thiết kế cấu trúc crisprcas9 và sử dụng tạo đột biến gen alcohol dehydrogenase trên cà chua

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ THỊ HOA

THIẾT KẾ CẤU TRÚC CRISPR/CAS9 VÀ SỬ DỤNG
TẠO ĐỘT BIẾN GEN ALCOHOL DEHYDROGENASE
TRÊN CÀ CHUA

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60420201

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Thanh Thủy
TS. Đồng Huy Giới

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả
nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình
nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ
nguồn gốc.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận văn

Lê Thị Hoa

i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản thân, tôi còn nhận
được rất nhiều sự hướng dẫn, sự giúp đỡ tận tình của rất nhiều các cá nhân, tập thể và
các đơn vị.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới cô giáo TS. Nguyễn Thị Thanh
Thủy - Vụ Trưởng vụ Khoa học Công nghệ và thầy TS. Đồng Huy Giới – Trưởng bộ
môn Sinh học đã dành nhiều thời gian, tâm huyết, chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Roland Schaftleitner –
Trưởng bộ môn Chọn giống phân tử-AVRDC đã trao cho tôi cơ hội quý giá được học
tập và nghiên cứu tại Trung tâm Rau màu Thế giới - Đài Loan, người đã kiên nhẫn chỉ
dạy và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại Đài Loan. Tôi xin cảm ơn
các đồng nghiệp tại trung tâm rau màu thế giới đã luôn động viên ủng hộ giúp tôi hoàn
thiện luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Trung tâm Tài nguyên thực vật đã tạo cơ hội để tôi
được tiếp cận với hướng nghiên cứu và tích lũy được những kinh nghiệm, kiến thức để
có được kết quả này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo học viện Nông
nghiệp Việt Nam đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt thời gian qua.
Lời cuối, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình đã luôn ở

bên tôi, chăm sóc, động viên tôi và toàn thể bạn bè đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi.
Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và
năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được
những đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận văn

Lê Thị Hoa

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii
Mục lục ........................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ....................................................................................................... v
Danh mục bảng ................................................................................................................ vi
Danh mục hình ................................................................................................................ vii
Trích yếu luận văn ........................................................................................................... ix
Thesis abstract................................................................................................................... x
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1

1.2.

Giả thuyết khoa học ............................................................................................ 2

1.3.

Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2

1.4.

Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 3

1.5.

Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 3

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4
2.1.

Chọn giống cây trồng ......................................................................................... 4

2.1.1.

Chọn giống bằng phương pháp lai...................................................................... 4

2.1.2.

Chọn giống bằng phương pháp đột biến............................................................. 5

2.1.3.

Cây trồng chuyển gen ......................................................................................... 6

2.2.

Công nghệ chỉnh sửa hệ gen (genome-editing) .................................................. 7

2.2.1.

Công cụ Zinc finger nucleases (ZFNs) ............................................................... 7

2.2.2.

Công cụ Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) .................. 8

2.2.3.

Công cụ CRISPR/Cas9 ..................................................................................... 10

2.3.

Công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 .......................................................... 10

2.3.1.

Sự ra đời của CRISPR/Cas ............................................................................... 10

2.3.2.

Cấu trúc của hệ thống CRISPR/Cas ................................................................. 12

2.3.3.

Cơ chế hoạt động của hệ thống Crispr/cas9 ..................................................... 14

2.3.4.

Thành tựu nghiên cứu về hệ thống CRISPR/Cas9 ........................................... 15

2.4.

Gen alcohol dehydrogenase (AHD) trên cây cà chua ....................................... 16

2.5.

Tiềm năng nghiên cứu tạo đột biến cripsr cas9 trên cà chua ............................ 17
iii


Phần 3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.......................................................... 19
3.1.

Địa điểm, thời gian nghiên cứu ........................................................................ 19

3.2.

Đối tượng/vật liệu nghiên cứu .......................................................................... 19

3.3.

Nội dung và phương pháp nghiên cứu.............................................................. 19

3.3.1.

Thiết kế gRNA.................................................................................................. 19

3.3.2.

Thiết kế vector tái tổ hợp CRISPR cas9 ........................................................... 20

3.3.3.

Biến nạp vector tái tổ hợp chứa hệ thống CRISPR/Cas9 vào vi khuẩn A.
tumefaciens bằng sốc nhiệt (Van Eck, Conlin et al., 2007) ............................. 22

3.3.4.

Chuyển cấu trúc CRISPR/cas9 vào cà chua thông qua A. tumefaciens ........... 24

3.3.5.

Xác định đột biến tạo bởi cấu trúc CRISPR/cas9 ............................................. 27

Phần 4. Kết quả và thảo luận ...................................................................................... 30
4.1.

Kết quả .............................................................................................................. 30

4.1.1.

Thiết kế gRNA đặc hiệu cho 2 gen mục tiêu ADH2-4 và ADH2-6 ................. 30

4.1.2.

Thiết kế vector tái tổ hợp CRISPR/Cas9 .......................................................... 33

4.1.3.

Biến nạp vector tái tổ hợp chứa hệ thống CRISPR/Cas9 vào vi khuẩn A.
tumefaciens (GV3101::pMP90) ....................................................................... 36

4.1.4.

Kết quả chuyển cấu trúc CRISPR/Cas9 vào cà chua........................................ 38

4.1.5.

Khảo sát đột biến trên cây chuyển gen ............................................................. 41

4.2.

Thảo luận .......................................................................................................... 49

Phần 5. Kết luận và kiến nghị...................................................................................... 52
5.1.

Kết luận............................................................................................................. 52

5.2.

Kiến nghị .......................................................................................................... 52

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 53

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

CRISPR/Cas9

Clustered regularly interspaced short
palindormic repeat/Cas9

ZFN

Zinc finger nucleases

GMO

Genetically Modified Organisms

Cây chuyển gen

ODM

Oligonucleotide directed mutagenesis

Oligonucleotide gây đột biến

gRNA

guideRNA

RNA dẫn đường

ADH

Alcohol dehydrogenase

Gen alcohol dehydrogenase

TALENs

Transcription activator-like effector
nucleases

Hoạt hóa phiên mã giống
nuclease

NHEJ

Non-homology end joining

Cơ chế sửa chữa đầu cuối

không tương đồng

HDR

Homology-directed repair

Sửa chữa tương đồng trực
tiếp

DSB

Double-strand break

Phá vỡ sợi kép

EEN

Enzyme endonucleases (EENs

RNAi

RNA interference

Can thiệp RNA

PAM

Protospacer-Adjacent Motif

Dạng trình tự liền kề

tracrRNA

Trans-activating crRNA

Tiền RNA hoạt động

sgRNA

Single-guideRNA

RNA dẫn đường đơn

v

Trình tự sắp xếp kiểu lặp lại
ngắn xen lẫn khoảng trống


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các trình tự PAM ứng với mỗi biến thể enzyme Cas9 .................................. 13
Bảng 4.1. Danh sách guideRNA thiết kế cho gen ADH2-6 ........................................... 31
Bảng 4.2. gRNA và enzyme cắt giới hạn cho gen ADH2-4 và ADH2-6 ........................ 32
Bảng 4.3. Mồi thiết kế khuếch đại vùng gen đích .......................................................... 33
Bảng 4.4. Số khuẩn lạc/1 đĩa môi trường ở các nồng độ Kanamycine ........................... 35
Bảng 4.5. Kết quả chuyển cấu trúc CRISPR/Cas9 vào cà chua ..................................... 39
Bảng 4.6. Danh sách các mẫu mang đột biến của ADH2-4............................................ 43
Bảng 4.7. Danh sách các mẫu mang đột biến cấu trúc ADH2-6 ..................................... 48

vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc Zinc finger nucleases và cơ chế sửa chữa qua trung gian ............... 8
Hình 2.2. Cấu trúc của Zinc finger nucleases (ZFNs) và Transcription
activator-like effector nucleases (TALENs) .................................................. 9
Hình 2.3. a)một locus CRISPR trong nhiễm sắc thể vi khuẩn với đặc trưng
đoạn lặp-khoảng trống. b) Vi khuẩn có thể nhận biết trình tự PAM ở
bên trong virus/plasmid và hợp nhất nucleic acid ngoại lai. ........................ 11
Hình 2.4. Cấu trúc của hệ thống CRISPR/Cas9........................................................... 13
Hình 2.5. Mô tả 2 cơ chế sửa chữa mạch kép khi bị cắt bởi enzyme Cas9 ................. 14
Hình 2.6. Biểu đồ các công bố khoa học của CRISPR/Cas9 theo từng năm ............... 15
Hình 2.7. Cơ chế xúc tác của enzyme ADH................................................................. 17
Hình 3.1. Giao diện chương trình CCTop để thiết kế gRNA ...................................... 20
Hình 3.2. Sơ đồ vector pKSE401 ................................................................................. 20
Hình 3.3. Minh họa gRNA trên gen mục tiêu .............................................................. 27
Hình 4.1. Giao diện chương trình Cas9 Designer khi thiết kế gRNA. ........................ 31
Hình 4.2. Xác định gRNA đặc hiệu gen ADH2-4 ....................................................... 32
Hình 4.3. Vị trí của guideRNA và mồi PCR của gen ADH2-6 .................................... 32
Hình 4.4. Cấu trúc của vector pCAMBIA và pKSE401 .............................................. 34
Hình 4.5. Vector pKSE401 trước và sau khi biến nạp gRNA ..................................... 35
Hình 4.6. Kiểm tra vector tái tổ hợp trên môi trường chọn lọc kanamycine ở
nồng độ 25, 50 và 100 mg/l trên gel agarose 1%. a) cấu trúc ADH24. b) cấu trúc ADH2-6 ................................................................................. 36
Hình 4.7. Cấy chang vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ........................................ 37
Hình 4.8. Kết quả kiểm tra plasmid tách từ vi khuẩn A. tumefaciens sau khi
biến nạp ........................................................................................................ 37
Hình 4.9. Các chồi tái sinh có sức sống kém ............................................................... 38
Hình 4.10. Quy trình biến nạp và tái sinh 2 cấu trúc ADH2-4 và ADH2-6 ở cà
chua CLN1621 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ..................................... 40
Hình 4.11. Kiểm tra chất lượng DNA trên gel agarose1% ............................................ 41

Hình 4.12a. Minh họa hoạt động enzyme cắt giới hạn trên gen đích ............................. 42
Hình 4.13. Kiểm tra đột biến gen ADH2-4 bằng enzyme cắt giới hạn .......................... 42
vii


Hình 4.14. Trình tự các đột biến mất nu trên gen ADH2-4 ............................................ 44
Hình 4.15. Trình tự các đột biến chèn nu trên gen ADH2-4 ........................................... 44
Hình 4.16. Dự đoán thay đổi trình tự amino acid của gen ADH2-4 ............................... 45
Hình 4.17. Các mẫu cà chua mang đột biến gen ADH2-4 .............................................. 45
Hình 4.18. Minh họa các phương pháp khảo sát đột biến .............................................. 46
Hình 4.19. Kết quả PCR sử dụng mồi đặc hiệu trên gen ADH2-6 ................................. 46
Hình 4.20. Kết quả cắt bằng enzyme cắt giới hạn AflII ................................................. 47
Hình 4.21. Kết quả giải trình tự mẫu đột biến gen ADH2-6 ........................................... 47
Hình 4.22. Kết quả PCR và cây của số 43 cấu trúc ADH2-6 ......................................... 48
Hình 4.23. Dự đoán thay đổi trình tự amino acid ở cấu trúc ADH2-6 ............................ 49

viii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Hệ thống CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindormic Repeat)
cas9 là một công nghệ mới trong lĩnh vực sửa chữa hệ gen. Nghiên cứu này đã thử
nghiệm thành công hệ thống CRIPSR/Cas9 cảm ứng gây đột biến 2 gen mục tiêu thuộc
họ Alcohol dehydrogenase của cà chua. Hai guideRNA (gRNA) được thiết kế bổ sung
với trình tự gen đích để đưa enzyme Cas9 tới chính xác vị trí mong muốn để chỉnh sửa.
Cơ chế tự sửa chữa của tế bào sẽ đưa ra các phương án khôi phục lại những sai hỏng do
enzyme cas9 gây ra tạo ra những đột biến tại gen mục tiêu. Hệ thống CRISPR/Cas9
được thiết kế cho 2 gen ADH trên nhiễm sắc thể thứ 4 và nhiễm sắc thể thứ 6 của hệ gen
cà chua. Hai cấu trúc tương ứng với 2 gen sẽ được chuyển nạp vào cà chua dòng
CLN1621 (AVRDC). Sau khi sàng lọc bởi kháng sinh kanamycine, 132 chồi được tái

sinh từ 1844 mẫu lá. Trong số đó, các đột biến xác định được là đột biến mất nu: phổ
biến từ 1 đến 4 nu, đặc biệt có một đột biến mất 55 nu, chèn và đột biến thay thế một
nucleotid. Kết quả là 08 cây tái sinh mang đột biến được tiếp tục trồng trong nhà lưới để
thu hạt, đánh giá khả năng di truyền của đột biến tạo bởi hệ thống CRIPSR/Cas9. Như
vậy, hệ thống CRISPR/Cas9 đã tạo được những đột biến mới trên vùng gen Alcohol
dehydrogenase, cung cấp cơ sở cho những ứng dụng tiềm năng của công cụ chỉnh sửa
gen sau này, không chỉ ở cà chua mà còn nhiều giống cây trồng khác.

ix


THESIS ABTRACT
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) cas9 system
is a novel techique for genome editing. In this thesis, a start-up attempt using CRISPR
Cas9 to induce site-specific mutation in tomato has been made on one model gene
alcohol dehydrogenase (ADH). By this means, two guideRNA sequence targets in two
specific sites of interest have been created, and constructed into a vector containing a
Cas9-expression cassette. Constructs targeting Cas9 to two different loci in two target
genes (alcohol dehydrogenase) were transformed into AVRDC tomato line CLN1621.
After kanamycine screening selection, 132 transformed shoots were regenerated from
1,844 co-cultured explants. Among them, the induced mutations were recorded as
deletions comonly ranging from1 to 4 base pairs and distint one of 55 base pairs, inserts
of 1 nucleotide base and single base subtitution. For the further heritability confirmation
research, 8 mutant plants are currently grown in the transgenic greenhouse for seed
production. In conclusion, The CRISPR/Cas9 platform for creating new mutations in
multiple targeted genome regions of alcohol dehydrogenase model gene (ADH) was
established in the research. Further researches on stability and heritability of CRISPR
Cas9 induced mutants and mutation expressions on tomato should be esteblsihed to
confirm the application of this technology in tomato and plant breeding.

x


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cà chua là cây rau có giá trị dinh dưỡng và giá trị y học cao. Vì vậy, khi cây
cà chua du nhập vào nước ta, nó đã được ưa chuộng và sử dụng rộng rãi, trở
thành cây có giá trị kinh tế cao. Do đó, công tác chọn tạo giống cà chua cũng
được tiến hành từ lâu và đã đạt được những thành tựu đáng khích lệ (Foolad
2007). Nhiều phương pháp giúp tăng năng suất cũng như chất lượng của sản
phẩm, ngoài ra còn có thể giảm tác động đến môi trường bởi hạn chế nhiều thuốc
trừ sâu và thuốc bảo vệ thực vật trong quá trình chăm bón. Tuy nhiên, các
phương pháp chọn giống lai hay tạo đột biến bằng tia X, hóa chất (Lehrman,
Chatzopoulou et al., 2014) thường gặp khó khăn do các đột biến là ngẫu nhiên
không định hướng được tính trạng đích, đôi khi còn tạo ra những đột biến có hại
cho cây trồng.
Công nghệ chỉnh sửa gen ngày nay được coi là tương lai của cây trồng thế
hệ mới đánh dấu bằng sự ra đời của những phương pháp zinc finger nuclease
(ZFN) và phương pháp gây đột biến trực tiếp trên oligonucleotide oligonucleotide directed mutagenesis (ODM) (Parisi et al., 2011). Hai phương
pháp này có thể gây ra đột biến tại những vị trí xác định trước trên hệ gen của
cây trồng. Từ đó, các đột biến được tạo ra có ý nghĩa to lớn trong chọn giống.
Tuy nhiên, bộ máy hoạt động của hai phương pháp này còn cồng kềnh dẫn đến
dù đạt hiệu quả cao nhưng tính ứng dụng thực tiễn còn hạn chế. Đến năm 2011,
Lusser và cộng sự đã công bố nghiên cứu về một kĩ thuật mới gây đột biến tại
vị trí xác định – CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short
palindromic repeat-cas9) với bộ máy hoạt động tối giản hơn rất nhiều. Sự kiện
này đã tạo ra bước đột phá trong công nghệ chuyển gen, giúp giảm 99% chi phí
dành cho công nghệ di truyền và thời gian rút ngắn từ 1 năm xuống một vài
tuần. Đặc biệt là có thể thực hiện ở hầu hết các phòng thí nghiệm cơ bản. Kĩ
thuật mới CRISPR/Cas9 được nâng cao hơn so với phương pháp ZFN là nhờ

vào thiết kế guideRNA (gRNA) đơn giản với 20bp bắt cặp bổ sung với gen
đích, đưa enzyme cas9 tới chính xác vị trí mong muốn và tiến hành chỉnh sửa
gen (Cong et al., 2013; Yang et al., 2013).

1


Với công cụ mới này, cho đến nay, nhiều loại cây trồng đã được thử nghiệm
để tạo đột biến có chủ đích như lúa gạo (Liu et al., 2012), lúa mì (Cheng et al.,
2014), khoai tây (Sawai et al., 2014), cà chua (Starker et al., 2014). Trong đó, cà
chua (Solanum lycopersicum) là một lựa chọn thích hợp cho nghiên cứu thử
nghiệm tạo đột biến mong đợi vì những lý do sau: là một trong những cây trồng
quan trọng trong sản xuất nông nghiệp, là đại diện cho cây 2 lá mầm mang bộ
gen lưỡng bội (Kirk et al., 2006) và hệ gen đã được công bố trình tự rõ ràng
(Tomato Genome 2012). Ứng dụng kỹ thuật CRISPR/Cas9 cải tiến hệ gen cà
chua hứa hẹn sẽ là một hướng đi đầy tiềm năng, tiết kiệm đáng kể thời gian và
công sức để chọn tạo giống đột biến mới dựa trên cơ sở chỉnh sửa những đặc
điểm tính trạng chưa hoàn hảo của thế hệ giống trước.
Để kiểm tra hiệu quả hoạt động của CRISPR/Cas9 trên cà chua, chúng tôi
lựa chọn gen Alcohol dehydrogenase (ADH), là một họ gen lớn và có vai trò
quan trọng trong nhiều loài sinh vật. Ở thực vật, gen mã hóa cho enzyme ADH,
đảm bảo cung cấp lượng NAD+ cho cơ thể sinh vật. Biểu hiện của các gen này
tác động đến sự đáp ứng mất nước, nhiệt độ và nồng độ axit absocisis nội bào,
đóng vai trò quan trọng trong quá phát triển cây con, phấn hoa và đặc biệt trong
quá trình chín của quả. ADH còn được coi là gen lý tưởng để nghiên cứu do kích
thước nhỏ thuận lợi để nghiên cứu chức năng: chỉ 2-3kb với xấp xỉ 1000 trình tự
là nucleotid coding và có số bản sao chép gen nhỏ (Thompson, Fernandes et al.,
2010). Đặc biệt, trong cà chua, tăng giảm biểu hiện của gen ADH2 cho thấy có
tác động đến mùi vị của cà chua chín cụ thể là đến các thành phần volatile tạo
mùi vị (Speirs et al., 1998). Hai gen thuộc họ gen ADH nằm tại nhiễm sắc thể số

4 và nhiễm sắc thể số 6, có chức năng bổ sung cho nhau. Vì vậy, khi
CRISPR/Cas9 gây ra những thay đổi trên gen làm biến mất chức năng thì cũng
không ảnh hưởng đến sự sinh tồn của cây (Brooks et al., 2014).
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên
cứu: “Thiết kế cấu trúc CRISPR/Cas9 và sử dụng tạo đột biến gen Alcohol
dehydrogenase trên cà chua”.
1.2. GIẢ THUYẾT KHOA HỌC
Hệ thống CRISPR/Cas9 có khả năng chỉnh sửa thông tin di truyền trên
gen mục tiêu Alcohol dehydrogenase.
1.3. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Thiết kế được các cấu trúc CRISPR/Cas9 gây đột biến hiệu quả trên 2 gen
ADH2-4 và ADH2-6 ở cà chua.
2


1.4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được tiến hành trên quy mô nghiên cứu phòng thí nghiệm nuôi
cấy mô và sinh học phân tử tại AVRDC, trên đối tượng vật liệu là dòng cà chua
AVRDC …, các dòng vi khuẩn E. Coli và A. tumefaciens liên quan đến biến nạp
thực vật.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC
Hệ thống CRISPR/Cas9 đã được thiết kế và thử nghiệm thành công trên cà
chua đã chứng minh tính hiệu quả trong chỉnh sửa genome của hệ thống. Kết quả
của nghiên cứu là cơ sở khoa học thực tiễn để áp dụng công cụ mới này trong
công cuộc cải cách hệ gen cây trồng thế hệ mới.

3


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG
Chọn giống thực vật là hoạt động nông nghiệp lâu đời nhất, song song với sự
phát triển của xã hội loài người. Bắt đầu từ xã hội nguyên thủy, nông nghiệp chủ
yếu là săn bắt, hái lượm từ khoảng 11.000 năm trước đây, cho đến khi biết trồng
trọt và chăn nuôi, con người dần dần can thiệp vào sự tiến hóa làm thay đổi cấu
trúc di truyền của thực vật để thỏa mãn nhu cầu của mình. Bắt đầu bằng chọn lọc
những cá thể phù hợp cho sự tiến hóa, chọn lọc nhân tạo đối với những tính trạng
mong muốn, như hạt và quả to, thời gian sinh trưởng ngắn, thấp cây.... Đến cuối
thế kỉ 18, nhờ những nỗ lực không ngừng nghỉ của mình, con người đã thuần hóa
được hơn 10.000 loài thực vật, trong đó, có khoảng 100-200 loài là cây trồng chủ
lực cung cấp lương thực và thức ăn cho con người như lúa gạo, lá mì, ngô, khoai
tây, khoai lang, dừa, chuối…Ngoài ra một số loại cây trồng còn phục vụ cho nhu
cầu y tế và thẩm mỹ. Để có được năng suất cao hơn, chất lượng tốt hơn, nhiều
phương pháp khoa học đã và đang được áp dụng trong nhân giống cây trồng như
lai, gây đột biến và biến đổi hệ gen của cây trồng. Thông qua những công nghệ
mới, nhiều cây trồng mang đặc tính ưu việt được tạo ra đem lại lợi ích to lớn về
giá trị sử dụng cũng như giá trị kinh tế.
2.1.1. Chọn giống bằng phương pháp lai
Phương pháp lai tạo được sử dụng từ rất lâu đời trong chọn giống. Vào
những ngày đầu, lai tạo xảy ra tự nhiên giữa hai cá thể có các tính trạng mong
muốn như quả, hạt lớn, có hương vị ngon hoặc năng suất cao. Sau đó, con người
mới quan sát thấy sự khác biệt hoa cái và hoa đực nhận ra rằng đời sau mang
những đặc điểm vượt trội so với bố mẹ có thể được tạo ra nhờ giao phối nhân tạo
hoặc thụ phấn chéo. Thông qua phương pháp lai nhân tạo, các nhà chọn giống kết
hợp được nhiều tính trạng tốt trong cá thể lai hoặc trong nhiều thế hệ lai. Một
trong những ứng dụng thành công nhất của phương pháp lai tạo là ưu thế lai, một
hiện tượng mà thế hệ F1 thường vượt trội hơn hẳn về kích thước và đặc điểm
sinh trưởng so với bố mẹ (Dirks et al., 2009). Nhiều loại cây ăn quả và rau màu
được tạo ra nhờ phương pháp lai và chọn lọc như dâu tây (Fragaria x ananassa),
táo (malus x domestica), cam đường (Citrus sinensis), cà chua (solanum

4


lycopersicum) và bí (Cucurbita maxima)…. Các ứng dụng khác của phương pháp
lai tạo ra những trái cây không hạt như dưa hấu khi lai cây nhị bội và cây tứ bội.
Tuy nhiên, chọn giống bằng phương pháp lai tạo cũng có những hạn chế nhất
định. Thứ nhất, chỉ tiến hành lai tạo giữa những cá thể cùng loài (lai gần). Thứ
hai, khi tiến hành lai tạo chọn lọc được những tính trạng tốt lại đi kèm với một số
tính trạng không mong muốn có thể dẫn đến mẫn cảm đối với bệnh cây hoặc tác
nhân nào đó từ môi trường. Do mối liên hệ chặt chẽ từ các gen, cần phải lai tạo
rất nhiều thế hệ mới có thể loại bỏ được các gen không mong muốn. Thứ ba, khả
năng sinh sản của nhiều loài thân gỗ như táo, óc chó có thể mất 20 hoặc 30 năm
để chọn lọc những tính trạng mong muốn trong một cá thể duy nhất, điều này đòi
hỏi một lượng lớn nguồn lực vật liệu và lao động.
2.1.2. Chọn giống bằng phương pháp đột biến
Trong quá trình tiến hóa của cây trồng, các đột biến tự phát sinh với các
đặc điểm mới đôi khi được bảo tồn và duy trì cho các thế hệ sau. Sử dụng các
nguồn đột biến trong tự nhiên tiêu biểu như đột biến lùn ở cây ngũ cốc mang lại
năng suất được nâng cao rõ rệt gọi là “cách mạng xanh” (Peng, Richards et al.,
1999). Các giống cây trồng mới được lựa chọn từ các đột biến tự nhiên đặc biệt
hiệu quả ở cây lâu năm, ví dụ như táo Fuji đỏ(Ban, Honda et al., 2007). Phương
pháp này bắt nguồn từ những món quà mà thiên nhiêu ưu ái dành tặng cho con
người cho đến nay vẫn được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, phương pháp này
cũng có nhiều điểm thiếu sót, hầu hết các đột biến này không di truyền và có
thể đảo lại kiểu hình gốc, tần số đột biến trong tự nhiên không cao. Có thể làm
tăng tần số đột biến bằng các tác nhân vật lí, hóa học lên hạt, phấn hoa hoặc
trong nuôi cấy mô sẹo. Được phát hiện vào đầu thế kỉ 20, các nhà thực vật học
khi sử dụng một số chất hóa học nhất định hoặc các tia phóng xạ có thể cảm
ứng đột biến trên cây trồng. Mặc dù cơ chế phân tử và di truyền của phương
pháp này chưa được nắm rõ tại thời điểm đó, tuy nhiên, các chất gây đột biến

đem lại nhiều thành tựu to lớn trong sản xuất nông nghiệp (Shu 2009). Dù vậy,
bất chấp sự tăng lên đáng kể của tần số đột biến, đột biến dạng này vẫn xảy ra
một cách ngẫu nhiên, không cụ thể, một phần không nhỏ là các đột biến có hại.
Do đó, để có được giống mang những đặc điểm mong muốn, đòi hỏi một số
lượng lớn vật liệu, thời gian sàng lọc…

5


2.1.3. Cây trồng chuyển gen
Ngày nay, công nghệ chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào
một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống
khác nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa
nhau. Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được
giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền
thống. Cây chuyển gen (transgenic plant - GMO) là cây mang một hoặc nhiều
gen được đưa vào bằng phương thức nhân tạo thay vì thông qua lai tạo như trước
đây. Những gen được tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những
loài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn. Thực
vật tạo ra được gọi là thực vật “chuyển gen” mặc dù trên thực tế tất cả thực vật
đều được “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại của chúng bởi quá trình thuần hóa,
chọn lọc và lai giống có kiểm soát trong một thời gian dài. Nhìn chung, việc ứng
dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích rõ rệt như sau:
- Tăng sản lượng.
- Giảm chi phí sản xuất.
- Tăng lợi nhuận nông nghiệp.
- Cải thiện môi trường.
Những cây chuyển gen “thế hệ thứ nhất” đã giúp giảm chi phí sản xuất. Cho
đến nay, các nhà khoa học đang hướng đến việc tạo ra những cây chuyển gen
“thế hệ thứ hai” nhằm tăng các giá trị dinh dưỡng hoặc có những đặc điểm thích

hợp cho công nghiệp chế biến. Lợi ích của những cây trồng này hướng trực tiếp
hơn vào người tiêu dùng, điển hình như:
- Lúa gạo giàu vitamin A và sắt.
- Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột.
- Vaccine thực phẩm (edible vaccine) ở ngô và khoai tây.
- Những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng.
- Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ hơn từ đậu nành và cải dầu.
Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm cũng có những nguy cơ tiềm ẩn trong
việc phát triển những kỹ thuật mới bao gồm:
- Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm
giảm dinh dưỡng vào thực phẩm.
6


- Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hàng hoang dại.
- Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây
chuyển gen.
- Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là loại
sinh vật cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh thái.
Nhìn chung, mặc dù còn những điểm chưa rõ ràng về cây chuyển gen nhưng
với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế, công nghệ này
có vai trò không thể phủ nhận được. Tuy vậy, để giải quyết những vấn đề đáng lo
ngại kể trên thì những kết luận thu được phải dựa trên những thông tin tin cậy và
có cơ sở khoa học.
2.2. CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA HỆ GEN (genome-editing)
Bắt đầu từ thập kỉ trước, cùng với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật, công
nghệ chỉnh sửa gen ra đời, đánh bại tất cả các kĩ thuật trước đó bởi tính đặc hiệu.
Thay vì tích hợp ngẫu nhiên plasmid, transposon, virus hoặc thông qua tái tổ hợp
tương đồng không đem lại hiệu quả cao thì công nghệ chỉnh sửa gen đưa ra một
phương thức chỉnh sửa ổn định, tại vị trí đặc hiệu một các hiệu quả. Các phương

pháp này dựa trên hoạt động của enzyme endonucleases (EENs) tạo nên các gãy
kép DNA tại một vị trí cụ thể nhờ sự hỗ trợ của trình tự RNA dẫn đường có thể
nhận diện chính xác vị trí mục tiêu. Phá vỡ sợi DNA kép (double strand break DSB) kích hoạt cơ chế tự sửa chữa của tế bào bằng sự tái tổ hợp đồng dạng. Hai
con đường sửa chữa chủ yếu là non-homology end joining (NHEJ) và homologydirected repair (HDR) (Wyman and Kanaar 2006). Một số phương pháp chỉnh
sửa hệ gen được biết đến như Zinc finger nucleases (ZFNs), Transcription
activator-like effector nucleases (TALENs) và gần đây nhất từ năm 2013 ra đời
công cụ Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/cas
(CRISPR/Cas).
2.2.1. Công cụ Zinc finger nucleases (ZFNs)
ZFNs là thế hệ đầu tiên được phát triển của EENs sau khi khám phá ra chức
năng của các vùng ngón tay kẽm Cys2-His2 (zinc finger domains) (Pabo, Peisach
et al., 2001). Mỗi vùng ngón tay kẽm Cys2-His2 bao gồm 30 amino acid được
làm bền bằng một ion kẽm tạo thành cấu trúc β β α (Cathomen and Joung 2008).
Protein này được gắn với DNA bằng cách chèn chuỗi xoắn α vào rãnh chính của
chuỗi xoắn kép (Pavletich and Pabo 1991). Mỗi protein zinc finger có thể nhận
7


diện 3 nucleotide liên tiếp ở trong trình tự DNA mục tiêu. Vùng cắt DNA của
ZFNs bắt nguồn từ enzyme ForkI không có tính đặc hiệu. Để có thể cắt được
DNA vùng này phải được dime hóa. Do đó, 2 ZFN phải gắn gần hoặc tại vị trí
mục tiêu như hình 2.1.

Hình 2.1. Cấu trúc Zinc finger nucleases và cơ chế sửa chữa qua trung gian
Kể từ báo cáo đầu tiên vào năm 1996, ZFNs đã được áp dụng thành công
chỉnh sửa gen của một số loài sinh vật như tế bào người (Perez, Wang et al.,
2008), cá ngựa (Doyon, McCammon et al., 2008; Meng, Noyes et al., 2008) và
cây trồng như arabidopsis (Osakabe, Osakabe et al., 2008), ngô (Shukla, Doyon
et al., 2009). Tuy nhiên, ZFNs tồn tại rất nhiều hạn chế khi bộ máy hoạt động
cồng kềnh dễ làm mất chức năng gen đích, thậm chí gây hại cho tế bào chủ.

2.2.2. Công cụ Transcription activator-like effector nucleases (TALENs)
TALENs là thế hệ thứ hai của EENs, hoạt động linh hoạt hơn, chi phí thấp
hơn ZFN nên đã nhanh chóng thay thế cho ZFNs (Joung and Sander 2013). Các
ứng dụng rộng rãi của TALENs dựa trên cơ chế hoạt động của yếu tố phiên mã
loại III bắt nguồn từ vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng Xanthomonas (Boch and
Bonas 2010). DNA liên kết với protein đặc hiệu và vùng chức năng để gắn với
enzyme FokI (Bogdanove and Voytas 2011). Trong đó loại protein có tên gọi
Transcription activator-like Effector (TAL Effector) có nhiệm vụ tìm kiếm vị trí
cần cắt bỏ. Protein còn lại chính là nuclease có nhiệm vụ cắt bỏ chuỗi DNA.

8


Chính vì vậy protein tạp giao này được gọi là TAL Effector Nuclease. Cắt đứt bộ
phận DNA không cần thiết và thay thế bằng các đoạn DNA chức năng được gọi
là quá trình tái tổ hợp tương đồng. Nguyên lý hoạt động của protein tạp giao là
trước tiên làm cho TAL Effector đọc trình tự DNA và tìm kiếm vị trí cần cắt bỏ,
đồng thời liên kết đoạn cần cắt bỏ này với DNA. Trong khi đó bộ phận nuclease
sẽ cắt bỏ chuỗi đôi DNA tại vị trí liêt kết, qua đó cắt đứt đoạn DNA không cần
thiết và hàn gắn đoạn DNA mới. Các nhà khoa học cho biết, protein tạp giao có
thể thực hiện việc tổ hợp tùy ý căn cứ vào các nhu cầu khác nhau, qua đó thực
hiện việc tìm kiếm vị trí cần thiết trong bất kỳ DNA có tổ chức hữu cơ nào. TAL
Effector Nuclease đã giúp cải tiến công cụ chuyển đổi gen hiện tại, hơn nữa giá
thành lại thấp, thời gian nhận biết trình tự DNA cũng dễ dàng hơn so với ZFNs
rất nhiều. Hơn thế nữa, các gen biến đổi bởi TALENs đã được sử dụng thành
công ở loài động vật và thực vật bao gồm cá ngựa (Sander, Cade et al., 2011),
chuột (Tesson, Usal et al., 2011), lúa gạo (Li, Liu et al., 2012), lúa mì (Wang,
Cheng et al., 2014), khoa tây (Sawai, Ohyama et al., 2014), cà chua (Lor, Starker
et al., 2014). Thành quả to lớn mới đây của TALEN đạt được khi áp dụng thành
công trên bệnh nhân ung thư máu đầu tiên. Bằng cách chỉnh sửa tế bào T của

người cho trước khi truyền vào bệnh nhân nhằm ngăn chặn khả năng tế bào T
này tấn công bệnh nhân (Groschel, Sanders et al., 2014).

Hình 2.2. Cấu trúc của Zinc finger nucleases (ZFNs) và Transcription
activator-like effector nucleases (TALENs)

9


Hai hệ thống chỉnh sửa gen ZFN và TALEN có tiềm năng to lớn nhưng bên
cạnh đó cũng có những hạn chế nhất định như: việc nhận diện trình tự đặc hiệu
chịu trách nhiệm bởi vùng protein gắn ADN thông qua tương tác protein – ADN.
Tương tác này không đặc hiệu hoàn toàn, hơn nữa khó dự đoán trước độ đặc hiệu
mà cần phải kiểm tra và tối ưu hóa qua thực nghiệm; việc thiết kế ZFN và
TALEN khó khăn do tính phức tạp trong thiết kế protein và dự đoán độ đặc hiệu.
Ngoài ra, 2 phương pháp này còn có khả năng gây đột biến lệch mục tiêu và phát
sinh độc tố.
2.2.3. Công cụ CRISPR/Cas9
CRISPR được phát hiện vào năm 1987 trong vi khuẩn E. coli. Sự ra đời của
hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 đã khắc phục được những hạn chế của
ZFN và TALEN, tạo nên cuộc cách mạng đột phá trong công nghệ sinh học.
Về bản chất, CRISPR là một phần hệ thống miễn dịch của vi khuẩn chống lại
virus xâm nhiễm. Hệ thống này đã được ứng dụng trên các tế bào nhân thực.
Tính đặc hiệu được điều khiển bởi “gRNA” (thường gắn với một đoạn trình tự
18-20 cặp base trên DNA mục tiêu) và có thêm một số motifs giúp hình thành
một phức hợp với Cas9 nuclease (CRISPR – associated nuclease). Để có thể gắn
thành công Cas9, trong trình tự bộ gen đích phải có một đoạn trình tự protospacer
adjacent motif (PAM) ngay sau trình tự đích. PAM là một motif NGG liền kề vị
trí liên kết. Đối lập với ZFN và TALEN, hệ thống CRISPR giúp nuclease
(enzyme cắt – Cas9) nhận biết trình tự cắt thông qua “gRNA”. Đặc tính này giúp

ta dễ dàng thiết kế một “gRNA” mới khi cần cắt một trình tự mục tiêu mới và
cũng cho phép cắt nhiều mục tiêu cùng lúc (khi kết hợp nhiều “gRNA”). Một
cách ngắn gọn, ZFN và TALEN cần phải tổng hợp protein, do đó tốn thời gian,
công sức hơn để tạo ra một nuclease mới cho một vị trí mục tiêu khác. Đối với hệ
thống CRISPR, chỉ cần tạo ra một “gRNA” mới để gắn vào trình tự mục tiêu
khác. Hơn nữa, với CRISPR việc gắn đa mục tiêu có thể được thực hiện bằng
cách kết hợp Cas9 nuclease với nhiều “gRNA” cùng một lúc.
2.3. CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA GEN CRISPR/CAS9
2.3.1. Sự ra đời của CRISPR/Cas
CRISPR là viết tắt của Clustered regularly interspaced short palindromic
repeats được hiểu là trình tự sắp xếp kiểu lặp lại ngắn xen lẫn khoảng trống thấy
trên vi khuẩn, công bố lần đầu tiên bởi các nghiên cứu của Yoshizumi Ishino và

10


cộng sự tại trường Đại học Osaka, Nhật Bản năm 1987 (Doudna and Charpentier
2014), tuy nhiên tại thời điểm đó, chưa ai thật sự hiểu rõ vai trò và chức năng của
những trình tự này. Điều này thúc đẩy các nhà khoa học tập trung nghiên cứu
chức năng đặc biệt của chúng trong hệ miễn dịch của vi khuẩn chống lại sự xâm
nhập của các thực khuẩn thể. Vi khuẩn và vi khuẩn cổ có thể ngăn chặn sự tấn
công của thực khuẩn thể (bacteriphage) bằng cách tích hợp các đoạn ngắn của hệ
gen virus, có độ dài tương đương với các khoảng trắng lặp lại trong bộ gen của vi
khuẩn. Vi khuẩn sẽ tự cắt chuỗi DNA của chính chúng và chèn đoạn mã di
truyền vào các khoảng trắng lặp lại (spacer) thường 20-50bp (Sorek, Lawrence et
al., 2013), đó chính là trình tự CRISPR. Vùng trình tự này được phiên mã và
được xử lý thành các đoạn RNA ngắn (được gọi là crRNA_CRISPR-derived
RNA) các crRNA này sẽ liên kết với endonuclease Cas để nhận diện DNA mục
tiêu (thông qua liên kết bổ sung của trình tự crRNA và DNA mục tiêu) và cắt
phân tử DNA mục tiêu (thông qua hoạt động endonuclease của Cas).

Hình 2. 3. a)một locus CRISPR trong nhiễm sắc thể vi khuẩn với đặc trưng
đoạn lặp-khoảng trống. b) Vi khuẩn có thể nhận biết trình tự PAM ở bên
trong virus/plasmid và hợp nhất nucleic acid ngoại lai
Chú thích: PS: a proto-spacer. Sự hợp nhất của proto-spacer tạo một khoảng
trống (spacer) mới (S0) và một trình tự lặp lại R (repeat squence) (Van der Oost,
Jore et al., 2009).
Nhiễm sắc thể vi khuẩn có thể chứa một hay nhiều locut CRISPR (Godde
and Bickerton 2006). Trong các loài chứa hai hay nhiều locut CRISPR, có một
chuỗi các vùng giàu TA được tìm thấy trên mỗi locut (Jansen, Embden et al.,
2002), bao gồm 300-500bp. Mặt khác, CRISPR- trình tự gen liên kết (cas) được
tìm thấy trên cả 2 bên của locut CRISPR. Gen Cas có nhiều loại khác nhau mã
11


hóa cho nhiều protein khác nhau, tuy nhiên gen Cas1 và Cas2 được bảo tồn trong
tất cả các bộ gen chứa locus CRISPR. Vào năm 2012, hai nhóm nghiên cứu độc
lập của tiến sĩ Jinek và cộng sự tại trường đại học Umea và tiến sĩ Jennifer
Doudna tại trường đại học California, Berkeley đã cùng khám phá ra cơ chế hoạt
động của enzyme Cas và CRISPR (Jinek, Chylinski et al., 2012).
Tiến sĩ Craig Mello, người được trao giải thưởng Nobel về Sinh lý học và
Y học năm 2006 về công trình nghiên cứu RNAi (RNA interference), đã có
những lời bình luận về tương lai hứa hẹn của phương pháp này: “CRISPR/Cas
có ý nghĩa vô cùng to lớn, khả năng của nó vô cùng mạnh mẽ, bởi vì chúng ta
về cơ bản có thể thay đổi bộ gen theo bất cứ điều gì chúng ta muốn”. Mello
nhấn mạnh rằng phương pháp này có thể được sử dụng rộng rãi từ các ứng
dụng cho nông nghiệp đến các ứng dụng liệu pháp gen trong điều trị các bệnh
lý trên người. Phương pháp này thật sự là một thành công của nghiên cứu
khoa học cơ bản, đây cũng là một đột phá to lớn có tác động mạnh mẽ đối với
di truyền học phân tử.

2.3.2. Cấu trúc của hệ thống CRISPR/Cas
Cấu trúc của hệ thống CRISPR/Cas được hình thành từ 3 gen bao gồm 1
gen mã hóa cho enzyme cắt DNA Cas9 nuclease và 2 gen không mã hóa RNA:
crRNA hoạt hóa phiên mã (trans-activating crRNA (tracrRNA)) và tiền
crRNA. Tiền crRNA sau khi liên kết với crRNA hoạt hóa phiên mã trở thành
crRNA trưởng thành, mang trình tự bổ sung trực tiếp với 1 đoạn ngắn (thường
là 20nu) trên gen đích vì vậy có thể đưa enzyme cắt Cas9 tới gen đích một
cách chính xác. 2 gen RNA có thể được thay thế bởi một gen RNA (singleguide RNA) thiết kế như một cấu trúc kẹp tóc là phức hợp của crRNAtrancrRNA. Single-guideRNA (sgRNA) liên kết chắc chắn với protein Cas9
(Ran, Hsu et al., 2013) nhờ cấu trúc kẹp tóc. Enzyme Cas 9 có vai trò phân cắt
DNA mục tiêu, trong khi phân tử sgRNA có vai trò nhận diện DNA mục tiêu
chứa trình tự bổ sung với phân tử gRNA và đưa enzyme Cas9 tới. Ngoài ra,
ngay sau gen đích được lựa chọn còn có sự hiện diện của trình tự PAM
(Protospacer-Adjacent Motif). Trình tự PAM có vai trò quan trọng như gRNA
đối với quá trình nhận diện và gắn chuyên biệt của enzyme Cas 9 vào trình tự
đích. Cas9 có nguồn gốc từ các loài vi khuẩn khác nhau có trình tự PAM đặc
hiệu khác nhau được trình bày ở bảng 2.1.
12


Bảng 2.1. Các trình tự PAM ứng với mỗi biến thể enzyme Cas9
Loài/biến thể của Cas9

Trình tự PAM

Streptococcus pyogenes (SP); SpCas9

NGG

SpCas9 D1135E

NGG

SpCas9 VRER

NGCG

SpCas9 VQR

NGAN hoặc NGNG

Staphylococcus aureus (SA); SaCas9

NNGRRT hoặc NNGRR(N)

Neisseria meningitidis (NM)

NNNNGATT

Streptococcus thermophilus (ST)

NNAGAAW

Treponema denticola (TD)

NAAAAC

Cpf1 (từ nhiều loài)

TTN
Nguồn: addgene.com

Đối với nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn enzyme Cas 9 có nguồn gốc từ
vi khuẩn Streptococcus với trình tự PAM gồm 3 nucleotit – NGG, trong đó N là
một nucleotit bất kỳ. Bằng việc thiết kế các trình tự gRNA khác nhau (khoảng 20
nucleotit), các nhà khoa học hầu như có thể tác động đến bất kì gen nào. Với việc
thiết kế đơn giản (chỉ thay đổi trình tự gRNA) và hiệu quả cao, có thể sử dụng
đối với nhiều loại tế bào khác nhau và nhiều gen cùng lúc, CRISPR/Cas thực sự
là một hệ thống tiềm năng để biến đổi DNA bộ gen (Hình 2.4).

Hình 2.4. Cấu trúc của hệ thống CRISPR/Cas9

13


2.3.3. Cơ chế hoạt động của hệ thống Crispr/cas9
Cas9 nuclease có 2 vùng chức năng: RuvC và HNH, mỗi vùng sẽ cắt một sợi
ở mạch kép DNA. Khi cả 2 vùng cùng hoạt động, enzyme Cas9 phá vỡ mạch kép
DNA trong hệ gen. Nếu không cung cấp nguyên liệu phù hợp, vị trí gãy ở mạch
kép sẽ nối lại nhờ cơ chế sửa chữa Non-Homologous End Joining (NHEJ) - kết
nối đầu cuối không tương đồng. Khi phục hồi đoạn DNA đứt gãy bởi cơ chế này,
hiện tượng chèn hay mất đi một vài nucleotide xảy ra một cách tự do. Điều này
dẫn đến làm thay đổi khung đọc mở trên gen đích hay biến đổi amino acid kể từ
vị trí bị cắt trở đi. Bất kì thay đổi nào ở gen đích theo con đường này đều phá vỡ
gen đích và tạo ra những thay đổi cần thiết phù hợp với hệ gen.
Bên cạnh đó, hệ thống CRISPR còn có thể đưa một đoạn trình tự đặc hiệu
vào vùng gen đích nhờ cơ chế Homology Directed Repair (HDR). Khi cơ chế
NHEJ không đem lại kết quả mong muốn, tế bào có thể được sửa chữa theo cơ
chế Homology Directed Repair (HDR) bằng cách cung cấp mẫu DNA ngoại lai.
Với cơ chế này, chúng ta có thể tự cung cấp một đoạn gen theo mong muốn vào
một vị trí xác định (hình 2.5).

Hình 2.5. Mô tả 2 cơ chế sửa chữa mạch kép khi bị cắt bởi enzyme Cas9

14