Nghiên cứu ảnh hưởng của stress hormone dopamine lên các yếu tố độc lực của vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây hội chứng tôm chết sớm (early mortality syndrome (EMS)) ở đồng bằng sông cửu long, việt nam

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan, đề tài tốt nghiệp: “Nghiên cứu ảnh hưởng của stress
hormone Dopamine

lên các yếu tố độc lực của vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus gây hội chứng tôm chết sớm (Early mortality syndrome
(EMS)) ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam” là công trình nghiên cứu thực
của cá nhân tôi, được thực hiện trên lý thuyết và kiến thức và sự hướng dẫn của
Th.s Nguyễn Thảo Sương.
Số liệu được dùng trong đề tài hoàn toàn trung thực, có nguồn gốc cụ thể, rõ
ràng. Đề tài có dùng tài liệu tham khảo được đăng tải trên sách, tạp chí, báo
cáo,trang web, các từ khóa liên quan đến khóa luận, đồ án trong và ngoài nước.

TP.HCM, ngày 20 tháng 09 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Tô Thị Thơm


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, em đã nhận được nhiều sự giúp
đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ từ phía gia đình thầy cô và bạn bè. Nhờ đó mà em đã hoàn
thành đồ án được như mong muốn, nay cho phép em được gửi lời cảm ơn sâu sắc và
chân thành đến:
Đầu tiên em xin cảm ơn Th.s Nguyễn Thảo Sương người trực tiếp hướng dẫn
đồ án trong thời gian vừa qua. Trong suốt thời gian thực hiện, chị đã tận tình hướng
dẫn, hỗ trợ cũng như truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp em giải quyết các vấn đề
nảy sinh trong quá trình làm đồ án và hoàn thành đồ án đúng định hướng ban đầu.
Tiếp đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến T.S Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh,
Viện Nghiên cứu nôi trồng thủy sản 2, đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi

cho em thực hiện tốt đồ án này. Đồng thời cảm ơn các anh chị, thầy cô của Viện
Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2, đã tạo điều kiện thuận lợi cho mượn dụng cụ
thí nghiệm và hỗ trợ em trong quá trình làm đồ án tại Viện.
Sau đó, em xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ
TP.HCM và các thầy cô khoa Công nghệ- Thực phẩm- Môi trường đã tận tình giúp
đỡ em trong suốt những năm học tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ của gia đình, bạn bè, anh chị
thầy cô đã động viên.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Chúc tất cả
mọi người sức khỏe và hạnh phúc.
TP.HCM, ngày 20 tháng 09 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Tô Thị Thơm


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AHPNS

Acute hepatopancreatic necrosis Syndrome

EMS

Early Mortality Syndrome

GAV

Gill-associated virus

IHHNV

Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus

LB

Luria Broth

TCBS

Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose

TSA

Trytic Soya Agar

TSB

Trytic Soya Broth

TSV

Taura syndrome virus

VP

Vibrio parahaemolyticus

WSSV

White spot Syndrome Virus

YHV

Yellow head virus

FAO

Food and Agricultute Organization

Ppt

Part per thousand

HCl

Hydrocloric acid

CFU

Colony Forming Unit

µM

Micromol per litre

Mm

Millimetre

Ml

Mililitre

H

Hour

LSI

Larval Stage Index

Mg

Miligram

i


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Khoảng chịu đựng và tối ưu của Vibrio parahaemolyticus. ........................... 6
Bảng 3.1: Đường kính vùng di động các chủng vi khuẩn gây bệnh VP (mm) sau
16h. .................................................................................................................................. 39
Bảng 3.2: Tỉ số giữa đường kính vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc làm dung
huyết, phân giải casein, phân giải chitin và đường kính khuẩn lạc có/không sự bổ
sung của stress hormone . ............................................................................................... 41
Bảng 3.3: Đường kính vùng di động các chủng vi khuẩn gây bệnh VP (mm) sau 16h

có/không bổ sung stress hormone và chất ức chế stress hormone. ................................ 43
Bảng 3.4: Tổng số tôm chết sau khi số tôm trong bể chết gần 50% . ............................ 45
Bảng 3.5 : Tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng sau 8 ngày thí ngiệm cảm nhiễm với
V. Parahaemolyticus có/không nuôi cấy với Dopamine và chất ức chế LED 209. ....... 45

ii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình1.1: Vi khuẩn V.parahaemolyticus trên môi trường TCBS, CHrom agar. .............. 5
Hình 1.2: Vi khuẩn V.parahaemolyticus .............................................................................. 6
Hình 1.3: Bệnh EMS/AHPNS trên tôm ................................................................................ 7
Hình 1.4: Tôm nhiễm bệnh EMS......................................................................................... 11
Hình 1.5: Stress hormone ..................................................................................................... 19
Hình 1.6: LED 209 ................................................................................................................ 21
Hình 1.7: Tổng sản lượng tôm nuôi trên thế giới .............................................................. 23
Hình 1.8: Tôm thẻ chân trắng .............................................................................................. 25
Hình 1.9: Bệnh WSSV trên tôm .......................................................................................... 26
Hình1.10 : Mô tế bào bị bệnh hoại tử cơ. ........................................................................... 27
Hình 1.11: Bệnh TSV trên tôm ............................................................................................ 28
Hình 1.12: Bệnh IHHNV trên tôm ...................................................................................... 30
Hình 2.1: Bố trí thí nghiệm .................................................................................................. 38
Hình 3.1: Khả năng di động của Vibrio parahaemolyticus ở lần lượt các nồng độ
ĐC,
50µM, 100µM......................................................................................................................... 41
Hình 3.2: Biểu đồ đường kính vùng di động các chủng vi khuẩn gây bệnh VP (mm)
sau 16h ..................................................................................................................................... 41
Hình 3.3: Biểu đồ tỉ số giữa đường kính vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc

phân
giải chitin và đường kính khuẩn lạc có/không sự bổ sung của stress hormone .............. 42
Hình 3.2: Khả năng dung huyết của Vibrio parahaemolyticus ở lần lượt các nồng
độ
ĐC, 50µM, 100µM. ............................................................................................................... 43
Hình 3.3: Tỉ số giữa đường kính vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc làm dung
huyết đường kính khuẩn lạc có/không sự bổ sung của stress hormone . ........................ 43
Hình 3.3: Khả năng thủy phân casein của Vibrio parahaemolyticus ở các nồng độ
ĐC,50µM, 100µM..................................................................................................................44
Hình 3.4: Biểu đồ tỉ số giữa đường kính vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc phân

iii


Đồ án tốt nghiệp

giải casein và đường kính khuẩn lạc có/không sự bổ sung của stress
hormone…………………………………………………………………………………… 44
Hình 3.4: Khả năng di động của VP ở các nồng độ ĐC, 50µM, 100µM, 0.05
LED209, 0.1 LED209...............................................................................................

45

Hình 3.5: Đường kính vùng di động các chủng vi khuẩn gây bệnh VP (mm) sau 16h
có/không bổ sung stress hormone và chất ức chế stress hormone................................46
Hình 3.6: Thí nghiệm 1 (N=16) tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng sau 8 ngày thí
ngiệm cảm nhiễm với V. Parahaemolyticus có/không nuôi cấy với Dopamine và chất
ức chế LED 209..........................................................................................................
48
Hình 3.7 : Thí nghiệm 2 ( N=12) tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng sau 8 ngày thí

ngiệm cảm nhiễm với V. Parahaemolyticus có/không nuôi cấy với Dopamine và chất
ức chế LED 209……………………………………………………………………..
48
Hình 3.8 : Thí nghiệm 3 ( N=20) tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng sau 8 ngày thí
ngiệm cảm nhiễm với V. Parahaemolyticus có/không nuôi cấy với Dopamine và chất
ức chế LED 209……………………………………………………………………….. 49

iv


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. i
DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................................. ii
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................ Error! Bookmark not defined.
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1
1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 1
2. Tình hình nghiên cứu .............................................................................................. 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................................. 2
4. Mục đích nghiên cứu............................................................................................... 2
5. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 2
6. Các kết quả đạt được của đề tài .............................................................................. 3
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp................................................................................... 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 5
1.1

Vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus ..................................................................... 5

1.1.1

Phân loại........................................................................................................ 5

1.1.2

Đặc điểm ....................................................................................................... 5

1.1.3

Ảnh hưởng của vi khuẩn gây bệnh Vibrio parahaemolyticus trong nuôi

trồng thủy sản ............................................................................................................. 7
1.1.4

Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ....................... 13

1.1.5

Quy chế biểu hiện gen độc lực ................................................................... 18

1.1.6 Phương pháp kiểm soát các yếu tố độc lực ................................................... 20
1.2

Stress hormone catecholamine .......................................................................... 22

v

Đồ án tốt nghiệp

1.2.1
1.3

Ảnh hưởng của catecholamine lên sự tăng trưởng của vi khuẩn ............... 22

Tôm thẻ chân trắng ............................................................................................ 23

1.3.1

Vai trò của ngành công nghiệp nuôi tôm thẻ chân trắng ........................... 23

1.3.2

Đặc điểm sinh học của tôm thẻ chân trắng ................................................ 24

1.3.3

Một số bênh thường gặp trên tôm thẻ chân trắng ...................................... 26

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 33
2.1

Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................... 33

2.2

Vật liệu nghiên cứu............................................................................................ 33

2.2.1

Hóa chất và môi trường .............................................................................. 33

2.2.2

Dụng cụ ....................................................................................................... 34

2.3

Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 34

2.3.1

Nguồn mẫu phân lập ................................................................................... 34

2.3.2

Thí nghiệm in vitro ..................................................................................... 35

2.3.3

Thí nghiệm in vivo...................................................................................... 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 39
3.1

Ảnh hưởng của stress hormone dopamine lên các yếu tố độc lực của Vibrio

parahaemolyticus in vitro ............................................................................................ 39

3.1.1

Ảnh hưởng lên khả năng di động ............................................................... 39

3.1.2

Ảnh hưởng lên khả năng dung huyết, thủy phân casein và thủy phân

chitin……………………………………………………………………………4
0
3.3

Ảnh hưởng của stress hormone dopamine tới độc lực của Vibrio

parahaemolyticus cảm nhiễm trên tôm thẻ chân trắng ............................................... 44
3.3.1

Kết quả thí nghiệm LD50 ........................................................................... 44

3.3.2

Kết quả thí nghiệm challenge ..................................................................... 45

vi


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 49
4.1

Kết luận .............................................................................................................. 49

4.2

Kiến nghị............................................................................................................ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 50

vii


Đồ án tốt nghiệp

LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm trở lại đây, nghề nuôi trồng thủy sản ở nước ta ngày càng
phát triển nhất là ngành nuôi tôm. Với sự đa dạng về loài, các hệ thống và cơ cấu tổ
chức- sản xuất giống và trang trại tôm biển ở Việt nam đã có những bước tiến mới,
có thể nói tôm thẻ chân trắng đã góp phần đáng kể vào sự nghiệp kinh tế xã hội của
đất nước nói chung và Đồng bằng song Cửu Long nói riêng. Đến năm 2006, nhận
thấy Đồng bằng sông Cửu Long có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển ngành
nuôi tôm thẻ chân trắng nên chính phủ quyết định đầu tư và chính thức nuôi tôm thẻ
chân trắng trên diện rộng mở ra một chân trời mới với đầy cơ hội và thử thách cho
nghành nuôi tôm ở nước ta.
Do nguồn lợi nhuận thu được từ nghề nuôi tôm là khá lớn, mặt khác quy mô
ngày càng được mở rộng, nhưng môi trường không được vệ sinh sạch sẽ, cùng với
sự quản lý không chặt chẽ đã dấn đến tình trạng khi tôm bị nhiễm bệnh lan ra các ao
nuôi khác là rất nhanh, chính điều này kiến cho nghề nuôi tôm của nước ta rơi vào
nhiều mối nguy phát triển không bền vững. Việc làm tự phát, không đủ kiến thức về

nghề nuôi tôm như sử dụng hóa chất, kháng sinh bừa bãi, đã gây ô nhiễm môi
trường sinh thái dẫn đến tôm bị bệnh chết hàng loạt như một số năm trở lại đây,
thêm vào đó là việc biến đổi khí hậu toàn cầu dẫn đến sự mất cân bằng làm cho tôm
không sống khỏe mạnh và nhanh chết. Chỉ trong vòng 10 năm nuôi nghề nuôi tôm
lại điêu đứng vì tôm thẻ chân trắng bị mắc bệnh và chết hàng loạt ví dụ như: bệnh
đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh hoại tử cơ,… đặc biệt những năm trở lại đây bệnh
tôm chết sớm (Early Mortality Syndrome- EMS) hay còn được gọi là chứng hoại tử
gan tụy cấp (Acute hepatopancreatic necrosis Syndrome- AHPNS) ở Đồng bằng
sông Cửu Long đã gây thiệt hại lớn về kinh tế cũng như môi trường sống của tôm
thẻ chân trắng.
Theo TS Lightner và các cộng sự nguyên nhân gây bệnh được xác định là do
chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tạo ra một độc tố mạnh làm phá hủy nhanh
mô và làm rối loạn chức năng gan tụy trong hệ thống tiêu hóa của tôm.

1


Đồ án tốt nghiệp

2. Tình hình nghiên cứu
Một số nghiên cứu gần đây đã xác định rằng stress hormone catecholamine
làm gia tăng độc lực của vi khuẩn và có thể bị ức chế bằng cách sử dụng các chất
đối kháng catecholamine LED 209 (sperandio et al, 2003). Tuy nhiên nghiên cứu
này là rất hiếm và cho đến nay chưa có báo cáo nào về tác dụng của stress hormone
và chất ức chế stress hormone ảnh hưởng tới độc lực của vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus chủng gây bệnh EMS trên tôm thẻ chân trắng.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Trong việc tìm kiếm nỗ lực nhằm tìm kiếm một chiến lược mới để kiểm soát
bệnh EMS ở Đồng bằng sông Cửu Long. Ở đề tài này, chúng tôi sẽ tập trung khảo
sát và tìm ra mối quan hệ giữa stress hormone Dopamine và chất ức chế stress

hormone LED 209 lên độc lực của vi khuẩn VP gây bệnh tôm chết sớm trên tôm thẻ
chân trắng.
4. Mục đích nghiên cứu
Mục tiêu của nghiên cứu là để khảo sát ảnh hưởng của stress hormone
Dopamine, chất ức chết stress hormone (LED 209) lên các yếu tố độc lực của vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus bao gồm khả năng di động, khả năng dung huyết,
khả năng phân giải casein và phân giải chitin in vitro và in vivo.
Mục đích việc hoàn thiện các mục tiêu trên là giúp làm sáng tỏ cơ chế độc lực
của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, ngăn chặn và giảm thiểu tác động cả bệnh
EMS về sản xuất tôm thẻ chân trắng ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam.
5. Phương pháp nghiên cứu
❖ Phương pháp thu thập thông tin
Phương pháp thu thập thông tin bao gồm:
-

Phương pháp nghiên cứu tài liệu.

-

Phương pháp thực nghiệm.

❖ Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu sau khi thu thập được sẽ được xử lý bằng Statgraphics Centurion.
Mức khác biệt có ý nghĩa thống kê được đề nghị là p < 0.05.

2


Đồ án tốt nghiệp

6. Các kết quả đạt được của đề tài
Đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của stress hormone Dopamine (Do) lên các
yếu tố độc lực của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hôi chứng tôm chết sớm
(Early mortality syndrome (EMS)) ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam” thu
được kết quả như sau:
❖ Thí nghiệm invitro
-

Khả năng di động:
✓ Ảnh hưởng stress hormone dopamine: thử nghiệm khả năng di động
của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở các nồng độ ĐC, 50µM,
100µM cho thấy có sự khác biệt giữa có và không bổ sung stress
hormone Dopamine .
✓ Ảnh hưởng LED 209: thử nghiệm khả năng di động của vi khuẩn
Vibrio parahaemolyticus ở các nồng độ đối chứng (ĐC), 50µM,
LED 0.05µM. LED 209 cho thấy LED 209 có sự khác biệt với đối
chứng. LED 209 Ở nồng độ 0.05µM không có sự khác biệt với
stress hormone dopamine.

-

Khả năng dung huyết, khả năng thủy phân casein, khả năng phân giải
chitin: ở cả 3 thử nghiệm này đều thấy vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
có khả năng dung huyết, thủy phân casein, phân giải casein nhưng không
có sự khác biệt quá lớn giữa các môi trường có/không bổ sung stress
hormone Dopamine và chất ức chế stress hormone LED 209.

❖ Thí nghiệm invivo
-

Thí nghiệm LD50: kết qủa thí nghiệm cho thấy bổ sung 106cfu/ml làm cho
vi khuẩn VP chết 50%.

-

Thí nghiệm challenge:
✓ Stress hormone dopamine: không thể hiện rõ tác dụng làm gia tăng
độc lực của vi khuẩn VP khi thí nghiệm cảm nhiễm trên tôm thẻ
chân trắng.

3


Đồ án tốt nghiệp

✓ Chất ức chế stress hormone LED 209: LED 209 ở nồng độ 0.1µM ở
thí nghiệm 2 và 3 không thể hiện rõ tác dụng làm giảm độc lực của
VP khi thí nghiệm cảm nhiễm trên tôm thẻ chân trắng, ở nồng độ
0.05µM thể hiện rõ sự khác biệt ở các thí nghiêm 1, 2, 3.
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Kết cấu đồ án tốt nghiệp bao gồm: 3 chương.
-

Chương 1: Tổng quan tài liệu.

-

Chương 2: Vật liệu và phương pháp.

-

Chương 3: Kết quả và thảo luận.

4


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus
1.1.1 Phân loại
Vibrio paraheamolyticus thuộc:
• Giới: Bateria
• Ngành: Proteobacteria
• Bộ: Vibrionales
• Họ: Vibrionaceae
• Lớp: Gammaproteria
• Giống: Vibrio
1.1.2 Đặc điểm
Theo phân loại của Bergey, Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, hình
que hoặc cong, kích thước 0.3-0.5x1.4-2.6 μm, được tìm thấy trong nước lợ hoặc
nước mặn, khi ăn vào gây bệnh tiêu hóa ở người. Chúng có khả năng di động ( di
động bằng tiêm mao) và không sinh bào và thử nghiệm oxidase dương tính, có khả
năng phát sáng, Vibrio parahaemolyticus trên môi trường CHrom agar có màu tím
hoa cà, trên môi trường TCBS thường có màu xanh. ( Nguồn: Makino, K., Oshima,
K., Kurokawa, K., Yokoyama, K., Uda, T., Tagomori, K., Iijima, Y., Najima, M.,
Nakano, M., Yamashita, A., 2003 Vibrio parahaemolyticus: a pathogenic
mechanism distinct from that of V cholerae).

Hình1.1: Vi khuẩn V.parahaemolyticus trên môi trường TCBS, CHrom agar.

5


Đồ án tốt nghiệp

Các loại V.parahaemolyticus cũng có thể lây lan từ bố mẹ và ấu trùng. Ví dụ
như mầm gây bệnh nên bệnh hoại tử gan cấp tính (Acute hepatopancreatic necrosis
disease- AHPND) hiện diện ở rất nhiều loai tôm và ở các giai đoạn phát triển khác
nhau. Điều này giải thích tại sao chúng có thể dễ dàng bùng phát, lây lan và vấn đề
tiêu diện hoặc kiểm soát mầm bệnh này không hề đơn giản.

Hình 1.2: Vi khuẩn V.parahaemolyticus
(Nguồn: />Vibrio parahaemolyticus được phát hiện ở ngoài biển và thường kí sinh trên
tôm, cua, cá, ốc,…và chúng phát triển được ở môi trường có 1- 8% NaCl, không
sinh trưởng được trong môi trường không có muối. Chúng không thể sống khi nhiệt
độ xuống dưới 40C, pH tối ưu sống trong môi trường 7% NaCl.
Theo tổ chức FAO năm 2011, V. parahaemolyticus có khoảng chịu đựng và
khoảng tối ưu như sau:
Bảng 1.1: Khoảng chịu đựng và tối ưu của Vibrio parahaemolyticus.
Yếu tố

Khoảng tối ưu

Khoảng chịu đựng

Nhiệt độ

370C

5-430C

Độ mặn

15000ppm-30000ppm

5000ppm-100000ppm

Ph

7.8-8.6

4.8-11

Điều kiện sống

Hiếu khí

Kị khí đến hiếu khí

Hoạt lực sinh học của

0.981

0.904-0.996

nước

6

Đồ án tốt nghiệp

Loài V. parahaemolyticus được cho là ký sinh trên nhiều đối tượng thủy sản
như cua, hàu, ốc,kể cả ký sinh trùng và tôm,… chúng bùng phát với điều kiện:
•

Khi tảo tàn vì tảo chết là nguồn hữu cơ tốt cho vi khuẩn phát

triển.
•

Khi nguồn hữu cơ trong ao cao.

•

Khi độ mặn cao.

•

Khi pH cao.

•

Khi ao nuôi có nhiều ốc, hàu và ký sinh trùng,…

1.1.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn gây bệnh Vibrio parahaemolyticus trong nuôi
trồng thủy sản
1.1.3.1 Tình hình dịch bệnh

Hình 1.3: Bệnh EMS/AHPNS trên tôm
( Nguồn: Nguyễn Thảo Sương (2011-2013) tạp chí nghề cá Sông Mekong, Viện
Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản 2, Hồ Chí Minh)
Bệnh tôm chết sớm (Early Mortality Syndrome- EMS) hay còn được gọi là
chứng hoại tử gan- tụy cấp (Acute hepatopancreatic necrosis Syndrome- AHPNS)
được xác định là bệnh do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra, cư trú trong

7


Đồ án tốt nghiệp

đường tiêu hóa của tôm và phát triển theo cơ chế khá phức tạp. Bệnh xuất hiện đầu
tiên ở miền nam Trung Quốc năm 2009 và lan rộng ra các nước ASEAN như Việt
Nam, Malaysia, Thái Lan,… gây thiệt hại lớn cho ngành nuôi tôm thế giới nói
chung và Châu Á nói riêng..
❖ Tình hình thế giới
Trên thế giới, EMS xuất hiện đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 2009, nhưng ban
đầu phần lớn những người nuôi tôm không chú ý tới bệnh này và kết quả 2 năm sau
dịch bệnh thật sự bùng nổ một cách nhanh chóng. Điều đáng chú ý tỷ lệ tôm bị chết
giai đoạn đầu của chu kỳ sinh trưởng do nhiễm bệnh EMS này cực kì cao. Theo tổ
chức Nông Lương Liên hợp quốc (FAO) đối với tôm ở thời kỳ đầu ở một số trường
hợp số tôm bị chết có thể lên tới gần 100% . Vào năm 2011 từ kết quả điều tra tại
các trại nuôi tôm ở các tỉnh Hải Nam, Quảng Đông, Phúc Kiến, Quảng Tây của
Trung quốc đã bị thiệt hại tới gần 80% do bệnh EMS, sau đó lan sang một số nước
khác như Việt Nam, Thái Lan, Malaysia, gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế
(Panakorn, 2012).
Ở Thái Lan, lượng tôm xuất khuẩn giảm 50% trong năm 2011 so với mức
trung bình là 350.000 tấn/năm. Năm 2012, kinh ngạch xuất khẩu tôm sang Mỹ của
Thái lan giảm từ 27% xuống còn 23% .

Ở Malaysia, bệnh EMS đã được báo cáo đầu tiên vào giữa năm 2010 ở các
bang bờ đông: Pahang và Johor. Dịch bệnh EMS bùng phát dẫn đến sự sụt giảm sản
lượng tôm thẻ 70.000 MT vào năm 2012 xuống còn 40.000 MT vào năm 2011. Dự
báo sản lượng thấp vào năm 2012 với các báo cáo không xác định về bệnh EMS ở
các bang Sabah và Sarawak.
Trước tình hình lo ngại về sự bùng phát của dịch bênh trên toàn cầu ngay từ
lúc xuất hiện dịch bệnh một số nước như Philippines, Mexico, Cộng hòa
Dominican, Mỹ, Nhật,.. đã lần lượt cấm nhập khẩu tôm hoặc thắt chặt đầu vào từ
các nước bị ảnh hưởng của dịch EMS, lý do đưa ra từ các nước đó là để tránh gây
thiệt hại và tránh dịch bệnh lây lan tại các quốc gia này.

8


Đồ án tốt nghiệp

Theo ước tính của Liên minh nuôi trồng thủy sản toàn cầu (GAA), thiệt hại do
dịch bệnh EMS gây ra đối với ngành nuôi tôm châu Á, nơi có khoảng một triệu
người vẫn sống phụ thuộc vào nghề nuôi trồng thủy sản con số thiệt hại có thể lên
tới 1 tỷ USD/năm. Đây là một con số rất lớn đòi hỏi cần phải tìm ra biện pháp mới
để kiểm soát dịch bệnh tốt hơn, tránh gây thiệt hại cho ngành thủy sản nói chung và
nuôi tôm nói riêng trên toàn cầu.
(Nguồn: />❖ Trong nước
Ở Việt Nam vào tháng 6 năm 2011, đã có báo cáo về thiệt hại do bệnh EMS
gây ra nhưng không quá lớn, ban đầu bệnh EMS xuất hiện ở 6 tỉnh gồm: Tiền
Giang, Bến Tre, Kiên Giang, Sóc Trăng, Bạ Liêu và Cà Mau. Bệnh EMS trên tôm
thẻ chân trắng thật sự bùng phát và lây lan nhanh chóng vào năm 2012. Theo thống
kê của sở nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Sóc Trăng (2012) cả nước đã ghi
nhận 15 tỉnh có vùng nuôi tôm nhiễm bệnh EMS với diện tích 35.245ha, năm 2013
số vùng có tôm bị nhiễm bệnh EMS lên tới con số 18 tỉnh, trong đó thiệt hại nặng

nhất là Bạc Liêu với diện tích 2.174ha và Trà Vinh với diện tích 2.070 ha với tỷ lệ
tử vong có thể vượt quá 70% (Whitehead RJ , 2013).
Do tính chất phức tạp của giống vi khuẩn Vibrio, làm cho việc kiểm soát và
khống chế mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPNS trở nên rất phức tạp và khó
khăn, trực tiếp gây tổn hại đến vật chủ. Hầu hết mầm bệnh vi khuẩn Vibrio sau khi
xâm nhập vào vật chủ chúng sẽ nhanh chóng phát triển, gia tăng mật số để bảo vệ
chính nó và cùng với sự phát triển của vi khuẩn là sức khỏe của vật chủ yếu đi và
dẫn đến cái chết. Dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh EMS/AHPNS
không tấn công và xâm nhập vào máu của tôm thông qua các vết thương hoặc các
cơ chế xâm nhập khác. Điều này giải thích lý do tại sao thuốc kháng sinh không thể
ngăn chặn các nhiễm trùng do EMS/AHPNS gây nên. Nếu như kháng sinh không
thể tiếp xúc với mầm bệnh ở mức độ đủ để ảnh hưởng đến nó thì kháng sinh sẽ
không thể phát huy tác dụng. Mặc dù vẫn có nhiều trường hợp cần dùng đến kháng
sinh trong việc điều trị bệnh trên tôm, dùng kháng sinh để trị bệnh EMS/AHPNS là

9


Đồ án tốt nghiệp

một ví dụ rất điển hình về việc sử dụng kháng sinh không hiệu quả. Ẩn mình trong
vỏ bọc an toàn là màng bao sinh học (biofilm), vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là
tác nhân gây bệnh EMS/AHPNS được bảo vệ trước các hóa chất về mặt lý thuyết là
có thể tiêu diệt chúng. Điều này đặt ra một thách thức rất lớn đối với các cố gắng
phát triển một phương pháp điều trị EMS/AHPNS.
(Nguồn: />1.1.3.2 Biểu hiện tôm nhiễm bệnh EMS/AHPNS
❖ Những biểu hiện của đàn tôm khi nhiễm bệnh EMS
-

Giai đoạn đầu các triệu chứng bệnh thường không rõ ràng.

-

Tôm chậm lớn và chết ở đáy ao.

-

Tôm bị bệnh thường lờ đờ, nơi tấp mé, quay đảo trên mặt nước, giảm ăn và
chết sau đó.

-

Bào tử trống, ruột không thức ăn, gan tụy teo nhỏ của tôm bệnh.

-

Thân tôm có màu sắc bất thường. Khi tôm chết cơ thể chuyển sang trắng
đục, bệnh tập trung ở những ao thả nuôi 10-45 ngày.

-

Tôm có thể chết rất nhanh sau khi phát hiện bệnh 2-3 ngày.

-

Nhiều trường hợp ghi nhận tôm ngưng chết khi ngưng ăn và sau đó chết rất
nhanh khi cho ăn trở lại.

❖ Những biểu hiện của bệnh EMS trên cá thể tôm khi nhiễm bệnh EMS
-

Gan tôm bệnh thường gặp có nhiều trạng thái khác nhau như:
✓ Sưng to, mềm nhũn.
✓ Biến màu.
✓ Nhiều trường hợp gan bị teo nhỏ và dai.
✓ Vỏ mềm, đục cơ.

-

Giải phẫu mô học thường phát hiện:
✓ Có đốm đen trên gan.
✓ Tế bào gan bị hoại tử.

-

Lượng chất béo dự trữ trong gan hầu như không còn.

-

Mẫu gan tụy bị bội nhiễm ở các mức độ khác nhau.

10


Đồ án tốt nghiệp

-

Kiểm tra PCR không thấy virus.

Hình 1.4: Tôm nhiễm bệnh EMS
( Nguồn: />1.1.3.3 Cách phòng và điều trị bệnh trên tôm
❖ Phòng bệnh
Phòng bệnh là khâu cực kỳ quan trọng trong việc kiểm soát bệnh, khi làm tốt
khâu này thì tôm ít khi bị dịch bệnh:
-

Trước tiên chúng ta phải làm tốt công tác cải tạo ao, thực hiện đúng quy
trình cải tạo theo 3 bước: cải tạo bằng cơ học, hóa học và sinh học.

-

Chọn giống tốt, giống có kiểm dịch.

-

Thả giống với mật độ vừa phải.

-

Nên nuôi tôm trên bạt.

-

Tránh lấy trực tiếp nước biển để nuôi tôm, vì trong nước biển có chứa rất
nhiều vi sinh vật rất dễ bị lây nhiễm cho tôm.

-

Điều chỉnh các thông số kĩ thuật môi trường nuôi thích hợp.

-

Duy trì pH trong ao nằm khoảng 7.8-8.2.

-

Cho tôm ăn hợp lý, không nên để dư thừa, vì khi thức ăn dư thừa dễ gây ô
nhiễm môi trường và dễ phát sinh bệnh.

11


Đồ án tốt nghiệp

-

Trong quá trình nuôi hạn chế tôm bị shock, mất tảo,..

-

Cung cấp đầy đủ nhu cầu vitamin, acid amin và khoáng chất thiết yếu giúp
tôm sinh trưởng và tăng trong nhanh.

-

Thức ăn cho tôm nên thường xuyên trộn men tiêu hóa (men có lợi cho
đường ruột) nhằm mục đích hỗ trợ tiêu hóa thức ăn công nghiệp và đưa vào
đường ruột tôm một lượng lớn vi khuẩn có lợi, cạnh tranh lấn át vi khuẩn
có hại theo quy luật cạnh tranh sinh tồn để tôm ít bị bệnh.

-

Sau 2 tuần nuôi ngoài việc dung men tiêu hóa cho tôm ăn, ta có thể dung
bổ sung sản phẩm bổ gan cho tôm ăn ngày 2 lần, mục đích bảo vệ tế bào
gan tôm.

-

Sau 3 tuần thả tôm: bổ sung thêm các sản phẩm có lợi cho tôm như giúp
tôm tăng cường sức đề kháng, tăng cường miễn dịch cho tôm.

-

Sau 4 tuần: diệt khuẩn nguồn ao nước, mục đích làm giảm mật độ vi khuẩn
có hại trong nguồn nước.

❖ Điều trị bệnh EMS/AHPNS
Một số lưu ý trong quá trình điều trị bệnh EMS trên tôm như sau:
-

Trong quá trình nuôi tôm phải thường xuyên theo dõi đàn tôm để sớm phát
hiện dấu hiệu bất thường. Khi xảy ra dịch bệnh, nhanh chóng lấy mẫu phân
tích nếu phát hiện cớ sự hiện diện của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở
mật độ cao trong ruột, thì phải điều trị ngay. Tuân thủ tốt lịch thời vụ, quy
định bảo vệ môi trường vùng nuôi, tuyệt đối không xả bùn đáy và mầm
bệnh chưa qua sử lý ra môi trường bên ngoài.

-

Có thể tăng cường oxy cho tôm trong ao nuôi bằng cách tăng cường quạt
nước, máy sục khí,…

-

Sau khi dùng kháng sinh trộn thêm men tiêu hóa để cung cấp vi khuẩn có
lợi cho đường ruột và chất giải độc gan giúp tôm mau hồi phục bệnh.

-

Diệt khuẩn và làm sạch nguồn ao nước nuôi để giảm mật độ vi khuẩn gây
bệnh có trong nguồn nước.

12


Đồ án tốt nghiệp

1.1.4 Các yếu tố độc lực của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
1.1.4.1 Sự bám vào tế bào
Bám vào tế bào là điều kiện đầu tiên để vi sinh vật có thể xâm nhập vào mô và
gây bệnh. Người ta đã quan sát thấy các vi khuẩn thường bám trên vật rắn hoặc các
hạt để tồn tại và phát triển. Bằng cách này chúng tránh được tác dụng của dòng
nước.
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus thường đi theo dòng nước vào bên trong dạ
dày của tôm, và bám vào thành ruột.
Khả năng bám đặc hiệu này của vi khuẩn là một yếu tố quan trọng của độc lực.
Sự bám lên trên bề mặt của niêm mạc là bước đầu tiên của quá trình sinh bệnh, dẫn
tới việc tôm chết hàng loạt.
Các yếu tố bám dính của vi sinh vật được gọi là adhesin. Bản chất của chúng là

polypeptide hoặc polysaccharide.
Các adhesion có bản chất polypeptide được chia thành 2 nhóm: nhóm có
fimbriae và nhóm không có fimbriae. Các fimbriae, hay còn gọi là các pili, là những
cấu trúc phụ của vi sinh vật có dạng như sợi lông trên bề mặt vi khuẩn. Các
fimbriae được cấu tạo bởi nhiều protein xếp chặt với nhau tạo nên hình dạng giống
như trụ xoắn ốc. Thường thì chỉ có một loại protein là cấu trúc chính của một phân
nhóm fimbriae tuy nhiên các protein phụ trợ khác cũng có thể tham gia vào cấu trúc
của đỉnh hoặc gốc fimbriae. Đỉnh của các fimbriae có chức năng gắn với tế bào vật
chủ. Các vi khuẩn Gram âm thường bám dính nhờ các fimbriae này như VP.
Các yếu tố bám dính bản chất polysaccharide thường là thành phần cấu tạo của
màng tế bào, vách tế bào và vỏ vi khuẩn. Teichoic acid trong vách của vi khuẩn có
tác dụng như là các yếu tố bám dính. Các polysaccharide (glucan và mannan) trong
lớp vỏ cũng được các thụ thể của vật chủ nhận diện (receptor bổ thể 3 và mannose
receptor) nhờ đó làm tăng tính bám dính của các tác nhân này. Mặc dù các tương
tác receptor-ligand nhằm tăng cường khả năng bám dính có thể chia thành hai nhóm
chính: tương tác protein-protein và protein-carbonhydrate, một điều quan trọng cần

13


Đồ án tốt nghiệp

nhớ là các vi sinh vật thường sử dụng rất nhiều thụ thể khác nhau của tế bào vật
chủ.
1.1.4.2 Khả năng xâm nhiễm
Khả năng xâm nhiễm là khả năng đi vào bên trong có tổ chức của cơ thể vật
chủ, nhân lên rồi sau đó lan tràn sang các vùng khác.Có thể chia quá trình xâm nhập
thành 2 loại: nội bào và ngoại bào.
❖ Xâm nhập ngoại bào
Xảy ra khi tác nhân gậy bệnh phá vỡ các rào cản của tổ chức để phát tán đi các

vị trí khác nhau trong cơ thể vật chủ nhưng bản thân chúng vẫn tồn tại bên ngoài tế
bào vật chủ. Cách thức xâm nhập ngoại bào là tiết ra một số enzyme nhằm phá hủy
các phân tử tế bào vật chủ.
Khả năng xâm nhập ngoại bào cho phép các tác nhân gây bệnh này tạo ra các
chỗ ẩn nấp trong vật chủ và tại đó chúng bắt đầu tăng sinh rồi phát tán đi khắp các
vị trí cũng như sản xuất các độc tố . Các tác nhân gây bệnh xâm nhập ngoại bào có
thể đi vào trong tế bào vật chủ và sử dụng cả hai con đường xâm nhập nội bào và
ngoại bào.
❖ Xâm nhập nội bào
Xảy ra khi các vi sinh vật đi vào bên trong tế bào vật chủ và sống trong môi
trường nội bào. Một số tác nhân gây bệnh là do vi khuẩn gram (-) có khả năng sống
bên trong tế bào. Các tế bào không có chức năng thực bào hay có chức năng thực
bào đều là đích tấn công của các tác nhân này.
1.1.4.3 Khả năng tạo vỏ
Một số vi khuẩn sản xuất ra một lượng lớn cá phân tử polysaccharide trọng
lượng phân tử cao, còn được gọi là exopolysaccharide. Lớp áo ngoại bào này gọi là
vỏ và được tạo ra nhằm mục đích kháng lại sự thực bào. Lớp vỏ giúp chúng chống
lại cơ chế phòng vệ của cơ thể cũng như đề kháng kháng sinh và có khả năng điều
hòa miễn dịch. Đó là lý do tại sao dùng thuốc kháng sinh để ngăn chặn bệnh EMS là
điều không khả thi.

14


Đồ án tốt nghiệp

1.1.4.4 Các enzyme
Nhiều vi khuẩn gây bệnh tạo được nhiều enzyme làm ảnh hưởng lớn tới tổ
chức mô của sinh vật chủ và quá trình ủ bệnh (Rasko và Sperandio, 2010).
Một số enzyme thường thấy do vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus tạo ra là:

hemolysins, protease và chitinases.
❖ Protease
Protease hay còn gọi là peptidase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt
mối liên kết peptide (-CO-NH-) trong các phân tử polypeptide. Protease của vi
khuẩn có thể thủy phân một loạt các phân tử protein, tiêu diệt cấu trúc ngoại bào và
đóng vai trò quan trọng trong gây bệnh. Qua các quá trình tiến hóa, protease đã
thích nghi với các điều kiện phức tạp trong sinh vật (thay đổi pH, môi trường khử
…) và sử dụng cơ chế xúc tác khác nhau cho chất nền thủy phân (Turk, 2006).
Dựa vào cơ chế hoạt động khác nhau mà chúng được phân loại như sau:
metalloproteases, protease serine, protease cystein, collagenases, caseinases và
gelatinases (Defoirdt, 2013). Nhiều tác giá đã báo cáo về sự hiện diện của protease
ở Vibrio spp. Theo Lee và cộng sự (1999), protease cysteine được xác định là một
yếu tố độc lực lớn của V. harveyi trong khi ở một nghiên cứu khác của Teo và cộng
sự (2003), metalloprotease cũng được coi như là một độc lực yếu tố của loài này.
Một độc tố gây chết người được sản xuất bởi V. alginolyticus dòng Swy được phân
lập từ bệnh Kuruma trên tôm sú (Penaeus japonicus) được xác định là protease
mang tính kiềm (Lee và cộng sự, 1997). Trong thí nghiệm in vitro, hoạt tính
protease được sử dụng đối với môi trường thạch có bổ sung 5% Skimmilk
(caseinase) (Natral và cộng sự, 2011).
❖ Chitinases
Chitinase (còn gọi là [poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosid
glucanohydrolase]) là enzyme thủy phân kitin (thành phần vỏ ngoài của động vật
giáp xác như cua, tôm, …) thành các đơn phân oligosaccharide. Vi khuẩn Vibrio có
thể sử dụng chitin rất hiệu quả bằng cách chuyển đổi chúng thành các hợp chất hữu
15


Đồ án tốt nghiệp

cơ sau đó sử dụng như là nguồn cung cấp nito và cacbon chính. Chitinase sản xuất

bởi Vibrios đã được chiết xuất và định rõ đặc điểm bởi nhiều nhà khoa học
(Ohtakara và cộng sự, 1979; Murao và cộng sự, 1992). Một vài gen quy định cho
việc sản xuất chitinase ở vi khuẩn V. vulnificus (Wortman, 1986), V. harveyi (SotoGil và Zyskind, 1984), V. furnissii (Keyhani và Roseman, 1996), V. cholerae
(Connell và cộng sự, 1998), V. parahaemolyticus và V. anguillarum (Hirono, 1998)
đã được giải trình tự và đồng hóa. Hoạt tính chitinase của vi khuẩn có thể được
khảo sát bằng cách sử dụng môi trường thạch có chứa keo kitin (Defoirdt và cộng
sự, 2010).
❖ Hemolysins
Hemolysin tác động trực tiếp lên tế bào hồng cầu, ly giải và phá vỡ tế bào
hồng cầu , giải phóng hemoglobin. Ở vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, có ba gene
quy định độc tố hemolysins chính gồm: thermostable direct hemolysin (tdh), TDHrelated hemolysin (trh) mã hóa các hemolysin bền nhiệt và tlh mã hóa các
hemolysin không bền nhiệt. Cả hai gen tdh và trh đều nằm trên operon độc tố Vibrio
parahaemolyticus toxRS (Vp-toxRS), được điều hòa bởi gen toxR có trình tự bảo
tồn cao trong loài (Nishibuchi, Kaper, 1995). Gen toxR là gen điều hòa kiểm soát sự
biểu hiện của các gen mã hóa cho các nhân tố độc lực ngoại bào quan trọng và các
gen liên quan đến các độc tố khác. Gen toxR có kích thướng 368 bp là gen điều hòa
cho operon Vp- toxRs (Zulkifli và cộng sự, 2009) tồn tại ở tất cả các chủng VP.
Gen tdh, trh lần lượt có kích thước khác nhau 250 và 251p. Hầu hết ở các mẫu
lâm sàn có tdh hoặc trh, hoặc cả hai, trong khi gần như tất cả các mẫu từ môi trường
không có (Shirai và cộng sự, 1990; Suthienkul và cộng sự, 1995; Iida và cộng sự
1997) hoặc có với tỉ lệ thấp 1-5% (Nishibuchi và Kaper, 1995, Robert và cộng sự,
2004).
Hemolysin là ngoại độc tố, tấn công vào màng tế bào máu và làm tan tế bào.
Hemolysin chuyển các ion liên kết với protein như hemolysin, transferrin,
lactoferrin thành dạng tự do. Các ion này (Fe3+) sẽ liên kết với các phức chất dạng
16