức môi trường tạo protocom).
- Thí nghiệm tuân thủ nguyên tắc lặp lại (mỗi công thức thí nghiệm đều lặp lại
3 lần).
2.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu khử trùng mẫu quả của cây lan Sơn Thủy Tiên.
+ Vật liệu sử dụng: Quả của lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium chrysotoxum).
+ Công thức thí nghiệm:
CT1: EtOH 70% (1 phút) + NaOCl (javen) 3% (10 phút)

CT2: EtOH 70% (1 phút) + NaOCl (javen) 5% (10 phút)
CT3: EtOH (cồn) 70% (1 phút) + HgCl2 0,1% (7 phút)
CT4: EtOH 70% (1 phút) + đốt trên ngọn lửa đèn cồn (2 lần)
+ Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu tái sinh.
+ Thời gian đánh giá: 30 ngày.
- Thí nghiệm 2: Nghiên cứu các môi trường nuôi cấy tạo protocom đối với lan
Sơn Thủy Tiên.


24
+ Vật liệu sử dụng: Hạt lan Sơn Thủy Tiên lấy ngoài tự nhiên đã khử trùng, sạch
khuẩn.
+ Công thức thí nghiệm:
MT1: MS
MT2: MS + 2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA
MT3: ½ MS
MT4: ½ MS + 2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA
MT5: KC
MT6: KC + 2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA
+ Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ nảy mầm của hạt.
+ Thời gian thu thập: 35 ngày.
- Thí nghiệm 3:Nghiên cứu môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng
trong giai đoạn tạo chồi đối với lan Sơn Thủy Tiên.
+ Vật liệu sử dụng: Protocom lấy từ thí nghiệm 2 có kích thước và sức
sống như nhau (các protocom to, đều, có màu xanh).
+ Công thức thí nghiệm:
MTa: MS+1,5mg/l BAP
MTb: MS+2mg/l BAP
MTc: MS +2,5mg/l BAP
+ Chỉ tiêu đánh giá: Chiều cao chồi/chồi, số lá/chồi, số rễ/chồi.

+ Thời gian thu thập: 60 ngày
Mỗi môi trường đều bổ sung thêm: 100ml/l nước dừa + 20g/l saccarose +
6,5g/l agar + 100g/l khoai tây + 0,5g/l than hoạt tính.
2.3.4. Phương pháp thu thập số liệu
Chỉ tiêu thu thập:
Số mẫu sạch
 Tỷ lệ mẫu sạch (%) =

x 100
Tổng số mẫu ban đầu
Số mẫu nhiễm

 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =

x 100


25
Tổng số mẫu ban đầu
Số mẫu chết
 Tỷ lệ mẫu chết (%) =
Tổng số mẫu ban đầu

x 100

 Tỷ lệ mẫu tái sinh = tỷ lệ mẫu sạch – tỷ lệ mẫu chết
Số mẫu tạo protocom
 Tỷ lệ tạo protocom (%) =

x 100

Tổng số mẫu ban đầu

 Đặc điểm protocom phát sinh: Hình dạng, màu sắc.
Số mẫu tái sinh chồi
 Tỷ lệ tái sinh chồi (%) =

x 100
Tổng số mẫu ban đầu

 Đặc điểm chồi tái sinh: Chiều cao, số rễ, số lá của chồi.
2.3.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Các số liệu được tính toán theo phương pháp phân tích thống kê sinh học.
Quá trình xử lý số liệu được thực hiện trên máy tính với ứng dụng Data Analysis
của chương trình Excel.
Các phương pháp thống kê sinh học
Cho mẫu số liệu có kích thước N là
+ Giá trị trung bình mẫu (kí hiệu X ):
= =
+ Phương sai (kí hiệu:) của mẫu số liệu được tính bởi công thức:
+ Độ lệch chuẩn (kí hiệu: s) của mẫu số liệu là: