Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị một số bệnh gan chuyển hóa di truyền ở trẻ em

BỘ Y TẾ
---------------------------

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU GHÉP TẾ BÀO GAN PHÔI THAI
NGƯỜI ĐỂ ĐIỀU TRỊ MỘT SỐ BỆNH GAN CHUYỂN
HÓA DI TRUYỀN Ở TRẺ EM

CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: GS.TS.NGUYỄN THANH LIÊM

8729

Hà Nội - 2010


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU..................................................................................................

3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................

5

1.1.

Tế bào gốc...................................................................................

5

1.1.1.

Định nghĩa...................................................................................

5

1.1.2.

Phân loại.....................................................................................

5

1.1.3.

Tiềm năng ứng dụng....................................................................

6

1.2.

Tế bào gan phôi thai người.......................................................

8

1.2.1.

Định nghĩa...................................................................................

8

1.2.2.

Nguồn gốc và đặc điểm...............................................................

8

1.2.3.

Tiềm năng ứng dụng....................................................................

10

1.3.

Các nghiên cứu trong và ngoài nước ghép tế bào gan............

11

1.3.1.

Nghiên cứu ở nước ngoài............................................................

11

1.3.2.

Nghiên cứu tại Việt Nam.............................................................

12

CHƯƠNG II: ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....

13

2.1.

Đối tượng nghiên cứu........................................................

13

2.2.

Phương pháp nghiên cứu.................................................

13

2.2.1.

Phân lập tế bào gan phôi thai người.....................................

13

2.2.2

Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người.....................................

14

2.2.3.

Hóa miễn dịch huỳnh quang.................................................

14

2.2.4.

Đánh dấu tế bào gan phôi thai người invitro........................

15

2.2.5.

Ghép tế bào trên mô hình chuột thí nghiệm..........................

15

2.2.6.

Mô và tế bào học..................................................................

16

2.2.7.

Thu thập và phân tích số liệu................................................

16

2.3.

Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu....................................

16

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

17


3.1.

Xây dựng quy trình nghiên cứu........................................

17

3.1.1.

Thu thập mẫu nghiên cứu....................................................

17

3.1.2.

Quy trình xử lý và phân lập tế bào gan phôi thai người.......

17

3.1.3.

Quy trình nuôi cấy tế bào gan thai người.............................

19

3.1.4.

Quy trình phản ứng hóa miễn dịch huỳnh quang.................

20

3.1.5.

Quy trình đánh dấu tế bào gan invitro bằng HOECHST.......

21

3.1.6.

Quy trình ghép tế bào trên mô hình chuột thí nghiệm...........

22

3.1.7

Quy trình phân tích mô và tế bào học...................................

24

3.1.8.

Thu thập và phân tích số liệu................................................

24

3.2.

Kết quả phân lập tế bào gan phôi thai người..................

25

3.3.

Kết quả nuôi cấy tế bào gan phôi thai người........................

25

3.4.

Kết quả hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào.........................

27

3.5.

Kết quả đánh dấu tế bào invitro bằng HOECHST................

28

3.6.

Ghép tế bào gan vào mô hình chuột thí nghiệm...................

29

3.7.

Phân tích mô bệnh học.........................................................

32

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN................................................................

34

4.1.

Phân lập tế bào gan phôi thai người.....................................

34

4.2.

Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người.....................................

34

4.3.

Hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào......................................

35

4.4.

Kết quả đánh dấu tế bào invitro bằng HOECHST................

36

4.5.

Ghép tế bào gan trên mô hình chuột thí nghiệm..................

37

4.6.

Phân tích mô bệnh học.........................................................

39

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..........................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

41


DANH MỤC MỘT SỐ THUẬT NGỮ, VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tiếng Anh

Tiếng Việt

Viết tắt

Stem cells

Tế bào gốc

Embryonic stem cells

Tế bào gốc phôi

ES

Adult stem cells

Tế bào gốc trưởng thành

AS

Pluripotent

Tế bào gốc vạn tiềm
năng

Multipotent

Tế bào gốc đa tiềm năng

Hepatoblast

Tế bào gan phôi thai

HHF

người
Cord blood stem cells

Tế bào gốc tạo máu

Cytokeratine

CK

Fetal Bovine Serum

Huyết thanh bào thai bê

Hepatocyte

Tế bào gan

Cholangiocyte

Tế bào đường mật

Epithelial stem cells

Tế bào gốc biểu mô

ECs

Meschymal stem cells

Tế bào gốc trung mô

MCs

Institut national de la sante and de Viện nghiên cứu quốc
la recherche medicale

FBS

INSERM

gia về sức khỏe và y tế
Sinh học phân tử

1

SHPT


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TRONG ĐỀ TÀI
STT

Tên hình vẽ

Trang

Hình 1.1

Tế bào gốc

5

Hình 1.2

Phân loại tế bào gốc

6

Hình 1.3

Quá trình biệt hóa của tế bào gan phôi thai người

10

Hình 1.4

Hình ảnh xoang tĩnh mạch qua kính viển vi điện tử

11

Hình 3.1

Tế bào gan thai người ngày thứ 3 sau khi nuôi cấy

26

Hình 3.2

Tế bào gan thai người ngày thứ 4 và thứ 5 sau nuôi

27

cấy
Hình 3.3

Hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào với các marker

28

Hình 3.4

Đánh dấu tế bào gan thai người bằng HOECHST

29

Hình 3.5

Bộc lộ vùng gan và tĩnh mạch cửa và cắt gan thùy

31

phải
Hình 3.6

Ghép tế bào gan vào tĩnh mạch cửa

31

Hình 3.7

Các tế bào gan sau khi ghép mắc lại ở khoảng cửa

32

Hình 3.8

Các tế bào gan xâm nhập vào nhu mô gan chuột

32

trưởng thành
Hình 3.9

Các tế bào gan xâm nhập vào nhu mô gan chuột sơ

33

sinh
Hình 4.1

Đường đi của tế bào gan sau khi được bơm vào tĩnh
mạch cửa

2

37

MỞ ĐẦU
Tế bào gốc là một nhóm các tế bào có khả năng vô hạn trong việc tự thay
mới, và biệt hoá thành nhiều loại tế bào của các mô, cơ quan khác nhau trong
cơ thể. Vì thế, tế bào gốc được xem như một nguồn tế bào tiềm năng có thể
dùng để khôi phục và tái tạo lại những tổn thương của các mô và cơ quan. Để
đạt được mục đích này, tế bào gốc cần được biệt hoá invitro và/hoặc invivo
thành các các tế bào của các mô và cơ quan cần tái tạo. Gan là một trong
những cơ quan lớn nhất và mang nhiều chức năng nhất của cơ thể, đặc biệt là
chức năng chuyển hoá và giải độc, nên gan cũng là cơ quan rất dễ bị tổn
thương bởi nhiều nguyên nhân bẩm sinh và mắc phải dẫn đến rối loạn chuyển
hoá của gan. Đây là trạng thái bệnh lý nếu không được điều trị sẽ nhanh
chóng dẫn đến tử vong. Hiện nay ghép gan đang là phương pháp điều trị hiệu
quả duy nhất cho các tổn thương gan trầm trọng. Tuy nhiên biện pháp này gặp
rất nhiều khó khăn như kỹ thuật can thiệp phức tạp, tỷ lệ thải ghép cao và đặc
biệt là hạn chế về số lượng người cho gan. Trong bối cảnh đó, liệu pháp tế
bào sử tế bào gốc biệt hoá thành tế bào gan rồi cấy ghép để chúng tái tạo lại
gan tổn thương được xem như một hướng điều trị mới đầy triển vọng. Có
nhiều nguồn tế bào gốc đã được sử dụng để biệt hoá thành tế bào gan, tuy
nhiên, lựa chọn nguồn tế bào gốc nào để biệt hoá đã và đang là một thách
thức với các nhà nghiên cứu. Bên cạnh đó khi sử dụng các tế bào được biệt
hóa từ tế bào gốc để cấy ghép khác gen cùng loài thì tính sinh miễn dịch của
tế bào được ghép là yếu tố quan trọng quyết định phản ứng thải ghép hay
thành công của cuộc ghép.
Trong bối cảnh đó, tế bào gan phôi thai người xuất hiện như một ý tưởng mới
trong lĩnh vực ghép tế bào gốc, và trở thành một nguồn cho hứa hẹn với nhiều
ưu thế về hình thái, độ biệt hóa và tính sinh miễn dịch.

3

Xuất phát từ thực tiễn này, đề tài " Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai
người để điều trị một số bệnh gan chuyển hóa di truyền ở trẻ em", được tiến
hành với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng quy trình nghiên cứu
2. Phân lập và nuôi cấy invitro tế bào gan phôi thai người
3. Xác định tế bào gốc định hướng dòng gan người bằng phản ứng miễn
dịch tế bào
4. Tiến hành thử nghiệm ghép tế bào gan phôi thai người trên chuột nhắt
trắng.

4


CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tế bào gốc:
1.1.1. Định nghĩa:
Tế bào gốc (stem cells) là một nhóm các tế bào có khả năng vô hạn trong việc
tự làm mới, và biệt hoá thành nhiều loại tế bào của các mô, tổ chức khác nhau
trong cơ thể [1]. Tế bào gốc có mặt trong tất cả các giai đoạn phát triển của cơ
thể, từ giai đoạn phôi, thai, có trong máu dây rốn, có trong nhiều loại mô và
cơ quan khác nhau của cơ thể đã trưởng thành, nơi các tế bào này được duy trì
dưới dạng chưa biệt hoá trong suốt cuộc đời của cơ thể đó [2].

Hình 1.1. Tế bào gốc
(Nguồn từ 2001 Teresese Windown Lydia Kibluk)
1.1.2. Phân loại:
Có nhiều cách phân loại tế bào gốc. Dựa vào nguồn gốc, tế bào gốc được chia

làm hai nhóm chính : tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells) và tế bào gốc
trưởng thành (Adult stem cells). Tế bào gốc phôi là những tế bào đầu tiên của
giai đoạn phôi hình thành từ 5-7 ngày tuổi sau khi thụ tinh. Đây là những tế
bào gốc vạn tiềm năng (Totipotent), có khả năng biệt hoá thành tất cả hoặc
hầu hết các loại tế bào khác nhau của cơ thể [3]. Tế bào gốc trưởng thành là

5


những tê bào trong nhiều loại mô và cơ quan của cơ thể từ sau khi được sinh
ra đến lúc trưởng thành. Đây là những tế bào gốc vạn tiềm năng hoặc đa tiềm
năng (Multipotent), có khả năng biệt hoá thành một số loại tế bào khác nhau
của cơ thể, như tế bào gốc tạo máu trong tuỷ xương [4]. Ngoài ra, còn có
những tế bào gốc phân lập từ các mô và tổ chức của giai đoạn thai. Những tế
bào này có thể là tế bào gốc vạn tiềm năng hoặc tế bào gốc đa tiềm năng, như
tế bào gốc của gan thai nhi (Hepatoblast), tế bào gốc máu dây rốn (Cord
Blood Stem cells) [5].

Hình 1.2. Phân loại tế bào gốc
(Nguồn từ />
1.1.3. Tiềm năng ứng dụng:
Tế bào gốc hiện nay được xem như một nguồn tế bào tiềm năng có thể được
sử dụng trong việc khôi phục và tái tạo lại những tổn thương của các mô và
cơ quan trong một số bệnh lý mạn tính và nan y. Với mục đích này, tế bào gốc
được sử dụng để biệt hoá invitro và invivo thành các các tế bào của các mô và
cơ quan đặc hiệu.
Các nghiên cứu về tế bào gốc hiện nay tập trung chủ yếu vào việc tìm hiểu và

6

làm rõ vai trò của tế bào gốc, đặc biệt xây dựng các mô hình biệt hoá tế bào
gốc invitro và invivo thành các loại tế bào khác nhau của cơ thể như: tế bào
da, xương, máu, gan, tuỵ…
Trong bối cảnh đó, các nghiên cứu biệt hoá tế bào gốc thành tế bào gan là một
trong những hướng nghiên cứu mới đang được quan tâm và mang nhiều triển
vọng. Gan là một trong những cơ quan lớn nhất và mang nhiều chức năng
nhất của cơ thể, đặc biệt là chức năng chuyển hoá. Có rất nhiều bệnh lý bẩm
sinh và mắc phải gây nên tình trạng suy tế bào gan, rối loạn chuyển hoá của
gan, nếu không được điều trị sẽ nhanh chóng dẫn đến tử vong.
Những phương pháp điều trị như cắt bỏ gan đến nay đã không còn được áp
dụng vì như vậy chỉ còn lại rất ít các tế bào có khả năng đảm nhiệm các chức
năng bình thường của gan. Ghép gan hiện này là phương pháp điều trị hiệu
quả duy nhất cho các tổn thương gan trầm trọng. Theo một nghiên cứu về
thực trạng ghép gan của Mỹ năm 2003, trong năm 1997 có khoảng 500 trường
hợp được tiến hành ghép gan, đến năm 2002 con số này chỉ dừng lại ở khoảng
550 trường hợp. Trong khi đó, số trường hợp trong danh sách chờ ghép gan
tăng nhanh từ khoảng 400 năm 1997 lên 700 năm 2002, và số trường hợp
đăng ký ghép gan mới tăng từ khoảng 1200 đến 1700 trường hợp. Do vậy với
số lượng người cho gan ngày càng hạn chế, kỹ thuật can thiệp phức tạp, tỷ lệ
thải ghép cao, nên các phương pháp điều trị khác vẫn cần được tiếp tục
nghiên cứu. Trong bối cảnh đó, liệu pháp tế bào sử tế bào gốc biệt hoá thành
tế bào gan (hepatocytes like cells) được xem như một hướng điều trị mới đầy
triển vọng.
Có nhiều nguồn tế bào gốc được sử dụng để biệt hoá thành tế bào gan
(hepatocyte-like cell), tuy nhiên, lựa chọn nguồn tế bào gốc nào để biệt hoá đã
và đang là một thách thức với các nhà nghiên cứu. Tế bào gốc phôi (ES) lần
đầu tiên được phân lập là từ phôi thai chuột [6]. Tế bào gốc phôi mặc dù
mang nhiều đặc điểm ưu việt nhất của tế bào gốc, nhưng nghiên cứu sử dụng

7


tế bào gốc phôi hiện nay đang gặp phải nhiều trở ngại về vấn đề đạo đức.
Các nghiên cứu về tế bào gốc hiện nay chủ yếu sử dụng nguồn tế bào gốc từ
thai hoặc nguồn tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cell). Đầu tiên, là các
nghiên cứu tập trung vào việc sử dụng nguồn tế bào gốc từ tuỷ xương (BM)
để sửa chữa các tổn thương gan invivo. Petersen và CS. [7] đã chỉ ra rằng việc
cấy ghép tuỷ của chuột đực vào gan của chuột cái bị chiếu xạ liều gây chết, và
gan bị gây tổn thương bằng 2-acetylaminofluorene và CCl4, thì có thể cứu con
chuột cái này khỏi việc bị diệt tuỷ bởi tia xạ và đồng thời có một số lượng nhỏ
của các tế bào gốc gan có nguồn gốc từ tuỷ xương được tạo thành. Sau đó, có
rất nhiều nghiên cứu đã được thực hiện đã khẳng định vai trò của những tế
bào này trong việc sửa chữa vùng gan bị tổn thường từ các tế bào gốc có
nguồn gốc từ tuỷ xương [8],[9],[10].
Các nghiên cứu về tế bào gốc trong nước hiện nay chủ yếu tập trung vào
hướng tìm kiếm các nguồn tế bào gốc khác nhau trong mục đích sử dụng
chúng để biệt hoá thành các loại tế bào như: máu, da, xương, sụn. Có một số
nghiên cứu sử dụng tế bào gốc tạo máu trong điều trị cho các bệnh nhân mắc
bệnh máu.
1.2. Tế bào gan phôi thai người:
1.2.1. Định nghĩa:
Gan phôi thai người ở giai đoạn 8-13 tuần tuổi được cấu tạo bởi các tế bào
nhu mô gan phôi thai (hepatoblast). Đây là những tế bào gốc đa tiềm năng
(bipotential stem cells), có khả năng biệt hóa thành hai dòng tế bào riêng biệt:
tế bào gan và tế bào đường mật.
1.2.2. Nguồn gốc và đặc điểm:
Trong quá trình phát triển phôi thai của động vật có vú, gan được hình thành
từ mầm của lá thai trong (tuần thứ 3 của thai kỳ ở người), cùng với sự ra đời
một phần của tụy, phổi và tuyến giáp. Những tế bào tại vùng này tự nhân lên,

phát triển, hình thành một phần chính là nguồn gốc của gan, bao gồm các tế

8


bào gan phôi thai. Sau đó, những tế bào này sẽ biệt hóa thành tế bào gan và tế
bào đường mật.
Tế bào gan phôi thai sử dụng cho mục đích nghiên cứu được phân lập từ gan
thai nhi trong khoảng từ 8 đến 13 tuần tuổi của những người mẹ tự nguyện
đình chỉ thai nghén. Đây là những tế bào có kích thước nhỏ ~15µm. Các
marker bề mặt của loại tế bào này là các marker của tế bào gan như:
Albumine, Alpha -1-antitrypsine, và các marker của tế bào đường mật như:
Cytokeratine 7 và 19. Ngoài ra các tế bào này còn thể hiện một loại marker
đặc hiệu của các tế bào biểu mô là E-Cadherine.
Xét về khả năng ứng dụng trong ghép tế bào để điều trị một số bệnh gan, tế
bào gan phôi thai người có nhiều ưu điểm hơn so với tế bào gan trưởng thành
[12]:
- Tế bào gan phôi thai có kích thước nhỏ hơn (15µm) so với tế bào
trưởng thành (30µm), điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc các tế
bào sau khi ghép di chuyển qua các xoang tĩnh mạch vào nhu mô gan
dễ dàng hơn.
- Tế bào gan phôi thai có khả năng tăng sinh rất lớn ngay cả khi đã được
đưa vào nhu mô gan. Điều này có thể mang lại một lợi thế lớn trong
ứng dụng điều trị, vì chỉ cần đưa một lượng tế bào nhỏ hơn mà có thể
thu được hiệu quả lớn hơn so với tế bào gan trưởng thành.
- Tế bào gan phôi thai có tinh miễn dịch thấp hơn tế bào gan trưởng
thành do đặc tính của tế bào non, chưa biệt hóa hoàn chỉnh.

9

Hình 1.3. Quá trình biệt hóa của tế bào gan phôi thai người
Ttheo IMSERM 00-20, Paris 2006)
1.2.3. Tiềm năng ứng dụng :
Một số năm gần đây, các thử nghiệm ghép tế bào gan trưởng thành vào điều
trị cho các bệnh nhân mắc suy gan cấp hoặc mạn tính, hay một số bệnh gan
chuyển hóa di truyền đã được thực hiện ở một số nước như Pháp và Mỹ [13].
Trong một số trường hợp, khi các tế bào gan chưa bị thay đổi về cấu trúc, và
gan chưa có thay đổi về mặt giải phẫu, chỉ có chức năng của tế bào gan bị tổn
thương, thì liệu pháp ghép tế bào trở thành một liệu pháp có nhiều ưu thế
- Ghép tế bào gan giúp giữ được vị trí cấu trúc của mạch máu và đường
mật trong gan của người nhận, chỉ thay thế những tế bào bị tổn thương
bằng những tế bào khỏe mạnh của người cho.
- Bệnh nhân không phải chịu một cuộc phẫu thuật nặng nề, nhiều nguy
cơ
- Những tế bào gan của một người cho duy nhất, có thể cho một vài
người nhận nếu có cùng một điều kiện hòa hợp về miễn dịch, có thể
giải quyết được cơ bản vấn đề thiếu tạng ghép.
- Chi phí cho một cuộc ghép tế bào gan thấp hơn 10% so với một cuộc

10


phẫu thuật ghép gan.

1µm
(b)

(a)

Hình 1.3. Hình ảnh xoang tĩnh mạch qua kính viển vi điện tử (a). Sơ đồ
khoảng cửa trong gan (b). (Nguồn từ www.liverfoundation.org)
1.3. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về ghép tế bào gan
1.3.1. Nghiên cứu nước ngoài:
Các thực nghiệm về ghép té bào gan trên mô hình động vật thí nghiêm (chuột,
thỏ, linh trường) được gây mắc một số bệnh lý về gan đã được thực hiện từ
những năm 1970 [14]. Các thí nghiệm này đã chỉ ra rằng việc cấy ghép các tế
bào gan trưởng thành cùng loài hoặc tự thân sau khi các tế bào gan bệnh được
lấy ra khỏi cơ thể, sửa chữa gen bên ngoài cơ thể và đưa trở lại cơ thể sống,
đã cải thiện phần nào những rối loại chuyển hóa ở các cơ thể mang bệnh này.
Tuy nhiên, hiệu quả rõ rệt của những cải thiện này vẫn còn chưa thực sự đầy
đủ và thuyết phục.
Các thử nghiệm lâm sàng về ghép tế bào gan được thực hiện từ năm 1995.
Công bố năm 2004 của nhóm bác sỹ người Pháp là thành công của ghép tế
bào gan trên một bệnh nhi 10 tuổi mắc hội chứng Crigler-Najjar (suy giảm
bilirubin-uridine diphosphoglucuronate glucuronosyltransferase) [15]. Tế bào
gan được truyền vào cơ thể bệnh nhân qua đường tĩnh mạch cửa. Bệnh nhi
tỉnh táo suốt quá trình truyền tế bào và xuất viện sau đó 20 giờ. Sau ghép,
nồng độ bilirubin trong máu từ 400-460µmol/l đã giảm xuống còn 180240µmol/l, và giữ ở mức độ này trong vòng hơn 1 năm. Nồng độ UGT1A1

11


hoạt hóa tăng từ 0.4% lên 5.5% so với nồng độ bình thường. Kết quả đáng
chú ý này đã chỉ ra rằng những thuận lợi về mặt lý thuyết của ghép tế bào gan
có thể ứng dụng thành công trên người.
Tuy nhiên trên thực tế, vẫn còn nhiềiu trở ngại trong lĩnh vực này. Mặc dù kết
quả ghép tế bào trên bệnh nhân Crigler-Najjar, nhưng trên một số bệnh nhân
khác có xuất hiện các dấu hiệu phức tạp về tim mạch và hô hấp, cũng như các
vấn đề khó khăn trong việc kiểm soát tình trạng suy giảm miễn dịch.

Hơn nữa, nếu ghép tế bào gan trở thành một liệu pháp hiệu quả và rộng rãi
cho các bệnh nhân có tổn thương gan mạn tính thì việc dự trữ tế bào gan cho
nhu cầu này cần phải được thúc đẩy. Do đó, hoặc phải sử dụng ngay phần gan
sau khi lấy ở người cho, phân lập xử lý và sử dụng ngay cho người nhận, hoặc
phải phân lập thành tế bào để bảo quản, dự trữ, vận chuyển. Điều này đặt ra
những thách thức cho các labo nghiên cứu bảo quản tế bào, để đảm bảo khả
năng nhân lên và phát triển của chúng trong giới hạn cho phép sử dụng lại cho
lâm sàng.
1.3.2. Nghiên cứu trong nước:
Hiện tại chưa có tài liệu nghiên cứu hay báo cáo của tác giả nào về phân lập,
nuôi cấy tế bào gan phôi thai người cho mục đích điều trị bệnh tại Việt Nam.

12


CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu:
- 62 mẫu thai trong khoảng 9-13 tuần tuổi của những sản phụ tự nguyện
đình chỉ thai nghén tại Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội.
- 15 mẫu thai khoảng 9-13 tuần tuổi của những sản phụ tự nguyện đình
chỉ thai nghén tại Bệnh Viện Kremlin Bicetre, Paris.
- Tế bào gan phôi thai người phân lập từ thai nhi 8-13 tuần tuổi thu thập
- Môi trường với yếu tố tăng trưởng cho tế bào tế bào HHF: DMEMHAM'S F12 Williams E (Sigma)
- Các hóa chất và sinh phẩm dùng để định danh các tế bào sau khi phân
lập bằng phân tích các protein bằng các kỹ thuật miễn dịch huỳnh
quang và flow cytometry
- Động vật : 10 chuột nhắt trắng trưởng thành và 7 chuột sơ sinh 3-5
ngày tuổi dùng để khảo sát khả năng cấy ghép tế bào.
2.2. Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1. Phân lập tế bào gan phôi thai người:
Gan của thai nhi trong khoảng 9-13 tuần tuổi từ những người mẹ tự nguyện
đình chỉ thai nghén, được thu thập tại Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội, phục vụ
cho các nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Chương trình này đã được sự thống
nhất của lãnh đạo giữa hai bệnh viện.
Gan của thai nhi trong khoảng 9-13 tuần tuổi từ những người mẹ tự nguyện
đình chỉ thai nghén, được thu thập tại Bệnh Viện Kremlin Bicetre, Paris, phục
vụ cho các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm. Chương trình này nằm trong
khuôn khổ hợp tác giữa phòng thí nghiệm 00-20 của Bệnh Viện Kremlin
Bicetre, với Khoa Di truyền và SHPT Bệnh Viện Nhi Trung Ương.
Tổ chức thai nhi sau khi thu thập, được xử lý theo quy trình của INSERM 0020 Bệnh Viện Kremlin Bicetre, Paris. Gan của thai nhi được phân lập từ tổ

13


chức thai, rửa sạch bằng HEPES, và xử lý bằng Collagenase type 3 với nồng
độ phù hợp với tuổi thai, trong điều kiện tiêu chuẩn (370C trong 1 giờ). Sau 1
giờ, thêm dung dịch với sự có mặt của huyết thanh bào thai bê (Fetal Bovine
Serum-FBS) để kết thúc quá trình xử lý với Collagenase. Hỗn hợp tế bào sau
khi xử lý được lọc qua một màng lọc vô trùng kích thước 70µm, và được ly
tâm trong 5 phút ở 500 vòng/phút. Khối tế bào thu được được tiếp tục rửa 3
lần trong môi trường đặc biệt cho tế bào gan thai người. Cuối cùng, các tế bào
đựợc đánh giá khả năng sống bằng phản ứng nhuộm nhân với Trypan, đánh
dấu các tế bào chết trên tiêu bản Malasser.
2.2.2. Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người:
Các tế bào sau khi phân lập được nuôi cấy trong đĩa nuôi cấy tế bào (Corning
35mm) với môi trường pha chế cho tế bào gan thai người. Sau ngày đầu tiên
của quá trình nuôi cấy, môi trường nuôi cấy đầu tiên được thay thế và bổ sung
thêm một số chất nuôi dưỡng khác, trong vòng 5 ngày. Môi trường nuôi cấy
tế bào gan thai người bao gồm những thành phần sau: DMEM-HAM'S F12

Williams E (Sigma), kháng sinh Penicilline 100Ul/ml, Streptomycine
100µg/ml (Gibco), 2mM Glutamine (Invitrogen), 0.1% Fetal Bovine Serum
(Gibco), 10-8M 3-3"-triiodo-L-Thyronine (T3) (Sigma), 10-6M Hydrocortisol
(Merk), 10-8M Insuline (Sigma), 0.24% acid linoleic (Sigma), 1mg/ml apotransferin (Sigma) và 100µg/ml Vitamin C (Roche).
2.2.3. Hóa miễn dịch huỳnh quang:
Tế bào gan phôi thai người sau khi rửa 3 lần với PBS 1X (Gibco), được cố
định trong PBS-Triton 0.1% trong 5 phút tại nhiệt độ phòng, chuẩn bị cho gắn
kháng

thể

kháng

cytokeratine,

hoặc

cố

định

trong

PBS-PFA

(Paraformaldehyde 4%) chuẩn bị cho gắn một số kháng thể khác. Sau đó, tế
bào được rửa 3 lần trong PBS 1X và xử lý trong PBS-Gelatin 1% trong vòng
1 giờ để làm tăng tính thấm màng tế bào. Sau đó, tế bào được ủ với một số
loại kháng thể khác nhau: kháng thể đơn dòng của chuột kháng albumin

14


người, gắn trực tiếp với FUTC (fluorochrome) (1/100, Dako), hoặc với kháng
thể đơn dòng của thỏ kháng α1-antitrypsin người (1/100, Dako), kháng thể
đơn dòng của chuột kháng CK-19 (1/100, Dako), kháng CK-18 (1/200,
Dako), kháng CK-17 (1/100, Dako), kháng CK8/18 (1/200, Dako). Ngoài ra,
marker màng tế bào E-Cadherin cũng được phân tích bằng kháng thể đơn
dòng ở chuột kháng E-Cadherin người (1/200, Dako). Sau khi ủ với kháng
thể, tế bào được rửa 3 lần với PBS 1X để loại bỏ đi những kháng thể thừa
không được gắn trên màng tế bào. Những kháng thể này được phát hiện nhờ
việc gắn thêm một kháng thể thứ hai kháng lại kháng thể đầu tiên, gắn với
FITC (1/1500). Tiêu bản sau khi hoàn thành được phủ một lớp DAPI cho
phép nhuộm nhân tế bào thành màu xanh, và phân tích dưới kính hiển vi
huỳnh quang.
2.2.4. Đánh dấu tế bào gan phôi thai người invitro:
Để thực hiện mục tiêu theo dõi sự phát triển của tế bào gan sau khi ghép vào
cơ thể vật chủ, tế bào gan trước khi ghép cần được đánh dấu bằng chất đánh
dấu huỳnh quang. Chúng tôi sử dụng HOECHST, là một chất đánh dấu nhân
huỳnh quang cho các tế bào trong nghiên cứu.
Ủ 20x106 tế bào trong 2ml môi trường không có FBS với 10µl HOECHST
(Sigma) trong vòng 30 phút ở 370C. Thêm vào đó FBS theo tỷ lệ 1/10 để kết
thúc quá trình đánh dấu tế bào. Rửa khối tế bào 3 lần, mỗi lần đều cần chuyển
khối tế bào sang các ống đựng mới, để loại trừ lượng chất đánh dấu dư thừa
đọng lại trên thành ống đựng tế bào cũ. Những tế bào sau khi đánh dấu được
phân tích trên kính hiển vi huỳnh quang để đánh giả tỷ lệ phần trăm số tế bào
được đanh dấu trên tổng số tế bào đã có.
2.2.5. Ghép tế bào trên mô hình chuột thí nghiệm:
Kỹ thuật gây mê: Pha 0.9ml Ketamin (Imagene) và 0.2% Xylastin
(Rampoun) trong 3.8ml nước muối sinh lý. Tiêm vào khoang màng bụng của

chuột nhắt trắng trưởng thành với hàm lượng 1ml/20mg trọng lượng. Thời

15


gian tác dụng ước tính trong vòng 30 phút.
Kỹ thuật ghép tế bào:
- Chuột trưởng thành: Sau khi gây mê, chuột được cắt 40% gan ở thùy phải.
Sau đó tế bào đã được đánh dấu được tiêm vào trực tiếp vào tĩnh mạch cửa
nhờ một catheter 29G trong vòng 10 phút. Nồng độ tế bào ước tính 8x105 tế
bào trong 300µl nước muối sinh lý vô trùng,
- Chuột sơ sinh: Tế bào gan sau khi đánh dấu được tiêm trực tiếp vào lách
của chuột sơ sinh 3-5 ngày tuổi bằng một sering Halminton 10µl qua đường
dưới da, không qua gây mê. Nồng độ tế bào ước tính 4x105 tế bào trong 300µl
nước muối sinh lý vô trùng,
2.2.6. Mô và tế bào học:
Chuột sau khi được ghép được nuôi sống trong vòng 2 tuần. Sau đó toàn bộ
gan của chuột đựoc ghép được thu hoạch. Gan sau khi thu hoạch được làm
đông lạnh trong isopentan, và được giữ ở -800C.
Gan đựợc cắt lạnh 7µm, dán trên lam kính, và được phân tích dưới kính hiển
vi huỳnh quang.
2.2.7. Thu thập và phân tích số liệu:
Đếm số lượng tế bào được đanh dấu trên mỗi lam kính
Phân tích số liệu: Xác định phần trăm số tế bào cấy đựoc vào gan chuột = (số
tế bào đếm được trên tiêu bản/100/450)x100.
2.3. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu:
Nghiên cứu được tiến hành dựa trên sự hợp tác giữa Bệnh Viện Nhi TƯ và
phòng thí nghiệm 00-20, với sự đồng ý của hội đồng y đức ký kết giữa Bệnh
Viện Kremlin Bicetre và phòng thí nghiệm 00-20.
Nghiên cứu cũng nhận được sự hợp tác với Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội trong

việc cung cấp mẫu nghiên cứu từ những người mẹ tự nguyện đình chỉ thai
nghén ở tuần thai 8-13 tuần. Các thông tin sản phụ không được thu thập lưu
trữ trong nghiên cứu này.

16


CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Xây dựng quy trình nghiên cứu:
3.1.1. Thu thập mẫu nghiên cứu:
62 mẫu nghiên cứu được thu thập tại Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội cho các
nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Các sản phụ tự nguyện đình chỉ thai nghén
trong khoảng 9-13 tuần thai, sau khi làm các thủ tục đăng ký tại Bệnh Viện
Phụ Sản Hà nội, sẽ được tiến hành đình chỉ thai nghén theo quy trình của
Bệnh Viện.
Mẫu nghiên cứu được thu thập về Bệnh Viện Nhi TƯ, đựng trong chai Duran
250-500ml tùy theo số lượng mẫu được thu thập, vô trùng. Mẫu nghiên cứu
được tiến hành xử lý phân lập ngay hoặc được giữ trong nhiệt độ +40, tại ngăn
mát tủ lạnh cho đến khi được phân lập trong vòng 6h kể từ khi nhận mẫu.
15 mẫu nghiên cứu được thu thập tại Khoa Sản Bệnh Viện Kremlin Bicetre,
và tiến hành xử lý tại phòng thí nghiệm 00-20, phục vụ cho mục đích nghiên
cứu trên động vật thí nghiệm.
3.1.2. Quy trình xử lý mẫu và phân lập tế bào gan phôi thai người:
Chuẩn bị dụng cụ:
- Khu vực xử lý mẫu sạch
- Tủ an toàn sinh học bậc II
- Khay thủy tinh vô trùng
- Dao mổ, panh gắp và kéo vô trùng
- Tube Corning vô trùng 15ml x 3 chiếc, 50ml x 2 chiếc

- Máy khuấy từ có gia nhiệt
- Con khuấy từ
- Cóng Scott 100 ml vô trùng
- Màng lọc 70µm vô trùng dùng một lần
- Pipet aid, pipet thủy tinh 5ml,10ml,25ml.

17


- Máy ly tâm góc văng
Chuẩn bị hóa chất:
- PBS 1X x 1000 ml đã khử trùng
- HEPES
- Collagenase type III (PAA)
- Môi trường nuôi cấy: DMEM-HAM'S F12 Williams E (Sigma), kháng
sinh Penicilline 100Ul/ml, Streptomycine 100µg/ml (Gibco), 2mM
Glutamine (Invitrogen), 0.1% Fetal Bovine Serum (Gibco), 10-8M 3-3"triiodo-L-Thyronine (T3) (Sigma), 10-6M Hydrocortisol (Merk), 10-8M
Insuline (Sigma), 0.24% acid linoleic (Sigma), 1mg/ml apo-transferin
(Sigma) và 100µg/ml Vitamin C (Roche).
Quy trình xử lý và phân lập tế bào:
- Tổ chức thai được đặt trên khay thủy tinh, rửa qua bằng PBS 1X.
- Gan của thai nhi được phân lập từ tổ chức thai bằng mắt thường, sử
dụng panh kéo và dao cắt.
- Các mảnh gan được thu thập vào tube Corning 15ml vô trùng, đựng sẵn
dung dịch HEPES.
- Ly tâm ống 15ml 3 lần với HEPES,
- Chuẩn bị máy khuấy từ 370C, cóng Scott đựng 50ml HEPES có
Collagenase type 3, nồng độ 1-2mg/ml tùy theo tuổi thai.
- Cho các mảnh gan vào dung dịch trên, khuấy trên máy khuấy từ 370C
trong 1 giờ.

- Sau 1 giờ, thêm 50ml môi trường nuôi cấy tế bào gan để kết thúc quá
trình xử lý với Collagenase.
- Hỗn hợp tế bào sau khi xử lý được lọc qua một màng lọc vô trùng kích
thước 70µm, và được ly tâm trong 5 phút ở 500 vòng/phút.
- Khối tế bào thu được được tiếp tục rửa 3 lần trong môi trường cho tế
bào gan thai người.

18


- Cuối cùng, các tế bào đựợc đánh giá khả năng sống bằng phản ứng
nhuộm nhân với Trypan, đánh dấu các tế bào chết trên tiêu bản
Malasser.
3.1.3. Quy trình nuôi cấy tế bào gan thai người:
Chuẩn bị dụng cụ:
- Tủ an toàn sinh học bậc 2
- Đĩa nuôi cấy 35mm (Corning)
- Pipet aid, pipet thủy tinh 5ml,10ml, 25ml.
- Tủ ấm 370C CO2 5%
Chuẩn bị hóa chất:
- Môi trường cấy ngày đầu tiên: DMEM-HAM'S F12 Williams E
(Sigma)
- Môi trường cấy những ngày tiếp theo: DMEM-HAM'S F12 Williams E
(Sigma), bổ sung thêm kháng sinh Penicilline 100Ul/ml, Streptomycine
100µg/ml (Gibco), 2mM Glutamine (Invitrogen), 0.1% Fetal Bovine
Serum (Gibco), 10-8M 3-3"-triiodo-L-Thyronine (T3) (Sigma), 10-6M
Hydrocortisol (Merk), 10-8M Insuline (Sigma), 0.24% acid linoleic
(Sigma), 1mg/ml apo-transferin (Sigma) và 100µg/ml Vitamin C
(Roche).
Quy trình nuôi cấy tế bào gan thai người:

- Tế bào gan sau khi phân lập với Collagenase được đánh giá về số lượng
tế bào sống bằng phản ứng nhuộm Trypan, đánh dấu tế bào chết trên
lam kính Malasser.
- Cấy tế bào vào đĩa Corning 35mm2 với mật độ 25,000 tế bào/cm2
- Đặt vào tủ cấy 370C CO2 5%.
- 24h sau khi cấy tế bào, đánh giá lại tình trạng mọc của tế bào qua kính
hiển vi soi ngược

19


- Loại bỏ môi trường nổi của ngày đầu tiên, thay thế bằng 2.5ml môi
trường mới của ngày thứ hai bổ sung các hoạt chất như đã kể trên.
- Đưa lại vào tủ cấy 370C CO2 5% và theo dõi những ngày tiếp theo
- Thay môi trường 1 ngày/1 lần
- Nuôi tế bào trong 5 ngày, sau đó đưa vào sử dụng cho các mục đích
khác.
3.1.4. Quy trình thực hiện phản ứng hóa miễn dịch huỳnh quang:
Chuẩn bị dụng cụ:
- Tube Eppendorf 1.5ml
- Pipet man và đầu côn 20-200µl, và 200-1000µl
- Hộp kín tránh ánh sáng
- Máy lắc
- Kính hiển vi huỳnh quang
Chuẩn bị hóa chất:
- PBS 1X
- Triton 0.1%
- Paraformaldehyde 4%
- Kháng thể đơn dòng của chuột kháng albumin người, gắn trực tiếp với
FUTC (fluorochrome) (1/100, Dako), hoặc với kháng thể đơn dòng của

thỏ kháng α1-antitrypsin người (1/100, Dako), kháng thể đơn dòng của
chuột kháng CK-19 (1/100, Dako), kháng CK-18 (1/200, Dako), kháng
CK-17 (1/100, Dako), kháng CK8/18 (1/200, Dako). kháng thể đơn
dòng ở chuột kháng E-Cadherin người (1/200, Dako).
Quy trình phản ứng hóa miễn dịch huỳnh quang:
- Tế bào gan được rửa 3 lần với PBS 1X (Gibco)
- Tế bào được cố định trong PBS-Triton 0.1% trong 5 phút tại nhiệt độ
phòng, chuẩn bị cho gắn kháng thể kháng cytokeratine,
- Hoặc cố định trong PBS-PFA (Paraformaldehyde 4%) chuẩn bị cho gắn

20


một số kháng thể khác. S
- Sau khi cố định, tế bào được rửa 3 lần trong PBS 1X
- Xử lý trong PBS-Gelatin 1% trong vòng 1 giờ để làm tăng tính thấm
màng tế bào.
- Tế bào được ủ với một số loại kháng thể khác nhau: kháng thể đơn
dòng của chuột kháng albumin người, gắn trực tiếp với FUTC
(fluorochrome) (1/100, Dako), hoặc với kháng thể đơn dòng của thỏ
kháng α1-antitrypsin người (1/100, Dako), kháng thể đơn dòng của
chuột kháng CK-19 (1/100, Dako), kháng CK-18 (1/200, Dako), kháng
CK-17 (1/100, Dako), kháng CK8/18 (1/200, Dako, kháng thể đơn
dòng ở chuột kháng E-Cadherin người (1/200, Dako).
- Sau khi ủ với kháng thể, tế bào được rửa 3 lần với PBS 1X để loại bỏ đi
những kháng thể thừa không được gắn trên màng tế bào.
- Ủ với kháng thể thứ hai kháng lại kháng thể đầu tiên, gắn với FITC
(1/1500).
- Tiêu bản sau khi hoàn thành được phủ một lớp DAPI cho phép nhuộm
nhân tế bào thành màu xanh, và phân tích dưới kính hiển vi huỳnh

quang.
3.1.5. Quy trình đánh dấu tế bào gan invitro bằng HOECHST
Chuẩn bị dụng cụ:
- Tube Eppendorf 1.5ml
- Pipet man và đầu côn 20-200µl, và 200-1000µl
- Hộp kín tránh ánh sáng
- Kính hiển vi huỳnh quang
Chuẩn bị hóa chất:
- HOECHST (Bis Benzimid, Sigma)
- Fetal Bovin Serum (Gibco)
- Môi trường nuôi cấy tế bào gan: DMEM-HAM'S F12 Williams E

21


Quy trình đánh dấu tế bào bằng HOECHST invitro:
- Ủ 20x106 tế bào trong 2ml môi trường không có FBS với 10µl
HOECHST (Sigma) trong vòng 30 phút ở 370C.
- Thêm vào đó FBS theo tỷ lệ 1/10 để kết thúc quá trình đánh dấu tế
bào.
- Rửa khối tế bào 3 lần, mỗi lần đều cần chuyển khối tế bào sang các ống
đựng mới, để loại trừ lượng chất đánh dấu dư thừa đọng lại trên thành
ống đựng tế bào cũ.
- Những tế bào sau khi đánh dấu được phân tích trên kính hiển vi huỳnh
quang để đánh giả tỷ lệ phần trăm số tế bào được đanh dấu trên tổng số
tế bào đã có.
3.1.6. Quy trình ghép tế bào trên mô hình chuột thí nghiệm:
Chuẩn bị dụng cụ:
- Bơm tiêm vô trùng 1ml
- Bơm tiêm Hamilton 10µl vô trùng

- Dao mổ, kéo, panh
- Bàn cố định chuột phủ toan vô trùng
- Băng dính cố định
- Tampon vô trùng
- Gạc vô trùng
Chuẩn bị hóa chất:
- Ketamin (Imagene)
- Xylastin (Rampoun)
- Nước muối sinh lý.
- Betadine
Chuẩn bị chuột thí nghiệm:
- Chuột trưởng thành
- Chuột sơ sinh 3-5 ngày tuổi

22