Nghiên cứu tạo Gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân Gelatin da cá Tra

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
--------------------------------------------------

PHẠM MỸ DUNG

NGHIÊN CỨU TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG
DỤNG TRONG THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI, 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
--------------------------------------------------

PHẠM MỸ DUNG

NGHIÊN CỨU TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG
DỤNG TRONG THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học: (1) PGS. TS. PHẠM CÔNG HOẠT

(2) GS. TS. LÊ HUY HÀM

HÀ NỘI, 2018


i

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
PGS.TS. Phạm Công Hoạt, Bộ Khoa học và Công nghệ và GS.TS. Lê Huy
Hàm, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, những người thầy đã định hướng, truyền
dạy những kiến thức khoa học, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi
vượt qua những khó khăn và trở ngại trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Di Truyền Nông Nghiệp,
Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo của Viện Khoa học
Nông Nghiệp Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và
giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm luận án.
Đặc biệt, Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trường Đại
học Vinh, Viện Nông Nghiệp và Tài Nguyên đã tạo điều kiện giúp tôi hoàn
thành tốt nhiệm vụ công tác, học tập và nghiên cứu trong bốn năm qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến Khoa Công nghệ sinh học -Viện Đại
học Mở Hà Nội, Trại thủy sản mặn lợ - Nghi Xuân của Trường Đại học Vinh
đã hỗ trợ, giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và người
thân đã luôn bên cạnh chia sẻ, và tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu và
hoàn thành luận án của mình.
Hà Nội, ngày……. tháng năm 2018


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
- Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả này cộng
tác với các cộng sự khác.
- Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả
Hà Nội, ngày….. tháng năm 2018
Tác giả luận án

Phạm Mỹ Dung


iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................................vii
DANH MỤC CÁC HÌNH..................................................................................................... ix
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 5
1.1. GELATIN ....................................................................................................................... 5
1.1.1. Cấu trúc và tính chất gelatin ........................................................................................ 5
1.1.2. Gelatin có nguồn gốc từ da cá ..................................................................................... 6
1.2. GELATINASE.............................................................................................................. 11
1.2.1. Đặc điểm, chức năng của gelatinase .......................................................................... 11
1.2.2. Phân loại gelatinase ................................................................................................... 13
1.2.3. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của gelatinase ............................................................. 16

1.2.4. Tính chất chung của gelatinase .................................................................................. 19
1.2.5. Nguồn sản xuất gelatinase ......................................................................................... 25
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ GELATINASE TÁI TỔ HỢP ...................................................... 27
1.3.1. Gen mã hóa gelatinase ............................................................................................... 27
1.3.2. Sản xuất gelatinase tái tổ hợp .................................................................................... 32
1.4. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG GETATINASE TẠI VIỆT NAM ..... 41
1.4.1. Nghiên cứu sản xuất gelatinase.................................................................................. 41
1.4.2. Nghiên cứu ứng dụng gelatinase vào thủy phân da cá............................................... 42
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 50
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .......................................................................................... 50
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ.......................................................................................... 50
2.2.1. Hóa chất ..................................................................................................................... 50
2.2.2. Thiết bị ....................................................................................................................... 51
2.3. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ....................................................................................... 52
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................ 52
2.4.1. Phương pháp sàng lọc nguồn gen mã hóa gelatinase................................................ 52
2.4.2. Phương pháp tạo chủng tái tổ hợp ............................................................................. 55
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu điều kiện biểu hiện rGEL .................................................. 61
2.4.4. Phương pháp thu hồi, tinh sạch và đặc tính của rGEL ............................................. 63


iv
2.4.5. Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da các tra ........................................................... 65
2.4.6. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu....................................................................... 71
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................. 72
3.1. SÀNG LỌC NGUỒN GEN MÃ HÓA GELATINASE .............................................. 72
3.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao .................................. 72
3.1.2. Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa và định tên của chủng vi khuẩn lựa chọn........ 74
3.2. TẠO CHỦNG TÁI TỔ HỢP ........................................................................................ 79
3.2.1. Thiết kế mồi khuếch đại gen gelE mã hóa gelatinase từ chủng E. faecalis MD4 ..... 79

3.2.2. Nhân dòng gen gelE mã hóa gelatinase .................................................................... 79
3.2.3. Giải trình tự và phân tích gen gelE ............................................................................ 81
3.2.4. Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu hiện gen gelE trong E. coli BL21(DE3) ............ 84
3.2.5. Tạo chủng E. coli tái tổ hợp mang gen gelE .............................................................. 86
3.3. ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN rGEL ................................................................................... 87
3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến biểu hiện rGEL .................................................................... 88
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện rGEL ............................................................ 89
3.3.3. Ảnh hưởng của IPTG đến biểu hiện rGEL ................................................................ 93
3.3.4. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp gelE tái tổ hợp ....................................... 95
3.4. THU HỒI, TINH SẠCH VÀ ĐẶC TÍNH CỦA rGEL................................................. 96
3.4.1. Thu hồi và tinh sạch rGEL ......................................................................................... 96
3.4.2. Đặc tính của gelatinase tái tổ hợp .............................................................................. 99
3.5. ỨNG DỤNG rGEL THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA ................................... 106
3.5.1. Kết quả xác định các điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL................. 106
3.5.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương cá Mú chấm đen ....... 111
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 118
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 121
PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 145


v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Tên đầy đủ

ADG

: Average daily growth

ADN

: Acid deoxyribonucleic

AMP

: Ampicillin

ARN

: Acid ribonucleic

BLAST

: Basis Local Aligment Search Tool

bp

: base pair

BSA

: Bovine Serum Albumin

Dal

: Dalton

E

: Enzym

EC

: Classification enzyme

EDTA

: Ethyllene diamine tetraacetic acid

EtBr

: Ethidium Bromide

FCR

: Feed change rate

IPTG

: Isopropyl β-D- thiogalactoside

kDa

: Kilo Dalton

Kb

: Kilo base

LB

: Lubria – Bertani

MMP 2

: Matrix metalloprotease 2

MMP 9

: Matrix metalloprotease 9

MMPs

: Matrix metalloproteases

NST

: Nhiễm sắc thể

OD

: Optical density (mật độ quang)

PBS

: Phosphate buffer

PCR

: Polymerase Chain Reactions

rGelE

: recombinant gelatinase enzyme (enzyme gelatinase tái tổ hợp)


vi

RE

: Restriction enzyme (enzyme giới hạn)

S

: Cơ chất

SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyarcrylamide gel electrophoresis
SGR

: Special growth rate

sprE

: serine proteinase

TAE

: Tris - acetate - EDTA

TSVKHK

: tổng số vi khuẩn hiếu khí

TTHĐ

: Trung tâm hoạt động

UV

: Ultra violet

VT TTH

: vector tái tổ hợp

VSV

: vi sinh vật


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần axit amin của gelatin từ da cá da trơn (Clarias
gariepinus) ........................................................................................................ 8
Bảng 1.2. Các thành phần axít amin chủ yếu trong gelatin da một số loại cá và
bì lợn (thành phần trong 1000g)...................................................................... 10

Bảng 1.3. Một số loại enzym thuộc nhóm MMPs .......................................... 14
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng thức ăn ..................................................... 68
Bảng 2.2. Thành phần dinh dưỡng các công thức thức ăn thí nghiệm ........... 69
Bảng 2.3. Thành phần axit amin trong các loại thức ăn thí nghiệm .............. 69
Bảng 3.1. Hoạt tính phân giải gelatin của dịch lên men 11 chủng vi khuẩn
phân lập phân lập từ các mẫu cá nước ngọt bị bệnh sau 48 giờ nuôi cấy. ...... 72
Bảng 3.2. Khả năng đồng hoá nguồn carbon và nitơ và đặc điểm sinh trưởng
của chủng MD4 sau 2 ngày nuôi cấy ở 37°C.................................................. 75
Bảng 3.3. Độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn MD4 với trình
tự gen tương ứng của các chủng được đăng ký trên Genbank (NCBI) .......... 77
Bảng 3.4. Mức độ tương đồng trình tự nucleotit của gen gelE của chủng E.
faecalis MD4 với các gen gelE tương ứng cả các vi khuẩn được đăng kí trên
GenBank .......................................................................................................... 81
Bảng 3.5. Mức độ tương đồng trình tự axít amin suy diễn của gen gelE của
chủng E. faecalis MD4 với các gen gelE tương ứng cả các vi khuẩn được
đăng kí trên GenBank...................................................................................... 84
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến sinh trưởng và biểu hiện
GEL ................................................................................................................. 93
Bảng 3.7. Hiệu suất tinh sạch của GEL tái tổ hợp .......................................... 97
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của GEL
tái tổ hợp ........................................................................................................ 103
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước khảo sát đến hiệu suất thủy phân ....... 106
Bảng 3.10. Thành phần axít amin của sản phẩm thủy phân từ gelatin da cá Tra
....................................................................................................................... 110


viii

Bảng 3.11. Diễn biến các yếu tố môi trường nước trong quá trình ương cá Mú
chấm đen ....................................................................................................... 111

Bảng 3.12. Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày của cá Mú chấm đen theo
khối lượng ở các mức bổ sung chế phẩm axit amin khác nhau .................... 113
Bảng 3.13. Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày của cá Mú chấm đen theo
chiều dài ở các mức bổ sung chế phẩm axit amin khác nhau ....................... 114
Bảng 3.14. Hệ số chuyển đổi thức ăn của cá Mú ở các mức bổ sung chế phẩm
axit amin khác nhau ...................................................................................... 116
Bảng 3.15. Hệ số biến động của cá Mú chấm đen giai đoạn giống .............. 117


ix

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 . Cấu trúc điển hình của gelatinase A, B có nguồn gốc từ người ... 17
Hình 1.2. Cấu trúc của các enzym gelatinase ................................................. 18
Hình 1.3. Sơ đồ trình tự axit amin dự đoán của gelatinase ............................ 28
Hình 1.4. A) Hệ thống điều hòa sự biểu hiện của gen gelE bởi operon ......... 31
Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn xác định nồng độ protein................................. 61
Hình 2.2a. Cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus) ............................... 67
Hình 2.2b. Hệ thống giai ương thí nghiệm ..................................................... 67
Hình 2.3. Thức ăn công nghiệp dùng cho cá Mú chấm đen ........................... 68
Hình 3.1. Khả năng thủy phân gelatin (nồng độ 7,5 g/l) sang dạng lỏng của
chủng MD4 ...................................................................................................... 73
Hình 3.2. Vòng phân giải cơ chất gelatin của chủng vi khuẩn ....................... 73
Hình 3.3. Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường MPA (a), tế bào MD4 dưới
kính hiển vi điện tử quét (b) và nhuộm Gram (c) ........................................... 75
Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel
agarose 1,0% ................................................................................................... 76
Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loại dựa trên việc so sánh trình tự gen 16S
rRNA của chủng MD4 với các trình tự gen tương ứng của các chủng khác
trên GenBank................................................................................................... 78

Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen gelE từ DNA của E. faecalis
MD4. ............................................................................................................... 80
Hình 3.7. Điện di đồ kiểm tra plasmid đã mang gen. ..................................... 80
Hình 3.8. Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tách dòng bằng enzym giới hạn. 80
Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide của gen gelE từ chủng E. faecalis MD4
với trình tự của các gen gelE được đăng ký trên GenBank ........................... 83
Hình 3.10: Trình tự axit amin suy diễn của gelE của chủng E. faecalis MD484
Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm gen tinh sạch từ vector tách dòng và cắt mở
vòng vector biểu hiện pET-22b(+). ................................................................ 85
Hình 3.12. Điện di đồ DNA plasmid từ thể biến nạp (a) và plasmid tái tổ hợp
được xử lý bằng HindIII và SalI (b)................................................................ 85
Hình 3.13. Điện di đồ protein tái tổ hợp trên SDS-PAGE . ............................ 86


x

Hình 3.14. Hình ảnh sàng lọc các dòng E. coli BL21(DE3)[pET22b(+)-gelE]
trên môi trường thạch và hình ảnh kiểm tra hoạt tính GEL của các dòng trên
đĩa thạch đục lỗ....................................................................................... ........ 87
Hình 3.15. Ảnh hưởng của pH đến biểu hiện gelE tái tổ hợp ......................... 88
Hình 3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện gelE tái tổ hợp.................. 90
Hình 3.17 Điện di đồ GEL biểu hiện ở 37oC (a) và 34oC(b) trên gel SDSPAGE. ............................................................................................................. 91
Hình 3.18. Điện di đồ protein GEL tái tổ hợp biểu hiện ở các nồng độ IPTG
khác nhau trên gel SDS-PAGE. ...................................................................... 94
Hình 3.19. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp rGEL ........................ 95
Hình 3.20. Điện di đồ protein tái tổ hợp trước và sau tinh sạch GEL bằng cột
sắc ký ái lực ..................................................................................................... 97
Hình 3.21. Quy trình thu nhận gelatinase tái tổ hợp từ chủng E. coli BL21
(DE3) ) [pET 22(b+) –GelE]……………………………………………...…97
Hình 3.22. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của rGEL ………… ...... 100

Hình 3.23. Độ bền nhiệt của rGEL ............................................................... 100
Hình 3.24. Ảnh hưởng của pH tới hoạt động xúc tác của GEL .................... 101
Hình 3.25. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của GEL tái tổ hợp .................... 102
Hình 3.26. Ảnh hưởng của các chất tẩy rửa đến hoạt tính của rGEL ................ 105
Hình 3.27. Biến đổi vận tốc phản ứng theo nồng độ gelatinase (a) và đồ thị
Lineaweaver -Burk của gelatinase tái tổ hợp với cơ chất gelatin (b). .......... 106
Hình 3.28. Hiệu quả thủy phân gelatin ở các nồng độ gelatinase khác nhau 107
Hình 3.29. Hiệu suất thủy phân gelatin bằng gelatinase ở các mức nhiệt độ
khác nhau....................................................................................................... 108
Hình 3.30. Hiệu suất thủy phân gelatin bằng gelatinase ở các mức thời gian
thủy phân ....................................................................................................... 109
Hình 3.31. Tỷ lệ sống của cá Mú chấm đen khi kết thúc thí nghiệm ........... 113


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Gelatinase (GEL) là một trong những enzym được nghiên cứu nhiều
hiện nay với tác dụng thủy phân gelatin, pheromone, collagen, casein và
fibrinogen thành các đoạn peptit ngắn và các axít amin. Gelatinase là enzym
chứa kim loại, thuộc nhóm protease ngoại bào sử dụng trong ngành công
nghiệp hóa chất, y học, công nghệ thực phẩm...
Gelatinase tự nhiên được thu nhận từ nhiều loài vi khuẩn thuộc các chi
khác nhau như Staphylococcus, Pseudomonas, Aerromonas, Enterobacter,
Bacillus… Tuy nhiên, phần lớn vi khuẩn sinh gelatinase nói trên là các đối
tượng vi sinh vật (VSV) gây bệnh có thể gây hại đối với con người, động vật
nên không được sử dụng trực tiếp để sản xuất gelatinase. Ngoài ra, các vi
khuẩn tự nhiên sinh gelatinase có hoạt tính không cao.
Để khắc phục những tồn tại trên đối với nguồn gelatinase tự nhiên,

hướng nghiên cứu sản xuất gelatinase tái tổ hợp đã và đang được các nhà
khoa học, doanh nghiệp quan tâm nghiên cứu nhằm nâng cao hoạt tính
enzym, sản xuất ở quy mô lớn và ứng dụng rộng rãi. Ngoài ra, gelatinase tái
tổ hợp sản xuất được sẽ loại trừ tính độc của các chủng vi khuẩn tự nhiên, hạn
chế tác dụng gây hại tới con người hay động vật.
Một trong những phương pháp hiệu quả được chú trọng phát triển trên
thế giới là ứng dụng kỹ thuật di truyền và công nghệ lên men tạo ra các chủng
VSV tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp gelatinase tái tổ hợp (rGEL) hoạt
tính cao, sản lượng lớn và có khả năng ứng dụng trong công nghiệp. Trong
nhiều công bố, hoạt tính rGEL thu được cao hơn nhiều lần so với GEL từ
VSV tự nhiên. Trong số các hệ biểu hiện rGEL, Escherichia coli được xem là
một trong những hệ biểu hiện nhanh, hiệu quả rGEL và tạo cơ sở khoa học cho
nghiên cứu đặc tính enzym để phát triển nghiên cứu sâu hơn. Các nghiên cứu
trước đây đã công bố rGEL được biểu hiện từ E. coli BL21 (DE3) cho hoạt


2

tính gelatinase đạt 38,14 U/mg và thể hiện khả năng ứng dụng hiệu quả trong
thủy phân.
Gelatinase là

một trong

những

enzym quan trọng thuộc

metalloproteases và chúng được sử dụng rộng rãi không chỉ trong hóa học, y
tế và các ngành công nghiệp mà còn trong thực phẩm và khoa học sinh học cơ

bản. Cụ thể, trong lĩnh vực nghiên cứu về sinh hóa và chẩn đoán ung thư: các
enzym của họ metalloproteinase này có khả năng làm giảm hầu hết các thành
phần ngoại bào và đó là chất trung gian quan trọng trong việc tái tạo mô sinh
lý và trong quá trình bị bệnh lý chẩn đoán ung thư. Còn trong công nghiệp
thực phẩm, gelatinase được ứng dụng để thủy phân da bò, da cá thành các axít
amin.
Theo Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, cả nước có diện tích
trên 6.078 ha nuôi cá Tra đạt sản lượng xuất khẩu hơn 1,11 triệu tấn/năm và
có tổng giá trị xuất khẩu cá tra của Việt Nam đạt 1,78 tỷ USD năm 2017. Sản
phẩm xuất khẩu chủ yếu là cá phi-lê dạng miếng, nhưng theo ước tính cứ 2 ÷
2,5 kg cá nguyên liệu sẽ chế biến được 1 kg cá phi-lê, phụ thuộc vào kỹ thuật
chế biến và tùy sản phẩm cụ thể, còn lại 1 ÷ 1,5 kg sẽ nằm trong phần phụ
phẩm chế biến, trong đó da cá chiếm từ 4 ÷ 6% trên tổng lượng phụ phẩm. Từ
da cá có thể tạo ra những sản phẩm khác có giá trị kinh tế cao hơn và có nhiều
ứng dụng hơn trong thực tế, giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Vì thế, trong
những năm gần đây, nhiều công ty cổ phần Việt Nam như Công ty Vĩnh
Hoàn, công ty Nam Việt…đã tăng cường đầu tư các công nghệ để tối đa hóa
giá trị của các phụ phẩm từ nhà máy chế biến cá Tra như sản xuất dầu,
collagen, gelatin, thức ăn cho động vật.
Hơn thế, gelatin có thể được thủy phân trong môi trường kiềm hoặc
axit. Tuy nhiên, các công nghệ sản xuất này yêu cầu thiết bị có tính chịu
nhiệt, chịu axit hoặc base, đồng thời có thể gây ô nhiễm môi trường. Hơn nữa,
việc sử dụng các dung dịch base hoặc axit để thủy phân gelatin sẽ rất dễ gây
hiện tượng làm chuyển dạng đồng phân của các axít amin, đây là nguyên nhân


3

làm mất hoạt tính của axít amin. Vì vậy, công nghệ enzym được lựa chọn như
giải pháp an toàn.

Mặt khác, hiện nay nghề nuôi cá biển đang phát triển mạnh ở nước ta,
nguồn thức ăn của cá biển rất cần bổ sung các axít amin thiết yếu vào bằng
thức ăn bởi bản thân cá biển không tự tổng hợp được.
Xuất phát từ cơ sở thực tiễn như trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài
“Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da
cá Tra”.
2. Mục tiêu của luận án
Tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase có
nguồn gốc từ Enterococcus faecalis và ứng dụng gelatinase tái tổ hợp thủy
phân gelatin da cá Tra thành chế phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá
Mú chấm đen giai đoạn ương giống có hiệu quả.
3. Nội dung của luận án
- Sàng lọc nguồn gen gelE mã hóa GEL từ vi khuẩn phân lập tại Việt Nam.
- Tạo chủng E. coli tái tổ hợp sinh gelatinase và nghiên cứu điều kiện
lên men biểu hiện rGEL .
- Lựa chọn điều kiện thu hồi sản phẩm rGEL kỹ thuật và nghiên cứu
đặc tính của rGEL.
- Ứng dụng rGEL trong thủy phân gelatin da cá Tra
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học
Kết quả của luận án góp phần cung cấp thêm dữ liệu về nguồn gen các
chủng vi sinh vật tổng hợp gelatinase tự nhiên. Từ đó tạo chủng E. coli tái tổ
hợp sinh tổng hợp gelatinase hiệu quả và ứng dụng gelatinase trong thủy phân
da cá Tra tạo nguồn axít amin bổ sung vào thức ăn nuôi cá Mú giống.
Ý nghĩa thực tiễn


4

Đưa ra khảo sát ứng dụng gelatinase tái tổ hợp để thủy phân da cá Tra

thành bột axít amin và ứng dụng bổ sung vào thức ăn ương nuôi cá Mú chấm
đen nhằm nâng cao hiệu quả.
5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
5.1. Đối tượng nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn MD4 sinh gelatinase tại Bộ sưu tập vi sinh vật của
Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội; Các chủng E. coli
BL21(DE3), XL1-blue, nhận từ phòng thí nghiệm Genomics, Khoa Vi sinh vật học,
Trường đại học quốc gia Kyungpook, Hàn Quốc.- Da cá Tra được thu tại công tyence of pH control in the formation of inclusion bodies during
production

of

recombinant

sphingomyelinase-D

in Escherichia

coli. Microbial Cell Factories. 13:137. doi:10.1186/s12934-014-0137-9.
[30]. Chen H. Y and Tsai J.C., (1994), “Optimum dietary protein level for
growth of juvenile grouper (Epinephelus

malabaricus) fed

semipurified diets”, Aquaculture, 119: pp.265-271.
[31]. Chuang

YC., Chang

characterization

of

TM., Chang
the

gene

MC.
(empV)

(1997),

“Cloning

encoding

and

extracellular


127

metalloprotease from Vibrio vulnificus”, Gene. 1997 Apr 21;189(2),
pp.163-168.
[32]. Clermont A., Wedde M., Seitz V, et al. (2004), “Cloning and
expression of an inhibitor of microbial metalloproteinases from insects
contributing to innate immunity”. Biochemical Journal. 2004;382(Pt
1), pp.315-322.

[33]. De Clerck, E., Vanhoutte T., Hebb T., Geerinck J., Devos J., and De
Vos P. (2004), “Isolation, characterization, and identification of
bacterial contaminants in semifinal gelatin extracts”, Applied and
Environmental Microbiology, vol. 70, no.6, pp. 3664–3672.
[34]. Del Papa M.F., Lynn E. Hancock, Vinai C. Thomas , and Marta
Perego, (2007), “Full Activation of Enterococcus faecalis Gelatinase
by a C-Terminal Proteolytic Cleavage”. Journal Bacteriol. 189( 24),
pp.8835-8843.
[35]. Dragutinovic, V.V.; Radovanovic, N.S.; Izrael-Zivkovic, L.T.; Vrvic,
M.M.; (2006), Detection of gelatinase B activity in serum of gastric
cancer patients World J. Gastroenterol. 12, 105-109.
[36]. Eastoe, J. E., & Leach, A. A. (1977), Chemical constitution of gelatin.
In A. G. Ward, &A. Courts (Eds.),The science and technology of
gelatin(p73–107). New York:Academic Press.
[37]. Einsfeldt K, Severo Júnior JB, Argondizzo APC, Medeiros MA, Alves
TLM, Almeida RV, Larentis AL. (2011), Cloning and expression of
protease ClpP from Streptococcus pneumoniae in Escherichia coli:
study of the influence of kanamycin and IPTG concentration on cell
growth,

recombinant

protein

production

and

plasmid

stability. Vaccine. 29:7136–7143. doi: 10.1016/j.vaccine.2011.05.073.
[38]. Ekpenyong M., Asitok A., Odey A. and Antai S. (2018), “Production
and activity kinetics of gelatinase by Serratia sp.SLO3”, Nigerian
Journal of Biopesticides 1 (1), pp.70-82.


128

[39]. Evans, D. G. & Wardlaw, A. C. (1953), “Gelatinase and Collagenase
Production by certain Species of Bucillus”, Journal gen. Microbiol. 8,
pp.481-487.
[40]. Farina AR., Mackay AR. (2014), “Gelatinase B/MMP-9 in Tumour
Pathogenesis and Progression”, Cancers (Basel). Jan 27;6(1), pp.240296.
[41]. Federica V, Loredano P, Gianluca Mo, Luca F, Flavia M, Luciano P
(2010), Production of recombinant cholesterol oxidase containing
covalently bound FAD in Escherichia coli. BMC Biotechnology 10:33
[42]. Galloway-Pena J.R., Bourgogne A., Qin X. and Murray B.E. (2011),
“Diversity of the fsr-gelE region of Enterococcus faecalis but
conservation in strains with partial deletion of the fsr operon”, Appl.
Environment. Microbiol. 77, pp.442–451.
[43]. Gao Xiang, Wang Jue, Yu Da-Qi, Bian Fei, Xie Bin-Bin Chen , XiuLan Zhou, Bai-Cheng, Lai Lu-Hua, Wang Zhi-Xin, Wu Jia-Wei, Zhang
Yu-Zhong. (2010), “Structural basis for the autoprocessing of zinc
metalloproteases in the thermolysin family”, Proceedings of the
National Academy of Sciences Oct 2010, 107 (41), pp.17569-17574.
[44]. Giri N.A., Suwirya and Marzuqi (2004), “Optimum level of dietary
protein and lipid for rearing juvenile tiger grouper (Epinephelus
fuscoguttatus)” in Rimmer, M.A., McBride S.,& William K.C., (edc),
Advances in grouper aquaculture, ACIAR, Canberra, Australia, pp.92-94.
[45]. Giri N.A. (1998), “ Nutritional aspect for supporting breeding and seed
production of grouper”, Prosiding seminar Technology Perikanan

Pantai, Denpasar, Bali, 6-7 Agustus 1998. Pp.44-51.
[46]. Gómez-Guillén M.C., & Montero P. (2001), “Extraction of gelatin
from megrim (Lepidorhombus boscii) skins with several organic acids”,
Journal of Food Science, 66(2), pp.213–216.


129

[47]. Gómez-Guillén M.C., Giménez B., López-Caballero M.E. & Montero
M.P. (2011), Funtional and bioactive properties of collagen and gelatin
from alternative sources: A review. Food Hydrocoilloid 25, pp.1813 –
1827.
[48]. Gómez-Guillén M.C., Turnay J., Ferna´ndez-Diaz M. D., Ulmo, N.,
Lizarbe, M. A., & Montero, P. (2002), “Structural and physical
properties of gelatin extracted from different marine speices: a
comparative study”, Food Hydrocolloids, 16, pp.25–34.
[49]. Gomis-Rüth FX, Maskos K, Betz M, Bergner A, Huber R, Suzuki K,
Yoshida N, Nagase H, Brew K, Bourenkov GP, Bartunik H, Bode W,
(1997),

Mechanism

of

inhibition

of

the

human

matrix

metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1. Nature.
[50]. Göõz M, Göõz P, Smolka AJ..(2001), “Epithelial and bacterial
metalloproteinases and their inhibitors in H. pylori infection of human
gastric cells” Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281(3):pp.823832.
[51]. Grossman Shlomo and Bergman Margalit, (1992), Process for the
production of gelatin from fish skins, Freepatentsonline.
[52]. Gudmundsson, M., Hafsteinsson, H. (1997), “Gelatin from cod skins as
affected by chemical treatments”, journal of food science, 62, pp.37 – 39.
[53]. Gútiez L., Borrero J, Jiménez JJ., Gómez-Sala B., Recio I., Cintas
LM., Herranz C., Hernández PE. (2014), “Genetic and biochemical
evidence that recombinant Enterococcus spp. strains expressing
gelatinase (GelE) produce bovine milk-derived hydrolysates with high
angiotensin converting enzyme-inhibitory activity (ACE-IA)” Journal
Agric Food Chem. 18;62(24), pp.5555-5564.
[54]. Haard N.F., Simpson B.K. & Sikorski Z.E. (1994), “Biotechnological
applications of seafood proteins and other nitrogenous compounds”. In


130

Z.E. Sikorski, B.S.Pan & F.Shahidi (Eds.), Seafood proteins. New
York, NY: Chapman and Hall, pp.194-216.
[55]. Haider M. Hamza. (2006), “Partial Purification of Gelatinase Enzyme
from Local Isolate of Brevibacillus laterosporus”, National Journal of
Chemistry, Vol 23, pp.437-442.
[56]. Hisano T., Abe S., Wakashiro M., Kimura A., Murata K. (1989),

“Isolation and properties of a collagenase with caseinolytic activity
from a Pseudomonas sp.”, Journal Fermen Bioeng, 68 (6), pp.399-403.
[57]. Holmes M.A., Matthews B.W. (1982), “Structure of thermolysin
refined at 1.6 A resolution”, Journal Mol. Biol. 160, pp.623-639.
[58]. Hu A. W., Hartley J. L., Jordan H. J. (2007), Acid nucleic ladders,
Patent No. 6924098B2, US Patent Issued on January 25.
[59]. Huang J.W., Tian L.X., Du X.Y., Yang H.J., Liu Y.J. (2005),
“Pyridoxine deficiency of grouper, Epinephelus coioides Physiological
and biochemical alteration”, Fish Physiol Biochem 31, pp.331-337.
[60]. Hudson C.B. (1994), Gelatine – Relating structure and chemistry to
functionality, in K. Nishihari and E. Doi, Food Hydrocolloids:
Structures, Properties, and Functions. New York: Plenum.
[61]. Ibrahim A.S.S, Al-Salamah A.A. (2009), “Optimisation of media and
cultivation conditions for alkaline protease production by alkaliphilic
Bacillus halodurans”, Res. J. Microbiol. 4, pp.251-259.
[62]. Islam RS, Tisi D, Levy MS, Lye GJ (2007), Framework for the rapid
optimization

of

soluble

protein

expression

in Escherichia

coli combining microscale experiments and statistical experimental
design. Biotechnol Prog. 23:785–793. doi: 10.1002/bp070059a.

[63]. Inouye K., Minoda M., Takita T., Sakurama H., Hashida Y., Kusano
M., Yasukawa K. (2006), “Extracellular production of recombinant
thermolysin expressed in Escherichia coli, and its purification and
enzymatic characterization”, Protein Expr Purif. Apr;46(2), pp.248-255.


131

[64]. Jamilah B., Harvinder K.G. (2002), “Properties of gelatins from skins
of fish-black tilapia (Oreochromis mossambicus) and red tilapia
(Oreochromis nilotica)”, Food Chemistry 77, pp.81–84.
[65]. Jie Y, Shou FZ, Ya FM, Yi HL (2004), Effects of lactose as an inducer
on expression of Helicobacter pylori rUreB and rHpaA and
Escherichia coli rLTKA63 and rLTB. World J Gastroenterol
10(12):1755-1758.
[66]. Jongjareonrak A., Rawdkuen S., Chaijan M., Benjakul S., Osako K.,
Tanaka M.(2010), “ Chemical compositions and characterisation of
skin gelatin from farmed giant catfish (Pangasianodon gigas)”, LWTFood Science and Technology, v. 43, pp.161-165.
[67]. Karim A.A., Bhat R. (2009), “Fish gelatin: properties, challenges and
prospects as an alternative to mammalian gelatins”, Food Hydrocolloids,
23, pp.563 -576.
[68]. Keenan T.R. (1994), Gelatin, in J. Kroschwitz (ed.) Kirk-Othmer
Encyclopedia of Chemical Technology. 12, pp.406-416.
[69]. Kessler Efrat, Mary Safrin,Jean Gustin K., Dennis Ohman E. (2009),
“Elastase and the LasA Protease of Pseudomonas aeruginosa Are
Secreted with Their Propeptides”, Appl Microbiol Biotechnol. 2009
Jul;83(6), pp.1055-1065.
[70]. Kiefhaber T., Rudolph R., Kohler H.H., Buchner J. (1991), Protein
aggregation in vitro and in vivo: a quantitative model of the kinetic
competition between folding and aggregation. Biotechnology (N Y), 9:

825-829
[71]. Kim SK, Choi YR, Park PJ, Choi JH, Moon SH. (2000), “Screening of
biofunctional peptides from cod processing wastes”, Journal of the
Korean Society of Agricultural Chemistry and Biotechnology 43,
pp.225-227.


132

[72]. Kröger M., Tschesche H. (1997), “Cloning, expression and activation of a
truncated 92-kDa gelatinase minienzyme”. Gene. 196(1-2), pp.175-180.
[73]. Kumar S., Ram Karan; Sanjay Kapoor; S.P. Singh; S.K. Khare (2012),
Screening and isolation of halophilic bacteria producing industrially
important

enzymes.

Braz.

J.

Microbiol. 43 (4 ).

/>[74]. Laemmli, U.K. (1970), « Cleavage of structural proteins during the
asembly of the head of bacteriophage T4 », Nature. 227, pp.680 -685.
[75]. Larentis AL. (2011), Cloning and expression of protease ClpP
from Streptococcus pneumoniae in Escherichia coli: study of the influence
of kanamycin and IPTG concentration on cell growth, recombinant protein
production

and

plasmid

stability. Vaccine.

29:7136–7143.

doi:

10.1016/j.vaccine.2011.05.073.
[76]. Lin Y.H., Shiau S.Y. (2003), “Dietary lipid requirement of grouper,
Epinephelus malabaricus, and efectets on immune responses”,
Aquaculture 225, pp.243- 250.
[77]. Liu H., Li, D., & Guo, S. (2008), “Rheological properties of channel
catfish (Ictalurus punctaus) gelatine from fish skins preserved by
different methods”, .LWT – Food.
[78]. Lo PK, Hassan O, Ahmad A, Muhammad Mahadi N, Illias RM (2007),
Excretory over-expression of Bacillussp. G1 cyclodextrin glucanotransferase
(CGTase) in Escherichia coli: Optimization of the cultivation conditions by
response surface methodology. Enzyme Microb Technol. 40: pp.1256–1263.
doi: 10.1016/j.enzmictec.2006.09.020.
[79]. Luo Z., Liu Y.J., Mai K.S., Liu D.H., Tan X.Y. (2004), “Optimal
dietary protein requirement of grouper (Epinephelus coioides) fed
isoenergetic dier in floating net cages”, Aquaculture nutrition 10,
pp.247-252.


133

[80]. Luo Z., Liu Y.J., Mai K.S., Tian L.X., Yang H.J., Tan X.Y., Liu D.H.
(2005),

Dietaryl-methionine

requirement

of

juvenile

grouper

Epinephelus coioides at a constant dietary cystine level, Aquaculture,
249, pp.409-418.
[81]. Lupatsch, I., Kissil, G.Wm. (2005), “Feed formulations based on
energy and protein demands in white grouper (Epinephelus aeneus)”,
Aquaculture 248, pp.83–95.
[82]. Mahmoud SM Mohamed, Mary S Khalil, Mohamed A Tagrida and
Youssef A Mawgoud (2017), Purification of gelatinase from the
bacteria contaminating gelatin production process. Research Journal of
Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. 8(4) pp.914- 930.
[83]. Makinen P. L., Clewell D. B., An F. & Makinen, K. K. (1989),
“Purification and substrate specificity of a strongly hydrophobic
extracellular metalloendopeptidase ("gelatinase") from Streptococcus
faecalis (strain 0G1-10)”, The Journal of biological chemistry, 264 (6),
pp.3325-3334.
[84]. Maurer LM, Yohannes E, BonDurant SS, Radmacher M, Slonczewski
JL.(2005), pH regulates genes for flagellar motility, catabolism, and
oxidative stress in Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 187:304–319.

doi: 10.1128/JB.187.1.304-319.2005.
[85]. Makinen P., Makinen K.K. (1994), “The Enterococcus faecalis
extracellular

metalloendopeptidase

(EC

3.4.24.30;

coccolysin)

inactivates human endothelin at bonds involving hydrophobic amino
acid residues”, Biochem. Biophys. Res. Commun. 200, pp.981-985.
[86]. Manjula R. (2014), Protease Production by haloarchaea Natrinema sp.
BTSH10 isolated from salt pan of South India. Doctor of Philosophy in
Biotechnology. India.


134

[87]. Maria Florencia D. P., Lynn E. H., Vinai C. T., Marta P. (2007), Full
Activation of Enterococcus faecalis Gelatinase by a C-Terminal
Proteolytic Cleavage. J. Bacteriol. Vol. 189, No.24, p8835-8843 .
[88]. McCawley L.J., Matrisian LM. (2001), “Matrix metalloproteinases:
they're not just for matrix anymore”, Curr Opin Cell Biol 13, pp.534–540.
[89]. Mei-Shiuan Yu and Chia-Yin Lee, (1999), “Expression and
characterization of the prtV gene encoding a collagenase from Vibrio
parahaemolyticus in Escherichia coli”, Microbiology, 145, pp.143-150.
[90]. Miao S., Tang H.C. (2002), “Bioeconomic analysis of improving

management productivity regarding grouper Epinephelus malabaricus
farming in Taiwan”, Aquaculture 211, pp.151–169.
[91]. Millamenna O.M. and Toledo J.D.(2004), “Development of fomulated
feeds for grow out culture of grouper (Epinephelus coioides) –tanks
and field study”, in Rimmer M.A., McBride S., &Williams K.C(eds)
Advances in grouper aquaculture. ACIAR, Canberra, Australia,
pp.115-118.
[92]. Monaco, S.; Gioia, M.; Rodriguez, J.; Fasciglione, G.F.; Di Pierro, D.;
Lupidi, G.; Krippahl, L.; Marini, S.; Coletta, M.; (2007), Modulation of
the proteolytic activity of matrix metalloproteinase-2 (gelatinase A) on
fibrinogen. Biochem. J. 402, 503-513.
[93]. Montero P., Borderıas J., Turnay J., Lizarbe M.A. (1999),
“Characterization of hake Merluccius merluccius L.) and trout (Salmo
irideus Gibb.) collagen. Journal Agricultue Food.
[94]. Montero P., Gómez-Guillén M.C. (2000), “Extracting conditions for
megrim (Lepidorhombus boscii) skin collagen affect functional properties
of the resultant gelatine”, Journal Food Science 65, pp.434-438.
[95]. Moon, H. Y. and D. M. Gatlin III. (1991), “Total sulphur amino acid
requirement of juvenile red drum, Sciaenops ocellatus” Aquaculture
95, pp.97 – 106.


135

[96]. Murphy G., McAlpine C.G., Poll C.T., Reynolds J.J. (1985),
"Purification and characterization of a bone metalloproteinase that
degrades gelatin and types IV and V collagen". Biochim. Biophys.
Acta. 831, pp.49–58.
[97]. Murray, B. E. (1990), “The life and times of the enterococcus”, Clin.
Microbiol.Rev. 3, pp.46–65.

[98]. Muyonga, J.H., Colec, C.G.B. & Duodub, K.G. (2004), “Extraction and
physicochemical characterisation of Nile perch (Lates niloticus) skin
and bone gelatin” Food Hydrocolloids8: pp.581-592.
[99]. Nagai T., Suzuki N. (2000), “Preparation and characterization of
several fish bone collagen” Journal Food Biochemical. 2000;24,
pp.427–436.
[100]. Nagase H., Woessner J.F. (1999), “Matrix metalloproteinases”,
Journal Biol Chem 274, pp.21491 -21494.
[101]. Nagase Hideaki., Robert Visse.,
and

function

of

matrix

Murphy Gillian (2006), “Structure
metalloproteinases

and

TIMPs “,

Cardiovascular Research, Volume 69, Issue 3, pp.562–573.
[102]. Nakayama J., Chen S., Oyama N., Nishiguchi K., Azab E. A., Tanaka
E.,

Kariyama

R.,

and

Sonomoto

(2006),

“Revised

model

for Enterococcus faecalis fsr quorum-sensing system: the small open
reading frame fsrD encodes the gelatinase biosynthesis-activating
pheromone

propeptide

corresponding

to

staphylococcal

AgrD”, Journal Bacteriol. 188, pp.8321-8326.
[103]. Nalinanon S., Benjakul S., Visessanguan W., Kishimura H. (2008),
“Tuna Pepsin: characteristics and its use for collagen extraction from
the skin of threadfin bream (Nemipterus spp.)”, Journal Food Science
73, C413–C419.
[104]. New England Biolabs (2006), “IMPACTTM – TWIN: Purification,

ligation and cyclization of recombinant proteins using self-cleavable