Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích auramin o trong thức ăn chăn nuôi bằng sắc ký lỏng khối phổ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
____________________

LÊ THỊ NHƢ THỦY

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
AURAMIN O TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI
BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
____________________

LÊ THỊ NHƢ THỦY

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
AURAMIN O TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI
BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA

HỌC

PGS.TS NGUYỄN VĂN RI

PGS.TS. TẠ THỊ THẢO


Hà Nội - Năm 2018
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi.Các số liệu và
kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ
công trình nào trước đó.
Lê Thị Nhƣ Thủy



LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Tạ Thị Thảo, chủ nhiệm Bộ
môn Hóa Phân tích - Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học
Quốc gia Hà nội đã tận tình hướng dẫn về chuyên môn, phương pháp nghiên cứu và
tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Xin gửi lời trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học và
các thầy, cô giáo Khoa Hóa- Trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã tận tình
dạy dỗ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các nội dung học tập và
thực hiện đề tài thuận lợi.
Xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đ ạo công ty, Phụ trách quản lý Phòng Thử
Nghiệm 1- Công ty CP Chứng nhận và Giám định VinaCert đã tạo điề u kiê ̣n , giúp
đỡ tôi trong quá trình triển khai nghiên cứu đề tài.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp và các

bạn cùng lớp Cao học Hóa phân tích K26(2015-2017) đã giúp đỡ và động viên tôi
trong hai năm học tập và quá trình làm luận văn.
Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2017


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH VẼ
BẢNG CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................1
1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ...........................................................................3
1.1

Tình hình sử dụng chất tạo màu trong thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam
.............................................................................................................3

1.2

Tổng quan về Auramin O ....................................................................4

1.3

Các phương pháp xác định ..................................................................6
1.3.1 Phương pháp quang phổ .............................................................6
1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ......................7
1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) ..........9

1.4

Phương pháp tách Auramin O ra khỏi nền mẫu ................................14

1.4.1 Lựa chọn dung môi chiết lỏng-lỏng .........................................14
1.4.2 Chiết pha rắn .............................................................................15
1.4.3 Tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu bằng phương pháp mặt mục

tiêu tâm xoay ..................................................................................................15
2 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........18
2.1

Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu ....................................................18
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ...............................................................18
2.1.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................18

2.2

Hóa chất, dụng cụ và thiết bị .............................................................18
2.2.1 Hóa chất ....................................................................................18
2.2.2 Thiết bị ......................................................................................19

2.3

Phương pháp nghiên cứu ...................................................................20
2.3.1 Phương pháp lấy mẫu ...............................................................20


2.3.2 Phương pháp phân tích mẫu .....................................................20
2.3.3 Phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm và xử lý kết quả ............22
3 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................23
3.1

Tối ưu hóa điều kiện phân tích trên hệ thống UPLC-MS/MS ..........23

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ MS/MS ....................................23
3.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện phân tích trên hệ thống UPLC .........25

3.2

Khảo sát giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) và khoảng tuyến tính

xác định sự phụ thuộc tín hiệu đo vào nồng độ chất phân tích .................................31
3.2.1 Giới hạn phát hiện thiết bị ........................................................31
3.2.2 Khoảng tuyến tính ....................................................................32
3.3

Tối ưu hóa phương pháp chiết Auramin O ra khỏi nền mẫu ............33
3.3.1 Khảo sát đơn biến để chọn các thông số ảnh hưởng và khoảng

biến thiên

..................................................................................................33

3.3.2 Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu vớipp mặt mục tiêu tâm xoay
(RSM)

..................................................................................................36

3.4

Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp .......................................45
3.4.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc .............................................................45
3.4.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .......47
3.4.3 Xây dựng đường chuẩn.............................................................48

3.4.4 Độ chính xác của phương pháp phân tích ................................52
3.4.5 Ước lượng độ không đảm bảo đo .............................................55

3.5

Phân tích mẫu thực tế ........................................................................57

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................62
PHỤ LỤC.............................................................................................................69


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1. Điều kiện nguồn Ion hóa ESI + ..................................................23
Bảng 3.2. Điều kiện tối ưu hóa trên MS/MS ...............................................24
Bảng 3.3. Chương trình đẳng dòng pha động ..............................................26
Bảng 3.4. Chương trình gradient pha động .................................................27
Bảng 3.5. Diện tích pic khi thay đổi tốc độ dòng .......................................29
Bảng 3.6. Kết quả tiêm lặp lại 6 lẫn mẫu chuẩn tại nồng độ 0,02 µg/kg ...31
Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi khi sử dụng ba loại dung môi chiết .................33
Bảng 3.8. Hiệu suất thu hồi khảo sát trên cột chiết pha rắn.........................35
Bảng 3.9. Hiệu suất thu hồi ở các tỉ lệ dung môi rửa giải khác nhau ..........36
Bảng 3.10. Khoảng biến thiên của các yếu tố cần khảo sát .........................37
Bảng 3.11. Kết quả thí nghiệm tiến hành theo mô hình bậc 2 tâm xoay .....38
Bảng 3.12. Bảng hệ số thực của phương trình hồi quy ................................39
Bảng 3.13. Phân tích phương sai của hiệu suất thu hồi AO ........................40
Bảng 3.14. Sai số giữa kết quả thực nghiệm với kết quả tính từ mô hình ...40
Bảng 3.15. Kết quả phân tích 6 lần lặp lại tại điều kiện tối ưu. ...................43
Bảng 3.16. Ion mẹ và 2 ion con của AO .....................................................47
Bảng 3.17. Tỉ lệ S/N phân tích 6 lần lặp lại tại nồng độ 10 µg/kg ..............47

Bảng 3.18. Sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ Auramin O ...........48
Bảng 3.19. Sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ AO .......................50
Bảng 3.20. Kết quả phê duyệt độ chính xác ................................................53
Bảng 3.21. Bảng tính kết quả độ không đảm bảo đo của phương pháp ......57
Bảng 3.22. Kết quả phân tích mẫu thực tế ...................................................58


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Mô hình hệ thống LC-MS/MS .....................................................10
Hình 1.2. Tứ cực .........................................................................................11
Hình 3.1. Sắc đồ 3 mảnh ion con tại điều kiện tối ưu hóa trên MS/MS .....24
Hình 3.2. Cơ chế phân mảnh phổ khối của AO ...........................................25
Hình 3.3. Sắc đồ chương trình đẳng dòng pha động 1 và 2 .........................26
Hình 3.4. Sắc đồ các chương trình 3,4,5 chạy gradient ...............................28
Hình 3.5. Sắc đồ tại tốc độ dòng 0,1 ml/phút ..............................................29
Hình 3.6. Sắc đồ tại tốc độ dòng 0,2 ml/phút ..............................................30
Hình 3.7. Sắc đồ tại tốc độ dòng 0,3 ml/phút ..............................................30
Hình 3.8. Sắc đồ tại nồng độ 0,02 µg/kg ....................................................32
Hình 3.9. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Auramin O .............32
Hình 3.10. Công thức cấu tạo của chất tạo hạt nhồi trong cột HLB ............35
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn mặt mục tiêu phụ thuộc thuộc tỉ lệ dung môi
chiết và khối lượng mẫu và thể tích rửa giải. ............................................................42
Hình 3.12. Các đường đồng mức biểu diễn hiệu suất thu hồi AO phụ thuộc
tỉ lệ dung môi chiết trên khối lượng mẫu và thể tích rửa giải ...................................42
Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn .........................46
Hình 3.14. Sắc đồ tại nồng độ 10 µg/kg ......................................................48
Hình 3.15. Đường chuẩn AO trong dung môi MeOH .................................49
Hình 3.16. Đường chuẩn Auramin O trong nền mẫu...................................51
Hình 3.17. Đường chuẩn AO trên nền mẫu và dung môi MeOH ................51
Hình 3.18. Sắc đồ không phát hiện pic của các mẫu phân tích thực tế .......59

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Tiếng anh

Tiếng Việt

AOAC

Association of Official Analytical

Hiệp hội các cộng đồng phân

Communities

tích chính thức

AO

Auramine O

Vàng Ô

TĂCN

Animal Feed

Thức ăn chăn nuôi

APCI

Atmospheric pressure chemical
ionization

Chế độ ion hóa hóa học ở áp
suất khí quyển

CE

Collision Energy

Năng lượng va chạm

DAD

Diode array detector

Đầu dò mảng diot

ELISA

Enzyme-Linked ImmunoSorbent
Assay

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch
liên kết với enzyme

ESI

Electronspray ionization

Ion hóa phun điện tử

HLB

Hydrophilic – lipophilic Balance

Cân bằng ưa nước-ưa dầu

IARC

International Agency for
Reasearch on Cancer

Cơ quan nghiên cứu Ung thư
quốc tế

IDL

Instrumental detection limit

Giới hạn phát hiện của thiết bị

KPH

Not detected

Không phát hiện

MRM

Multiple Reaction Monitoring

Kiểm soát đa phản ứng

LC-MS/MS

Liquid chromatography tandem

Sắc ký lỏng ghép khối phổ 2

mass spectrometry

lần

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lượng

PDA

Photo diode array

Đầu dò Photo diot

QC

Qualiy control

Mẫu kiểm soát

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SCX

Strong Cation Exchange

Nhựa trao đổi cation mạnh

S/N

Signal to Noise

Tín hiệu nhiễu trên nền

SPE

Solid phase extraction

Chiết pha rắn

UPLC
WAX

Ultra Performance Liquid
Chromatography
Weak Anion Exchange

Siêu sắc ký lỏng hiệu năng cao
Nhựa trao đổi anion axit yếu


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, công nghệ chế biến thức ăn chăn nuôi (TĂCN)
tại Việt Nam có xu hướng tăng tuy nhiên vẫn không đáp ứng được nhu cầu trong
nước. Cùng với việc phát triển mạnh mẽ về quy mô, sản lượng, chủng loại thì chất
lượng của sản phẩm cũng còn khá nhiều bất cập như công bố chất lượng không
đúngtrên bao bì, nguyên liệu không đạt chuẩn, tỷ lệ các chất phụ gia quá cao, lạm
dụng kháng sinh, chất cấm nhằm mục đích tạo nạc, đặc biệt việc sử dụng chất tạo
màu công nghiệp trong TĂCNđang gây bức xúc dư luận, được người tiêu dùng, các
cơ quan quản lý, phương tiện thông tin đại chúng rất quan tâm.
Những năm gần đây, cục cảnh sát phòng chống tội phạm về môi trường đã
phát hiện hàng trăm tấn thức ăn chăn nuôi tại các cơ sở sản xuất ở Việt Nam đã sử
dụng chất tạo màu công nghiệp, chủ yếu là Auramin O (AO), để tạo màu vàng cho
thức ăn chăn nuôi. Auramin O là chất tạo màu công nghiệp, căn cứ vào cấu tạo hóa
học, tính chất vật lý hóa học và độc tính của AO, Viện Ung thư quốc gia NCI Hoa

Kỳ, Cơ quan Nghiên cứu Ung thư quốc tế IRAC của Tổ chức Y tế thế giới WHO
xếp các thuốc nhuộm vat yellow trong đó có AO thuộc nhóm 3 các chất gây ung
thư[52].Ngoài ra còn nhiều thí nghiệm trên chuột cho thấy chất AO còn gây hại các
tế bào gan, thận và tủy xương [18].Vì vậy khi vật nuôi ăn phải thức ăn có chứa AO
sẽ gây tổn hại trực tiếp đến sức khỏe gia súc, gia cầm. Tồn dư của loại hóa chất này
trong thực phẩm sẽ dẫn đến nguy cơ gây ung thư cho con người.
Hầu hết các nhà nghiên cứu đều chú ý nhiều hơn đến việc xác định hàm
lượng thuốc nhuộm trong thực phẩm vì mối liên hệ trực tiếp đối với sức khoẻ con
người. Tuy nhiên, như chúng ta đã biết, có rất nhiều chất tạo màu độc hại được
thêm vào thức ăn cho động vật, những chất này sẽ chuyển hoá và tồn dư trong cơ
thể vật nuôi và chính những vật nuôi này lại là nguồn thực phẩm cho con người. Vì
vậy việc phát hiện sớm các chất độc hại này trong TĂCN là để ngăn ngừa chúng
bước vào chuỗi thức ăn của con người, đồng thời tăng chất lượng vật nuôi, đảm bảo
một nguồn thực phẩm sạch cung cấp trong nước và xuất khẩu nước ngoài.Ở nước
ta, kể từ khi các cơ quan chức năng phát hiện AO được các cơ sở sản xuất TĂCN sử

1


dụng làm chất tạo màu, đã có rất nhiều phòng thử nghiệm Việt Nam nghiên cứu
phương pháp phân tích loại chất này bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, tuy nhiên,
hiện nay vẫn chưa có báo cáo nghiên cứu chính thức nào về việc đánh giá các yếu tố
ảnh hưởng và tối ưu hóa phương pháp xác định Auramin O bằng LC-MS/MS. Từ
những yêu cầu cấp thiết trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu phát triển phƣơng pháp phân tích Auramin O trong thức
ăn chăn nuôi bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)”
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài: Nghiên cứu đã áp dụng kỹ thuật
phân tích hiện đại sắc ký lỏng khối phổi 2 lần (LC-MS/MS) để phân tích nhằm đưa
ra những kết quả đáng tin cậy. Việc sử dụng phương pháp mặt mục tiêu tâm xoay
để tối ưu hóa các điều kiện phân tích giúp tránh lãng phí thời gian phân tích, hóa

chất sử dụng nhưng vẫn đạt được hệ số thu hồi cao nhất. Quy trình phân tích đã
được ứng dụng để xác định AO trong mẫu thực tế tại phòng thí nghiệm.
.

2


1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tình hình sử dụng chất tạo màu trong thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam
Thức ăn chăn nuôi là những sản phẩm mà vật nuôi ăn, uống ở dạng tươi
sống hoặc đã qua chế biến, bảo quản, bao gồm: nguyên liệu TĂCN hay thức ăn đơn,
thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh, thức ăn đậm đặc, thức ăn bổ sung, phụ gia TĂCN,
premix, hoạt chất và chất mang [8].
Thức ăn chăn nuôi hoàn chỉnh là hỗn hợp của nhiều nguyên liệu thức ăn
được phối chế theo công thức nhất định đảm bảo có đủ các chất dinh dưỡng để duy
trì đời sống và khả năng sản xuất vật nuôi theo từng giai đoạn sinh trưởng của chu
kỳ sản xuất mà không cần thêm bất kỳ loại thức ăn nào khác ngoài nước uống [8].
Chất lượng của thực phẩm thường được đánh giá thông qua màu sắc của nó.
Tạo màu trong thực phẩm nói chung, hay tạo màu trong TĂCN nói riêng đều nhằm
mục đích: phục hồi lại màu sắc cho sản phẩm do những biến đổi trong tự nhiên, bảo
quản, chế biến, đóng gói, phân phối…; làm tăng độ đồng nhất cho sản phẩm; giúp
duy trì những tính chất đặc chung của sản phẩm; tăng cường màu sắc, làm tăng tính
hấp dẫn của sản phẩm. Việc sử dụng phụ gia tạo màu có những yêu cầu bắt buộc
như: không dùng để che đậy khuyết điểm của thực phẩm, không độc tính, chất màu
sử dụng là những chất không gây ung thư, những sản phẩm chuyển hóa của những
chất màu trong quá trình chế biến và bảo quản không gây độc hại… [42].
Thức ăn chăn nuôi được sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau

như: cám gạo, khoai lang, ngô, đỗ tương, bột thịt xương, bột đầu tôm…tùy thuộc
vào mỗi nguồn nguyên liệu, các cơ sở sản xuất sẽ tạo cho sản phẩm có màu đặc
trưng theo từng nguyên liệu bằng cách trộn với các chất phẩm màu tự nhiên hoặc
tổng hợp. Tuy nhiên, nhằm tính toán đến lợi nhuận, một số cơ sở sản xuất đã không
sử dụng những phụ gia tạo màu được phép [3] như vàng curcumin, vàng Riboflavin,
tartrazin, sunset FCF với hàm lượng được phép mà sử dụng chất tạo màu công
nghiệp, rẻ tiền và vô cùng độc hại như AO.Điều đáng lo ngại, dù trên thùng sản
phẩm hóa chất công nghiệp đều khuyến cáo chỉ sử dụng trong công nghiệp không
sử dụng trong TĂCNvà thực phẩm nhưng các công ty sản xuất TĂCN vẫn cố tình

3


mua và sử dụng sai mục đích nhằm trục lợi. Chính điều này đã gây hoang man và
bức xúc trong toàn xã hội.
Để chấn chỉnh tình trạng sử dụng chất cấm trong chăn nuôi, Bộ Nông
Nghiệp và Phát triển nông thôn đã ban hành thông tư số 42 về danh mục bổ sung
hóa chất, kháng sinh cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong TĂCN
gia súc, gia cầm tại Việt Nam[1].Theo đó, bổ sung 5 loại Vàng Ô (vat yellow) vào
danh mục này gồm: vat yellow 1, vat yellow 2, vat yellow 3, vat yellow 4, Auramin
và các dẫn xuất của Auramin hay còn được gọi là màu vàng cơ bản 2, sử dụng trong
công nghệ dệt nhuộm. Tuy nhiên, hiện nay vẫn còn nhiều cơ sở sản xuất lén sử
dụng AO để tạo màu vàng cho thức ăn gia súc gia cầm vì vậy việc định lượng chính
xác hàm lượng chất này trong TĂCN là vấn đề cần được quan tâm trong công tác
kiểm tra chất lượng sản phẩm. Đồng thời cũng rất cần thiết về mặt quản lý để đánh
giá tình hình mức độ sử dụng AO trong chăn nuôi và đưa ra những cảnh báo về vệ
sinh an toàn thực phẩm nếu có,nhằm kiểm soát việc sử dụng chất cấm cũng như
đảm bảo cung cấp một nguồn thực phẩm sạch trong nội địa và xuất khẩu.
1.2 Tổng quan về Auramin O
Auramine O thuộc nhóm thuốc nhuộm Diphenylmethane, trong nhóm này

có hai loại thuốc nhuộm quan trọng có tính thương mại là Auramin O và Auramine
G. Ở dạng tinh khiết, tinh thể Auramin có màu vàng, tan tốt trong nước và ethanol
[24], [33].
Công thức cấu tạo của Auramin O [44]:

Công thức phân tử: C17H21N3.HCl
Tên đầy đủ của AO:

4


4,4’-Carbonimidoylbis[N,N-dimethylbenzenamine]hydrochlorid
Tên thương mại: Auramin O, Vàng Ô, basic yellow 2
Auramin và muối của nó có thể được tạo ra bằng cách nung nóng
đimethylaminođiphenyl với hỗn hợp urê, axit sufamic, và sulfur trong amoni tại 175
o

C. Muối của Auramin được tạo thành trong phản ứng có thể sử dụng trực tiếp trong

quá trình nhuộm hoặc có thể chuyển đổi thành Auramin cơ bản hay Auramin
hyđrochloric [33], [38],[47].
Auramine G cũng được tạo ra từ dimethylamino điphenylmethan, thu được
bằng cách ngưng tụ N-methyl o-toluidin với fomandehit[33].
Việc sản xuất Auramindiễn ra lần đầu tiên ở Châu Âu (Thụy Sĩ, Đức, Mỹ,
Pháp) nhưng đã bị ngưng.Hiện giờ Auramin chủ yếu được sản xuất tại Ấn độ và
Trung Quốc[24], [47].
Auramin được dùng trong công nghiệp nhuộm sợi như lụa và sợi bông;
ngoài ra còn để nhuộm da, giấy.Nó cũng được sử dụng trong việc in ấn, tạo màu
trong các loại mực.Ngoài ra, AO còn được áp dụng trong các nghiên cứu về y tế
như sử dụng AOnhư một chất huỳnh quang để phát hiện nhiễm trùng vi khuẩn lao

không điển hình (ví dụ như Mycobacterium) trong mô tế bào[29], [39] hoặc nó
được kết hợp với Rhodamine B tạo thành chất auramine-rhodamine được sử dụng
như chất khử trùng[45].Ngoài ra các thuốc nhuộm huỳnh quang như Rhodamine và
AO còn được áp dụng trong nghiên cứu hóa học, sinh học, y tế [19,[45].
Thuốc nhuộm tổng hợp đã được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp
cũng như thực phẩm vì so với hầu hết các thuốc nhuộm tự nhiên, chúng có độ ổn
định cao hơn và giảm được chi phí sản xuất.Tuy nhiên, cấu trúc hóa học của một số
thuốc nhuộm tổng hợp có thể gây tác động xấu đến sức khỏe con người.Vì những lý
do này, việc sử dụng các thuốc nhuộm tổng hợp trong các sản phẩm thực phẩm hiện
nay bị cấm ở Châu Âu và nhiều nước trên thế giới.Quy định EC số 1333/2008 phụ
lục II đưa ra danh sách các phụ gia thực phẩm của Liên minh Châu Âu để sử dụng
trong thực phẩm và các điều kiện của chúng, bao gồm một danh sách các chất tạo
màu cho phép và AO không nằm trong danh sách[20].Tại Việt Nam, cấm nhập

5


khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong chế biến TĂCN các loại chất tạo màu
công nghiệp trong đó có AO.
Theo quyết định số 846/QĐ-CN-TĂCN ngày 17/112015 của Cục trưởng
Cục chăn nuôi về việc mở rộng phạm vi chỉ định phòng thử nghiệm thức ăn chăn
nuôi gia súc, gia cầm thì giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích AO phải đạt
được 1 mg/kg [2].
1.3 Các phƣơng pháp xác định
Các nghiên cứu phân tích về Auramin bắt đầu vào những năm 1970 và tiếp tục
đến năm 1980, các phương pháp chủ yếu sử dụng sắc ký lỏng và sắc ký bản mỏng
để xác định Auramin trong mô tôm và thuốc nhuộm sinh học[38], [54].
Hiện nay, các công trình nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để
xác định các nhóm thuốc nhuộm trên nhiều nền mẫu thực phẩm và thức ăn chăn
nuôi trong đó phải kể đến một số phương pháp như phương phápđiện hóa, phương

pháp hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme ELISA [57],tuy nhiên, hiện nay phương
pháp phổ biến để xác định AO, đặc biệt để ứng dụng phân tích tại phòng thí nghiệm
là quang phổ và sắc ký lỏng hiệu năng cao.
1.3.1 Phƣơng pháp quang phổ
Cơ sở của phương pháp quang phổ là dựa trên bức xạ điện từ được phát ra
hay hấp thụ từ mẫu phân tích, từ các cường độ phát xạ hay hấp thụ này có thể định
tính hoặc định lượng thành phần có trong mẫu.
Nhóm nghiên cứu người Nhật, Jingjing Yan và cộng sự [27] đã nghiên cứu
phương pháp xác định AO bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang trong thuốc
thảo mộc dựa trên sự tương tác gắn kết với Albumine huyết thanh bò (BSA).
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ chế là tắt huỳnh quang. Khi ở trong môi
trường đệm axit acetic pH 7 AO có khả năng làm tắt huỳnh quang của BSA (do sự
va chạm giữa các phân tử, không biến đổi về mặt hóa học, quá trình tỏa nhiệt).
Nghiên cứu cho thấy, tại bước sóng 339 nm, độ nhạy cũng như cường độ huỳnh
quang của BSA giảm mạnh khi tăng dần nồng độ AO từ 0- 5.10-5mol/l, màu sắc của
dung dịch chuyển đổi rõ rệt từ màu vàng sang màu vàng đậm có nghĩa có thể sử

6


dụng BSA để định lượng AO. Phương pháp bị ảnh hưởng của 3 yếu tố là pH, nồng
độ BSA và thời gian phản ứng. Khoảng tuyến tính của phương pháp khoảng từ 0,16
đến 50 µmol/l và giới hạn phát hiện 0,05 µmol/l. Nghiên cứu đã xác nhận phương
pháp trên một số nền mẫu thuốc với hiệu suất thu hồi cao từ 96-101 % và độ lệch
chuẩn tương đối từ 0,15-2,6 %.
Năm 2017, Hou ZHANG, Zhi LI [25] cùng các cộng sự đã nghiên cứu
thành công phương pháp xác định AO bằng phương pháp quang phổ tetrahertz
trong thuốc thảo dược. Mẫu được nghiền thành dạng bột, sau đó ép thành viên tròn
bằng máy ép thủy lực dưới áp suất 12 MPa. Độ dày của viên chỉkhoảng 1,50 mm.
Mẫu được phân tích trên máy đo phổ miền thời gian tetrahezt (THz-TDs). Phổ hấp

thụ AO được đo trong khoảng 0,2-1,6 THz sau đó chuyển đổi phổ miền thời gian
thành phổ tần số bằng phương pháp chuyển đổi nhanh Fouier. Kết quả cho thấy, AO
hấp thụ tại 0,43 THz; 1,21 THz; 1,32 THz, có thể sử dụng các tín hiệu hấp thụ này
để phân tích định lượng AO. Phương pháp được đánh giá là nhanh chóng, đơn giản,
chính xác để định lượng AO trong dược thảo. Phương pháp có ưu điểm là tiết kiệm
và thân thiện với môi trường vì không sử dụng thuốc thử, không có dư lượng hóa
học trong quá trình thí nghiệm.
1.3.2 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha
động là chất lỏng. Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch.
Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động
và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí
hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha
động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi
nhau [4].
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được ứng dụng rộng rãi trong việc xác
định hàm lượng các chất tạo màu bị cấm với độ tin cậy cao.
Một nhóm tác giả người Anh, đã nghiên cứu xác định 19 loại thuốc nhuộm
trong đó có AO trong các nền mẫu thực phẩm như bột ớt, thì là; cá, thịt gà đóng hộp

7


bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò UV[30].Tác giả đã sử dụng hỗn hợp dung
môi axetonitril: axeton tỉ lệ thể tích 90:10 để chiết chất cần phân tích ra khỏi nền
mẫu ở nhiệt độ 40oC. Dịch chiết được lọc và định lượng AO trên hệ thống HPLCUV tại bước sóng 436 nm. Khoảng tuyến tính từ 1-20 mg/l, hiệu suất thu hồi đối với
AO trong khoảng từ 73-103 % và độ lệch chuẩn tương đối lần lượt tại các nồng độ 5
mg/l; 10 mg/l; 20 mg/l là 4,1%; 1,4 %; 1,9 % tương ứng.
Tác giả Tan Enling, Xiao Jian [46] cũng đã phát triển phương pháp xác định
đồng thồi ba chất Orange II cơ bản, Axit Orange II và AuraminO trong các sản

phẩm làm từ đậu bằng HPLC-UV. Phương pháp có khoảng tuyến tính rộng, độ
đúng và độ chụm cao. Giới hạn phát hiện của Auramin O đạt 0,05 mg/kg.
Tại Nhật Bản, việc kiểm soát hàm lượng các chất cấm tạo màu trong thực
phẩm chế biến là vấn đề rất được quan tâm. Tác giả người Nhật Chiye Tatebe và
cộng sự[17] đã phát triển một phương pháp nhanh và đơn giản để xác định đồng
thời3 chất Rhodamine B, Auramin O và pararosanilin bằng HPLC-PDA trong nhiều
nền mẫu khác nhau như: cà ri, sốt ớt, bột tôm, sốt gà, súp bột.Nghiên cứu đã tối ưu
hóa các điều kiện trên HPLC với cột pha tĩnh là octadecylsilan ODS (4,6x150mm, 5
µm), nhiệt độ cột là 40oC. Pha động gồm hai kênh A là amoni acetate 20 mM
pH=4,5 và kênh B là axetonitril, gradient pha đông. pH của dung dịch pha động
được đánh giá là yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp, qua khảo sát tại
ba giá trị pH khác nhau: 3,5; 4,5; 6,5 kết quả cho thấy tại pH 4,5 thì cả ba chất phân
tích đều có độ nhạy cao nhất.
Nhóm tác giả Yang Shuang, Yu ZiXuan, Wang YongFang, Ge BaoKun [56]
đã định lượng Chrysoidin II và Auramin O trong nền mẫu đậu khô bằng phương
pháp HPLC-PDA. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp đối
với Auramin là 0,02 mg/kg và 0,05 mg/kg. Hiệu suất thu hồi trong khoảng nồng độ
khảo sát 0,05; 2,0 và 10 mg/kg đạt từ 95-103,1 %. Độ lệch chuẩn phương pháp dưới
5 %. Phương pháp được đánh giá là đơn giản, nhanh chóng, chi phí thấp phù hợp để
ứng dụng phân tích trong phòng thử nghiệm.

8


Auramin O đã được phát hiện trong mẫu thuốc làm từ vỏ cây Hoàng Bá (loại
cây được sử dụng làm thuốc đông y chữa bệnh) bằng phương pháp HPLC-DAD.
Nhóm tác giả LI Yun cùng cộng sự [35] đã tối ưu hóa các điều kiện phân tích trên
hệ thống sắc ký bằng phương pháp sàng lọc nhanh. Cột pha tĩnh ZORBAX SB-C18
(4,6 mmx250 mm, 5µm) đã được sử dụng để tách AO, nhiệt độ cột là 30 oC. Pha
động gồm hỗn hợp dung dịch axetonitril và KH2PO4 0,025M pH=3 tỉ lệ 35:65. Tốc

độ dòng là 1,0 ml/phút. AO được phát hiện tại bước sóng 432 nm. Nghiên cứu đã
phân tích 30 mẫu thuốc, kết quả cho thấy có 6 mẫu dương tính với Auramin O. Các
kết quả được xác nhận lại bằng phương pháp HPLC-MS/MS, đánh giá kết quả là
phù hợp.
1.3.3 Phƣơng phápsắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)
Sắc ký lỏng khối phổ là một phương pháp phân tích công cụ kỹ thuật hiện
đại với những tính năng vượt trội được ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực như
dược phẩm, môi trường, đặc biệt là xác định hàm lượng chất cấm trong thực phẩm
dành cho người và động vật.
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của
các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng
và điện tích (M/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích
của chúng như loại bỏ electron, proton hóa,..Các ion tạo thành này được tách theo tỉ
số M/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử
của hợp chất [4].

9


Cấu trúc của hệ thống LC-MShình 1.1

Hình 1.1. Mô hình hệ thống LC-MS/MS
Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, bộ phận
phân tích khối phổ và bộ phận phát hiện. Trước hết, các mẫu được ion hóa trong
nguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số M/z.
Tiếp tục các ion đi vào bộ phận phát hiện (detector), sẽ được khuếch đại và chuyển
thành tín hiệu. Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ.
Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)
Bộ phân tích tứ cực dựa trên nguyên tắc các ion có khối lượng khác nhau sẽ
dao động khác nhau theo điện áp tổng hợp một chiều và xoay chiều đặt vào môi

trường di chuyển của nó.
Bộ tứ cực gồm 4 thanh cực ghép song song nối với nhau từng đôi một đối
diện nhau, tạo thành hai cặp, sau đó chúng nối với điện áp một chiều tạo thành 2 cặp
dương và âm. Ngoài điện áp một chiều, hai cặp điện cực còn được nối với điện áp
xoay chiều. Tổ hợp điện áp này đặc biệt là điện áp xoay chiều sẽ thay đổi theo chu
kỳ để quét khối lượng các ion.

10


Hình 1.2. Tứ cực
Một số ion có tỷ số M/z xác định cộng hưởng với thế xoay chiều xác định có
thể đi thẳng qua khoảng không đến detector. Trong khi đó các ion khác không sẽ có
quỹ đạo không ổn định va chạm với các cực và bị giữ lại ở đó. Tuy nhiên để thu
được tất cả các ion ta quét điện áp theo chu kỳ từ zero đến một điện áp nhất định
tăng dần sau đó lại trở lại zero, lần lượt các ion sẽ vượt qua được tứ cực cũng có
khối lượng từ nhỏ đến lớn để đến detector.
Kỹthuật MS một lần có một số nhược điểm như: không nghiên cứu được cơ
chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc hoá
học, chịu ảnh hưởng rõ rệt nền mẫu chất phân tích, do kỹ thuật ion hoá êm dịu nên
khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử…
Kỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những điểm này đồng thời tăng
thêm độ nhạy, tăng độ chính xác kết quả loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu.
Máy khối phổ MS/MS hay máy đo khối phổ hai lần liên tiếp gồm hai hệ khối
phổ riêng biệt độc lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va
chạm (collision cell).Bộ tứ cực thứ nhất (tứ cực Q1), có nhiệm vụ tách các ion. Lựa
chọn ion mẹ với M/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến buồng va chạm. Tại buồng
va chạm, ở điều kiện áp suất cao, các ion mẹ bị phân li do va chạm với khí trơ có
mặt như khí N2, Ar, He,ion này liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tạo ra các ion con
(daughter ions).Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tứ cực Q3.Bộ tứ cực

11


thứ ba làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ buồng va chạm để đi tới detector
và chuyển thành tín hiệu.
 Bộ phận phát hiện
Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phần
cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối
phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được
khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát
hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang.
Ưu điểm chung của phương pháp là có độ nhạy cao, đặc biệt phương pháp sắc
ký lỏng khối phổ có độ nhạy đạt đến mức µg/kg , độ chọn lọc tốt, thời gian phân
tích nhanh, tuy nhiên chi phí đầu tư thiết bị cao.
Ở Trung Quốc, chất tạo màu trong thực phẩm cũng rất được quan tâm. Trong
một tạp chí khoa học, tác giảPeng Cao và cộng sự[40] đã sử dụng phương pháp
UPLC-MS/MS để nghiên cứu xác định 6 loại chất tạo màu công nghiệp(Chrysoidin
II, Rhodamin B, Auramin O, Rhodamin 6G and Safranin T,Orange II)trong thực
phẩm. Mẫu được chiết bằng dung dịch amoniacetate 50 mmol trong 50 % methanol
và 1 % axit fomic và làm sạch bằng cột chiết pha rắn WAX, định lượng trên hệ
thống UPLC-MS/MS theo chế độ MRM. Giới hạn phát hiện của AO là 1,6 µg/kg và
giới hạn định lượng là 6 µg/kg. Khoảng tuyến tính trong khoảng từ 1-100 µg/kg với
hệ số tương quan R2=0,999. Hiệu suất thu hồi từ 70,3 %-109,2 % và độ lệch chuẩn
tương đối từ 2,6 %-14,1 %. Phương pháp được đánh giá là đơn giản, có độ nhạy và
chọn lọc tốt, có thể xác định đồng thời 6 loại chất tạo màu trong thực phẩm.
Trong một nghiên cứu khác tại Trung Quốc tác giả Zheng Xiao-yanđã báo cáo
nghiên cứu xác định đồng thời Chrysoidin, Auramin O, Safranin T trong thực phẩm
bằng UPLC-MS/MS[60]. Mẫu được chiết bằng MeOH và làm sạch bằng n-hexan.
Sử dụng UPLC-MS/MS để phát hiện và định lượng cả ba thuốc nhuộm. Khoảng

tuyến tính nằm trong khoảng từ 0,01 -0,05 µg/ml ( R= 0,995). Hệ số thu hồi khoảng
từ 74,3% đến 91,1 % và độ lệch chuẩn là 2,4 %-9,4 % (n=6).Giới hạn phát hiện lần
lượt là 0,3;0,6;0,7 µg/kg đối với Chrysoidin, Auramin O, Safranin T.

12


Dựa trên độ nhạy và độ chính xác cao của phương pháp LC-MS/MS nhóm tác
giả Juan Li, Xiao-Ming Ding, Dan-Dan Liu…[28] đã tối ưu hóa phương pháp xác
định đồng thời tám chất nhuộm (Sudan (I-IV), Para Red, Rhodamin, Chrysoidin and
Auramin O) bị cấm sử dụng trong các sản phẩm chứa ớt (bột ớt, nước tương,..).
Nghiên cứu đã khảo sát bốn loại hỗn hợp pha động khác nhau để tách tám chất phân
tích trên HPLC, kết quả cho thấy hỗn hợp pha động methanol và amoni acetate
5mM với chế độ chay gradient cho tín hiệu pic cao nhất và pic cân đối nhất. Phương
pháp định lượng trên hệ thống MS/MS với chế độ ion hóa dương ESI+. Các điều
kiện trên MS/MS được tối ưu như sau: mảnh ion m/z=268,1được lựa chọn là ion mẹ
với thế phân mảnh là 35V, hai mảnh ion con dùng để định tính và định lượng là
m/z=147,1và m/z= 252,1 với năng lượng va chạm là 28V. Giới hạn phát hiện và
giới hạn định lượng của phương pháp đối với AO lần lượt là 0,05 µg/kg và 0,3
µg/kg. Các thông số xác nhận phương pháp như độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ
chụm, độ thu hồi đều đạt yêu cầu của AOAC.
Nhóm tác giả LI Jing-Qing, QI Yan, LIAO Gui-Fu, CHEN Man-Ying, đã tối
ưu hóa các điều kiện xác định Auramin O và dimethyl yellow [31] trong các sản
phẩm được làm từ đậu trên hệ thống LC-MS/MS với chế độ ion hóa dương ESI+ và
chế độ quét phổ MRM. Các thông số tối ưu đối với nguồn ion hóa ESI+ như sau:
nhiệt độ nguồn 150oC, điện thế mao quản 2,82 kV, nhiệt độ sấy khô 500oC, lưu
lượng khí (Argon) 800L/h. Mảnh ion mẹ là m/z=268,2, hai mảnh ion con dùng để
định tính và định lượng lần lượt là 107,0 và 147,0. Hiệu suất thu hồi của phương
pháp đối với AO trong các khoảng nồng độ khảo sát 6; 10; 50 µg/kg đạt từ 89,1%100,7 %. Độ lệch chuẩn nhỏ hơn 12 % (n=6).
Năm loại chất tạo màu vàng công nghiệp (Chrysoidin G, chất màu vàng dạng

bazo 2, Axit Orange I, Axit Orange II and chất màu vàng dạng xxit) đã được phát
hiện đồng thời trên hệ thống sắc ký lỏng khối phổ HPLC-MS/MS [34]. Sự tách chất
được thực hiện với cột Agilent ODS C18, tốc độ dòng chảy 0,3 mL / phút. Hỗn hợp
pha động được lựa chọn là amoniacetat 5mM và axetonitril tỉ lệ 3:2. Phân tích dưới
các điều kiện đã tối ưu, các kết quả cho thấy khoảng tuyến tính cho Chrysoidin G và

13


Basic Yellow 2 là 5,0-80,0 mg/L, và đối với Axit Orange I, Axit OrangeII và Axit
Yellow 36 là 10,0-160,0 μg / L. Giới hạn định lượng cho Chrysoidin G, Basic
Yellow 2, Axit Orange I, Axit Orange II và Axit Yellow 36 lần lượt là 20, 20, 40,
40 và 40 ng/g.Phương pháp này được áp dụng để xác định hiệu suất thu hồi của
năm loại thuốc nhuộm trên các nền mẫu thịt gà, các sản phẩm đậu và cà tím vàng,
kết quả hiệu suất thu hồi đạt từ 79,8% -95,2%.
Tác giả Yu Xin-qi và cộng sự [58] đã nghiên cứu phát triển phương pháp phát
hiện và định lượng Auramin O trong nền mẫu thuốc bằng phương pháp HPLCMS/MS với chế độ ion hóa dương ESI+ và mảnh m/z=268,1 được chọn làm mảnh
mẹ. Điều kiện trên HPLC được tối ưu ở điều kiện cột pha tĩnh C18
(250mmx4,6mm; 5µm), hỗn hợp pha động axetonitril và amoniacetate 0,05M tỉ lệ
30:70.Kết quả xác nhận phương pháp cho thấy hiệu suất thu hồi cao đạt từ 95-99 %
đối với 3 mức nồng độ thấp, trung bình, cao. Phương pháp được đánh giá là đáng
tin cậy và có độ chính xác cao, có thể sử dụng để xác định AO trong nền mẫu thuốc.
1.4 Phƣơng pháp tách Auramin O ra khỏi nền mẫu
1.4.1 Lựa chọn dung môi chiết
Đối với một phương pháp định lượng thì bước xử lý mẫu là quan trọng
nhất, sao cho chất phân tích được chiết hoàn toàn ra khỏi nền mẫu và tạp chất phải
được loại bỏ. Phương pháp chiết tách Auramin O ra khỏi các nền mẫu chủ yếu là
phương pháp chiết lỏng-rắn. Auramin O là chất phân cực vì vậy sẽ tan tốt trong các
dung môi hữu cơ phân cực. Đối với các nền mẫu như thực phẩm, thuốc, thức ăn
chăn nuôi, Auramin O thường được chiết bởi các loại dung môi chính như

Acetonitril [23],[28], [43], [50], Methanol [23], [36], [55], [60] và Ethanol
[56]…Tuy nhiên, với mỗi loại nền mẫu khác nhau cần phải lựa chọn tỷ lệ dung môi
chiết phù hợp, việc sử dụng tỷ lệ 100 % dung môi hữu cơ thường cho hiệu suất chiết
không cao, vì vậy để tăng hiệu suất chiết các nghiên cứu thường khảo sát tỷ lệ chiết
giữa dung môi hữu cơ và nước hoặc với axit hữu cơ như axit acetic, axit
formic..[28],[40],[43].

14


Một số nền mẫu thực phẩm nói chung hay nền thức ăn chăn nuôi nói riêng
thì hàm lượng protein tồn tại trong mẫu rất lớn, đây cũng là một yếu tố gây cản trở
cho quá trình phân tích trên hệ thống LC-MS/MS. Theo một số tài liệu tham khảo
[43], [56] thì protein sẽ bị kết tủa sau khi mẫu được chiết bằng dung môi hữu cơ
như Methanol, Ethanol, Acetonitril và ly tâm lạnh tại nhiệt độ thấp, loại bỏ protein
bằng cách lọc qua giấy lọc.
1.4.2 Chiết pha rắn
Khi phân tích trên hệ thống LC-MS/MS đối với nền mẫu có thành phần
phức tạp có thể ảnh hưởng bất lợi đến quá trình phân tích như làm tăng hoặc ngăn
cản quá trình ion hóa. Nền mẫu TĂCN chứa một lượng lớn các thành phần khác
nhau như muối vô cơ, ion kim loại, carbohydrat, protein, các chất phụ gia khác…Để
giảm thiểu những ảnh hưởng này các nghiên cứu thường sử dụng phương pháp chiết
pha rắn để làm sạch. Chiết pha rắn (SPE) là phương pháp được sử dụng để loại bỏ
hầu hết các chất ảnh hưởng ra khỏi nền mẫu. .
Trong các tài liệu tham khảo có rất nhiều loại cột SPE được dùng trong
phân tích xác định các chất tạo màu công nghiệp như cột WAX (Weak Anion
Exchange) [23], [40],cột SCX (Strong Cation Exchange)[37], cột HLB (Hydrophilic
– lipophilic Balance)[16],[17]. Nhóm tác giả người Nhật Hiye Tatebe và cộng sự
[16] đã nhận định cột chiết pha rắn có chứa hạt chất nhồistyrene-divinylbenzene
polymeric có khả năng lưu giữ tốt các chất cần phân tích AO trong báo cáo xác định

nhóm chất cấm tạo màu trong chế biến thực phẩm (rhodamine B, Auramin O,
pararosaniline).
1.4.3 Tối ƣu hóa các điều kiện xử lý mẫu bằng phƣơng pháp mặt mục tiêu
tâm xoay
Hiện tại, các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước, để tách chiết AO
ra khỏi nền mẫu đa phần được khảo sát theo phương pháp đơn biến. Phương pháp
này chỉ đánh giá được sự ảnh hưởng của các yếu tố riêng rẽ nhưng không đánh giá
được sự ảnh hưởng tương hỗ giữa các yếu tố. Để khắc phục những nhược điểm của

15