Báo cáo thí nghiệm vi sinh

MỤC LỤC

1


DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG

2


1.BÀI 1: QUAN SÁT VI SINH VẬT BẰNG KÍNH
HIỂN VI
MỤC ĐÍCH BÀI THÍ NGHIỆM
Quan sát đặc điểm hình thái của vi sinh vật: nấm men, vi khuẩn,
nấm mốc
Làm quen và biết cách sử dụng kính hiển vi để quan sát vi sinh vật.
Biết làm tiêu bản vi sinh vật để quan sát dưới kính hiển vi.
2. LÝ THUYẾT
2.1.
Giới thiệu về vi sinh vật
Vi sinh vật là những sinh vật đơn bào hoặc đa bào nhân sơ hoặc nhân
thực có kích thước rất nhỏ, không quan sát được bằng mắt thường mà
phải sử dụng kính hiển vi. Kích thước vi sinh vật thường được đo
bằng micromet. Thuật ngữ vi sinh vật không tương đương với bất
kỳ đơn vị phân loại nào trong phân loại khoa học. Nó bao gồm cả virus,
vi khuẩn(bao gồm cả cổ khuẩn), nấm, tảo, nguyên sinh động vật.
2.2.
Giới thiệu về kính hiển vi quang học
Kính hiển vi quang học là một loại kính hiển vi sử dụng ánh sáng khả
kiến để quan sát hình ảnh các vật thể nhỏ được phóng đại nhờ một hệ

thống các thấu kính thủy tinh. Kính hiển vi quang học là dạng kính hiển
vi đơn giản, lâu đời nhất và cũng là phổ biến nhất.
1.

3


Hình 1-1: Kính hiển vi quang học

– Cấu tạo của kính hiển vi quang học:
(1) Thị kính: Có thể từ một đến 2 thấu kính thủy tinh cho phép tạo ra
ảnh cuối cùng của vật qua hệ quang học. Độ phóng đại của thị kính
khá nhỏ, thường chỉ dưới 10x, và được lắp đặt trong một ống trụ, cho
phép thay đổi dễ dàng.
(2) Giá điều chỉnh vật kính.
(3) Vật kính: là thấu kính quan trọng nhất của các hệ tạo ảnh nhờ
thấu kính, là một (hoặc có thể là hệ nhiều thấu kính) có tiêu cự ngắn,
cho phép phóng đại vật với độ phóng đại lớn. Nhờ có giá điều chỉnh,
các vật kính khác nhau có thể xoay để thay đổi trị số phóng đại. Trên
vật kính có thể ghi các trị số phóng đại 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x
hay 100x. Trong một số vật kính đặc biệt, người ta có thể sử dụng
dầu nhằm tăng độ phân giải của hệ thống.
(4),(5) Giá vi chỉnh, cho phép điều chỉnh độ cao của mẫu vật để lấy
nét trong quá trình tạo ảnh.
(6) Giá đặt mẫu vật
4


(7) Hệ thống đèn, gương... tạo ánh sáng để chiếu sáng mẫu vật.
(8) Hệ thống khẩu độ, và các thấu kính hội tụ để hội tụ và tạo ra

chùm sáng song song chiếu qua mẫu vật.
(9) Vi chỉnh cho phép dịch chuyển mẫu vật theo chiều ngang để
quan sát các phần khác nhau theo ý muốn.
 Cách sử dụng kính hiển vi

– Điều chỉnh ánh sáng bằng gương phản chiếu.
– Đặt tiêu bản lên bàn kính sao cho vật mẫu nằm ở đúng trung tâm,
dùng kẹp giữ tiêu bản. Hãy thận trọng không để ánh sáng mặt trời
chiếu trực tiếp vào gương, làm như vậy dễ bị hỏng mắt.
– Mắt nhìn vật kính từ một phía của kính hiển vi, tay phải từ từ vặn ốc
to theo chiều kim đồng hồ (vặn xuống) cho đến khi vật kính gần sát
lá kính của tiêu bản.
– Mắt nhìn vào thấu kính, tay phải từ từ vặn ốc to theo chiều ngược lại
(vặn lên) cho đến khi nhìn thấy vật cần quan sát
– Điều chỉnh bằng òc nhỏ để nhìn vật mẫu rõ nhất.
2.3.
Làm tiêu bản để quan sát
– Làm tiêu bản giọt ép: đây là phương pháp đơn giản nhất, quan sát
trực tiếp sự chuyển động của vi khuẩn.
– Làm tiêu bản giọt treo: quan sát vi khuẩn trong thời gian lâu hơn, vi
khuẩn được treo dưới lam kính đặt trên một phiến kính lõm.
3. CÁCH TIẾN HÀNH
- Ngâm phiến kính và lam kính trong petri chứa còn 70°
- Lấy phiến kính ra, lau khô bằng giấy, hơ trên ngọn lửa đèn cồn
- Dùng đũa thủy tinh lấy một giọt nước vô khuẩn nhỏ lên phiến kính
- Hơ đỏ que cấy, làm nguội, sau đó lấy một phần nhỏ sinh khối vi sinh
vật lên que cấy
- Trộn đều vi sinh vật trên que cấy vào giọt nước và dàn mỏng giọt nước
trên phiến kính
- Lấy lam kính lau khô bằng giấy và hơ nhẹ lướt qua ngọn lửa đèn cồn,

sau đó đậy lên phiến kính để cố định vi sinh vật quan sát
- Dùng giấy thấm xung quanh, đảm bảo xung quanh lam kính khô
- Quan sát hình thái nấm men, vi khuẩn, nấm mốc dưới kính hiển vi
4. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT

5


Hình 1-2: Nấm men

Hình 1-3: Penicilium

 Nhận xét:
-

Quan sát được đặc điểm của nấm men qua kính hiển vi: hình cầu
và

6


Quan sát được đặc điểm của nấm mốc Penicillium: chuỗi đính bào
tử, phân nhánh, có vách ngăn.
- Thời gian điều chỉnh kính hiển vi để quan sát rõ nét còn lâu.
5. ỨNG DỤNG
– Sử dụng kính hiển vi quan sát vi sinh vật
-

– Nhận định sự có mặt của vi sinh vật trong mẫu cần khảo sát: có hay
không

– Quan sát, nhận biết được sự khác nhau giữa các loại vi sinh vật.
6. NHẬT KÝ THÍ NGHIỆM
Ngày 04/09/2018
12h45
Cô Phượng hướng dẫn nội quy phòng thí nghiệm
13h
Cô Ái hướng dẫn cấu tạo kính hiển vi và cách lấy mẫu quan
sát
14h10
Cả nhóm tiến hành vô trùng lame, lamelle
14h30
Cả nhóm quan sát nấm men
14h45
Cả nhóm quan sát vi khuẩn
15h15
Cả nhóm quan sát nấm mốc
16h
Kết thúc thí nghiệm, ra về

7


2.BÀI 2: QUAN SÁT NẤM MEN
MỤC ĐÍCH BÀI THÍ NGHIỆM
- Đánh giá canh trường nấm men, tỷ lệ nảy chồi vàtỷ lệ sống chết
- Quan sát số lượng và chất lượng nấm men.
2. LÝ THUYẾT
2.1.
Khái quát về nấm men
Nấm men là một nhóm vi sinh vật được dùng nhiều trong công nghiệp,

hầu hết nấm men là đơn bào, không chuyển động. Hình dạng và kích
thước của chúng thay đổi tùy điều kiện môi trường. Nói chung nấm men
có dạng hình cầu, hình trứng, hình bầu dục,…có kích thước tương đối
lớn, chiều dài từ 6 – 10μm có khi 12 - 18μm, có chiều ngang từ 4 - 8 μm.
Về cấu tạo tế bào, gồm thành tế bào và tế bào chất. Trong tế bào chất
có nhiều cơ quan con khác nhau, không bào và các chất chứa đựng
khác như: glycogen, granuloza, chất béo, volutin,…
Nấm men có thể sinh sản theo lối nảy chồi, phân chia hoặc tạo thành
bào tử hữu tính.
Trong quá trình phát triển, hình thái nấm men có thể thay đổi như sau:
- Ở nấm men trẻ (qua 12 – 16 giờ nuôi cấy): màng mỏng, tế bào chất
đồng nhất, không bào chưa có hoặc mới bắt đầu xuất hiện, tế bào
sinh sản chiếm tỷ lệ cao.
- Ở nấm men trưởng thành ( 24 – 48 giờ): kích thước điển hình, không
bào lớn, số không bào có thể đến hai, lượng glycogen tăng, tế bào
sinh sản chiếm tỷ lệ cao.
- Ở nấm men già (đã nuôi cấy từ 72 giờ trở lên): màng dày nhẵn, tế
bào chất không đồng nhất, không bào lớn, lượng chất béo tăng, tế
bào hầu như không sinh sản nữa, không có glycogen, tế bào chết
chiếm tỷ lệ lớn.
 Nguyên tắc quan sát nấm men sống và chết:
- Tế bào chất chết dễ bắt màu
- Thuốc nhuộm đi qua màng tế bào chết dễ dàng hơn đi qua màng
tế bào sống.
 Vì vậy ta có thể dùng xanh methylene để nhuộm phân biệt sống và
chết.
 Quan sát lượng nấm men nảy chồi:
- Đây là một việc làm quan trọng khi đánh giá chất lượng canh trường
nấm men để cho vào thùng lên men.
- Trong canh trường nấm men cho vào thùng lên men, lượng tế bào

đang nảy chồi ít nhất phải chiếm từ 10-15%.
- Nếu canh trường đang ở giai đoạn sinh sản mạnh, số tế bào nảy chồi
có thể đạt đến 70-80%
2.2.
Phương pháp đếm số tế bào vi sinh vật bằng buồng đếm:
Phạm vi áp dụng: đếm một số loài nấm men và vi khuẩn
1.

8


Mục đích: theo dõi sự sinh trưởng của vi sinh vật trong các quá trình lên
men thực hiện trên môi trường lỏng
Cấu tạo buồng đếm:
- Buồng đếm là một phiến kính dày, với bề mặt hình chữ nhật
- Trên bề mặt buồng đếm, có đục 4 rãnh song song với chiều rộng và
chia bề mặt thành 3 khoang chính A, B và C. Chiều cao của hai
khoang A, C là như nhau. Khoang giữa B thấp hơn hai khoang bên A
và C một đoạn h. Giá trị h được gọi là chiều cao của buồng đếm
- Khoang B được chia tiếp thành 2 khoang nhỏ B1 và B2 nhờ một rãnh
đục song song với chiều dài của bề mặt buồng đếm.
- Trên mỗi khoang nhỏ, người ta kẻ một lưới đếm gồm nhiều ô lớn hình
vuông hoặc hình chữ nhật. Một ô lớn được chia tiếp thành các ô nhỏ
hơn
- Buồng điếm có kèm theo lá kính để đậy. Lá kính có bề mặt hình vuông
và rất phẳng
3. CÁCH TIẾN HÀNH
3.1.
Quan sát nấm men sống và chết
- Cho vài giọt canh trường nấm men Saccharomyces cerevisae và một

giọt thuốc nhuộm xanh methylene (đã pha loãng 10 lần) lên phiến
kính, nhẹ nhàng trộn đều, đậy lá kính lại để yên trong 2-3 phút rồi
đem quan sát: tế bào chết bắt màu xanh còn tế bào sống không
màu.
- Muốn tính tỷ lệ tế bào sống chết, ta đếm số tế bào chết và tổng số tế
bào chung (sống và chết) trên 5 kính trường rồi suy ra phần trăm tế
bào sống chết. Nếu nấm men đang ở giai đoạn sinh trưởng, lượng tế
bào chết không quá 2-4%.
3.2.
Quan sát lượng nấm men nảy chồi:
- Cho một giọt canh trường nấm men và một giọt NaOH hoặc H2SO4
10% lên phiến kính trộn đều, đậy lá kính lại, đặt lên kính hiển vi
quan sát. Đếm số tế bào chung và số tế bào đang nảy chồi rồi suy ra
phần trăm.
- Tế bào được xem là đang nảy chồi, tức là những tế bào có tế bào con
bé hơn hoặc bằng ½ tế bào mẹ, nếu tế bào con lớn hơn ½ tế bào mẹ
thì phải tính hai tế bào.
3.3.
Quan sát tỷ lệ sống chết:
Trong bài thí nghiệm này, ta dùng xanh metylen để nhuộm màu, phân
biệt tế bào sống và tế bào chết.
Cơ sở của việc nhuộm màu nấm men.
- Thuốc nhuộm đi qua màng tế bào chết dễ hơn tế bào sống.
- Nguyên sinh chất tế bào chết dễ bắt màu.
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị xanh metylen (pha loãng 10 lần) để nhuộm màu.
- Pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10-2.
- Làm tiêu bản.
- Nhuộm màu trước khi ép lamen mỏng lên lam kính.
9

-

Chờ khoảng 1-2 phút đủ thời gian để màu thấm vào tế bào nấm men.
Đem tiêu bản đi quan sát dưới kính hiển vi tại 5 điểm khác nhau.
3.4.
Đánh giá nhiễm vi sinh vật của canh trường:
- Trong khi thực hiện thí nghiệm 1 và 2, quan sát xem canh trường có
bị nhiễm VSV lạ hay không.
3.5.
Đếm tế bào nấm men trong 1ml canh trường (dùng buồng
đếm Thomas):
Cách tiến hành:
- Tiệt trùng buồng đếm bằng cách ngâm trong cồn 70o
- Pha loãng mẫu với độ pha loãng 10-2.
- Đậy lá kính lên trên buồng đếm và nhỏ mẫu vào khe hẹp phía trên
buồng đếm, dùng giấy thấm, sau đó tiến hành quan sát bằng kính
hiển vi, đếm tổng số tế bào trong 10 ô vuông lớn của buồng đếm.
Cấu tạo buồng đếm Thomas:
- Buồng đếm là một phiến kính dày, với bề mặt hình chữ nhật. Trên bề
mặt buồng đếm, có đục bốn rãnh song song với chiều rộng và chia bề
mặt thành 3 khoang chính A, B và C. Chiều cao của 2 khoang A và C
là như nhau. Khoang giữa B thấp hơn 2 khoang A và C một đoạn h.
Giá trị h được coi là chiều cao buồng đếm. Khoang B được chia tiếp
thành 2 khoảng nhỏ B1 và B2 nhờ một rảnh đục song song với chiều
dài của bề mặt buồng đếm. Trên mỗi khoang nhỏ, người ta có kẽ một
lưới đếm gồm nhiều ô lớn hình vuông hoặc hình chữ nhật. Một số ô lớn
được chia tiếp thành các ô nhỏ hơn. Buồng đếm có kèm theo lá kính
để đậy. Lá kính có bề mặt hình vuông và rất phẳng. Chiều cao của

KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
3.6.
Quan sát tỉ lệ nảy chồi
Bảng 2-1: Tỉ lệ nảy chồi của nấm men
Vùng
Nảy chồi
Tổng nấm
% nảy chồi
1

6

27

22,2%

2

8

31

25,8%

3

6

36

16,7%

4

3

29

10,3%

5

10

26

38,5%

10


Hình 2-4: Sự sinh trưởng nấm men dưới kính hiển vi.
*Nhận xét: Tỉ lệ nảy chồi trung bình của nấm men này là 18,6%. Như vậy,
loại nấm men này đang trong giai đoạn sinh trưởng.
3.7.

Quan sát tỉ lệ sống chết của nấm men
Bảng 2-2: Tỉ lệ sống và chết của nấm men
Vùng

Số tế bào
chết

Tổng số
tế bào

% tế
bào
sống

% tế
bào
chết

1

25

138

81,9%

18,1%

2

24

140

82,8%

17,1%

3

16

130

87,7%

12,3%

4

21

128

83,6%

16,4%

5

18

125

85,6%

14,4%

Tỉ lệ tế bào chết là khoảng 15,6%.

11


Hình 2-5: Nhuộm xanh nấm men bằng metylen
3.8.
Đánh giá canh trường:
Tỷ lệ nảy chồi nằm trong khoảng cho phép (18,6%), chứng tỏ nấm men
đang trong giai đoạn sinh trưởng, tuy nhiên không thích hợp để lên men vì
tỷ lệ nảy chồi thích hợp cho quá trình lên men là 70-80%.

Khả năng tìm thấy tế bào chết trong mẫu rất thấp, chỉ khoảng 15,6%. Sau
khi nhuộm thì tế bào bị nhuộm xanh toàn bộ còn tế bào sống chỉ viền xanh
ngoài.
Đếm tế bào nấm men trong 1mL canh trường:
Công thức:
3.9.

Trong đó: A- số tế bào trung bình của buồng đếm.
h- chiều cao buồng đếm (mm), có giá trị 0.1 mm
S- diện tích một ô đếm mm2), có giá trị (1/250) mm2
F- hệ số pha loãng của mẫu trước khi đếm.

12

Hình 2-6: Nấm men trên buồng đếm Thomas

Vùng

Số nấm men

1

36

2

21

3

19

4

11

5

22

6

12

7

32

8

22

9

25

10

18

= 54,5. 105
Nhận xét: Đếm buồng đếm cho kết quả đếm không chính xác do có thể
đếm bị trùng hay bỏ sót.
Ưu điểm: nhanh chóng, đơn giản.
Nhược điểm:
- Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết.
- Chỉ thích hợp với tế bào có kích thược lớn (nấm men, nấm mốc).
- Khó đạt độ chính xác cao.
- Không thích hợp trong huyền phù hay mật độ thấp.
13


ỨNG DỤNG CỦA NẤM MEN:

Nấm men bánh mì: Saccharomyces cerevisiae được sử dụng nhằm tạo ra
CO2 làm nở cấu trúc khối bột đồng thời tạo ra các cấu tử tạo hương trong
quá trình trao đổi chất của nó.
4.

-

Hình 2-7: Ứng dụng của nấm men trong sản xuất bánh mì

Ứng dụng trong sản xuất đồ uống có cồn:
- Saccharomyces cerevisiae kết hợp với vi khuẩn butyric tạo ra hương
thơm mạnh và đặc trưng trong sản xuất rượu Rum.
- Saccharomyces carlbergeois lên men bia – kiểu lên men chìm thường
để sản xuất bia có độ cồn thấp và bia vàng. Sử dụng nấm men chìm
để sản xuất bia sẽ tốn thời gian hơn nhưng bia thu được trong hơn
đống thời nấm men dễ lọc và dễ thu hồi để sử dụng hơn.

-

Lên men rượu vang: saccharomyces cerevisiae sinh ra enzyme
invectara có khử đường saccaroza thành fructoza và glucoza, vì vậy,
trong quá trình lên men, ta có thể bổ sung loại đường này vào dung
dịch quả và hàm lượng rượu được tạo thành bình thường đối với
những nòi của men này chỉ đạt khoảng 8- 10 % thể tích.

14


Rượu vang
Ứng dụng trong nước mắm, nước chấm, nước tương, tương ớt

- Chiết xuất nấm men khi sản xuất nước mắm nước chấm sẽ tăng
thêm vị Umami mà không cần sử dụng thêm MSG và I+G, bổ sung
thêm đạm (1% chiết xuất nấm men tăng thêm 1 độ đạm), khử vị
chát của muối, khử mùi khó chịu của cá, làm tròn vị của nước mắm
nước tương
5. NHẬT KÝ THÍ NGHIỆM
Ngày 11/09/2018
12h45
Cô Phượng hướng dẫn sử dụng micropipetre và buồng đếm
Thomas
13h05
Cô Ái cho cả lớp xem hình ảnh thực tế, hướng dẫn thí
nghiệm
13h15
Bắt đầu thí nghiệm
14h15
Cả nhóm quan sát và đánh giá canh trường nấm men bằng
kính hiển vi
14h25
Tiến hành cho thuốc nhộm
14h30
Cả nhóm đếm số tế bào nấm men mẫu đậm đặc
15h
Cả nhóm đếm số tế bào nấm men mẫu pha loãng 1/10
16h30
Kết thúc thí nghiệm và ra về

15

3.BÀI 3: QUAN SÁT VI KHUẨN
MỤC ĐÍCH BÀI THÍ NGHIỆM
- Mô tả và phân biệt được đặc điểm hình thái và tính chất sinh lý của
vi khuẩn, nhận biết được từng loại vi khuẩn
- Rèn luyện kỹ năng sử dụng kính hiển vi
- Thông thạo thao tác làm tiêu bản giọt treo, giọt ép, phương pháp
nhuộm gram.
2. SƠ LƯỢC LÝ THUYẾT
2.1.
Giới thiệu về vi khuẩn
Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật có cấu tạo tế bào nhưng chưa có cấu trúc
nhân phức tạp, thuộc nhóm Prokaryotes. Nhân tế bào chỉ gồm một
chuỗi ADN không có thành phần protein không có màng nhân.
Vi khuẩn có nhiều hình thái khác nhau: hình cầu, hình que, hình xoắn,
hình dấu phẩy, hình sợi ... Kích thước thay đổi tuỳ theo các loại hình và
trong một loại hình kích thước cũng khác nhau. So với virus, kích thước
của vi khuẩn lớn hơn nhiều, có thể quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi
quang học. Dựa vào loại hình có thể chia ra một số nhóm sau:
1.

16


Cầu khuân là loại vi khuẩn có hình cầu. Nhưng có nhiều loại không hẳn
hình cầu thí dụ như hình ngọn nến như phế cầu khuẩn - Diplococcus
pneumoniae hoặc hạt cà phê (lậu cầu khuẩn Neisseria gonorrhoeae).
Kích thước của vi khuẩn thường thay đổi trong khoảng 0,5 (1μ = 10 -3 mm).
Tuỳ theo từng loài mà chúng có những dạng khác nhau.
Đặc tính chung của cầu khuẩn:
-

Tế bào hình cầu có thể đứng riêng rẽ hay liên kết với nhau.

-

Có nhiều loài có khả năng gây bệnh cho người và gia súc

-

Không có cơ quan di động.

-

Không tạo thành bào tử.

 Giống Streptococcus
Từ tiếng Hy Lạp (Streptos - chuỗi) chúng phân cách theo một mặt phẳng
xác định và dính với nhau thành từng chuỗi một dài.
 Giống Staphilococcus
Từ tiếng Hy Lạp Staphile - chùm nho. Thường chúng liên kết với nhau
thành những đám trông như chùm nho. Chúng phân cách theo một mặt
phẳng bất kỳ và sau đó dính lại với nhau thành từng đám như hình chùm
nho. Bên cạnh các loài hoại sinh còn có một số loài gây bệnh ở người và
động vật.
Trực khuẩn là tên chung chỉ tất cả các vi khuẩn có hình que. Kích thước
của chúng thường từ 0,5 - 1,0 x 1 - 4 μ. Thường gặp các loài trực khuẩn
sau đây:
 Bacillus (viết tắt là Bac)
Trực khuẩn gram dương, sinh bào tử. Chiều ngang của bào tử không vượt
quá chiều ngang của tế bào. Vì thế khi tạo thành bào tử tế bào không thay

đổi hình dạng chúng thường thuộc loài hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc.
 Vi khuẩn lactic:
Về mặt hình thái, vi khuẩn lactic có dạng lưỡng cầu, tứ cầu, liên cầu, và
dạng que, đứng đơn độc hoặc thành chuỗi. Khả năng sinh tổng hợp của
các vi khuẩn lactic thuộc dạng yếu. Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có
yêu cầu dinh dưỡng cao. Để sinh trưởng bình thường, ngoài nguồn carbon,
chúng cần nitơ một phần dưới dạng các acid amin, một số vitamin, các
chất sinh trưởng và chất khoáng.
17


 Lactobacillus
Vi khuẩn gram dương, sống kỵ khí tùy ý, có khả năng tạo acid lactic, có thể
lên men đồng hình hoặc dị hình, catalase âm tính và có khả năng lên men
glucose.
2.2.
Chuẩn bị tiêu bản và cố định vi khuẩn trên phiến kính:
- Quá trình cố định vi khuẩn bằng nhiệt hoặc bằng dung môi sẽ giúp
ngăn chặn sự tự thủy phân của vi khuẩn, làm thay đổi hình dạng của
tế bào. Mặt khác cũng giúp tế bào vi khuẩn bám chặt vào phiến kính
không bị rửa trôi.
- Làm tiêu bản giọt ép: là phương pháp đơn giản nhất quan sát trực
tiếp sự chuyển động của vi khuẩn.
- Làm tiêu bản giọt treo: để quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi trong
thời gian lâu hơn.
2.3.
Phương pháp nhuộm Gram
Phương pháp nhuộm này sử dụng hai màu khác nhau, dùng để phân biệt
tế bào vi khuẩn Gram âm G- và vi khuẩn Gram dương G+ . Vi khuẩn G+ có
thành tế bào dày, bao gồm nhiều lớp peptidoglycan. Vi khuẩn G- có lớp

peptidoglycan mỏng và lớp lipopoly-saccharide.
Trong phương pháp nhuộm Gram, tím tinh thể được sử dụng như màu thứ
nhất. Tím tinh thể cũng là màu bazo, làm cho tất cả các tế bào vi khuẩn
trên tiêu bản bắt màu. Iod là chất cẩn màu, có khả năng tạo phức chất với
tím tinh thể. Phức chất này không tan trong tế bào vi khuẩn , do đó làm
cho tế bào bắt màu rõ hơn. Ethanol được dùng trong bước tiếp theo để tẩy
màu khỏi tế bào G-, trong khi tế bào G+ vẫn giữ màu. Sau đó tế bào Gđược nhuộm lại bằng màu thứ 2 thường là safranin. Khi quan sát dưới kính
hiển vi, tế bào G+ có màu tím của tím tinh thể, còn tế bào G- sẽ có màu đỏ
của safranin.
Một số lỗi hay gặp khi nhuộm Gram:
- Hơ nóng khi cố định vi khuẩn lên phiến kính có thể làm vỡ tế bào, từ
đó màu của tế bào G+ có thể bị rửa trôi làm cho tế bào G+ trở thành
G-.
Lớp tế bào trên phiến kính quá dày làm cho quá trình nhuộm màu
không tốt hay quá trình tẩy màu bằng ethanol không tốt, từ đó tế
bào G- có thể xuất hiện như tế bào G+.
- Bước tẩy màu bằng ethanol là quan trọng: nếu thời gian tẩy màu
quá ngắn sẽ làm cho vi khuẩn G- được thể hiện như vi khuẩn G+. Nếu
thời gian quá dài thì ngược lại, tế bào G+ sẽ có màu của tế bào G-.
- Tế bào già thường không bắt màu chính xác. Cần phải nhuộm màu
tế bào chưa tới 24 giờ nuôi cấy.
3. CÁCH TIẾN HÀNH
 Nguyên vật liệu và thuốc nhuộm:
- Cầu khuẩn: Streptococus thermophillus
- Trực khuẩn: Bacillus subtilis, E.Coli, Acetobacter xylium
- Lactic: Lacto acidophillus
- Dung dịch tím tinh thể
18

Dung dịch lugol
Ethanol 95%
Dung dịch safranin
Nước cất
3.1.
Quan sát vi khuẩn
 Làm tiêu bản giọt ép
- Ngâm phiến kính và lam kính trong cồn 70º, thấm khô, hơ trên
ngọn lửa đèn cồn.
- Hơ nóng đỏ que cấy, làm nguội dùng để lấy môi trường chứa vi
khuẩn
Đối với môi trường lỏng chứa vi khuẩn đã pha loãng
- Dùng que cấy lấy và dàn đều môi trường lỏng chứa vi khuẩn
đó lên phiến kính. (Tiến hành lấy mẫu gần đèn cồn)
Đối với môi trường rắn chứa vi khuẩn chưa pha loãng
- Nhỏ một giọt nước vô khuẩn lên phiến kính
- Dùng que cấy lấy và dàn đều mẫu cùng với nước vô khuẩn
trên phiến kính.
- Lấy lam kính đậy lên phiến kính sao cho không tạo thành bọt khí
giữa lam kính và phiến kính.
- Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi.
 Làm tiêu bản giọt treo
- Ngâm phiến kính lõm và lam kính trong cồn 70º, thấm khô, hơ
trên ngọn lửa đèn cồn.
- Hơ nóng đỏ que cấy, làm nguội dùng để lấy môi trường chứa vi
khuẩn
- Bôi vaselin lên bốn góc của lam kính
- Lắc dung dịch có vi khuẩn và lấy hai đầu que cấy đầy dịch lên
lam kính
- Đặt phiến kính lên lam kính

- Lật ngược phiến kính nhanh sao cho giọt dung dịch không chảy
ra ngoài
- Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi từ độ phóng đại nhỏ nhất.
3.2.
Nhuộm Gram và quan sát
 Đối với E.Coli và Bacillus subtilis
Chuẩn bị tiêu bản cố định vi khuẩn
- Ngâm phiến kính và lam kính trong cồn 70º, thấm khô, hơ trên ngọn
lửa đèn cồn.
- Dùng que cấy sau khi đã hơ nóng đỏ và làm nguội để lấy mẫu dần
mỏng trên phiến kính
- Để khô, cố định bằng nhiệt (hơ sơ trên ngọn lửa đèn cồn)
- Nhỏ vài giọt tím tinh thể lên tiêu bản và để trong vòng 1 phút
- Nghiêng tiêu bản và rửa bằng nước từ 1-3 giây.
- Nhỏ vài giọt dung dịch lugol lên tiêu bản và để trong vòng 10
giây
- Nghiêng tiêu bản và rửa bằng nước từ 1-3 giây
- Nhỏ ethanol lên tiêu bản và để trong vòng 30 giây
- Nghiêng tiêu bản và rửa trôi lại bằng nước
-

19


Nhỏ safranin lên tiêu bản và để trong vòng 30 giây
Rửa lại bằng nước, để khô, lấy lam kính đậy lên phiến kính sao
cho không tạo bọt khí giữa lam kính và phiến kính.
- Quan sát dưới kính hiển vi
4. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT
- Kefir là hỗn hợp nấm men và vi khuẩn, vừa có trực khuẩn vừa có liên

cầu khuẩn, vừa có Gram (+) vừa có gram (-), không có khả năng di
chuyển
- Streptococus thermophillus vi khuẩn Gram (+), liên cầu khuẩn, hình
cầu hoặc hình trứng, kết thành chuỗi ngắn, không có khả năng di
chuyển di chuyển
- Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram
(+), đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động.
- E. coli là trực khuẩn Gram (-), vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ, có
hình que, thường đứng riêng rẽ, có thể từng đôi hoặc chuỗi ngắn, có
khả năng di động.
- Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn Gram (+), hình que, đứng riêng
lẻ hay tập trung thành sợi ngắn.
- Acetobacter xylium là vi khuẩn Gram (-), hình que, có khả năng di
chuyển
Một số hình ảnh tham khảo và quan sát được:
-

Hình 3-8 Kefir ở độ phóng đại x400.

Hình 3-9 Streptococcus thermophilus ở độ phóng đại x1000.

20


Hình 3-10 Lactobacillus acidophilus ở độ phóng đại x400.

Hình 3-11 Bacillus subtilis ở độ phóng đại x400

Hình 3-12 E.coli ở độ phóng đại x400.

Hình 3-13 Acetobacter xylinum ở độ phóng đại x400
5.

ỨNG DỤNG

21


Ngày nay với những thành tựu của khoa học hiện đại, người ta đã tìm ra
những biện pháp hạn chế tác hại do vi khuẩn gây ra, ví dụ như việc chế
vacxin phòng bệnh, sử dụng chất kháng sinh,
Bên cạnh đó, có một số vi khuẩn có lợi và có ứng dụng nhiều các lĩnh vực
thực phẩm, y học, công nghệ.
5.1. Streptococus thermophillus

– Ứng dụng trong lên men sữa, sản xuất sữa chua, sản xuất phô mai
5.2.

Bacillus subtilis

– Ứng dụng hữu ích trong môi trường
– Sản xuất enzyme sử dụng làm chất phụ gia trong chất tẩy rửa giặt ủi
– Có hoạt động tự nhiên diệt nấm, được sử dụng như một tác nhân
kiểm soát sinh học

– Như một tác nhân để hỗ trợ điều trị các bệnh đường tiêu hóa và tiết
niệu. sử dụng rộng rãi ở Tây Âu và Trung Đông như một loại thuốc
thay thế kháng sinh.

– Có thể chuyển đổi một số vật liệu nổ thành các hợp chất nito vô hại,

carbon dioxide và nước.

– Xử lý chất thải hạt nhân phóng xạ an toàn (ví dụ như thỏi IV và
plutonium IV)

– Được sử dụng trong sản xuất polyhydroxyalkanoates (PHA) và chất
thải mạch nha.

– Sử dụng để sản xuất amylase
– Sử dụng để sản xuất axit hyaluronic trong khu vực công ty chăm sóc
y tế

– Có thể cung cấp một số lợi ích cho người trồng nghệ tây, đẩy mạnh
tăng trưởng và tăng năng suất sinh khối.

– Ứng dụng trong chăn nuôi, trong nuôi trồng thủy sản.
5.3.

E.Coli

22


– Một số chủng của vi khuẩn E.coli có thể chuyển hóa đường trong
thực vật thành dẫn xuất axít béo, chất thường được dùng để sản
xuất nhiên liệu.

– E. coli cùng các vi khuẩn khác trong hệ vi khuẩn chí đường ruột góp
phần vào nhiều chức năng quan trọng trong sự sống của con người.

– Sản xuất insulin
– Tuy vậy, một khi vì lý do gì đó chúng bị lạc vào chỗ khác ngoài hệ
tiêu hóa thì chúng có thể gây bệnh. Ví dụ E. coli gây bệnh nhiễm
trùng tiểu, bệnh viêm màng não…Một số E.Coli gây bệnh đường ruột
như tiêu chảy ra máu.

5.4.

Lactobacillus acidophilus

– Thường được bổ sung vào các chế phẩm lên men từ sữa trong công
nghiệp sản xuất các loại enzyme amylase (một enzyme phân
giải carbohydrate), từ công dụng này chúng thường được gọi là lợi
khuẩn (vi khuẩn có lợi).

– Lên men cellobiose, galactose, lactose, maltose và sucrose. Không
lên men được mannitol, melezitose, rhamnose, sorbitol, và xyloseo.

–

Giúp cho việc sinh ra hay hấp thu vitamin B (folic acid, niacin), giúp
giảm cholesterol trong máu và giải được một số độc tố.

– Sinh ra một số chất kháng sinh mạnh trong ruột bao gồm
acidophilin, acidolin, lactocidin và bacteriocin giúp ngăn chặn khả
năng sinh trưởng của một số loài vi sinh vật gây bệnh
như Campylobacter listeria và Staphylococci

–

Sinh enzyme lactase giúp phân giải đường sữa. Làm giảm sự phát
triển của các u bướu, có khả năng trung hòa hiệu quả và ngăn chặn
các chất gây ung thư. Làm giảm cholesterol trong máu.

– Là một loại lợi khuẩn được ứng dụng vào chế phẩm sinh học. Dùng
để sản xuất men và chất diệt khuẩn lactocidin, ức chế sinh trưởng số
lượng vi khuẩn gây bệnh đường ruột cho vật nuôi. Tăng cường kháng
sinh tự nhiên và hệ miễn dịch đường ruột.
NHÂT KÝ THÍ NGHIỆM
Ngày 18/09/2018
6.

23


12h45
13h15
13h50
14h40
15h15
15h45
16h15
17h

Cô Phượng dặn dò trước thí nghiệm
Cô Ái hướng dẫn bài “Quan sát vi khuẩn”
Nhóm tiến hành nhuộm Gram mẫu vi khuẩn số 1
Nhóm tiến hành nhuộm Gram mẫu vi khuẩn số 2
Nhóm tiến hành nhuộm Gram mẫu vi khuẩn số 3
Nhóm tiến hành nhuộm Gram mẫu vi khuẩn số 4, 5, 6

Nhóm tiến hành làm tiêu bản giọt treo mẫu vi khuẩn số 3,
6
Kết thúc thí nghiệm và ra về

24


4.BÀI 4: QUAN SÁT NẤM MỐC
1. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM
- Quan sát hình dạng các loại nấm mốc và bào tử của nó.
- Phân loại nấm mốc trong bài thí nghiệm dựa vào đặc điểm của nó.
- Ôn lại và nắm đặc điểm hình thái nấm mốc.
- Quan sát hình thái khuẩn ty (có vách ngăn không), bào tử (trần hay kín).
2. SƠ LƯỢC LÝ THUYẾT
Một số nấm ở thể đơn bào có hình trứng, đa số có hình sợi, sợi có ngăn vách
(đa bào) hay không có vách ngăn (đơn bào). Sợi nấm thường là một ống hình
trụ dài có kích thước lớn nho khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm
thường 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí 1mm. Chiều dài của sợi nấm có thể
tới vài chục centimet. Các sợi nấm có thể tăng trưởng chiều dài theo kiểu tăng
trưởng ở ngọn. Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân
nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì như bông. Trên
môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm
hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng
nhất định gọi là khuẩn lạc nấm.

Nấm mốc (nấm sợi) được nhận diện bằng đặc điểm hình thái đặc trưng quan
sát được dưới kính hiển vi. Tế bào nấm thường được phát triển thành hệ sợi
gọi là khuẩn ty thể. Sợi nấm có thể có hay không có vách ngăn. Khuẩn ty mọc
lên trên bề mặt cơ chất thường là những cấu trúc mang bào tử. cuống mang
bào tử có thể phân nhánh hay không phân nhanh. Bào tử vô tính của nấm sợi

thường tập trung trong hai nhóm là báo tử kín hay bào tử trần.
Hai giống nấm Aspergillus và Penicillium thuộc nhóm nấm bất hoàn
Deuteromycetes, không có hình thức sinh sản hữu tính. Hệ sợi có vách ngăn.
Bào tử vô tính là bào tử trần.
Mucor và Rhizopus thuộc lớp nấm tiếp hợp Zygomycetes. Hệ sợi không có
vách ngăn và có thể có rễ giả. Bào tử vô tính là bào tử kín. Bào tử hữu tính là
bào tử tiếp hợp Rhizopus có cuống mang bào từ không phân nhánh. Mucor có
cuống mang bào tử phân nhánh.

25