sắc ký trao đổi ion

Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC TẾ HỒNG BÀNG
KHOA DƯỢC – BỘ MÔN HÓA PHÂN TÍCH


SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION
(Ion – exchange chromatography)
Lớp

14ĐH-DS1

LỜI NÓI ĐẦU
1


Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)

Sắc ký là một phương pháp tách quan trọng dựa trên các quá trình hấp thụ trong
điều kiện động học. Trong phương pháp sắc ký, quá trình tách được thực hiện liên
tục bằng cách cho các pha tiếp xúc với nhau nhiều lần ở trên cột, trên giấy hay
trên bản mỏng.
Pha được giữ nguyên gọi là pha tĩnh. Pha di động, tiếp xúc với pha tĩnh gọi là
pha động. Trong quá trình tiếp xúc giữa pha tĩnh và pha động, các cấu tử cần
phân tích sẽ phân bố khác nhau giữa các pha ấy phụ thuộc vào bản chất của chất
phân tích, bản chất của pha tĩnh và pha động, nhờ đó mà ta có thể tách được
từng cấu tử riêng biệt.
Ngày nay, sắc ký ion là kỹ thuật sắc ký chung nhất được áp dụng khi muốn tách
hỗn hợp thành các dạng ion riêng rẽ.
Có rất nhiều kỹ thuật sắc ký ion khác nhau; tuy nhiên sắc ký ion được phân loại

theo cơ chế phân cách điện tử như sau:
 Ion - exchange chromatography
 Ion - exclusion chromatography
 Ion - pair chromatography
 Ion - suppression chromatography
Phương pháp sắc ký ion quan trọng nhất là sắc ký trao đổi ion (ion - exchange
chromotography – IEC) vì là cơ chế chung, bao hàm cho tất cả các kỹ thuật sắc ký
ion khác, được ứng dụng rất nhiều trong cách lĩnh vực Hóa Sinh, Công Nghệ Sinh
Học, và kiểm nghiệm trong Dược học.

1. NGUYÊN TẮC
Sắc ký trao đổi ion dựa trên sự ái lực khác nhau của các ion và đầu charge trái dấu
ionic (nhựa trao đổi ion) trong pha tĩnh. Các ion và ionic sẽ hút vào nhau nhờ
lực hút tĩnh điện giữa các phân tử mang điện tích trái dấu.
Dựa theo điện tích trao đổi trên bề mặt, nhựa trao đổi ion phân loại như sau:
 Nhựa trao đổi cation:
2


Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)

 Phân tử ion âm gắn kết trên bề mặt ionit
 Cationit acid mạnh có nhóm acid sulfonic –SO3-H+
 Cantionit acid yếu có nhóm acid carboxylic –COO-H+
 Nhựa trao đổi anion:
 Phân tử ion dương gắn kết trên bề mặt ionit
 Anionit base mạnh có nhóm amin bậc 4 –N(CH3)3+OH Anionit base yếu có nhóm amin bậc 1 –NH3+OHHình 1: Nhựa trao đổi cation và anion

2. CƠ CHẾ
2.1 Cân bằng trao đổi ion

Quá trình trao đổi ion dựa trên cân bằng trao đổi giữa các ion trong dung dịch và
các ion trên bề mặt pha tĩnh. Trao đổi ion A+ và B+ giữa một dung dịch và cột Rnhư sau:
Hằng số cân bằng trao đổi ion:

A.R + B+  B.R + A+

3


Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)

Nếu nồng độ A+ trong dung dịch lớn thì cân bằng chuyển sang trái, tức là B+ bị
phản hấp phụ. Vì vậy, chất nào có Kex càng lớn sẽ bị lưu giữ mạnh trên ionit (B.R
tăng cao) và ngược lại.
Hằng số phân bố:

Ví dụ:

Hình 2: Cationit axit mạnh –SO3-H+ gắn kết với cation K+
Cationit axit mạnh có nhóm –SO3-H+ phản ứng với cation K+ theo phương trình
phản ứng sau:
Resin –SO3-H+ + K+  Resin –SO3-K+ + H+

Tương tự, khi trao đổi ion C- và D- và cột sắc ký E+
C.E + D-  D.E + CKex chính là ái lực hấp thu của ionit với chất phân tích phụ thuộc vào điện tích

4


Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)

của ion, kích thước hydrat hóa của nó và các tính chất khác. Mặt khác KD còn
phụ thuộc nồng độ H+ theo tỷ lệ ngược.
2.2 Pha động trong sắc ký trao đổi ion
Trong phản ứng trên E là chất rửa giải hay pha động, X là nhóm trao đổi ion trên
pha tĩnh. Quá trình rửa giải - hoàn nguyên tái sinh ionit theo cơ chế cạnh tranh vị
trí hấp thu vào pha tĩnh, vai trò phóng thích những ion đang gắn trong cột. Khi
tăng nồng độ ion của pha động, các ion này sẽ thay thế ion chất ban đầu, gắn vào
pha tĩnh, ion ban đầu sẽ ra ngoài cột theo trình tự độ lớn về điện tích.
Hình 3: Ion Cl- gắn kết trên pha tĩnh của anionit – NH3+ và cạnh tranh liên kết với RCO2-

Có 4 căn cứ để lựa chọn pha động như sau: Kiểu phát hiện chất phân tích; Độ
phức tạp của mẫu phân tích; Loại chất phân tích và Loại cột được sử dụng.
Thông thường, pha động là các dung dịch đệm có pH xác định, để tách các ion
kim loại người ta còn thêm các chất tạo phức, mục đích cuối cùng là để cạnh
tranh liên kết của ion với cột R, tách ion ra khỏi cột và thu được ion cần thiết.
Với hỗn hợp chất ban đầu có nhiều hợp chất khác nhau, có nhiều hợp chất mang
điện tích.
2.3 Trình tự giai đoạn sắc ký trao đổi ion
Hình 4: Giai đoạn trong quá trình trao đổi ion

5


Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)

-

Giai đoạn 1: Nhựa trao đổi ion cân bằng với các đối ion của nó. Các hợp chất

-

cần phân tích sẳn sàng đi ngang qua nhựa.
Giai đoạn 2: Nhựa trao đổi ion đang bị cạnh tranh gắn kết với các ion cần
phân tích, các đối ion của nhựa sẽ bị loại ra khỏi nhựa, sau giai đoạn cân bằng

-

này, việc giải ly sẽ được thực hiện.
Giai đoạn 3: Ion của dung dịch rửa giải đang cạnh tranh trao đổi với nhựa để

-

đẩy tách hợp chất  ra khỏi nhựa
Giai đoạn 4: Gia tăng nồng độ dung dịch rửa giải, để ion dung dịch rửa giải đủ

mạnh để cạnh tranh đẩy các ion  ra khỏi nhựa
- Giai đoạn 5: Tái tạo nhựa, trở lại tình trạng như ban đầu
3. CÁCH TIẾN HÀNH
- Cần xem thông tin về nhựa do nhà sản xuất cấp để tính toán lượng nhựa sử
dụng, số lượng nhựa quy ra thể tích sau khi trương nở trong dung dịch cho
-

phù hợp.
Sử dụng cột sắc ký ngắn, đường kính lớn vì nếu quá dài thì các hợp chất sau
khi ly giải sẽ bám vào gần hay xa đầu cột. ngoài ra các áp suất của cột bị sụt

-

giảm thất thường, làm cho ảnh hưởng đến quá trình tách các hợp chất.

Nhồi nhựa vào trong cột:
6


Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)

o Giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bên dưới cột.
o Nhựa trao đổi được cân bằng trong dung dịch đệm sao cho có thể rót
dễ dàng vào cột mà không xuất hiện bọt khí.
o Để yên 5-10 phút cho nhựa lắng xuống, rót đầy cột bằng dung dịch
đệm, mở khóa cho nhựa lắng xuống.
o Khi nhồi cột hoàn tất, cân bằng bằng cách cho dung dịch đệm chảy qua
-

cột, kiểm tra pH của dung dịch chảy ra khỏi cột.
Nạp mẫu chất lên đầu cột:
o Dung dịch mẫu phải được lọc trong suốt trước khi nạp vào cột
o Mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa trên đầu
cột, khóa lại.
o Dùng pipet hút và đặt dung dịch mẫu trên đầu cột, mở khóa cho dung
dịch mẫu hút vào lớp nhựa trên đầu cột. Để yên 10-20 phút cho mẫu
chất tiếp xúc cân bằng với nhựa
o Khi tất cả lượng mẫu đã được gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dung
dịch đệm ban đầu chảy qua cột, nối cột với bình cung cấp dung dịch
điện ly.

7


Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)

-

Hình 5: Các bước tiến hành của sắc ký trao đổi ion
Tái sinh ionit: Loại bỏ những tạp chất và hoạt chất còn dính trong nhựa bằng
cách rửa nhiều lần bằng nước muối đậm đặc và tăng dần nồng độ cho đến
2M/lít. Các hoạt chất tạp bẩn khác có thể rửa với NaOH 0,1M và sau đó rửa
nhựa với nước cất và dung dịch nước muối cho đến khi dung dịch qua lọc hết

tính base.
4. ỨNG DỤNG TRONG NGÀNH DƯỢC
8


Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)

Hình 6: Sơ đồ chung của một hệ thống sắc ký ion
Ứng dụng
Phương pháp trao đổi ion được dùng nhiều trong khử độ cứng của nước do các
muối hòa tan dưới dạng ion Ca2+ và Mg2+, tinh chế các chất thử hóa học, tinh chế
các chất không điện ly ra khỏi hỗn hợp điện ly, tách chiết protein, tách hợp chất ra
khỏi hỗn hợp…

Biphosphonate Drug
Thuốc điều trị về các bệnh về xương như: hypercalceamia, osteoporosis(loãng
xương), Paget’s disease.
Ứng dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion kết hợp UV để định tính các hợp chất
của Biphosphonate.

9

Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)

Hình 7: Cấu trúc tổng quát của
-

-

Biphosphonate
Cột nhựa trao đổi anion: IC – Pak HR, PAX 100…
Điều kiện tiến hành:
o Dung môi ở pH = 2-3: HNO3 (2-10mM) + 0-20% acetonitrite, acid
succinic, acid citric
o Dung dịch tái sinh ionit: NaOH pH = 9.5
Kết quả :

Hình 8: Dẫn xuất khác nhau của Biphosphonate cho kết quả SIM khác nhau.

10


Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)

Hình 9: Đồ thị biểu diễn của Etidronate sau khi đã được tách bởi sắc ký
Mỗi dẫn xuất của Biphosphonate khi ra khỏi cột cho một thông số thời gian khác
nhau, dễ dàng định tính các hợp chất riêng rẽ để đạt hiệu quả mong muốn.

-

Tách chiết protein
Protein với điện tích trái dấu sẽ gắn vào giá thể trong khi các protein khác bị
rửa trôi khỏi cột. Sau khi rửa trôi các hợp chất, protein gắn với giá thể sẽ được

-

chiết xuất bằng lực ion cao (muối nồng độ cao) hoặc thay đổi pH.
Protein tích điện dương nếu pH < pI khi đó nó sẽ gắn với cột cationit (tích điện

-

âm)
Protein tích điện âm nếu pH > pI khi đó nó sẽ gắn với cột anionit (tích điện

-

dương)
Trên cùng 1 protein, có những vùng tích điện khác nhau so với điện tích tổng
thể.

11


Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)

Hình 10: Tách chiết protein bằng sắc ký trao đổi ion
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Lokesh Bhattacharyya, Ion Chromatography in Pharmaceutical Drug Characterization,
Dionex IC Users Meeting Providence, October 16, 2011
2.www.chromacademy.com/lms/sco111/theory_of_hplc_ion-chromatography.pdf

3.Leo Jinyuan Wang, Marcus Miller, and William Schnute, Quantitative Determination
of Bisphosphonate Pharmaceuticals and Excipients by Capillary Ion Chromatography
Mass Spectrometry, Thermo Fisher Scientiic, Sunnyvale, CA, USA

12


Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography)

13