Nghiên cứu nhân nhanh cây bạc hà mentha arvensis l và bước đầu thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn phân lập từ bình nuôi cấy mô bị nhiễm của tinh dầu thô bạc hà

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam là một nước nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa, có thời
tiết nóng ẩm thuận lợi cho việc phát triển tài nguyên thực vật. Cho đến nay đã có xấp
xỉ 12.000 loài thực vật bậc cao đã được thống kê, trong số đó nhiều loài chứa tinh dầu
và đã được khai thác để sản xuất tinh dầu dùng trong mỹ phẩm, dược phẩm và phục vụ
nhu cầu xuất khẩu.
Cây Bạc hà Mentha arvensis L. là một loài cho tinh dầu có giá trị kinh tế cao,
đã được trồng phổ biến ở các vùng có nhiều phù sa như Hải Phòng, Hải Dương, Hưng
Yên, Thái Bình, Hà Nam thuộc miền Bắc Việt Nam vì đất tốt và khí hậu có một mùa
lạnh với nhiệt độ không quá thấp, thuận lợi cho cây Bạc hà mọc quanh năm và cho
tinh dầu chất lượng tốt. Ngoài ra cũng được trồng tại một số tỉnh phía Nam như Quảng
Nam, Đà Nẵng và Tiền Giang.
Về mặt y học, Bạc Hà được xem như là một vị thuốc được sử dụng từ nhiều
năm nay để điều trị rất nhiều bệnh phổ biến như: chữa cảm sốt, nhức đầu, sổ mũi, đau
họng, khản tiếng, kích thích tiêu hóa của các bệnh đường ruột, sát trùng giảm đau.
Theo Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam, Bạc Hà có tác dụng kháng khuẩn trong thí
nghiệm in vitro đối với các chủng vi khuẩn tả Vibro Choreia Elto, Vibro Choreia
Inaba,Vibro Choreia Ogawa.
Menthol là thành phần chính của tinh dầu bạc hà, được sử dụng rộng rãi trên thế
giới làm hương liệu chính và tạo vị the mát trong nhiều loại thực phẩm, đồ uống và mỹ
phẩm. Ngày nay, đa số các sản phẩm như kẹo cao su, kem đánh răng, kẹo ngậm,… có
mùi Bạc hà trên thị trường phần lớn là sử dụng nguyên liệu tổng hợp bằng phương
pháp hóa học vì có thể sản xuất với số lượng lớn với giá thành thấp. Tuy nhiên, chất
lượng cuộc sống của con người ngày một tăng do đó nhu cầu về việc sử dụng các chất
có nguồn gốc tự nhiên nhằm bảo vệ sức khỏe và môi trường cũng tăng theo. Vấn đề
đặt ra là làm sao để giảm giá thành tinh dầu chiết xuất từ cây trồng. Phương pháp nuôi
cấy in vitro, trong nhiều thập niên vẫn được xem là một trong những kỹ thuật hữu hiệu

nhất dùng để nhân nhanh các giống cây trồng sạch bệnh đã được tuyển chọn hoặc các
nguồn gene thực vật quý hiếm. Tuy nhiên phương pháp vi nhân giống truyền thống
(conventional micropropagation) vẫn còn gặp một số giới hạn, ví dụ như giá thành cây
SVTH: Nguyễn Thị Thìn

1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
cấy mô chưa đáp ứng yêu cầu của người trồng trọt do chất lượng và tỷ lệ sống cây cấy
mô ở vườn ươm tương đối còn thấp, cũng như tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn trong giai
đoạn in vitro không nhỏ là một trong những nguyên nhân gây tổn thất về kinh tế và
làm tăng giá thành cây giống nuôi cấy mô gây khó khăn cho ngành nhân giống nước
ta.
Vì những thực tiễn như vậy mà đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh cây bạc hà
Mentha arvensis L. và bước đầu thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn phân lập từ
bình nuôi cấy mô bị nhiễm của tinh dầu thô Bạc hà” được tiến hành nhằm mục đích
góp phần tìm ra môi trường thích hợp trong nhân giống cây Bạc hà Mentha arvensis L
tạo năng suất cao ứng dụng vào thực tiễn sản xuất và bước đầu thử nghiệm hoạt tính
kháng vi sinh vật nhằm tìm ra hướng mới trong giải quyết vấn đề nhiễm vi sinh vật
trong nuôi cấy in vitro, một trong những nguyên nhân gây tổn thất về mặt kinh tế.
2. Mục đích nghiên cứu
Đề tài “Nghiên cứu nhân nhanh cây bạc hà Mentha arvensis L. và bước đầu thử
nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật phân lập từ bình nuôi cấy mô bị nhiễm của dịch
chiết bạc hà” được thực hiện nhằm mục đích:
-

Nghiên cứu và hoàn thiện phương pháp nhân giống in vitro cây bạc hà
Mentha arvensis L.

-

Tìm ra môi trường và điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sự phát triển của cây
bạc hà Mentha arvensis L in vitro.

-

Bước đầu thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật nhằm tìm ra hướng mới
trong giải quyết vấn đề nhiễm vi sinh vật trong nuôi cấy in vitro.

3. Nhiệm vụ nghiên cứu
-

Khảo sát môi trường nuôi cấy Bạc hà Mentha arvensis L.

-

Tìm ra môi trường và điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sự phát triển của cây bạc hà
Mentha arvensis L in vitro.

-

Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L.

4. Phương pháp nghiên cứu
Các kết quả thu nhận được xử lý theo phương pháp phân tích phương sai ANOVA.
Sử dụng phần mềm Statgraphic, phần mềm Microsoft Office Excel 2010® để
tính toán và xử lý số liệu.

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

2


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
5. Các kết quả đạt được của đề tài
Sau khi tiến hành thử nghiệm tôi thu được kết quả như sau:
 Môi trường MS có bổ sung 5% nước dừa là môi trường tốt nhất cho sự nhân
nhanh chồi Bạc hà Mentha arvensis L.
 Môi trường MS bổ sung 50g/l đường là tốt nhất cho sự nhân nhanh chồi Bạc hà
Mentha arvensis L. trong điều kiện chiếu sáng.
 Môi trường MS bổ sung 90g/l đường là tốt nhất cho sự nhân nhanh chồi Bạc hà
Mentha arvensis L. trong điều kiện tối.
 Thể tích tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L. tách chiết 5ml cho khả năng kháng
vi khuẩn tôt nhất.
 Thể tích tinh dầu Bạc hà thương phẩm thể tích 0,5ml; 1ml; 2ml đều cho khả
năng kháng vi khuẩn tôt nhất.
6. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp
Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương
Chương 1. Tổng quan tài liệu
Chương 2. Vật liệu và phương pháp
Chương 3. Kết quả và thảo luận
Chương 4. Kết luận và kiến nghị

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

3


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1:
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

4


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Tổng quan về Bạc hà Châu Á
1.1.1. Giới thiệu về cây Bạc Hà Châu Á
Giới :

Plantae

Ngành:

Magnoliophyta

Lớp :

Magnoliopsida

Bộ

:

Lamioles

Họ

:

Lamiaceae (Hoa môi)

Chi :

Mentha

Loài :

Mentha arvensis L.

Tên khác: Bạc hà Nam - Nhân đơn thảo
(Trung Quốc) - Mentha (Pháp) -

Hình 1.1. Bạc hà Á

Peppermint (Anh)
1.1.2. Nguồn gốc Bạc hà Á

Trên thế giới, Bạc Hà Á được trồng chủ yếu ở Nhật Bản, Brazil, Triều Tiên, Ấn
Độ, Thái Lan, Paraguay, vùng Viễn Đông, Trung Á, Tây và Bắc Siber.
Theo Planchon (1882), ở Nhật Bản người ta trồng Bạc hà Á từ rất lâu đời, sau
đó đưa trồng ở Mãn Châu (Đông Bắc Trung Quốc).
Theo Perot (1888), mặc dù người ta đã di thực được Bạc hà châu Âu vào Nhật
Bản nhưng về mặt công nghiệp người ta vẫn ưa trồng Bạc hà địa phương Mentha
arvensis Linn.
Ở Ấn Độ đầu tiên người ta trồng Bạc hà châu Âu vào năm 1881 ở các bang

Madras và Maysia. Bạc hà Á Mentha arvensis L. được đưa vào trồng tỏ ra có hương
thơm hơn Bạc hà Châu Âu Mentha piperita L. Hiện nay, toàn bộ Bạc hà được đưa vào
trồng trên phạm vi công nghiệp ở Ấn Độ là Bạc hà Á (Mentha arvensis L.).
Những năm cuối thập kỷ 70, Bạc Hà được phát triển nhiều nhất.
1.1.3. Phân bố sinh thái ở Việt Nam
Ở Việt Nam cây Bạc hà được đưa vào trồng từ tháng 9/1974 là giống BH974,
tháng 9/1975 là giống BH975. Hai loại BH974 và BH975 được xác định là loài
M.arvensis.
Cây Bạc hà được trồng nhiều ở các huyện Nghĩa Trai (Hưng Yên), Đại Yên (Hà
Nội). Ngoài ra Bạc hà mọc hoang nhiều ở Sa Pa (Lào Cai), Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Ba

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

5


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Vì (Hà Nội), Bắc Cạn, Sơn La. Cây Bạc hà được di thực về đồng bằng để trồng nhưng
không phát triển được. Đã có nhiều tỉnh trồng để khai thác tinh dầu như ngoại thành
Hà Nội, Nam Hà, Thái Bình, Quảng Ninh, Đà Nẵng, TP. Hồ Chí Minh, Tiền Giang,
Long An.
Nhờ đó, từ 1977 nước ta đã tự túc được mỗi năm 50 tấn tinh dầu và 10 tấn hoạt
chất menthol chiết xuất từ tinh dầu (Đỗ Tất Lợi, 1987).
Cây Bạc hà Á có hàm lượng menthol cao tới 80 – 90% nên sau khi chiết lấy bớt
menthol ra, tinh dầu còn lại vẫn được sử dụng như tinh dầu cây Bạc hà Châu Âu
(Sukhmal, 2002).
Theo Nguyễn Năng Vịnh (1966), Bạc hà là loài cây đặc biệt ưa ẩm và ưa ánh
sáng, mọc hoang dại và tập trung thành những đám nhỏ gần bờ suối hay trong thung
lũng. Đất nơi Bạc hà mọc thường có màu nâu đen, tơi xốp và giàu chất mùn. Cây ra
hoa hằng năm, nhưng hình thức tái sinh chủ yếu vẫn bằng cách mọc chồi, đẻ nhánh bò

lan trên mặt đất.
Cây Bạc hà thường được trồng bằng cách dâm cành, trước tiên trồng ở nơi đất
có nhiều mùn, sau đến chỗ đất cát. Ở miền Nam Bạc hà có thể trồng được quanh năm.
Miền Bắc có 2 vụ: trồng vào tháng 2 – 3 thu hoạch tháng 6 – 7, trồng tháng 8 – 9 thu
hoạch tháng 2 – 3. Gần đây ta đã nhập một loại Bạc hà Nhật Bản cũng thuộc loài
Mentha arvensis L. Có sản lượng tinh dầu và menthol khá cao. Các vùng sản xuất hiện
nay chủ yếu là loại Bạc hà này.
1.1.4. Đặc điểm hình thái Bạc hà Á
Cây Bạc hà là cây cỏ, sống lâu năm, cao 10 – 60
cm, thân vuông, mọc đứng hay hơi bò, có khi
phân nhánh, trên thân và lá có nhiều lông. Lá mọc
đối, chéo chữ thập, cuống dài, rộng 2 – 3cm, mép
có răng cưa, mặt trên và mặt dưới đều có lông che
chở và lông bài tiết. Hoa mọc vòng ở kẽ lá, màu
tím hay hồng nhạt, có khi màu trắng. Mùa hoa
tháng 7 – 10, tất cả thân, cây, lá, hoa đều có mùi
thơm (Savithri Bhat, 2000).

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

6

Hình 1.2. Hình thái Bạc hà Á


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Rễ Bạc hà: Cấu tạo từ thân ngầm dưới đất. Phân bố lớp đất từ 30 – 40 cm phân
nhánh như rễ phụ. Từ các đốt ngầm mọc thân khí sinh. Thân ngầm không chứa tinh
dầu. Khi bộ phận khí sinh tàn lụi, thân ngầm vẫn sống qua đông, đến xuân tiếp tục
phát triển thành bộ rễ và cho cây Bạc hà mới. Khi cây và rễ phát triển xong thân ngầm

cũ héo và chết. Thân ngầm không có thời kỳ ngủ nghỉ rõ rệt, thời gian tạm ngừng sinh
trưởng vào khoảng tháng 11. Thân ngầm là đối tượng nhân giống và vị trí giữa cho tỷ
lệ sống cao nhất.
Thân Bạc hà: thuộc dạng thân thảo, thân chính và lá tạo thành hình chóp. Tán
càng lớn, sản lượng càng cao. Thân chính cao 0,6 – 1,2m. Rỗng ruột khi già. Trên thân
có đốt, mỗi đốt mọc hai mầm đối xứng nhau và các rễ bất định. Giữa hai đốt là lóng,
độ dài ngắn của lóng phụ thuộc vào các giống và điều kiện trồng trọt. Thân chứa hàm
lượng tinh dầu tương đối thấp khoảng 0,3% tỷ lệ tinh dầu.
Lá Bạc hà: lá đơn mọc đối chéo chữ thập. Cuống lá ngắn, hình trứng, màu xanh
thẫm có thể đỏ tím, xẻ răng cưa không đều, dài 4 – 8cm, rộng 2 – 4cm. Hai mặt lá là
các túi tinh dầu, mặt trên số lượng nhiều hơn mặt dưới, cấu tạo một túi dầu gồm 9 tế
bào, 1 tế bào đáy 8 tế bào còn lại xếp tròn trên đáy tạo thành một khoang trống. Khi túi
chứa tinh dầu có màng phủ căng, dễ bị vỡ dưới tác động cơ giới. Tế bào tiết tinh dầu
tăng từ đầu lá đến cuống lá và từ mép lá vào giữa lá. Hai mặt đều có lông, lông che
chở và lông tiết tinh dầu. Lá là cơ quan dinh dưỡng quan trọng nhất có nhiệm vụ
quang hợp, hô hấp, thoát hơi nước và mang tinh dầu. Quá trình tổng hợp và tích lũy
tinh dầu trong lá tiến hành đồng thời cùng với quá trình tổng hợp chất hữu cơ, ở trong
lá non quá trình này diễn ra mạnh hơn. Số lượng lớn nhất các loại lá này quyết định
hàm lượng tinh dầu đạt cao nhất ở cuối thời kỳ làm nụ của cây trồng. Lá là nguyên liệu
chính để cất tinh dầu 2,4 – 2,7% tỷ lệ tinh dầu.
Hoa, quả và hạt Bạc hà: hoa mọc vòng ở kẽ lá, cánh hoa hình môi, môi trên
lõm, môi dưới tách là 3, màu tím, hồng nhạt, có khi màu trắng. Cụm hoa bồng hình
chóp. Trên hoa có cuống ngắn, 5 đài cánh hợp thành hình chuông, có 4 nhị (2 dài, 2
ngắn), bầu chia thành 4 ô, mỗi ô có một noãn. Mặt ngoài đài hoa có lông bao phủ, có 4
– 6% tỷ lệ tinh dầu. Ít khi thấy quả và hạt của Bạc hà, quả hình bế có 4 ngăn, hạt hình
bầu dục màu nâu vàng rất bé.

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

7

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.1.5. Giới thiệu về tinh dầu Bạc hà
1.1.5.1. Bản chất của tinh dầu
Tinh dầu là những hỗn hợp khác nhau của những chất bốc hơi nguồn thực vật
(rất ít khi nguồn động vật), các chất này thường có mùi thơm và thành phần hóa học,
cấu tạo, tính chất, điểm chảy, điểm sôi, độ tan trong nước hay trong các dung môi rất
khác nhau, phần lớn không tan, chính xác là ít hay rất ít tan trong nước. Các hợp phần
của tinh dầu hòa tan lẫn nhau. Nếu một lượng tinh dầu nào đó là một khối đồng nhất
(một pha) bắt đầu sôi ở một nhiệt độ phụ thuộc thành phần và tỷ lệ các hợp phần.
1.1.5.2. Nhu cầu về tinh dầu hương liệu
Theo số liệu thống kê, năm 2003 Việt Nam xuất khẩu được 852.000 USD tinh
dầu – hương liệu và 2.875.000 USD mỹ phẩm chế biến tổng hợp từ tinh dầu – hương
liệu các loại nhưng đã nhập khẩu trở lại với giá trị tương ứng là 1.750.000 và
152.386.000 USD.
Nhu cầu về tinh dầu và hương liệu – mỹ phẩm trên thế giới tăng nhanh do nhu
cầu người dân ngày càng có xu hướng quay trở về dùng những hợp chất tự nhiên trong
hương liệu – mỹ phẩm, thực phẩm. Trung Quốc và Ấn Độ là 2 quốc gia có sản lượng
và xuất khẩu tinh dầu – hương liệu lớn nhất thế giới nhưng hiện nay cũng phải nhập
thêm tinh dầu vì đã xây dựng những nhà máy sản xuất đơn hương và mỹ phẩm lớn để
đáp ứng yêu cầu sử dụng trong nước và xuất khẩu.
Hương liệu sử dụng cho mỹ phẩm và thực phẩm hàm chứa trong tinh dầu các loại như:
bạc hà, hương nhu, bạch đàn, húng quế, hoắc hương, quế, hồi, sả các loại,....
Ngoài ra, còn có những loại hiếm hoi như xá xí, hương lau, tràm trà, trầm hương. Đây
là nguồn nguyên liệu cơ bản để tổng hợp ra nhiều hợp chất tự nhiên quan trọng cho
công nghiệp hương liệu – mỹ phẩm. Các hãng dược phẩm trên thế giới ngày càng có
nhu cầu nhiều loại tinh dầu chứa các chất chưa được tổng hợp nhân tạo như citronellal,
geraniol, citral,.... Các nghiên cứu cho thấy, những nguyên liệu này đều đang có trong
các loại cây cỏ thực vật phong phú của Việt Nam. Cả nước có đến 300 loài cây tinh

dầu đã được thu thập, trong đó có đến 50 loài cây đã được trồng mang tính sản xuất
hàng hóa. (Nguồn: VnExpress, 12/2004).
1.1.5.3. Các hợp phần của tinh dầu
Phần lớn các hợp phần của tinh dầu có mùi thơm, một số có tính chất sinh lý đặc

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

8


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
biệt. Giá trị của các hợp phần về từng mặt rất khác nhau, ví dụ có hợp phần là chất
quyết định hương vị chủ yếu của tinh dầu, có hợp phần không đưa lại hương vị chủ
yếu nhưng lại rất cần thiết để cố định (giữ) mùi thơm hay cần thiết cho sự hòa hợp
mùi, làm tinh dầu có mùi rất tinh tế, nhiều khi các nước hoa pha chế bằng cách trộn
các hợp chất thơm thiên nhiên tổng hợp không sao đạt được, có hợp phần có rất ít mùi
hay không có mùi, thậm chí có hợp phần lại có mùi làm hại hương vị chung cần loại
đi.
Về mặt hóa học các hợp phần chủ yếu thuộc các loại hợp chất sau: các
hydrocarbon (loại hợp phần ít giá trị nhất, nhiều khi người ta tìm cách loại ra), các
rượu este (loại hợp chất rất phổ biến của các tinh dầu và là nguồn mùi thơm quan
trọng), các phenol và ether của phenol (hai loại hợp phần quan trọng của một số tinh
dầu, nguồn thơm quan trọng của chúng và là những hợp chất được dùng trong một số
tổng hợp các mỹ phẩm), các aldehyde và các ceton (hai loại hợp phần cũng có nhiều
trong tinh dầu và có vai trò quan trọng bậc nhất trong mùi thơm), ngoài ra còn có loại
hợp chất khác như các acid tự do, các hợp chất nitrogen,…. Trong mỗi tinh dầu có rất
nhiều hợp phần khác nhau, nhưng nhiều hợp phần có hàm lượng rất nhỏ. Mỗi loại tinh
dầu có từ vài đến 10 – 20 hợp phần đáng kể về mặt hàm lượng hay về mặt giá trị sử
dụng. Trong các mẫu khác nhau của cùng một loại tinh dầu (cùng tên) nhưng có nguồn
gốc khác nhau, thành phần và hàm lượng các hợp phần cũng không nhất thiết giống

nhau.
1.1.5.4. Tinh dầu trong vật liệu thực vật
Tinh dầu cũng như các chất nguồn thực vật khác được tạo thành trong quá trình
sinh trưởng của cây và tích tụ lại trong một hay một số bộ phận của cây (như hoa, lá,
vỏ, rễ, thân,…), phân bố không đồng đều. Tinh dầu rất ít khi tự do ở bên ngoài (vì nếu
có nó sẽ nhanh chóng bay hơi hết, không tích tụ lại được) mà thường nằm ở các
khoảng trống bên trong tế bào hay ở các túi, các hạch tinh dầu, ngăn cách với bên
ngoài bằng một màng (còn gọi là tế bào có tinh dầu hay túi tinh dầu). Những túi tinh
dầu có thể ở ngoài mặt hay nằm bên trong mô thực vật. Nếu túi nằm ngoài mặt mô mà
màng mỏng manh (như các lóng tinh dầu trên lá hay hoa có trong một số trường hợp)
thì màng này rất dễ vỡ ra và người ta dễ ngửi thấy mùi tinh dầu. Nhưng thường thì cần
một tác động để làm vỡ túi nếu không tinh dầu bị giữ lại trong túi không khuếch tán ra

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

9


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
được. Trong túi, tinh dầu lẫn với nước, túi lại nằm trong mô thực vật có nước, đều này
ảnh hưởng đến việc chưng cất tinh dầu.
1.1.5.5. Thành phần hóa học của tinh dầu Bạc hà Mentha arvensis L.
Là một chất lỏng có màu vàng nhạt, mùi Bạc hà, nóng bỏng và có vị tê; thu được
bằng cách chưng cất lôi cuốn hơi nước lá Bạc hà. Thành phần, tính chất của tinh dầu
Bạc hà tùy thuộc vào giống, đất đai, khí hậu... Hiện nay loại tinh dầu Bạc hà tốt nhất là
của Nhật Bản.
Tinh dầu Bạc hà là hỗn hợp phức tạp của rất nhiều chất hóa học khác nhau như:
Hydratecarbon, Alcolphenol, Aldehyde, Ceton, … tùy từng chủng loại Bạc hà mà
thành phần chính của tinh dầu có thể là:
-

Menthola thuộc nhóm Alcol: Bạc hà Âu 40 – 50% Menthola trong tinh dầu,
Bạc hà Á 70 - 90% Menthola trong tinh dầu.

-

Linalola, Cacvon, Pulegon ở các giống Bạc hà khác như ở Bạc hà xanh, ba hợp
chất này thay thế cho Menthola.

-

Flavonoid ở Bạc hà cay.

Ngoài thành phần chính là Menthola, tinh dầu còn chứa ceton, Mentol (6 - 18%),
Aldehyde acetic, Aldehyde isovalerianic, rượu amilic, acid acetic, mentofuran…
Trong một số trường hợp tinh dầu còn chứa cả dimetila sulfur được tạo thành trong
quá trình chưng cất từ lá và làm cho tinh dầu có mùi khó chịu.
Tinh dầu có chất lượng cao là kết quả của sự kết hợp hài hòa giữa các thành phần
Menthola, Menthol, Metilacetate và chia các thành phần của tinh dầu ra 4 nhóm chính:
-

Hợp chất không terpen: có phân tử thấp, chiếm 2% trong tinh dầu, chủ yếu là
amilic (amilic và isoamilic). Chúng quyết định mùi thơm đặc trưng của tinh
dầu. Ngoài ra còn có acetaldehyde, isovalerandehyde, femilacetaldehyde.

-

Hydratecarbon terpen: 4% trong tinh dầu gồm xineola (2%), dipenten, limonen,
beta-pinem, camfen, beta-micxen, aximen, gamatecpimen và para-ximola.

-

Hợp chất terpen có chứa oxy: 85% trong tinh dầu, chủ yếu là menthola,
monthle, mentilacetate, mentofuran và một lượng nhỏ neomentola, hydrate
xabinen và các terpenceton (piperiton và oxylacton terpen).

-

Hợp chất secquiterpen: 3% trong tinh dầu chủ yếu là hydratcarbon, cariofilen
đồng dạng.

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

10


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Ngoài ra còn có acid béo tự do, fenola và các chất trùng hợp khác. Lượng chất
này tùy thuộc vào phương pháp chưng cất và bảo quản tinh dầu.
1.1.6. Sự sinh trưởng và phát triển của cây Bạc hà
Bạc hà có 4 giai đoạn sinh trưởng và phát triển
1.1.6.1. Thời kì mọc mầm
Tính từ khi cây con mọc đến khi định rõ hàng trồng quá trình mọc bắt đầu ở 10oC
trong khoảng 10 – 15 ngày.
Sau khi trồng, các đốt thân ngầm bắt đầu mọc rễ phụ và mầm. Để Bạc hà ra rễ và nãy
mầm tốt cần chú ý đến độ ẩm, nếu đất thiếu ẩm (độ ẩm 40 – 50%) rễ không phát triển
và sau đó không kích thích được mầm phát triển. Vì vậy xác định thời vụ trồng và vấn
đề quan trọng, giúp Bạc Hà mới trồng có đủ độ ẩm để phát triển.
1.1.6.2. Thời kỳ phân cành
Sự phân cành diễn ra theo trình tự sau: tại đốt gốc thân chính, đuôi lá có mầm mọc

lên và dần lên ngọn. Các cành gần ngọn ra muộn và có độ dài càng ngắn dần. Do đó
cây có dạng hình nón.
Thời gian này tốc độ sinh trưởng và khối lượng chất xanh của cây tăng mạnh. Đây là
thời kỳ quyết định năng suất của Bạc hà. Cần chú ý cung cấp đầy đủ dinh dưỡng, ánh
sáng, nước để cây phát triển hết mức về thân, cành, lá tạo năng suất cao.
1.1.6.3. Thời kỳ làm nụ
Kéo dài 10 – 15 ngày, tốc độ ra lá của cây ở giai đoạn này chậm lại rồi dừng hẳn.
Tuy nhiên cây vẫn tiếp tục tăng nhanh về kích thước của thân lá và trọng lượng cũng
như tỷ lệ tinh dầu.
Giai đoạn này yêu cầu về đạm của cây giảm nhưng lại cần nhiều lân. Thời điểm này
khối lượng chất xanh và tích lũy tinh dầu của cây tiếp tục tăng lên do đó các điều kiện
ngoại cảnh nhất là độ ẩm, ánh sáng cây cần là cao nhất trong các thời kỳ.
1.1.6.4. Thời kỳ hoa nở
Hoa Bạc hà nở kiểu vô hạn. Hoa cành chính nở trước, sau đó theo thứ tự cành nào ra
trước thì nở trước, hoa nở từ gốc lên ngọn. Đây là thời kỳ Bạc hà đạt khối lượng chất
xanh và tinh dầu cao nhất (280kg hữu cơ/ ha/ ngày).

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

11


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Khi hoa nở 50% là lúc hàm lượng tinh dầu đạt cao nhất, Bạc hà ngừng sinh trưởng.
Đây là thời điểm thu hoạch. Nếu thu hoạch muộn (100% hoa đã nở), lá đã rụng nhiều
thì làm giảm năng suất và hàm lượng tinh dầu.
1.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng
Bạc hà là cây phân bố, thích nghi rộng. Có năng suất cao từ vùng mây mù ẩm
ướt của nước anh đến vùng cận nhiệt đới nhiều ánh sáng như ở bungari, grime và
karasnoda (Liên Xô cũ). Nói chung Bạc hà là cây dễ thuần hóa, thích nghi với điều

kiện khác nhau.
Các điều kiện sinh thái cụ thể cho cây Bạc hà là:
1.1.7.1. Nhiệt độ
-

Thời kỳ mọc mầm: Nhiệt độ để mầm mọc từ thân ngầm bắt đầu là 3oC, đến giai đoạn
cây non mẫn cảm với nhiệt độ thấp và sẽ chết rét nếu nhiệt độ giảm xuống -6oC. Nhiệt
độ từ 0 đến -3oC thân mầm bắt đầu ngủ nghỉ.

-

Cây làm nụ, nở hoa ở 28 – 30oC.

-

Cây Bạc hà sinh trưởng bắt đầu ở nhiệt độ trung bình là 10oC trong khoảng 10 – 15
ngày. Cây thích hợp ở 18 – 25oC. Nhiệt độ ảnh hưởng đến thời gian sinh trưởng của
cây, biến động từ 80 – 200 ngày.
+ Nếu nhiệt độ trung bình ngày là 18 – 19 oC thì cây cần 80 – 90 ngày sinh trưởng.
+ Nếu nhiệt độ thấp hơn 15 – 16 oC thì thời gian sinh trưởng kéo dài 90 – 100 ngày.
Nếu nhiệt độ thấp hơn nữa tức là thời gian sinh trưởng dài hơn, cây sẽ gặp mùa thu
ngày ngắn nên không thể ra hoa dẫn đến chất lượng, hàm lượng tinh dầu giảm.

-

Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phân bố của các giống Bạc hà. Ví dụ Bạc hà Âu đen và
trắng có yêu cầu về chế độ nhiệt khác nhau (chủng Bạc hà trắng đòi hỏi nhiệt độ cao
hơn chủng Bạc hà đen). Do vậy khả năng phân bố của Bạc hà tùy vào từng loại là khác
nhau.

-

Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ tinh dầu và hàm lượng mentol trong tinh dầu.
Nếu nhiệt độ cao từ 28 – 30oC sẽ làm tăng tỷ lệ tinh dầu và hàm lượng mentol trong
tinh dầu. Tuy nhiên, nhiệt độ cao trên 30oC và gió nhiều sẽ làm giảm tỷ lệ tinh dầu do
quá trình biến thành nhựa bay hơi của tinh dầu, đồng thời giảm chất lượng tinh dầu,
giảm hàm lượng Menthola. Ngoài ra sự thay đổi đột ngột chế độ nhiệt làm cây mẫn
cảm hơn với bệnh gỉ sắt.

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

12


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.1.7.2. Độ ẩm
Độ ẩm trong đất thích hợp nhất là 80%. Cây có bộ rễ ăn nông và kém phát triển. Sức
hút và giữ nước kém, mẫn cảm với hạn hán. Nếu hạn liên tục cây sẽ bị chết. Ngược lại
nếu độ ẩm cao trong suốt thời kỳ sinh trưởng thì năng xuất chất xanh đạt cực đại
nhưng hàm lượng tinh dầu lại giảm. Do đó, trước thu hoạch 7 – 10 ngày giảm độ ẩm
đất xuống dưới 50% có tác dụng làm giảm chất xanh, tăng tỷ lệ tinh dầu.
Thời kỳ từ mọc đến phân cành cây Bạc hà rất cần nước. Do đó cần bảo đảm độ ẩm
cho cây trong giai đoạn này. Khi có độ ẩm cao cần bón phân đầy đủ mới đạt hiệu quả
kinh tế (độ ẩm cao không làm giảm chất lượng tinh dầu).
Thời kỳ khủng hoảng về độ ẩm xuất hiện khi cây bắt đầu ra nụ đến hết thời gian sinh
trưởng.
Ảnh hưởng của độ ẩm không khí tương tự như độ ẩm đất.
1.1.7.3. Ánh sáng
Bạc hà là cây dài ngày, ưa ánh sáng và phát triển tốt ở độ chiếu sáng hoàn toàn. Tuy
nhiên nó cũng thích ứng với các cấp độ ánh sáng.

Để phát triển bình thường cây yêu cầu ánh sáng ban ngày lớn hơn 12 giờ. Thời gian
chiếu sáng ảnh hưởng đến thời gian sinh trưởng của cây. Thời gian chiếu sáng càng dài
thì thời gian sinh trưởng càng rút ngắn lại và ngược lại.
Trong điều kiện ngày dài (14 – 16 giờ chiếu sáng) cây chuyển từ sinh trưởng sinh
dưỡng sang sinh trưởng sinh thực và nở hoa sớm.
Trong điều kiện thời gian chiếu sáng 8 – 10 giờ trong ngày làm cây không thể
chuyển giai đoạn được. Cành gốc chuyển thành thân ngầm, năng xuất chất xanh giảm,
tỷ lệ thân ngầm tăng.
Những nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh sáng đến quá trình sinh trưởng phát triển
của cây cho biết nếu giảm thời gian chiếu sáng xuống 10 giờ và giảm cường độ chiếu
sáng, đều dẫn đến cây sinh trưởng phát triển không bình thường, năng xuất chất xanh
giảm rõ rệt. Ngày đủ dài, nhiệt độ cao, trời râm sẽ làm tăng kích thước của lá dẫn đến
tỷ lệ tinh dầu tăng nhưng tỷ lệ giữa lá và chất xanh giảm do có hiện tượng rụng lá.
Thời gian chiếu sáng giảm quá nhiều khiến 50% số lá bị rụng trước khi nở hoa.

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

13


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Khi trồng Bạc hà cần lưu ý chế độ ánh sáng hợp lý cho cây. Mật độ vừa phải, không
nên trồng xen cây cạnh tranh ánh sáng để đạt được năng xuất chất xanh và tinh dầu
cao.
1.1.7.4. Dinh dưỡng
Cây Bạc hà cần khối lượng lớn các chất dinh dưỡng ở dạng dễ tiêu bởi bộ phận thứ
sinh tăng nhanh trong thời gian sinh trưởng tương đối ngắn và bộ rễ phân bố nông.
Vai trò của các nguyên tố dinh dưỡng:
-

Nitrogen (N): các kết quả nghiên cứu cho thấy N có tác dụng lớn nhất là tăng khối
lượng chất xanh, trên cơ sở ấy làm tăng năng xuất tinh dầu. Mặt khác bón N sẽ kéo dài
thêm thời gian sinh trưởng làm tăng chiều cao cây, tăng số cành và số lá do đó tăng
năng xuất chất xanh. Dạng đạm ammonium nitrate làm cây phát triển tốt hơn đạm ở
dạng nitrate.

-

Lân (P): giúp cây sinh trưởng tốt, hệ thống rễ phát triển, tăng khả năng phân cành, xúc
tiến quá trình làm nụ, nở hoa. Tiến hành quá trình trao đổi chất và năng lượng, xúc tiến
các hoạt động sinh lý đặc biệt là quang hợp và hô hấp là cơ sở cho việc tăng năng xuất,
chất lượng tinh dầu và mentol.

-

Potossium (K): có vai trò sinh lý cực kỳ quan trọng. Nó làm tăng hoạt động sống diễn
ra trong tế bào, điều chỉnh quá trình trao đổi nước, đồng hóa CO2, tăng khả năng chống
chịu của cây, điều chỉnh các chất hữu cơ tích lũy về các cơ quan làm tăng năng suất
chất xanh. Tuy nhiên hiệu quả của K kém hơn của N và P. Sự có mặt của nguyên tố K
làm giảm đáng kể tỷ lệ tinh dầu. Vì K có trong cây bạc hà đã thúc đẩy quá trình oxy
hóa khử, giảm lượng tích trử tinh dầu. Do đó phải lưu ý bón cân đối NPK, tránh bón
thừa K đặc biệt ở giai đoạn cuối.
Nhu cầu dinh dưỡng của Bạc hà qua từng thời kỳ sinh trưởng là không giống nhau.
Khi mới mọc cây chứa N và K nhiều nhất, P ít nhất. trong thời kỳ cuối N và K đều
giảm mặc dù trong các thời kỳ này khối lượng hai chất đó cây hấp thụ tăng lên, khối
lượng chất xanh cũng tăng nhiều hơn. Vì thế yêu cầu về dinh dưỡng cho cây Bạc hà
trong suốt quá trình sinh trưởng hầu như không đổi.
Ngoài ra nguyên tố vi lượng cũng rất quan trọng với cây Bạc hà. Nó hoạt hóa hệ
thống enzyme, thay đổi đặc tính lý hóa và tính chống chịu của cây.

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

14


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.1.7.5. Đất
Bạc hà ưa đất tơi xốp, thoát nước, thành phần cơ giới nhẹ, giàu mùn. Thích hợp nhất
là đất phù sa ven sông, đất đen, đất than bùn, đất có tầng canh tác dày.
Nếu trồng trên đất không có cấu tượng, đất sét, đất cát thì hàm lượng tinh dầu thấp
và chất lượng kém, nghèo mentola và các este.
Bạc hà sinh trưởng tốt ở pH = 5 – 7. Chủng Bạc hà đen sống ở pH = 5. Chủng Bạc hà
trắng yêu cầu pH = 7.
Chú ý làm đất kỹ, bón phân đầy đủ, nhất là đạm lân và tưới tiêu hợp lý.
1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cây Bạc hà trên thế giới và ở Việt Nam
1.2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cây Bạc hà trên thế giới
Cây Bạc hà được con người biết đến và sử dụng từ rất lâu đời. Bạc hà được xem
là thảo dược xưa nhất thế giới, với những bằng chứng khảo cổ cho thấy nó đã được sử
dụng làm thuốc khoảng 10.000 năm về trước. Người La Mã, Do Thái, Ai Cập, Trung
Quốc, Nhật Bản là những dân tộc đầu tiên biết sử dụng cây Bạc hà.
Bạc hà có nguồn gốc từ tây châu Âu và Xibia. Từ nước Anh qua vùng Bắc Âu
đến vùng thấp của châu Âu thuộc Liên Xô (cũ). Nước Anh trồng Bạc hà từ năm 1840,
tuy nhiên hiện nay cây Bạc hà trồng ở Anh với diện tích không đáng kể.
Ở Mỹ, người ta trồng Bạc hà tập trung ở bang Washington, Oregon và
Wisconsin. Tinh dầu Bạc hà sản xuất tại Mỹ là một trong những loại tốt nhất thế giới.
Nhật Bản trồng Bạc hà cuối thế kỷ 19. Sản xuất Bạc hà của Nhật chỉ tập trung ở
Khondo. Sang thế kỷ 20, việc trồng Bạc hà lan mạnh sang các vùng mới (Uzen, Xinao,
Amato, Hirosima,…) sự phát triển mạnh mẽ cây Bạc hà trong thời kỳ này đã đưa Nhật
Bản lên vị trí hàng đầu thế giới về sản xuất tinh dầu. Năm 1914, 50% tinh dầu Bạc hà
của thế giới được sản xuất ra tại Nhật Bản và vùng sản xuất hiện nay là đảo Hokaido.

Tinh dầu Bạc hà của Nhật Bản mặc dù giàu Menthola, nhưng chất lượng không cao, có
mùi hắc, vị đắng, vì vậy thường dùng để lấy Menthola. Trung Quốc trồng Bạc hà tập
trung ở một số tỉnh phía nam.
Khoảng 50 năm trở lại đây, nhu cầu tinh dầu trên thế giới bị ảnh hưởng bởi rất
nhiều yếu tố. Nhu cầu về nguyên liệu cho gia vị và nước hoa tăng lên một cách tự
nhiên theo đà tăng của dân số thế giới, đặc biệt là nguyên liệu tạo hương vị thực phẩm.
Ở đây còn phải kể đến sự thay đổi thị hiếu ở phương tây. Vấn đề an toàn thực phẩm

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

15


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
(không chứa chất gây hại trước mắt và lâu dài) đã làm cho người tiêu dùng có xu
hướng sử dụng những thực phẩm có nguồn gốc thiên nhiên. Trong thời gian này thói
quen về ăn uống cũng đã thay đổi. Một mặt, sự giao lưu quốc tế gia tăng dẫn đến hiện
tượng sử dụng nhiều thức ăn nước ngoài, sử dụng ngày càng nhiều rau thơm và gia vị.
Mặt khác, ngày càng có nhiều loại thức ăn nhanh hoặc thực phẩm chuẩn bị sẵn được
ướp với tinh dầu.
Ở một số nước, sự khuyến khích trồng cây tinh dầu được coi là chính sách kinh
tế của chính phủ. Ở Pháp, sự phát triển trong việc trồng cây tinh dầu được kết hợp chặt
chẽ trong những nhóm trang trại. Kết quả là trong 20 năm gần đây, người ta đã tích lũy
được nhiều thông tin mới về nền nông nghiệp trên cây tinh dầu ở vùng khí hậu ôn đới.
1.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ Bạc hà ở Việt Nam
Bạc hà Á ở Việt Nam có 2 nguồn gốc:
 Bạc hà bản địa:
Mọc hoang ở các tỉnh Sơn La, Lào Cai, Lai Châu. Cây có thể cao đến 1,50m. Thân
màu xanh, xanh lục hoặc tím. Loại này được đưa về đồng bằng trồng cho năng suất
cây xanh cao, nhưng hiệu suất tinh dầu và hàm lượng methol trong tinh dầu thấp nên

không có giá trị kinh tế. Ngoài ra, còn phát hiện các chủng mọc hoang khác ở một số
vùng khác nhau, phổ biến nhất là chủng giàu piperiton oxyd và pulegon.
Hiện nay ở vùng Nghĩa Trai (Hưng Yên) có trồng một loại Bạc hà hoa màu trắng
hồng, mọc vòng quanh kẽ lá. Thành phần menthol trong tinh dầu loài Bạc hà này rất
thấp (3,6 - 8,2%), trong khi đó tỷ lệ pulegon lại khá cao (33,0 – 56,5%). Loại này được
bán trong vùng để sử dụng làm thuốc.
 Bạc hà di thực có nhiều chủng loại:
Bạc hà 974, Bạc hà 976, Bạc hà Ðài Loan. Một số giống đang nghiên cứu TN - 8
và TN – 26, Bạc hà Nhật.
Giống Bạc hà 974 được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng Bắc bộ và các tỉnh phía
Nam. Những năm cuối thập kỷ 70, Bạc hà được phát triển nhiều nhất. Hiện nay giống
Bạc hà của Nhật đang được trồng nhiều ở các tỉnh thuộc đồng bằng Bắc bộ và một số
tỉnh ở Trung bộ. Trên thế giới, Bạc hà Á được trồng nhiều ở Trung Quốc, Ấn Ðộ,
Paraguay, Triều Tiên.

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

16


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Ở Việt Nam, từ năm 2004, giống Bạc hà SK33 đã thay thế giống VN 74 - 76.
Trồng tập trung ở Hưng Yên, Hà Nam, Thái Bình, Hải Phòng...
Hiện tại mặc dù số lượng cây có tinh dầu phong phú nhưng Việt Nam chỉ mới sử
dụng và tìm hiểu được một số cây có khả năng khai thác được như: Hồi, Sả, Màng
tang, Húng quế, Bạc hà, Cam, Chanh.
Các hoạt động sản xuất tinh dầu ở nước ta còn rời rạc, lẻ tẻ chủ yếu là khai thác
thô, chưng cất thủ công, trình độ kỹ thuật còn thấp, các xí nghiệp còn trong tình trạng
khó khăn chưa giải quyết tốt mối quan hệ giữa sản xuất và thu mua, giữa nhà sản xuất
và người sử dụng. Trong thời gian qua Việt Nam tràn ngập hương liệu nhập từ nước

ngoài chủ yếu là hương liệu tổng hợp.
Dù còn gặp nhiều vấn đề khó khăn nhưng vẫn có các ngành cơ sở tham gia
nghiên cứu và ứng dụng những tiến bộ khoa học vào sản xuất như trung tâm nghiên
cứu các hợp chất tự nhiên (Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh), viện công
nghệ thực phẩm, bộ y tế và ngành dược.
Tuy nhiên những kết quả này chưa đáp ứng được các yêu cầu trong nước.
1.3. Nhân giống Bạc hà Mentha arvensis L.
1. 3.1. Phương pháp nhân giống Bạc hà truyền thống
1. 3.1.1. Nhân giống bằng thân ngầm hoặc thân cây trên mặt đất
Là cách thường được sử dụng nhất, có thể để nguyên hoặc cắt khúc khoảng 8 –
10cm. Trồng theo luống cao nơi gần nguồn nước. Thường xuyên bón phân, tưới nước
và làm cỏ.
1.3.1.2. Nhân giống bằng hạt
Ít được sử dụng hơn vì ít khi thấy được hạt của cây Bạc hà vì hạt rất nhỏ. Khả năng
nảy mầm thấp, thời gian thu hoạch kéo dài dẫn đến hiệu quả kinh tế kém.
1.3.2. Nhân giống cây Bạc hà bằng phương pháp nuôi cấy mô
Là phương pháp duy nhất hiện nay được sử dụng trong các trung tâm cung cấp
giống cây phục vụ trong thí nghiệm. Các cây Bạc hà con được sản xuất hoàn toàn
giống nhau từ một cây bố mẹ quý mới được lai tạo và được xem là những giống có giá
trị về mặt tinh dầu. So với phương pháp tách chiết thông thường tốc độ phát triển chỉ
vài cây một năm và không sạch bệnh, phương pháp nhân giống thông qua nuôi cấy mô
sẽ sản xuất một lượng lớn cây con sạch bệnh, giữ được giống có năng suất tinh dầu

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

17


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
cao, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nghiên cứu mà trong đó nguồn mẫu phải

tuyệt đối sạch bệnh, chủ động về nguồn giống.
1.4. Một số phương pháp tách chiết Bạc hà
Để chiết xuất tinh dầu thì người ta thường dựa trên 4 phương pháp: Cơ học, tẩm trích,
hấp thụ và chưng cất hơi nước.
Nhưng dù có tiến hành theo bất cứ phương pháp nào, quy trình sản xuất đều có
những điểm chung sau đây:
- Tinh dầu thu được phải có mùi thơm như nguyên liệu.
- Qui trình khai thác phải phù hợp với nguyên liệu.
- Tinh dầu phải được lấy triệt để khỏi nguyên liệu, với chi phí thấp nhất.
Nguyên tắc ly trích của tất cả các phương pháp nói trên đều dựa vào những đặc tính
của tinh dầu:
- Dễ bay hơi.
- Lôi cuốn theo hơi nước ở nhiệt độ dưới 100oC.
- Hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ.
- Dễ bị hấp thu ngay ở thể khí.
1.4.1. Phương pháp cơ học
1.4.1.1. Vắt
Phương pháp này cổ điển, thủ công, hiệu suất tinh dầu thu được kém, nhưng có
mùi vị tự nhiên vì không có tác dụng của nhiệt.
1.4.1.2. Nạo xát
Ưu khuyết điểm của phương pháp này tương tự phương pháp vắt, nhưng nó có thể
được cơ khí hóa.
1.4.1.3. Ép
Để chiết tinh dầu từ một số vỏ quả (cam, chanh, bưởi,…) người ta thường dùng
phương pháp ép quả tươi.
Nguyên liệu được cắt nhỏ cho vào dụng cụ ép tay hoặc ép máy. Dịch thu được
sau khi ép thưởng vẩn đục và dần dần trong trở lại. Phần bã còn lại đem cất để tận thu
tinh dầu có chất lượng kém hơn.
Tinh dầu thu được ở phương pháp ép có mùi thơm dễ chịu hơn phương pháp cất
kéo hơi nước, song nhược điểm của phương pháp này là tinh dầu không được chiết

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

18


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
kiệt, thường bị vẩn đục vì còn lẫn các chất nhày, các mô và tạp chất khác, do đó
thường phải tinh chế lại.
1.4.2. Phương pháp tẩm trích
1.4.2.1. Phương pháp tẩm trích bằng dung môi dễ bay hơi
Phương pháp này có nhiều ưu điểm vì tiến hành ở nhiệt độ phòng nên thành phần
hóa học của tinh dầu ít bị thay đổi.
Phương pháp này không những được áp dụng để ly trích cô kết từ hoa mà còn
dùng để tận trích khi các phương pháp khác không ly trích hết hoặc dùng để ly trích
các loại nhựa dầu gia vị.
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên hiện tượng thẩm thấu, khuếch tán và
hòa tan của tinh dầu có trong các mô cây vào các dung môi hữu cơ.
Yếu tố quan trọng nhất cho sự thành công của phương pháp này là phẩm chất và
đặc tính của dung môi sử dụng. Do đó, dung môi dùng trong tẩm trích cần phải đạt
được những yêu cầu sau:
-

Hòa tan hoàn toàn và nhanh chóng các cấu phần có mùi thơm trong nguyên
liệu.

-

Hòa tan kém các hợp chất khác như sáp, nhựa dầu có trong nguyên liệu.

-

Không có tác dụng hóa học với tinh dầu.

-

Không biến chất khi sử dụng lại nhiều lần.

-

Hoàn toàn tinh khiết, không có mùi lạ, không độc, không ăn mòn thiết bị,
không tạo thành hỗn hợp nổ với không khí và có độ nhớt kém.

-

Nhiệt độ sôi thấp vì khi chưng cất dung dịch ly trích để thu hồi dung môi, nhiệt
độ sôi cao sẽ ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu.

Ngoài ra cũng cần có thêm những yếu tố phụ như giá thấp, dễ tìm, …
thường thì không có dung môi nào thỏa mãn tất cả những điều kiện trên. Người ta sử
dụng cả dung môi không tan trong nước như: diethyl ether, ether dầu hỏa, hexan,
chloroform, benzen,… lẫn dung môi tan trong nước như: ethanol, aceton, methanol,…
trong một số trường hợp cụ thể, người ta dùng một hỗn hợp dung môi.
1.4.2.2. Phương pháp tẩm trích bằng dung môi không bay hơi
Trước khi phương pháp tẩm trích tinh dầu bằng dung môi dễ bay hơi ra đời, đây
là phương pháp xưa nhất để ly trích tinh dầu từ các loài hoa mà phương pháp ướp

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

19

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
nguội không đạt được hiệu quả. Phương pháp này phù hợp với các loài hoa mà khi hái
rời khỏi cây không tiếp tục tạo thêm tinh dầu.
Phương pháp này dựa vào tính chất tinh dầu có thể hòa tan trong chất béo động
vật, thực vật. Ngày xưa, người ta đã dùng mỡ động vật (heo, bò, cừu,…) hoặc dầu thực
vật (olive, hạnh nhân,…) làm dung môi ly trích tinh dầu. Đầu tiên, ngâm hoa tươi vào
trong dung môi đang đun chảy lỏng trong một khoảng thời gian nhất định, tùy theo các
loại hoa, làm nhiều lần cho đến khi dung môi bão hòa tinh dầu. Dầu hoặc mỡ bão hòa
tinh dầu này được gọi là “sáp hoa” có thể sử dụng thẳng trong kỹ nghệ mỹ phẩm hoặc
ly trích lại với ethanol để điều chế “tinh dầu tuyệt đối”.
Ưu điểm của phương pháp là tinh dầu chứa ít tạp chất, hiệu xuất ly trích cao. Tuy
nhiên các chất béo thường rất khó bảo quản, dễ bị oxy hóa nên ảnh hưởng đến mùi của
tinh dầu. Phương pháp này còn thủ công, giá thành cao nên hiện nay rất ít được áp
dụng.
1.4.3. Phương pháp hấp thụ
1.4.3.1. Phương pháp ướp
Có một số hoa (nhài, Tuberose) sau khi đã hái còn tiếp tục tạo ra tinh dầu một
thời gian nữa nhưng tinh dầu các hoa đó rất dễ bay hơi nên không thể chờ cho quá
trình tạo tinh dầu hoàn thành mới lấy. Còn nếu cất ngay bằng hơi nước hay nếu trích ly
ngay bằng các phương pháp khác thì cánh hoa bị chết, không tiếp tục tạo ra tinh dầu
nữa. Để trích ly người ta dùng chất nào hấp thu ngay tinh dầu sẵn có và hấp phụ dần
tinh dầu được tạo ra. Chất ấy là mỡ động vật (có thành phần phù hợp theo kinh
nghiệm). Mỡ thực vật không dùng được vì nó gồm các hợp chất không no dễ bị hỏng.
Mỡ khoáng vật hấp phụ kém, lại để mùi trong tinh dầu. Người ta đặt những cánh hoa
dưới những lớp mỡ và để một thời gian 24 giờ cho hoa tiếp tục tạo tinh dầu và mỡ hấp
phụ hết tinh dầu đó. Sau 24 giờ người ta thay các cánh hoa mới và phải thu hơi mỡ có
hấp phụ tinh dầu dính vào các cánh hoa thải ra, cứ thế nhiều ngày (hơn 1 – 2 tháng) để
mỡ tích tụ được nhiều tinh dầu Mỡ lấy ra có thể dùng ngay trong công nghệ mỹ phẩm

hoặc có thể dùng rượu để hòa tan tinh dầu và tiếp tục xử lý thêm. Phương pháp này tốt,
nó giữ được nguyên mùi của tinh dầu nhưng phức tạp và đắt tiền, nên chỉ dùng cho các
hoa cho tinh dầu có giá trị cao (như hoa hồng, các hoa tiếp tục tạo tinh dầu sau khi
hái).

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

20


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.4.3.2. Phương pháp hấp thụ động học
Khi thổi không khí vào giữa các lớp hoa, tinh dầu trong hoa sẽ bốc hơi bay theo
không khí. Nếu không khí này được dẫn ngang qua một cột chứa than hoạt tính thì hơi
tinh dầu sẽ bị than hấp thụ. Thường xác hoa sau đó được tẩm trích tiếp tục bằng dung
môi hữu cơ để lấy thêm những cấu phần khó bay hơi. Hiện nay đây là phương pháp
tương đối hoàn thiện, cho hiệu suất cao, thành phẩm có độ tinh khiết cao, tuy nhiên có
nhiều công đoạn phức tạp, nhiều thông số phải tính đến trong quá trình sản xuất.
1.4.4. Phương pháp chưng cất hơi nước
Phương pháp chưng cất hơi nước dựa trên sự khuếch tán, thẩm thấu, hòa tan và
lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô
khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao.
1.4.4.1. Phương pháp chưng cất bằng nước
Cho nước phủ kín nguyên liệu, nhưng phải chừa một khoảng không gian tương
đối lớn phía bên trên lớp nước để tránh khi nước sôi mạnh làm văng chất nạp qua hệ
thống hoàn lưu. Nhiệt cung cấp có thể đun trực tiếp bằng củi lửa hoặc đun bằng hơi
nước dẫn từ nồi hơi vào (sử dụng bình có hai lớp đáy). Trong trường hợp chất nạp quá
mịn lắng chặt xuống đáy nồi gây hiện tượng cháy khét nguyên liệu ở mặt tiếp xúc với
đáy nồi, lúc đó nồi phải trang bị những cánh khuấy trộn đều bên trong suốt thời gian
chưng cất.

Sự chưng cất này thường không thích hợp với những tinh dầu dễ bị thủy giải.
Những nguyên liệu xốp và rời rạc rất thích hợp cho phương pháp này. Những cấu phần
có nhiệt độ sôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi trong khối lượng lớn nước phủ
đầy, khiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những hợp chất này. Vì thế người ta chỉ
dùng phương pháp này khi không thể sử dụng các phương pháp khác.
1.4.4.2. Phương pháp chưng cất bằng nước và hơi nước
Nguyên liệu được xếp trên một vỉ đục lỗ và nồi cất được đổ nước sao cho nước
không chạm đến vỉ. Nhiệt cung cấp có thể là ngọn lửa đốt trực tiếp hoặc dùng hơi
nước từ nồi hơi dẫn vào lớp bao chung quanh phần đáy nồi. Ta có thể coi phương pháp
này là một trường hợp điển hình của phương pháp chưng cất bằng hơi nước với hơi
nước ở áp suất thường. Như vậy chất ngưng tụ sẽ chứa ít sản phẩm phân hủy hơn
trường hợp chưng cất bằng hơi nước trực tiếp, nhất là ở áp suất cao hay hơi nước quá

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

21


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
nhiệt.
Việc chuẩn bị nguyên liệu trong trường hợp này quan trọng hơn nhiều so với
phương pháp trước, vì hơi nước tiếp xúc với chất nạp chỉ bằng cách xuyên qua nó nên
phải sắp xếp thế nào cho chất nạp tiếp xúc tối đa với hơi nước thì mới có kết quả tốt.
Muốn vậy thì chất nạp nên có kích thước đồng đều không sai biệt nhau quá.
Nếu chất nạp được nghiền quá mịn, nó dễ tụ lại vón cục và chỉ cho hơi nước đi
qua một vài khe nhỏ do hơi nước tự phá xuyên lên. Như vậy phần lớn chất nạp sẽ
không được tiếp xúc với hơi nước. Ngoài ra, luồng hơi nước đầu tiên mang tinh dầu có
thể bị ngưng tụ và tinh dầu rơi ngược lại vào lớp nước nóng bên dưới gây hư hỏng thất
thoát. Do đó việc chuẩn bị chất nạp cần được quan tâm nghiêm túc và đòi hỏi kinh
nghiệm tạo kích thước chất nạp cho từng loại nguyên liệu.

Tốc độ chưng cất trong trường hợp này không quan trọng như trong trường hợp
chưng cất bằng hơi nước. Tuy nhiên tốc độ nhanh sẽ có lợi vì ngăn được tình trạng quá
ướt của chất nạp và gia tăng vận tốc chưng cất. Về sản lượng tinh dầu mỗi giờ, người
ta thấy nó khá hơn phương pháp chưng cất bằng nước nhưng vẫn còn kém hơn phương
pháp chưng cất bằng hơi nước.
So với phương pháp chưng cất bằng nước, ưu điểm của nó là ít tạo ra sản phẩm
phân hủy. Do đó dù với thiết bị loại nào đi nữa thì ta phải đảm bảo là chỉ có phần đáy
nồi được phép đốt nóng và giữ cho phần vỉ chứa chất nạp không tiếp xúc với nước sôi.
Phương pháp này cũng tốn ít nhiên liệu, tuy nhiên nó không thể áp dụng cho những
nguyên liệu dễ bị vón cục.
Khuyết điểm chính của phương pháp là do thực hiện ở áp suất thường nên
những cấu phần có nhiệt độ sôi cao sẽ đòi hỏi một lượng rất lớn hơi nước để hóa hơi
hoàn toàn và như thế sẽ tốn rất nhiều thời gian. Về kỹ thuật, khi xong một lần chưng
cất, nước ở bên dưới vỉ phải được thay thế để tránh cho mẻ sản phẩm sau có mùi lạ.
1.4.4.3. Phương pháp chưng cất bằng hơi nước
Hơi nước tạo ra từ nồi hơi thường có áp suất cao hơn không khí được đưa thẳng
vào bình chưng cất. Trong kỹ nghệ ngày nay, phương pháp này thường dùng để chưng
cất tinh dầu từ các nguyên liệu thực vật.
Điểm ưu việt của phương pháp này là người ta có thể điều chỉnh áp suất, nhiệt độ
như mong muốn để tận thu sản phẩm, nhưng phải giữ nhiệt độ ở mức giới hạn để tinh

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

22


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
dầu không bị phân hủy.
Việc sử dụng phương pháp này cũng lệ thuộc vào những điều kiện hạn chế như
đã trình bày đối với hai phương pháp chưng cất trên cộng thêm 2 yếu tố nữa là yêu cầu

hơi nước không quá nóng và quá ẩm. Nếu quá nóng nó có thể phân hủy những cấu
phần có nhiệt độ sôi thấp, hoặc làm chất nạp khô quăn khiến hiện tượng thẩm thấu
không xảy ra. Do đó trong thực hành nếu dòng chảy của tinh dầu ngưng lại sớm quá,
người ta phải chưng cất tiếp bằng hơi nước bão hòa trong một thời gian cho đến khi sự
khuếch tán hơi nước được tái lập lại, khi đó mới tiếp tục dùng lại hơi nước quá nhiệt.
Còn trong trường hợp hơi nước quá ẩm sẽ đưa đến hiện tượng ngưng tụ, phần chất nạp
phía dưới sẽ bị ướt. Trong trường hợp này người ta phải tháo nước ra bằng một van xả
dưới đáy nồi. Trong công nghiệp, hơi nước trước khi vào bình chưng cất phải đi ngang
qua bộ phận tách nước.
Với hơi nước có áp suất cao thường gây ra sự phân hủy quan trọng nên tốt nhất
là bắt đầu chưng cất với hơi nước ở áp suất thấp và cao dần cho đến khi kết thúc.
Không có một quy tắc chung nào cho mọi loại nguyên liệu vì mỗi chất nạp đòi hỏi một
kinh nghiệm và yêu cầu khác nhau.
Hiệu suất và chất lượng tinh dầu phụ thuộc vào đặc tính cả tinh dầu và cách chọn
phương pháp chưng cất. Thông thường các loại tinh dầu có tỷ trọng lớn hơn nước, khi
chưng cất hơi nước trong thiết bị áp suất cao cho hiệu suất ly trích cao trong thời gian
chưng cất ngắn.
1.5. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.5.1. Khái niệm
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức
nuôi cấy các bộ phận thực vật, bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật không bị nhiễm vi
sinh vật, được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp trong ống nghiệm có chứa
môi trường xác định ở điều kiện vô trùng. Môi trường có các chất dinh dưỡng thích
hợp như muối khoáng, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và đường.
Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và
cấy chuyền để nhân giống. Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan
(sự phát sinh cơ quan) từ các mô như: lá, thân, hoa hoặc rễ.

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

23


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.5.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều
mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó.
Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể
hoàn chỉnh đó là tính toàn năng của tế bào. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt
nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến
nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật
hoàn chỉnh.
Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất
cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn
đầu, tế bào hợp tử liên tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh mang chức
năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được
biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác
nhau. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào khác
nhau.
Quá trình phân hóa tế bào có biểu thị tuy nhiên khi tế bào đã phân hóa thành
các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của
mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng lại có thể về dạng tế
bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược
lại với sự phân hóa tế bào. Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá
trình tuyệt hóa, ức chế các gene. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá
thể, có một số gen hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn
một số gen khác lai bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo chương trình đã được
mã hóa cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát
triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác tế bào nằm trong khối mô của cơ

thể luôn bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm
kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kết quả của quá
trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến
cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát triển hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy

SVTH: Nguyễn Thị Thìn

24