Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện nhi trung ương

i

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÝ THỊ THANH HÀ

LÝ THỊ THANH HÀ

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN
TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN
NHI TRUNG ƯƠNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018


ii

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

L LÝ THỊ THANH HÀ
THANH HÀ

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN  GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN
TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN
NHI TRUNG ƯƠNG
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 9 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Trần Vân Khánh
Trường Đại học Y Hà Nội
2. GS.TS. Trương Nam Hải
Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội - 2018


i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án này tôi đã nhận được sự hỗ trợ, tạo điều kiện của rất
nhiều người đã thông cảm, sẻ chia, động viên và giúp đỡ tôi. Tôi xin được trân
trọng cảm ơn và luôn luôn ghi nhớ!
Tôi vô cùng biết ơn PGS. TS. Trần Vân Khánh, Phó giám đốc Trung tâm gen
và protein, Trường đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và góp ý tận tình cho tôi trong quá
trình thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS. Trương Nam Hải, Viện Công nghệ sinh
học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi
trong thời gian qua.
Tôi xin được cảm ơn các vị lãnh đạo Bệnh viện Nhi Trung Ương và Khoa Di
truyền và Sinh học phân tử, đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình thực hiện
nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Phòng công nghệ gen Viện nghiên cứu tế
bào gốc và công nghệ gen Vinmec đã giúp đỡ trong những chặng đường đã qua. Tôi
thực sự xúc động và tự hào bởi sự hỗ trợ nhiệt tình, sự động viên, chia sẻ của các
các đồng nghiệp tại nơi đây tôi đang công tác, đã giúp tôi hoàn thành nhiệm vụ và

nghiên cứu này!
Bố, mẹ là những người đã mang tôi đến với cuộc sống;chồng và các con của
tôi đã luôn động viên và yêu thương vô bờ bến! Tôi xin được chia sẻ thành quả này
với bố, mẹ và gia đình tôi. Họ là động lực để tôi luôn luôn cố gắng không ngừng.
Hà Nội, ngày 1 tháng 2 năm 2018
Tác giả
Lý Thị Thanh Hà


ii

sLỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 1 tháng 2 năm 2018
Tác giả

Lý T Lý Thị Thanh Hà
hị Thanh Hà


iii

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4
1.1.

Cấu trúc và các dạng phân tử Hemoglobin ................................................ 4

1.1.1. Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường ..................................................... 4
1.1.2. Các dạng phân tử hemoglobin ....................................................................... 5
1.2.

Bệnh  thalassemia ...................................................................................... 6

1.2.1. Khái niệm ............................................................................................. 6
1.2.2. Dịch tễ học bệnh  thalassemia............................................................. 6
1.2.3. Cơ chế bệnh sinh .................................................................................. 6
1.2.4. Đặc điểm lâm sàng bệnh β thalassemia ................................................. 9
1.2.5. Đặc điểm cận lâm sàng bệnh  thalassemia ........................................ 10
1.2.6. Chẩn đoán bệnh  thalassemia ............................................................ 10
1.3.

Đột biến gen  globin................................................................................. 11

1.3.1. Cấu trúc gen  globin.......................................................................... 11
1.3.2. Các dạng đột biến trên gen  globin và một vài cơ chế đột biến
trong tổng hợp chuỗi  globin ............................................................. 13
1.3.3. Tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình .............................................. 15
1.3.4. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định các đột biến gen β globin ...... 16
1.3.5. Phát hiện người lành mang gen bệnh .................................................. 22
1.4.

Chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia ............................................... 23

1.4.1. Dịch nước ối (Amniotic fluid sampling) ............................................. 24
1.4.2. Mẫu gai rau (Chorionic villus sampling - CVS) ........................................... 24
1.4.3. Chẩn đoán tiền phôi (Pre-implantation genetic diagnosis - PGD) ................ 26
1.5.

Tình hình nghiên cứu bệnh  thalassemia tại Việt Nam.......................... 26

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 28
2.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 28


iv

2.2.

Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 28

2.2.1. Nhóm bệnh nhân bị bệnh  thalassemia thể nặng ............................... 28
2.2.2. Nhóm người mang gen bệnh  thalassemia ....................................... 28
2.2.3. Nhóm làm chẩn đoán trước sinh ......................................................... 29
2.3.

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân................................................................ 29

2.4.

Trang thiết bị cần thiết .............................................................................. 29

2.4.1. Trang thiết bị ...................................................................................... 29
2.4.2. Hóa chất ............................................................................................. 29
2.5.

Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 32

2.6.

Quy trình xác định đột biến gen  globin ................................................. 32

2.6.1. Thu thập mẫu máu và tách DNA từ mẫu máu ngoại vi ....................... 32
2.6.2. Kỹ thuật tách DNA tổng số từ máu ngoại vi và tế bào ối .................... 33
2.6.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ........................................ 33
2.6.4. Kỹ thuật PCR xác định đột biến trên gen β globin .............................. 34
2.6.5. Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột biến trên gen β globin............. 36
2.6.6. Kỹ thuật Gap PCR .............................................................................. 37
2.6.7. Nuôi cấy tế bào ối ............................................................................... 37
2.7.

Vấn đề đạo đức .......................................................................................... 38

2.8.

Sơ đồ nghiên cứu ....................................................................................... 39

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 40
3.1.

Đặc điểm của nhóm nghiên cứu ................................................................ 40

3.2.

Kết quả xác định đột biến gen β globin .................................................... 40

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA...................................................................... 40
3.2.2. Kết quả xác định đột biến của bệnh nhân mắc  thalassemia thể nặng ......... 48

3.2.3. Kết quả xác định đột biến gen β globin ở người mang gen
bệnh  thalassemia. ............................................................................. 67


v

3.2.4. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia ............................... 81
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................... 88
4.1.

Vai trò của kỹ thuật Multiplex ARMS PCR, giải trình tự gen và
Gap PCR trong chẩn đoán xác định bệnh  thalassemia ........................ 88

4.1.1. Kỹ thuật Multiplex ARMS PCR ......................................................... 88
4.1.2. Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger ........................................................ 90
4.1.3. Kỹ thuật Gap PCR .............................................................................. 91
4.2.

Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến các đột biến gen  globin trên
nhân  thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương .................................. 91

4.2.1. 09 đột biến sàng lọc bằng kỹ thuật Multiplex PCR ............................. 91
4.2.2. Đặc điểm và tỷ lệ đột biến gen β globin trên bệnh nhân  thalassemia
tại bệnh viện Nhi Trung ương. ............................................................ 92
4.2.3. Một số ca không điển hình có lâm sàng đặc biệt ................................. 93
4.3.

Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến gen  globin trên người mang gen
 thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương ........................................... 97

4.4.

Chẩn đoán trước sinh bệnh  thalassemia ............................................. 100

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 103
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ................................................................................... 104
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH .................................................... 105
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 116
PHỤ LỤC


vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
PCR

Polymerase Chain Reaction, phản ứng đồng trùng hợp

C-ARMS-PCR

Combine-Amplification Refractory Mutation System-PCR,

GAP-PCR

PCR khoảng cách

RT-PCR

Reverse transcrip PCR

MLPA

Multiplex ligation dependent probe amplification

Sequencing

Giải trình tự gen

Multiplex

Phản ứng đa mồi

ASO

Allele specific oligonucleotide dot blot, lai đặc hiệu oligo

RDB

Reserve dot blot, lai ngược

RE - PCR

Restriction enzyme – PCR, phản ứng PCR sử dụng enzyme
cắt giới hạn

Hb

Hemoglobin

CO2

Carbon dioxide

CO

Carbon monoxide

NO

Nirtric oxide

O2

Oxygen



Chuỗi alpha

β

Chuỗi beta

γ

Chuỗi gamma

δ

Chuỗi delta


vii

ε

Chuỗi epsilon

ζ

Chuỗi zeta

(2β2)

Hemoglobin A

(2δ2)

Hemoglobin A2

(ζ2ε2)

Hemoglobin Gower1

(2ε2)

Hemoglobin Gower2

(ζ2γ2)

Hemoglobin Porland

(2γ2)

Hemoglobin F

HPFH

Hội chứng tồn dư huyết sắc tố bào thai di truyền

HPLC

Điện di hemogobin bằng sắc ký lỏng cao áp

/

Người mang gen  kết hợp mang gen  thalassemia

/E

Người mang gen  kết hợp mang gen HbE

RBC (1012/L)

Red Blood Cells, số lượng hồng cầu

HGB (g/dL)

Khối lượng hemoglobin (g/dL)

HCT (%)

Hematocrit (%)

MCV (fL)

Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu

MCH (pg)

Mean Corpuscular Hemoglobin, số lượng hemoglobin trung
bình hồng cầu (pg)

MCHC (%)

Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, nồng độ
hemoglobin trung bình hồng cầu (%)

cffDNA

Cell free fetal DNA, ADN tự do của thai nhi

NIPD

Non invasive Prenatal Diagnosis, chẩn đoán trước sinh
không xâm lấn


viii

PGD

Pre-implantation genetic diagnosis, chẩn đoán tiền làm tổ

IVF

In vitro fertilization, thụ tinh ống nghiệm

EQA

External Quality Assessment, tổ chức ngoại kiểm

WHO

World Health Organization, tổ chức y tế thế giới

TIF

Thalassemia International Fondation, Hiệp hội Thalassemia
quốc tế

BV Nhi TƯ

Bệnh Viện Nhi Trung Ương

DT-SHPT

Khoa Di truyền - Sinh Học Phân Tử


ix

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần globin của các Hb bình thường .......................................... 5
Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh  thalassemia ........................................... 11
Bảng 1.3. Kiểu hình, kiểu gen bệnh  thalassemia .............................................. 16
Bảng 1.4. Các kĩ thuật sinh học phân tử được áp dụng trong phát hiện đột biến
gây bệnh  thalassemia. ...................................................................... 17
Bảng 1.5. Tình hình mang gen bệnh  thalassemia tại Việt Nam......................... 26
Bảng 1.6. Tỉ lệ các loại đột biến  thalassemia ở người Việt Nam....................... 27
Bảng 2.1. Tên và trình tự mồi sử dụng trong quy trình xác định 09 đột biến
trên trên gen β globin .......................................................................... 31
Bảng 2.2. Các bước sàng lọc trên gene β globin .................................................. 34
Bảng 2.3. Bộ mồi sử dụng trong kỹ thuật giải trình tự gen β globin .................... 36
Bảng 3.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo các nhóm ..................................... 40
Bảng 3.2. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân 
thalassemia .......................................................................................... 41
Bảng 3.3. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin ở bệnh nhân 
thalassemia theo vị trí đột biến ............................................................ 42
Bảng 3. 4. Kiểu gen và kiểu hình của 214 bệnh nhân  thalassemia ..................... 43

Bảng 3.5. Tần số và tỷ lệ các đột biến của gen β globin trên đối tượng người
mang gen bệnh. ................................................................................... 69
Bảng 3.6. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết
sắc tố của bệnh nhân mã số WBbT110706 .......................................... 74
Bảng 3.7. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết
sắc tố của bệnh nhân mã số PWBbT120505M .................................... 75
Bảng 3.8. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết
sắc tố của bệnh nhân mã số WBbT150926. ......................................... 77


x

Bảng 3.9. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết
sắc tố của bệnh nhân mã số PWBbT120505F ...................................... 78
Bảng 3.10. Kết quả sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu và điện di huyết
sắc tố của 3 gia đình có kiểu gen kết hợp  và  thalassemia. ............. 80
Bảng 3.11. Kết quả số lượng và tỷ lệ thai nhi chẩn đoán trước sinh. ..................... 83
Bảng 3.12. Kết quả tần số và tỷ lệ alen đột biến trong chẩn đoán trước sinh cho
thai nhi ................................................................................................ 83
Bảng 3.13. Tần số và tỉ lệ kiểu gen đột biến xuất hiện ở 178 thai nhi .................... 84
Bảng 4.1. Các đột biến gen β globin phổ biến ở một số quần thể trên thế giới. .... 92


xi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ
Hình 1.1.

Thành phần globin của các Hb bình thường ......................................... 4

Hình 1.2.

Sơ đồ cơ chế bệnh sinh trong Thalassemia ........................................... 8

Hình 1.3.

Cấu trúc và quá trình tổng hợp chuỗi β globin .................................... 13

Hình 1.4.

Nguyên lý kĩ thuật ARMS-PCR ......................................................... 18

Hình 1.5.

Thủ thuật chọc ối trong chẩn đoán trước sinh. .................................... 24

Hình 1.6.

Thủ thuật lấy bệnh phẩm trong chẩn đoán trước sinh ......................... 25

Hình 2.1.

Quy trình xác định đột biến gen  globin ........................................... 32

Hình 2.2.

Sơ đồ mồi quy trình xác định đột biến gen β globin ........................... 37

Hình 2.3.

Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................... 39

Hình 3.1.

Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT081203
có đột biến CD41/42(-TCTT), CD17 (AAG-TAG) ............................ 45

Hình 3.2.

Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT081203 phát hiện
kiểu gen CD41/42(-TCTT) (A) và CD17 (AAG-TAG) (B) ................ 46

Hình 3.3.

Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT081203 với
đột biến dị hợp tử CD41/42(-TCTT) (A) và CD17 (AAG-TAG) (B). .... 47

Hình 3.4.

Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713
có đột biến IVS1-1 (G-T) ................................................................... 48

Hình 3.5.

Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713 phát hiện
kiểu gen IVS1-1(G-T) ........................................................................ 49

Hình 3.6.

Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713

có đột biến IVS2-654 (C-T) ............................................................... 49

Hình 3.7.

Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT140713 phát hiện
kiểu gen IVS2-654(C-T) .................................................................... 50

Hình 3.8.

Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT140713
với đột biến dị hợp tử IVS1-1 (G-T) (A) và IVS2-654 (C-T) (B)........ 51

Hình 3.9.

Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504
có đột biến -28(A-G) .......................................................................... 51


xii

Hình 3.10. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504 phát hiện
kiểu gen -28(A-G) .............................................................................. 52
Hình 3.11. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504
có đột biến CD71/72(+A) ................................................................... 53
Hình 3.12. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130504 phát hiện
kiểu gen CD71/72(+A)....................................................................... 54
Hình 3.13. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT130504 với
đột biến dị hợp tử CD71/72 (+A) ....................................................... 55
Hình 3.14. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215
có đột biến -28(A-G) .......................................................................... 55

Hình 3.15. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215 phát hiện
kiểu gen -28(A-G) .............................................................................. 56
Hình 3.16. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215
có đột biến IVS1-5 (G-C) ................................................................... 57
Hình 3.17. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT101215 phát hiện
kiểu gen IVS1-5 (G-C) ....................................................................... 57
Hình 3.18. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130310
có đột biến CD41/42(-TCTT) ............................................................. 58
Hình 3.19. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130310 phát hiện
kiểu gen CD41/42(-TCTT) ................................................................. 59
Hình 3.20. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130310
có đột biến CD95 (+A)....................................................................... 59
Hình 3.21. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT130310 phát hiện
kiểu gen CD95 (+A) ........................................................................... 60
Hình 3.22. Kết quả multiplex ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT090304
có đột biến CD41/42(-TCTT) ............................................................. 61
Hình 3.23. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT090304 phát hiện
kiểu gen CD41/42(-TCTT) ................................................................. 61


xiii

Hình 3.24. Kết quả ARMS PCR của bệnh nhân mã số WBbT090304 phát hiện
kiểu gen HbE (GAG-AAG)-CD26 ..................................................... 62
Hình 3.25. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbT090304 với
với đột biến dị hợp tử HbE (GAG-AAG)-CD26 ................................. 63
Hình 3.26. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbTS150926 với
đột biến dị hợp tử c.441-442ins AC.................................................... 64
Hình 3.27. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbTS150926 với
đột biến dị hợp tử c.-140C>T ............................................................. 64

Hình 3.28. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân mã số WBbTS150926 với
đột biến dị hợp tử c.-138C>T ............................................................. 65
Hình 3.29. Kết quả xác định đột biến gen của bệnh nhân mã số
PWBbT120505F và gia đình. ............................................................. 66
Hình 3.30. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ máu ngoại vi của các
đối tượng nghiên cứu. ........................................................................ 68
Hình 3.31. Kết quả điện di bước 1 sàng lọc 4 đột biến CD41/42(-TCTT),
CD17(AAG-TAG), IVS1-1(G-T), -28 (A-G) của cặp bố mẹ có mã
số WBbT090803 và WBbT090804 .................................................... 71
Hình 3.32. Kết quả điện di bước 2 sàng lọc 4 đột biến IVS2-654(C-T),
CD71/72(+A), IVS1-5(G-C), CD95 (+A) của cặp bố mẹ có mã số
WBbT090803 và WBbT090804 ......................................................... 72
Hình 3.33. Kết quả điện di bước 3 sàng lọc đột biến HbE (CD26) của cặp bố
mẹ có mã số WBbT090803 và WBbT090804 .................................... 72
Hình 3.34. Kết quả điện di tìm kiểu gen đột biến của người mẹ mã số
WBbT090804. Thay hình khác .......................................................... 73
Hình 3.35. Kết quả giải trình tự tìm đột biến điểm hiếm gặp của bệnh nhân mã
số WBbT110706 ................................................................................ 75
Hình 3.36. Kết quả giải trình tự tìm đột biến điểm hiếm gặp của bệnh nhân mã
số PWBbT120505M .......................................................................... 76


xiv

Hình 3. 37. Kết quả giải trình tự tìm đột biến điểm hiếm gặp của bệnh nhân mã
số WBbTS150926 .............................................................................. 77
Hình 3.38. Kết quả điện di phát hiện đột biến mất đoạn lớn ở người bố.
Hình 3.39. Kiểu gen kết hợp đột biến gen β globin và α globin của 3 gia đình
có các con vừa bị Beta thalassemia thể nặng và phù thai di Alpha
thalassemia thể nặng. ......................................................................... 81

Hình 3.40. Quy trình chẩn đoán trước sinh cho bệnh Beta thalassemia ................ 82
Hình 3.41. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình bệnh nhân sản phụ mã số
AFbT120605, Nguyễn Thị Th. ........................................................... 85
Hình 3.42. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình bệnh nhân sản phụ mã số
AFbT110705, Hà Thị V. .................................................................... 86
Hình 3.43. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình bệnh nhân sản phụ mã số
AFbT121061 Nguyễn Phương D. ....................................................... 86
Hình 3.44. Kết quả chẩn đoán trước sinh của gia đình sản phụ mã số
AFbT150302, Lò Thị Bích Th. ........................................................... 87


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Beta thalassemia (β Thalassemia) là một bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể
thường, gây thiếu máu tan máu phổ biến ở Việt Nam, gây ra bởi đột biến gen Beta
globin ( globin) nằm trên nhiễm sắc thể (NST) 11 (NC Khanh 1985). Tần suất
mang gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc Kinh là 1,49%, Mường 20,6%, Tày
11%... (Saovaros Svasti, Hieu et al. 2002). Bệnh nhân là những người mang 2 đột
biến gen  thalassemia (đồng hợp tử) hoặc  thalassemia kết hợp với HbE. Biểu
hiện lâm sàng là da xanh, niêm mạc nhợt, biến dạng xương, gan lách to, xạm da...
do hồng cầu của bệnh nhân dễ bị phá hủy và tăng tạo máu ngoài tủy (BV Viên
2001).
Việc quản lý bệnh nhân β Thalassemia bao gồm vấn đề về phòng ngừa các
trường hợp bệnh mới, điều trị các bệnh nhân Thalassemia thể nặng bằng truyền máu
thường xuyên và tầm soát, phát hiện người mang gen. Điều trị bệnh β thalassemia
chủ yếu bằng truyền máu, thải sắt suốt đời hoặc chữa trị bằng ghép tế bào gốc, liệu
pháp gen đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và phải có nguồn tế bào gốc phù hợp. Việc
này gây ra gánh nặng về kinh tế và tâm lý cho các gia đình có người nhà bị bệnh β

Thalassemia, cũng như cho toàn xã hội. Vì vậy việc phòng bệnh được xem là chiến
lược trong việc giải quyết vấn đề Thalassemia trong cộng đồng. Biện pháp phòng
ngừa bệnh β Thalassemia hữu hiệu nhất hiện nay là chẩn đoán trước sinh, nhằm
phát hiện các thai nhi bị bệnh đối với những cặp vợ chồng đã có con bị bệnh muốn
sinh con trong các lần tiếp sau hoặc những cặp vợ chồng trước hoặc sau khi kết hôn
đều đã được chẩn đoán là người mang gen bệnh. Đột biến trên gen β globin phần
lớn là đột biến điểm. Mỗi chủng tộc hoặc dân tộc khác nhau lại mang đột biến và
tần suất khác nhau. Bệnh β Thalasemia được chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm
lâm sàng và các xét nghiệm huyết học. Tuy nhiên, các xét nghiệm di truyền phân tử
xác định các đột biến trên gen β globin là điều kiện thiết yếu để thực hiện chẩn đoán
trước sinh bệnh β thalassemia.


2
Phân tích kiểu gen không chỉ giúp khẳng định chẩn đoán trong một số trường
hợp xét nghiệm thành phần Hb không điển hình mà còn giúp chẩn đoán thể bệnh
nặng và trung gian, là cơ sở để lên kế hoạch điều trị tốt hơn cho bệnh nhân. Phân
tích kiểu gen là cơ sở thiết yếu cho thực hành tư vấn tiền hôn nhân, tư vấn di truyền
cho các cặp vợ chồng là người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh β
Thalassemia, giúp giảm tỷ lệ ca bệnh mới ra cộng đồng. Đây được xem là biện pháp
phòng bệnh hiệu quả nhất và cần thiết để ngăn ngừa và giảm bớt nguy cơ sinh ra
các em bé mắc thể bệnh nặng. Phân tích kiểu đột biến gen còn giúp nghiên cứu về
kiểu đột biến gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc (Weatherall 2007).
Ở các quốc gia khác trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về tần suất đột
biến gen và nghiên cứu lâm sàng ở các dân tộc khác nhau như ở người Thái Lan,
Philippin, Malaysia, Trung Quốc, Hàn Quốc (Kazazian, Dowling et al. 1986, Park,
Lee et al. 2002, Peng, Liu et al. 2003, Tan, George et al. 2004, Viprakasit,
Tanphaichitr et al. 2004). Đã có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa kiểu gen
là kiểu hình trên bệnh nhân  thalassemia

(Galanello, Ruggeri et al. 1983,

Galanello, Barella et al. 2002, Gabbianelli, Morsilli et al. 2008, Sripichai,
Munkongdee et al. 2008, Sharma and Saxena 2009, Viprakasit, Lee-Lee et al. 2009,
Nuinoon, Makarasara et al. 2010). Thái Lan là một trong những nước làm tốt tư vấn
di truyền và chẩn đoán trước sinh với hơn 10 trung tâm (Dhamcharee, Romyanan et
al. 2001).
Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về bệnh  thalassemia nhưng chủ yếu là
các nghiên cứu về lâm sàng, tần suất bệnh thông qua xét nghiệm điện di huyết sắc
tố. Gần đây đã có một số nghiên cứu về tần suất bệnh dựa vào kỹ thuật sắc ký lỏng
cao áp (HPLC), về tần suất mang gen dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử nhưng mô
hình nghiên cứu và số lượng bệnh nhân tham gia nghiên cứu còn chưa lớn, chưa đủ
để đưa ra con số tỷ lệ đột biến đặc trưng của người Việt Nam nói chung và của
người miền Bắc nói riêng. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đột biến gen β globin và
chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương” được
thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu sau:


3
1. Phát hiện đặc điểm đột biến gen β globin trên bệnh nhân β thalassemia và
người mang đột biến dị hợp tử bằng các kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR, ARMSPCR và giải trình tự gen Sanger.
2. Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật sinh học phần
tử từ tế bào ối.


4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CẤU TRÚC VÀ CÁC DẠNG PHÂN TỬ HEMOGLOBIN
1.1.1. Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường

Thalassemia là rối loạn di truyền do bất thường trong quá trình tổng hợp
hemoglobin mà nguyên nhân là sự thay đổi tỷ lệ tổng hợp các chuỗi globin. Bình
thường 2 loại chuỗi α globin và “không α” globin cặp đôi với nhau theo tỷ lệ 1:1,
đột biến gen làm giảm hoặc ngừng sản xuất một loại chuỗi globin nhất định hoặc
một vài chuỗi (α, β, γ, δ) sẽ gây ra sự mất cân bằng giữa các chuỗi globin. Loại
chuỗi globin được tổng hợp bình thường trở nên dư thừa vì không được cặp đôi, sẽ
tích tụ trong tế bào hồng cầu và gây phá hủy hồng cầu. Thông thường người ta chia
bệnh thalassemia ra làm 2 loại, nếu giảm hoặc không tổng hợp chuỗi α globin sẽ
gây bệnh α thalassemia và rối loạn tổng hợp chuỗi β globin sẽ gây thể bệnh β
thalassemia.

Hình 1.1. Thành phần globin của các Hb bình thường

(Nguồn: />Hemoglobin (Hb), hay còn gọi là huyết sắc tố, là chất chứa trong các tế bào
hồng cầu, có nhiệm vụ vận chuyển oxy từ phế nang đến tổ chức và vận chuyển
chuyển hóa của tổ chức là H+ và CO2 đến thận và phổi để đào thải. Cấu trúc phân tử
Hb gồm hai phần: phần Globin và phần HEM. Phần Globin có bản chất protein, đặc
trưng cho từng loài. Ở người, phần globin được cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide,
giống và gắn với nhau từng đôi một. Mỗi chuỗi polypeptide gắn với 1 HEM. Vì
vậy, mỗi phân tử Hb có 2 đôi chuỗi polypeptide và 4 HEM, có khả năng vận chuyển
4 phân tử oxy.


5
1.1.2. Các dạng phân tử hemoglobin
Trong quá trình phát triển của cá thể ở người, các loại chuỗi polypeptide có
sự chuyển đổi, loại chuỗi này thay thế chuỗi kia ở từng giai đoạn của cuộc sống.
Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả Igram, Schoeden
và Brautnixer, Koemberg và Hill chia chuỗi polypeptide ra các loại sau đây: Chuỗi
alpha (α), chuỗi beta (β), chuỗi gamma (), chuỗi delta (δ), chuỗi epsilon (ε ), chuỗi

theta (ζ).
Các chuỗi (ζ) và chuỗi (ε) chỉ tồn tại ở những tuần đầu của thời kỳ bào thai,
sau đó nhanh chóng được thay thế bằng chuỗi (α), (β), (), (δ). Các chuỗi này tồn tại
suốt cuộc đời ở các mức độ khác nhau. Ở người trưởng thành gặp chủ yếu là chuỗi
(α), (β) một số ít chuỗi (δ) và rất ít chuỗi (). Các loại chuỗi (β), (), (δ) đều kết
hợp từng cặp với chuỗi (α) nên các loại chuỗi đó còn gọi chung là các chuỗi
“không α”.
Bảng 1.1. Thành phần globin của các Hb bình thường
Loại Hb

Thành phần

Thời kỳ xuất hiện

globin
HbA1

α2 β2

Bào thai 6 tuần, Hb ở người bình thường

HbA2

α2δ2

Thai nhi gần sinh, Hb ở người bình thường

HbF

α2γ2

Bào thai 5 tuần, Hb chủ yếu ở thai nhi

Hb Gower 1

ζ2ε2

Phôi thai 2-3 tuần, trong 2 tháng đầu của thai

Hb Gower 2

α2ε2

Xuất hiện và có cùng Hb Gower 1

Hb PorlDNA

ζ2γ2

Phôi thai 2 - 3 tuần đầu

Bình thường mỗi phân tử Hb có 2 cặp chuỗi polypeptide ở phần globin. Các
loại Hb khác nhau có các thành phần chuỗi polypeptide khác nhau. Gen α globin
hoạt động tương đối sớm, ngay từ cuối tháng đầu của thời kỳ bào thai và tồn tại
trong suốt quá trình phát triển của cá thể. Trong khi đó, tổ hợp gen β globin hoạt
động thay đổi theo từng giai đoạn phát triển và có sự thay thế một cách trình tự
chuỗi này bằng chuỗi khác


6

1.2. BỆNH  THALASSEMIA
1.2.1. Khái niệm
Thalassemia là nhóm bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng
bởi sự suy giảm hoặc thiếu hụt tổng hợp chuỗi α hoặc β globin trong phân tử
Hemoglobin (Cao and Galanello. 2010). Tùy theo sự thiếu hụt xảy ra ở chuỗi α hay
β globin mà được gọi là bệnh α hay β Thalassemia. Đây là một trong các bệnh di
truyền phổ biến nhất trên thế giới và là nguyên nhân gây thiếu máu, tan máu hàng
đầu ở trẻ em.
1.2.2. Dịch tễ học bệnh  thalassemia
Theo ước tính của hiệp hội Thalassemia quốc tế (TIF), thế giới hiện nay có
khoảng 1,5% dân số thế giới là người lành mang gen bệnh β Thalassemia, và có
khoảng 100.000 trẻ sơ sinh với bệnh thiếu máu β thalassemia được sinh ra mỗi
năm (Colah, Gorakshakar et al. 2010). Bệnh thiếu máu β Thalassemia xảy ra phổ
biến nhất ở các nước Địa Trung Hải, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ, Trung Á và
Đông Nam Á, tập trung chủ yếu tại châu Phi, Ấn Độ và Đông Nam Á, trong đó có
Việt Nam.
1.2.3. Cơ chế bệnh sinh
Trong hội chứng Thalassemia có một hiện tượng chung nhất là sự thiếu hụt
một loại chuỗi polypeptit của phần globin, gây ra dư thừa tương đối loại chuỗi kia
(Cousens, Gaff et al. 2010). Hiện tượng này xảy ra ở các mức độ rất khác nhau phụ
thuộc vào từng thể bệnh, song hậu quả của nó gây ra:
- Giảm tổng hợp Hb do thiếu phần globin
- Mất cân bằng giữa các chuỗi α và “không α”
Người bình thường có hai gen β globinnằm trên 2 NST tương đồng số 11
(β/β). Nếu một trong hai gen này bị đột biến (dị hợp tử β+ thalassemia hoặc β0
thalassemia), được gọi là người mang gen bệnh hay còn gọi là thể nhẹ. Nếu đột biến
xảy ra ở cả hai gen trên hai NST được gọi là thể trung gian hoặc thể nặng tùy thuộc
vào mức độ gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi β globin.
Tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả hai giới nam và nữ. Nếu bố và mẹ là mang
gen dị hợp tử với một đột biến, nguy cơ trong một lần sinh thai nhi là người lành

7
mang gen bệnh là 50%, thai nhi là người hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen
bệnh là 25%, thai nhi mắc bệnh β thalassemia thể nặng là 25%.
Hiện tượng thứ nhất: giảm tổng hợp Hb
Là hậu quả trực tiếp của việc thiếu hụt tổng hợp phần globin do thiếu một
loại chuỗi polypeptit nào đó nên làm giảm tổng hợp Hb. Biểu hiện là hồng cầu
nhược sắc và tăng sinh các hồng cầu non trong tủy. Ở các thể nhẹ, sự mất cân bằng
giữa chuỗi α và chuỗi β không nặng nề nên biểu hiện sự giảm tổng hợp Hb là không
rõ rệt.
Hiện tượng thứ hai: mất cân bằng giữa 2 loại chuỗi globin do thiếu hụt
một loại chuỗi globin nào đó.
Việc thiếu hụt một loại chuỗi globin này sẽ gây ra sự dư thừa tương đối loại
kia. Trong bệnh β Thalalassemia do thiếu hụt chuỗi β gây ra dư thừa chuỗi α globin.
Do tính chất lý hóa của các chuỗi α và “không α” khác nhau nên những rối
loạn do các chuỗi dư thừa gây ra cũng khác nhau. Các chuỗi α dư thừa tạo thành các
hạt tủa xuống màng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng cầu. Với hồng cầu ở
máu ngoại vi, những hạt tủa này làm cho màng hồng cầu mất độ mềm dẻo, hồng cầu
trở thành tế bào cứng nên khó vượt qua các “màng lọc” ở lách. Mặt khác nó cũng
làm cho màng này tăng diện tiếp xúc, dễ bị các tác nhân oxy hóa và phá hủy. Đồng
thời còn làm thay đổi tính thấm của màng hồng cầu nên kali ở bên trong tế bào thoát
ra ngoài huyết tương. Những tác hại trên của các hạt tủa làm hồng cầu bị vỡ sớm
gây nên hiện tượng tan máu. Còn ở tủy xương, các hạt tủa trên gắn lên nguyên sinh
chất và màng của các hồng cầu non, làm cho hồng cầu bị chết trước khi trưởng
thành, dẫn đến tăng sinh mạnh các hồng cầu non trong tủy, gây nên các biến dạng
xương, tăng hấp thu sắt gây ra nhiễm sắt cho cơ thể


8

Hình 1.2. Sơ đồ cơ chế bệnh sinh trong Thalassemia

(Nguồn : Dương Bá Trực. 1996).
Hiện tượng các hồng cầu non bị chết sớm không đến được giai đoạn trưởng
thành như trên gọi là hiện tượng sinh hồng cầu không hiệu quả. Đây là cơ chế chủ
yếu gây ra những biến đổi về lâm sàng và huyết học ở những bệnh nhân β
Thalassemia thể nặng.
Việc đột biến gen dẫn đến không tổng hợp hoặc giảm tổng hợp chuỗi 
globin, thay vào đó là tăng sự tổng hợp các chuỗi  và các chuỗi  để tạo ra thành
HbF (22), tăng tổng hợp các chuỗi  và các chuỗi  để taọ thành HbA2 ( 22).
Vì vậy, người mang gen bệnh hoặc người bị bệnh  thalassemia sẽ có chỉ số HbF và
HbA2 cao hơn bình thường. Nếu cả hai gen  globin đều bị đột biến dần đến mất
chức năng hoàn toàn, không sản xuất được chuỗi  globin, khi đó gọi là 0


9
thalassemia, người bệnh không có HbA1. Nếu một trong hai gen  globin bị đột
biến nhưng vẫn sản xuất chuỗi  globin khi đó gọi là + thalassemia.  thalassemia
phối hợp với HbE tạo thành thể phối hợp  thalassemia/HbE. Thể này có hồng cầu F
từ 10-80% và HbE.
1.2.4. Đặc điểm lâm sàng bệnh β thalassemia
1.2.4.1. Thể nhẹ
Người mang  Thalassemia thể nhẹ thường chỉ mang 1 đột biến gen 
Thalassemia. Biểu hiện lâm sàng: có thiếu máu nhẹ, MCV nhỏ, HbA2 tăng cao từ
3,5 đến 8,0%; HbF thường nhỏ hơn 5%. Những đối tượng này không cần điều trị,
truyền máu.
1.2.4.2. Thể trung gian
Bệnh nhân  Thalassemia thể trung gian mang 2 đột biến gen  Thalassemia.
Biểu hiện lâm sàng: thiếu máu nhẹ hơn thể nặng nên thường phát hiện bệnh sau 2

tuổi. Nhiều trường hợp không cần phải truyền máu định kỳ, chỉ truyền máu khi Hb
< 70g/L. Xét nghiệm thường có Hb >7g/dl, HbF 20 - 100%, HbA2 < 7%. Bệnh nhân
cũng có thể biểu hiện bệnh rõ như lách to, gan to, biến dạng xương mặt, chậm phát
triển nếu bệnh diễn biến lâu và không được truyền máu đủ. Người có HbE/ 
Thalassemia thường cũng biểu hiện bệnh như thể trung gian. Các trường hợp 
Thalassemia thể trung gian là thể rất ít gặp, rất dễ bỏ sót vì các chỉ số dùng cho mục
đích sàng lọc bệnh Thalassemia không đặc trưng.
1.2.4.3. Thể nặng
 Thalassemia đồng hợp tử đa số là thể nặng, bệnh thường được phát hiện
sớm dưới 2 tuổi, thiếu máu nặng rõ, đòi hỏi phải truyền máu định kỳ, thường 2 - 4
tuần/ 1 lần. Xét nghiệm Hb thường < 7g/dl, HbA2 < 4; HbF >50%. Nếu không được
điều trị hoặc điều trị không đầy đủ sẽ biểu hiện rõ trên lâm sàng: bộ mặt huyết tán
mạn tính với mũi tẹt, gò má cao, bướu trán, bướu đỉnh, gan lách to, xạm da. Ở giai
đoạn muộn còn có các biến chứng như: chậm dậy thì, đái tháo đường, loãng xương,
suy tim... Những bệnh nhân này thường có tuổi thọ nhỏ hơn 20 tuổi (Khanh.1985,
Old, Traeger-Synodinos et al. 2005, Weatherall 2005). Một số trường hợp HbE/ 
Thalassemia biểu hiện như thể nặng.