ỨNG DỤNG RAPD TRONG NGHIÊN CỨU SỰ LIÊN KẾT VỚI GENE KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA

ỨNG DỤNG RAPD TRONG NGHIÊN CỨU SỰ LIÊN KẾT VỚI GENE KHÁNG BỆNH
BẠC LÁ LÚA (-)
4. Các chỉ thị sinh học phân tử:
‐

RFLP: Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn

=> Phức tạp , cồng kềnh, khó tự động hóa, tốn kém, nguy hiểm.

-AFLP: (Đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại)
Tạo nên các đoạn cắt khác nhau được phân biệt bằng phương pháp điện di
=> Giới hạn về kích thước đoạn DNA, phức tạp và tốn kém.


- RAPD: Đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên
=> Rẻ tiền, nhanh, dễ thực hiện, giúp xác định tính đa dạng sinh học.

II. Ứng dụng RAPD trong nghiên cứu sự liên kết với gen kháng bệnh bạc lá ở lúa
1. Phương pháp RAPD
- Dùng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các giống cây trồng hay giữa các
cá thể, phục vụ lai tạo giống và phân loại.
- Nguồn gen: Ngân hàng gene, các giống lúa địa phương.
2. Đối tượng nghiên cứu
36 giống lúa có nguồn gốc, tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá do Bộ môn Di truyền miễn
dịch, viện khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp.
Sử dụng các primer ngẫu nhiên.
3. Các bước tiến hành:
a. Tạo cây con và thu lá
Cây mạ: Hạt lúa được ngâm, ủ cho nảy mầm
Khi cây mạ được 3-5 lá thật thì thu lá non vì lá non có ít sản phẩm trao đổi chất trở ngại cho khả
năng hòa tan của DNA thu được

b. Tách chiết DNA tổng số:
Theo phương pháp của Egnin và CS (1998).
Quy trình :Thu 0,1- 0,2g lá lúa non, ghiền nhanh trong nitơ lỏng (đảm bảo mẫu được nghiền triệt
để, DNA thu được có dạng sứa, có phân tử lượng cao, không đứt đoạn) đến khi mẫu có dạng bột
mịn.
Pha đệm tách chiết AND:


c. Xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA.
Điện di:
Chạy điện di 80V trong 30 phút

Quang phổ:
λ = 260nm và 280nm

Độ tinh sạch DNA từ 1.8 đến 2 được xem là mẫu sạch


c. Xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA.

Hàm lượng tính đa hình (PIC) của 36 giống lúa
d. Phân tích số liệu RAPD:
Phản ứng PCR – RAPD
+Mỗi ống phản ứng PCR có 25 µl
+Trộn đều hỗn hợp
+Tiến hành khuếch đại theo chu trình:
o B1: 94oC trong 1 phút
o B2: 92oC trong 1 phút
o B3: 35oC trong 1 phút
o B4: 72oC trong 1 phút

o B5: 72oC trong 10 phút
o B6: Giữ ở 4oC
(B2-4 lặp lại 45 chu kì)
+ Điện di sản phẩm RAPD:
Pha agarose 1,8% trong TAE 1X đun nóng => để nguội (600C) => khuôn gel có cài lược (30
phút) => rút lược => thêm đệm TAE 1X ngập bản gel 1mm => trộn 3µl thuốc nhuộm cho vào
mỗi ống sản phẩm.
o

0

o

1

Không xuất hiện phân đoạn DNA
Xuất hiện phân đoạn DNA


Kết quả điện di sản phẩm RAPD
Xác định hệ số di truyền tương đồng (Sij):
Dice
Sij=
Jaccard
SM Sij=
Xác định hệ số di truyền tương đồng (Sij):
Trong đó:
- Sij: hệ số giống nhau giữa hai cá thể i và j
- a: Số phân đoạn DNA xuất hiện ở i,j
- b: Số phân đoạn DNA xuất hiện ở i và không xuất hiện ở j

- c: Số phân đoạn DNA không xuất hiện ở i và xuất hiện ở j
- d: Số phân đoạn DNA không xuất hiện ở i và j
- Xác định hệ số di truyền tương đồng (Sij)
Giá trị tương quan kiểu hình
‐

Lập bản đồ cây di truyền dựa vào giá trị tương quan kiểu hình:
Đưa ra nhận xét và kết luận

ỨNG DỤNG RFLP TRONG NGHIÊN CỨU SỰ LIÊN KẾT VỚI GEN KHÁNG BỆNH
BẠC LÁ LÚA


3. Kỹ thuật RFLP
Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP): Là kỹ thuật tìm những trình tự DNA khác
biệt. Trong phân tích RFLP, DNA mẫu được cắt thành các đoạn nhỏ bằng cách sử dụng các
enzyme cắt giới hạn (RE) để tạo ra các đoạn DNA nhỏ sau đó điện di trên gel

RFLP là công nghệ nghiên cứu đa hình DNA đầu tiên, rẻ nên được ứng dụng rộng rãi. RFLP
là công cụ quan trọng trong lập hồ sơ di truyền, lập bản đồ hệ gene, định vị gene cho các rối
loạn di truyền, nguy cơ mang bệnh, và xét nghiệm phả hệ.
VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
1. Nguyên liệu thực vật
•

Dòng IR-BB1 mang một gen kháng bệnh bạc lá Xa-1 từ Kogyoku.

•

IR-BB3 mang gen khángXa-3 từ Chugoku45.

•

IR - BB4 mang gen kháng Xa-4 từ IR20.

•

IR24, Kogyoku, Chugoku45 và IR20 cũng được sử dụng làm giống kiểm tra.

•

Để phân tích mối liên hệ giữa Xa-1, Xa-2 và marker RFLP, tiến hành thử nghiệm các
quần thể F2 và F3 (20 cây / dòng) được lai từ giống cây nhạy cảm Kinmaze không có
Xa-1 và Xa-2 và Te-tep kháng với Xa-1 và Xa-2 trong đó Xa-1 giao kháng với chủng tộc
gây bệnh 1 của Nhật Bản,và Xa-2 giao kháng với chủng tộc 2 (Ezuka et al., 1975).


2. Phân tích RFLP của NIL
Các điểm đánh dấu RFLP 151 trên bản đồ liên kết RFLP đã được sử dụng (Saito và ctv.,
1991) .
Chín marker khác được gọi là Q1 đến Q9 cũng được sử dụng. Những marker này bắt nguồn
từ thư viện gen lúa được xây dựng với pUC19 và IR24, tổng DNA và vị trí nhiễm sắc thể
không rõ.
Kiểu gen ở mỗi locus của marker RFLP được xác định bằng cách lai tạo Southern.
DNA được ly trích từ lá của IR24, ba dòng gây bệnh và các thể cho bằng phương pháp cethyl
trimethyl amoni bromua (Ctab) (Murray và Thompson, 1980).
DNA được phân cắt với năm enzyme giới hạn khác nhau (BamHI, DraI, EcoRI, EcoRV và
HindIII).
3. Phân tích liên kết:
•

DNA từ mỗi cây trong quần thể F2 được lai tạo với bốn dòng RFLP: Npb102, 120, 197
và 235 được đánh dấu bằng ánh xạ trên nhiễm sắc thể số 4, vì Xa-1 và Xa2 nằm trên
nhiễm sắc thể số 4 (Sakaguchi, 1967) .

•

Ba kiểu gen được đánh dấu RFLP có thể được phát hiện trong quần thể F2: P1
(Kinmaze), F1 và P2 (Te-tep)

•

Các dòng F3 đã được thử nghiệm cho các phản ứng bạc lá
+
Vi khuẩn được sử dụng Xanthomonas oryzae pv. chủng oryzae T7174 và T7147,
tương ứng với các chủng đại diện gây bệnh chủng 1 và 2 của Nhật Bản để kiểm tra sự
phân biệt Xa-1 và Xa- 2. Mỗi chủng vi khuẩn được chuyển lên các môi trường thạch
khoai tây bán tổng hợp và ủ ở 30 o C trong 3 ngày. Nuôi cấy bằng cách cho sinh khối
huyền phù vi khuẩn với nước cất ở nồng độ khoảng 10^9 tế bào / ml.
+ Các cây con sau khi gieo 31 ngày và 54 ngày được lây nhiễm với T7147 và
T7174, tương ứng, bằng phương pháp cắt lá (Kauffman et al., 1973) .Các dòng được cấy
đã được đánh giá sau 10 ngày và 14 ngày sau khi cấy và được phân thành ba loại: kháng,
kháng vừa và dễ mẫn cảm.

KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
ỨNG DỤNG RAPD NGHIÊN CỨU LIÊN KẾT BỆNH ĐẠO ÔN Ở LÚA
. GIỚI THIỆU KỸ THUẬT RAPD
2.1. Nguyên lý
Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách
sử dụng những primer ngắn (khoảng 6 - 10 nucleotide).

Khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện như
nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau.


Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện
của DNA khuôn thì đoạn DNA sẽ được nhân lên và được quan sát sau khi điện di.

Hình 2. Nguyên lý kỹ thuật RAPD
2.2. Ứng dụng
 Đánh giá đa dạng di truyền.
 Phân tích đa dạng di truyền ở nấm bệnh thực vật.
 Nhận diện chỉ thị phân tử

2.3. Ưu nhược điểm
2.3.1. Ưu điểm
 Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công, thao tác đơn giản, chất lượng DNA khuôn

không cần độ tinh sạch cao.
 Thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao.
 Chi phí thực hiện thấp đồng thời không dùng chất phóng xạ độc hại.

2.3.2. Nhược điểm
 Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất.
 Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu.
 Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao.


ỨNG DỤNG RAPD TRONG PHÁT HIỆN GEN KHÁNG ĐẠO ÔN Ở LÚA
3.1. Vật liệu
 Chủng phân lập 106 (JMB840610) của Pyricularia oryzea

 Giống lúa Tongil của Hàn Quốc được sử dụng làm đối chứng kháng bệnh đạo ôn.
 Giống CO39 được sử dụng là giống nhạy cảm với bệnh đạo ôn.
 Hai mồi với trình tự như sau:

F6: GGGAATTCGG
H18: GAATCGGCCA
3.2. Cách tiến hành
- Tạo quần thể cây con từ các phép lai của 2 giống lúa Tongil và CO39.
- Đánh giá khả năng kháng và nhạy cảm với bệnh đạo ôn bằng cách phun bào tử nấm bệnh với
nồng độ 6 x 104 bào tử trên mỗi ml được phun lên lá.
- Trong quá trình sinh trưởng của cây, các mẫu lá được lấy để chiết DNA để phân tích RAPD với
2 mồi F6 và H18.
Bảng 1. Thành phần phản ứng RAPD
Thành phần

Nồng độ

Tris-Cl

10 mM

KCl

50 mM

MgCl2

2 mM

Gelatin

0.001%

dNTPs

100 µM

Primer

0.4 µM

DNA mẫu

40 ng

Taq DNA
polymerase

1 unit

Giai đoạn

Chu trình

Số chu kỳ


nhiệt
Biến tính

960C / 85s

Bắt cặp

360C / 70s

Kéo dài

740C / 2 phút

Giữ sản phẩm

40C

45

Bảng 2. Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD
- Các sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 1,8% và quan sát với thuốc nhuộm
ethidium bromide.
- Nếu có band xuất hiện ở những cây kháng mà không có ở những cây nhạy cảm thì xác định gen
ở band đó là gen kháng bệnh đạo ôn.
3.3. Kết quả

Hình 3. Kết quả điện di RAPD với mồi F6

Hình 4. Kết quả điện di RAPD với mồi H18
3.4. Thảo luận và kiến nghị
Việc sử dụng phân tích RAPD phân lập hàng loạt trên các dòng kháng đồng hợp tử và nhạy cảm
là một chiến lược hiệu quả cho việc tìm ra các marker phân tử liên quan đến gen kháng bệnh đạo
ôn trong cây lúa.

Sau khi phân tích RAPD nên thực hiện thêm các kỹ thuật khác như RFLP để xác định vị trí của


gen kháng phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Tạo dòng gen kháng để tạo cây lúa kháng bệnh đạo ôn.
ỨNG DỤNG SSR TRONG LIÊN KẾT GEN KHÁNG ĐẠO ÔN Ở LÚA
III. Ứng dụng SSR trong nghiên cứu gen kháng bệnh đạo ôn
 Khái niệm: SSR( simple sequence repeats): chuỗi lặp lại đơn giản, được thực hiện bằng

phản ứng PCR với mồi SSR xuôi và ngược. Sản phẩm PCR được phân tách trên gel
polyacrylamide kết hợp nhuộm bạc ( AgNO3) hoặc bằng máy giải trình tự tự động.
•

Các bước thực hiện SSR:

Xây dựng thư viện SSR
Xác định locus SSR
xác định vùng phù hợp để
thiết kế mồi
PCR với các mồi được thiết kế
Đánh giá và phân tích mẫu băng
Đánh giá đa hình của sản phẩm PCR
* Ưu điểm:
Cho nhiều allen trong 1 locus.
Phân bố đều trong genome.
Cho thông tin cụ thể
Là chỉ thị đồng trội.
Có tính đa hình và đặc thù cao.
Có thể lặp lại ở các thí nghiệm, sử dụng ít DNA, rẻ, dễ tiến hành, không dùng phóng xạ.
Phân biệt được các cá thể có mối quan hệ gần.

* Nhược điểm:
Cần phải đọc trình tự genome để dựa vào đó thiết kế các cặp mồi đặc thù và tối ưu hóa điều
kiện các mồi trước khi sử dụng


3. Vật liệu nghiên cứu:
Giống nhận gene: giống lúa OM6976 có nắng suất cao , phẩm chất gạo tốt, nhiễm bệnh đạo ôn.



Vật liệu cho gene kháng: là dòng đẳng gene (NIL) mang gene kháng tương ứng với gene
Piz ( kích thước 195 bp) và Pik-m( kích thước 245 bp) là IRBL 9 và IRBL 25.



Các mồi sử dụng trong phản ứng PCR:


Bước 1: Lai hồi giao và sử dụng các chỉ thị phân tử để chọn cá thể lúa mang gene kháng bện đạo
ôn.

Bước 2: ly trích DNA


Bước 3: Chạy PCR bằng mồi liên kết với chỉ thị SSR.
Thiết kế mồi
Chuẩn bị mẫu dò
Pha mix các thành phần
Cho vào máy, set chương trình
Kiểm tra sản phẩm trên gel agarose

Bước 4: Chạy PCR bằng mồi liên kết với chỉ thị STS
Thực hiện thao tác tương tự , thay với mồi liên kết với chỉ thị STS
Bước 5: Chọn các dòng lúa mang gene kháng bệnh đạo ôn bằng chỉ thị phân tử
Chọn các dòng lúa mang một và hai gene kháng bệnh đạo ôn dựa vào chỉ thị RM3431 liên kết
với gen Piz và RM144 liên kết với gen Pik-m để xác định cá thể mang gen kháng dị hợp tử.
Kết luận và thảo luận
a. Đánh giá tính đa hình của các chỉ thị phân tử giữa bố và mẹ:
Chỉ thị phân tử có tính đa hình khi có sự khác nhau rõ rệt về kích thước của 2 băng bố mẹ, sự
khác nhau này được đánh giá dựa trên kết quả chạy điện di


Tính đa hình giữa bố và mẹ cặp primer RM144 (1, 3:OM6976; 2, 4: IRBL25)
•

b. Chọn lọc các dòng hồi giao dựa vào chỉ thị phân tử với các dòng lúa mang một
gen kháng bệnh đạo ôn :
Kết quả lai tạo trong quần thể hồi giao BCnF1 xuất hiện hai dạng kiểu gen là kiểu gen dị
hợp tử kháng (hai băng) và kiểu gen đồng hợp tử nhiễm (một băng), kiểu gen dị hợp tử
kháng ở quần thể BC1F1 sẽ được chọn và chọn cá thể càng giống dạng hình của OM
6976 càng tốt để sử dụng trong chương trình lai hồi giao tiếp theo. Ở thế hệ BC2F1 và
BC3F1 cũng làm tương tự thế hệ BC1F1.

Kiểu gen của bố mẹ và các cá thể BC1F1 mang gen kháng bệnh đạo ôn Pik-m và Piz (M:
100bp DNA ladder, p1: OM6976, p2: IRBL25, p3: IRBL9, land 1,2, 6, 9, 10, 13, 14 các cá
thể BC1F1 mang gen kháng bệnh đạo ôn Pik-m, cá thể số 3, 5 và 11 các cá thể BC1F1 mang
gen kháng bệnh đạo ôn Piz).

Kiểu gen các cá thể BC2F1 của tổ hợp lai OM6976 x IRBL25 mang gen kháng bệnh đạo ôn
Pik-m (M: 100bp DNA ladder, p1: OM6976, p2: IRBL25,1-8 các cá thể BC2F1)

Ảnh điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ cá thể F2 có từ cặp lai OM6976/IRBL9//
3*OM6976///OM6976/IRBL25//3*OM6976 sử dụng 2 mồi RM3431 và RM144
M: 100bp DNA ladder, p1: OM6976, p2: IRBL25, p3: IRBL 9, 1-10 các cá thể F2, cá thể số
1, 2, 6, 7 và 10 mang 2 gen kháng Pi z + Pi k-m được chon lọc qua sự hiện diện
của 2 băng ở vị trí khoảng 195bp và 245bp.
ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN KẾT GẦN (SSR) TRONG CHỌN GIỐNG
LÚA CHỊU NGẬP CHÌM
II - Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
1) Giống lúa nghiên cứu
- Giống lúa cho gen: IR64Sub1 là giống chịu ngập chìm là Giống lúa chống chịu ngập đầu
tiên tại Philippines.
- Giống lúa nhận gen: AS996 là giống lúa chất lượng cao.
- Các giống lúa khác: Q5c, Q5l, OM5472, FL478, KDDB, BT.
2) Phương pháp nghiên cứu
- Tách chiết và tinh sạch DNA theo phương pháp CTAB cải tiến
- Chọn lọc cây con mang gen kháng thông qua phương pháp PCR đối với các chỉ thị SSR
liên kết với gen quy định tính chịu ngập chìm (Sub1). Chọn lọc nền gen thông qua phương
pháp PCR đối với các chỉ thị phân bố trên 12 NST lúa.
- Điện di trên gel agarose 0,8% nhuộm Ethidium Bromide.
- Điện di trên gel polyacrylamide biến tính 4,5% nhuộm bạc.
- Điện di trên gel polyacrylamide không biến tính 6% nhuộm Syber safe.
- Phân tích dữ liệu trên chương trình Graphical Genotyper
III – Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần (SSR) trong chọn giống lúa chịu ngập chìm

Giếng số 1: Lambda DNA nồng độ chuẩn (200ng/µl), Các giếng từ 2 -17: DNA mẫu nghiên
cứu.


2) Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ

Nhằm mục đích tìm kiếm chỉ thị có thể sử dụng để phát hiện gen chịu ngập trong các cá thể
con lai
Đa hình giữa hai giống lúa có thể được phát hiện bằng chiều dài khác nhau của các đoạn
lặp lại được khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp mồi SSR.

4) Quy tụ gen chịu ngập chìm Sub1 vào giống lúa AS996
a) Xác định con lai F1
- Trồng các cá thể F1

22 cá thể

Tách chiết DNA.

- Tiến hành phản ứng PCR với DNA của mẹ (AS996) và bố (IR64Sub1) và các con lai F1
với hai chỉ thị cho đa hình liên kết chặt với gen Sub1 là SC3, ART5.
- Các cá thể F1 mang DNA cả bố và mẹ được chọn làm mẹ để tiến hành lai trở lại với
giống nhận gen tạo thế hệ BC1F1.


b) Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC1F1
- P1(AS996) x F1 => 497 cá thể BC1F1=> tách chiết DNA và kiểm tra sự có mặt của
gen đích (Sub1) bằng hai chỉ thị liên kết chặt là ART5 và SC3 => thu được165 cá thể dị hợp
tử với cả hai chỉ thị.


-

Những cá thể dị hợp tử với cả hai chỉ thị ART5 và SC3 được lựa chọn để chọn lọc các cá
thể tái tổ hợp.
- Sàng lọc cá thể tái tổ hợp từ các cá thể dị hợp tử mang gen đích Sub1 tiến hành sử dụng

các chỉ thị cho đa hình trên nhiễm sắc thể số 9 => 14 cá thể tái tổ hợp.
- 14 cá thể tái tổ hợp tiếp tục được phân tích
- Số liệu của từng cá thể được đưa vào phân tích trên chương trình Graphical Genotyper để
lựa chọn
5 cá thể có nền di truyền cao nhất tiếp tục lai tạo thế hệ BC2F2.

c) Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC2F1
- Từ 5 cá thể BC1F1 được lựa chọn đã lai tạo được quần thể thế hệ BC2F1. Tiến
hành tách chiết DNA, làm phản ứng PCR với các bước như ở thế hệ BC1F1.

Sau khi sàng lọc với 10 chỉ thị trên NST số 9 chọn ra được 17 cá thể tái tổ hợp.
Kết quả:
-Cá thể có nền gen cây nhận gen cao nhất là 93,75 % là cá thể số P442 -11 và P442
-14.


-Các cá thể P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 có nền gen cây nhận gen là 92,25%.
-P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 được chọn để lai tạo quần thể BC3F1.
Tương tự như với quần thể BC2F1 cho thế hệ BC3F1 với 445 cá thể. Sử dụng hai chỉ thị
ART5 và SC3 là hai chỉ thị liên kết chặt với gen Sub1 để lựa chọn cá thể mang gen Sub1
ở thế hệ BC3F1.
- Xác định được 124 cá thể dị hợp tử với cả hai chỉ thị mang gen Sub1.
- Tiếp tục sàng lọc với các chỉ thị trên NST số 9 để tìm ra các cá thể tái tổ hợp.
Sau khi sàng lọc từ 10 chỉ thị cho đa hình trên NST số 9 với 124 cá thể. Kết quả chọn
được 22 cá thể tái tổ hợp. Những cá thể này được tiếp tục chọn lọc nền di truyền của
giống nhận gen. Sử dụng 19 chỉ thị trên 11 nhiễm sắc thể còn lại.
- Số liệu của từng cá thể đƣợc đƣa vào phân tích trên chƣơng trình Graphical Genotyper
để lựa chọn cá thể BC3F1. Các cá thể nào mang gen đồng hợp tử cây mẹ nhiều nhất sẽ
đƣợc lựa chọn để lai cho lai tạo thế hệ BC4F1.
IV. Kết quả và Đề nghị

1) Kết quả
- Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ AS996 x IR64Sub1 thu được 53 chỉ thị
đa hình trong tổng số 372 chỉ thị. Xác định được 11 cá thể mang gen Sub1 từ 22 cá thể
F1.
- Kết quả sàng lọc các cá thể BC1F1 chọn lọc được các cá thể tái tổ hợp mang gen
Sub1 và chứa tối đa nền gen giống nhận gen từ 62,5%- 87,50%. Cá thể có nền gen của
giống nhận gen cao nhất là 87,50%.
- Dòng BC2F1 chọn lọc được cá thể tái tổ hợp mang gen Sub1 chứa nền gen của
giống nhận gen cao nhất đạt 93,75 %.
- Dòng BC3F1 có nền di truyền cây nhận gen cao nhất là 100% alen từ AS996
trên tổng số chỉ thị đã phân tích.
2) Đề nghị
Các dòng BC4F1 và BC3F2 sẽ tiếp tục được nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử, đánh giá
ngập nhân tạo, kết hợp với chọn giống truyền thống để tạo các dòng AS996- Sub1 có thể
trồng ở các vùng ngập nước, lũ lụt góp phần vào công tác chọn tạo giống lúa ứng phó với
biến đổi khí hậu.
DEVELOPMENT OF SCAR MARKER FOR PHYTOPHTHORA RESISTANCE IN
BLACK PEPPER (PIPER NIGRUM L.)
•
•
•
•
•

GIỚI THIỆU CHỈ THỊ SCAR
Kỹ thuật SCAR là kỹ thuật chỉ thị dựa vào PCR tạo ra các phân đoạn DNA tại các locus
được xác định bằng sử dụng các mồi nucleotide đặc thù
SCAR được tiến hành bằng cách tách dòng sản phẩm PCR với các mồi ngẫu nhiên sau đó
đọc trình tự hai đầu đoạn tách dòng
Dựa vào trình tự hai đầu này để thiết kế cặp mồi với độ dài 15 đến 30 bp để nhân băng

đơn với kích thước tương tự như phân đoạn được nhân dòng
Sự đa hình được xác định bằng sự có mặt hay vắng mặt của băng được nhân bản hoặc sự
xuất hiện đa hình về chiều dài đồng thời chuyển chỉ thị trội thành chỉ thị SCAR đồng trội
Ưu điểm
Sử dụng các chỉ thị xác định được bằng các mồi ngẫu nhiên (như RAPD, AFLP v.v.)
khắc phục nhược điểm mẫn cảm với điều kiện phản ứng của các phản ứng với mồi ngẫu
nhiên


•
•
•
•
•

•

Kỹ thuật SCAR được dùng để phân tích thư viện genome
Xác định các locus đặc thù
Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử
Nhược điểm
Có tính ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất
Có tính trội do đó khó phân biệt được những gen lặn hay cá thể dị hợp tử
II. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
Dòng nhạy cảm với P.capsici

Dòng mang gen kháng P.capsici

IISR-Subhakara (KS-27)
chỉ thị RAPD

IISR-Shakthi
HP-780
HP-23
HP-1
C-1090
C-1095

Chỉ thị SCAR sử dụng 500 cây con được trồng từ 26 kiểu gen.

PHƯƠNG PHÁP
•

Sàng lọc cây con mang gen kháng Phytophthora=>Ly trích DNA=>Chỉ thị RAPD=>Phát
triển chỉ thị SCAR
Sàng lọc cây con mang gen kháng Phytophthora
Sàng lọc phôi của hồ tiêu kháng Phytophthora

•

Cây con được nuôi trong các khay nhựa và tỷ lệ nảy mầm của hạt giống được ghi lại cho
mỗi dòng
Chiều dài tổn thương của cây con trong 72h dao động từ 1-120mm
Mức độ thâm nhập được tính dựa vào thang chỉ số từ 0-4
0= không tổn thương, 1= tổn thương giới hạn trên bề mặt, 2= tỉ lệ thâm nhập lên đến
25%, 3= tỉ lệ thâm nhập lên đến 50%, 4= tỉ lệ thâm nhập trên 50%



Chu trình nhiệt

Giai đoạn

Nhiệt độ

Thời gian

Biến tính

94 OC

5 phút


Hồi tính

58 OC

1 phút

Kéo dài

72 OC

1 phút

Hậu kéo dài

72 OC

10 phút

Lặp lại 35 chu kì trong 30s ở 94oc
Nhiệt độ hồi tính được tối ưu hóa cho mồi scar
III KẾT QUẢ
1. SÀNG LỌC CÂY CON
•

Khoảng 34% hạt nảy mầm được thu từ vườn ươm

•

Cây con nhạy cảm với p.capsici bị chết sau khi được tiêm bào tử động và làm ngập đất
trong 30 ngày.

•

Những cây kháng vẫn khỏe mạnh và hầu như không bị tổn thương. Những cây con bị
chết này có tỉ lệ từ 14% -100% sau hai lần làm ngập đất.

•

Cây con có chiều dài tổn thương dưới 5mm và chỉ số thâm nhập bằng 1, được xem là
kháng với P.capsici.


2. CHỈ THỊ RAPD
•

Vùng đa hình là xuất hiện all dòng mang gen kháng không xuất hiện ở dòng nhạy cảm
với p. capsici

Vị trí trình tự đặc hiệu (360 bp) xuất hiện ở primer opa-01 sau khi rửa giải tạo dòng trên
gel giải trình tự được sang chỉ thị scar
3. PHÁT TRIỂN VÀ THỬ NGHIỆM CHỈ THỊ SCAR
Nhiệt độ hồi tính được cài đặt sẵn ở 58 độ để tránh mồi bắt cặp không đặc hiệu và
đa hình giả.
Tiến hành qua 3 lần PCR.