Nghiên cứu ứng dụng protease trong thuỷ phân phế liệu tôm sú penaeus monodon nhằm tận thu protein phù hợp cho mục đích thực phẩm

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH
Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS. NGUYỄN LỆ HÀ

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM
ngày … tháng … năm …

Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:
TT

Họ và tên

Chức danh Hội đồng

1

Chủ tịch

2

Phản biện 1

3

Phản biện 2

4

Ủy viên

5

Ủy viên, Thư ký

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được
sửa chữa (nếu có).

Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV


TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

PHÒNG QLKH – ĐTSĐH

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
TP. HCM, ngày..… tháng….. năm 20..…

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: ..........................ĐỖ TIẾN NAM.....................Giới tính: …...Nam .........
Ngày, tháng, năm sinh: ..............15-12-1988.............................Nơi sinh: ….Hải Hưng ....
Chuyên ngành: .........KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG.............MSHV:…1441810005 .........
I- Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEASE TRONG THUỶ PHÂN PHẾ LIỆU TÔM SÚ
PENAEUS MONODON NHẰM TẬN THU PROTEIN PHÙ HỢP CHO MỤC ĐÍCH
THỰC PHẨM
II- Nhiệm vụ và nội dung:
Nhiệm vụcủa đề tài là nghiên cứu ứng dụng protease trong việc thủy phân phế liệu tôm sú
nhằm thu được protein với hiệu suất cao nhất, nâng cao hiệu quả sản xuất và góp phần giảm
thiểu ô nhiễm môi trường.

III- Ngày giao nhiệm vụ:

IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 22-08-2016
V- Cán bộ hướng dẫn: TS. NGUYỄN LỆ HÀ
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này
đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn
gốc.
Học viên thực hiện Luận văn

Đỗ Tiến Nam


ii

LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo nhà trường, quý thầy cô khoa
Công nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường đã khơi nguồn động lực, tin tưởng
giao cho em đề tài đồ án tốt nghiệp “ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEASE
TRONG THUỶ PHÂN PHẾ LIỆU TÔM SÚ PENAEUS MONODON NHẰM

TẬN THU PROTEIN PHÙ HỢP CHO MỤC ĐÍCH THỰC PHẨM”.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô TS.Nguyễn Lệ Hà đã tận tình
hướng dẫn và giúp em từng ngày hoàn thiện đề tài nghiên cứu.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn và kính chúc quí thầy cô, gia đình và những
người thân yêu luôn dồi dào sức khỏe.

Đỗ Tiến Nam


iii

TÓM TẮT
Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu ứng dụng enzyme protease - TEGALASE R660L
trong việc thủy phân phế liệu tôm sú nhằm thu được protein với hiệu suất cao nhất.
Thông qua nội dung nghiên cứu, một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
protein như thời gian thủy phân thích hợp, ảnh hưởng của thời gian, nồng độ
enzyme cho thuỷ phân đã được xem xét đánh giá nhằm tìm kết quả tối ưu. Từ các
kết quả thí nghiệm cho thấy, thời gian thủy phân protein tối ưu nhất là 9h, nồng độ
enzyme là 0.075% với nhiệt độ là 55oC.


iv

ABSTRACT
Target of this study are enzymatic hydrolysis of protein from head meat of Black
Tigershrimp using protease - TEGALASE R660L. Factors affecting the hydrolysis
of protein including time, temperature and concentration were investigated. The
experimental results showed that, the optimal hydrolysis time for the best efficiency
was 9 hours. The optimal conditions for the besthydrolysis included temperature
55oC combined with the concentration 0.075%.

v

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………………...……i
LỜI CẢM ƠN………………………………………………………………...…….ii
TÓM TẮT…………………………………………………………...……………..iii
ABSTRACT………………………………………………..………………………iv
MỤC LỤC…………………………………………………………..……………...v
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ viii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNHẢNH. ..................................................................... viii
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu ........................................................................1
Mục đích chung của đề tài nghiên cứu : ..................................................................2
Phương pháp nghiên cứu : .......................................................................................2
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN ......................................................................................3
1.1) Nguồn phế liệu tôm. ......................................................................................3
1.1.1)

Thành phần hóa học trong đầu tôm. .......................................................3

1.1.2)

Tình hình sử dụng nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm. .................................4

1.1.3)

Hiệu quả môi trường mà đề tài mang lại…………………...…………6

1.2) Giới thiệu proteaza. .......................................................................................6
1.2.1)

Giới thiệu chung về protease : ................................................................ 6

1.2.2)

Tính chất chung của một enzyme: ..........................................................8

Giới thiệu Enzyme proteaza sử dụng : ............................................................... 14
1.3) Ứng dụng của proteaza: ...............................................................................14
1.3.1)

Trong công nghiệp: ...............................................................................14

1.3.2)

Trong nông nghiệp : ..............................................................................15

1.3.3)

Trong mỹ phẩm :...................................................................................15

1.3.4)

Trong y học : .........................................................................................15

1.3.5)

Trong kỹ nghệ phim ảnh : .....................................................................16

vi

1.4) Các nghiên cứu trong và ngoài nước về việc sử dụng enzyme proteaza thủy
phân protein. ..........................................................................................................16
1.4.1)

Các nghiên cứu trong nước : .................................................................16

1.4.2)

Các nghiên cứu ngoài nước: .................................................................17

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ..................18
2.1) Nguyên liệu nghiên cứu................................................................................18
2.2) Phương pháp nghiên cứu. .............................................................................18
2.2.1) Quy trình nghiên cứu. .............................................................................18
2.2.2)

Phương pháp phân tích đã áp dụng:......................................................20

Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease (Phương Pháp Amano) .......21
Phương pháp xác định hàm lượng chất khô. ......................................................21
Phương pháp xác định hàm lượng chất tro.........................................................21
2.2.3)

Phương pháp xử lý số liệu: ...................................................................21

2.3) So sánh chi phí lợi ích mở rộng giữa kế hoạch thuỷ phân phế liệu tôm sú

nhằm tận thu protein với các phương pháp khác để thấy hiệu quả .......................21
2.3.1)

Phương pháp 1 : Sản xuất thức ăn gia súc : ..........................................21

2.3.2)
học :

Phương pháp 2 : Tận thu Chitin và Chitosan bằng phương pháp hoá
22

2.3.3)

Phương pháp 3 : Phương pháp tận thu protein. ....................................23

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................24
3.1) Kết quả nghiên cứu : ....................................................................................24
3.1.1) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, thời gian đến quá trình thuỷ phân ở
nhiệt độ 50oC .....................................................................................................24
3.1.2) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, thời gian đến quá trình thuỷ phân ở
nhiệt 55oC. .........................................................................................................28
3.1.3) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, thời gian đến quá trình thuỷ phân ở
nhiệt độ 60oC. ....................................................................................................31
3.2) Thảo luận ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đến quá trình thuỷ phân. ..33
3.2.1)

Ảnh hưởng của nhiệt độ :......................................................................33

3.2.2)

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: .........................................................34

3.2.3)

Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân. ....................................................34


vii

3.3) Thành phần hoá học trong đầu tôm trước và sau phản ứng : ...................35
3.4 ) Hiệu quả kinh tế và khả năng ứng dụng : ......................................................36
3.5 ) Thành phần, tính chất nguồn thải và phương pháp xử lý . ............................ 37
3.5.1) Nguồn thải trong quá trình thủy phân. .....................................................37
3.5.2) Thành phần và tính chất nước thải . .........................................................37
3.5.3) Công nghệ có thể áp dụng để xử lý nguồn thải này. ................................ 38
4.1) Kết luận ..........................................................................................................39
4.2) Đề xuất cho những nghiên cứu tiếp theo ........................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................40
PHỤ LỤC ..................................................................................................................42


viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ thực vật. ………………19
Bảng 2: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ động vật………………..20
Bảng 3: Thành phần hoá học của đầu tôm trước và sau khi thuỷ phân…………...44

DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH.
Hình 1 : sơ đồ Bố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu đầu, vỏ

tôm………………………………………………………………………………27
Hình 2 : Một số sản phẩm bột cá trên thị trường………………………………..29
Hình 3 : Kết quả thuỷ phân ở nhiệt độ là 50oC………………………………….31
Hình 4 : Kết quả thuỷ phân ở nhiệt độ là 55oC………………………………….37
Hình 5 : Kết quả thuỷ phân ở nhiệt độ là 60oC………………………………….38


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu
Với diện tích nuôi trồng thuỷ hải sản lớn, Việt Nam là một đất nước có thế mạnh
về nuôi trồng và xuất khẩu thuỷ hải sản. Sản lượng thủy sản năm 2013 khoảng 5,9
triệu tấn, riêng mặt hàng tôm sú đạt 193.000 tấn tăng 6,4% so với cùng kỳ năm
trước

( />
seafood-exports -in- 2013.htm).Tương ứng thì hằng năm sẽ có một khối lượng
khổng lồ phế liệu từ tôm được thải ra, vì với tôm chỉ có 65% là ăn được, phần còn
lại là đầu và vỏ tôm sẽ được loại bỏ trong quá trình làm sơ chế. Nếu không được xử
lý tốt đây sẽ là một mối nguy lớn gây ô nhiễm môi trường, vì vậy, yêu cầu đặt ra là
phải xử lý thật hữu dụng nguồn phế thải này. Bên cạnh đó trong đầu tôm chứa một
lượng lớn protein, chitin, chất màu astaxanthin và nhiều hợp chất sinh họckhác.Việc
thủy phân protein làm nhằm tạo peptid và acid amin để sử dụng vào các mục đích
khác nhau trong thực phẩm đã được tiến hành. Tuy nhiên việc thuỷ phân bằng
phương pháp hoá học, sử dụng các loại acid mạnh hoặc bazơ mạnh như HCl 1M,
sodium sulfite, NaOH hay KOH là nguyên nhân tạo ra các sản phẩm phụ có tác hại
với môi trường. Vì vậy, thực hiện thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú theo phương
pháp enzyme có nhiều thuận lợi trong việc kiểm soát các quá trình thủy phân và do
đó giảm thiểu các phản ứng không mong muốn, nhằmgiảm ô thiểu nguy cơ gây

nhiễm môi trường. Bên cạnh đó việc sử dụng protease để thuỷ phân như thế nào
đểđạt hiệu quả kinh tế cao nhất, tránh gâng lãng phí là điều cần thực hiện. Vì vậy đề
tài “Nghiên cứu ứng dụng protease trong thuỷ phân phế liệu tôm sú Penaeus
monodon nhằm tận thu protein phù hợp cho mục đích thực phẩm.” được tiến
hành với mong muốn ứng dụng protease để thu được nguồn protein với hiệu suất
cao nhất từ phế liệu tôm sú nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất và góp phần giảm
thiểu ô nhiễm môi trường.


2

Mục đích chung của đề tài nghiên cứu :
Mục đích chung của đề tài là nghiên cứu ứng dụng enzyme protease - TEGALASE
R660L trong việc thủy phân phế liệu tôm sú nhằm thu được protein với hiệu suất
cao nhất. So với những nghiên cứu khác từ phế liệu đầu tôm thì tính mới của đề tài
này là sử dụng enzyme công nghiệp và xác định điều kiện tối ưu nhằm cho hiệu suất
cao nhất. Bên cạnh đó đề tài này có ý nghĩa về mặt môi trường là tận thu protein
trước cho các mục đích thực phẩm sau đó ta có thể tách chiết để thu chitin và
chitosan,so với một số đề tài khác đã được tiến hành như thu chitin và chitosan từ
phế liệu tôm bằng phương pháp hoá học thì bên cạnh việc tốn hoá chất để khử các
chất khoáng và protein thì sau khi thu chitin và chitosan ta lại phải tốn nhiều hoá
chất để xử lý protein trong nước thải như dùng dung dịch HCl hay dung dịchNaOH,
KOH điều chỉnh pH về điểm đông tụ protein nhằm thu hồi protein trong nước thải
vì protein trong phế liệu tôm hàm lượng cao (25% - 28% ).
Phương pháp nghiên cứu :
Dựa trên các cơ sở dữ liệu và thông tin liên quan từ nguồn tài liệu tham khảo,
nghiên cứu thực hiện bố trí thí nghiệm nhằm ứng dụng enzyme protease TEGALASE R660L vào thủy phân phế liệu tôm và thu nhận dịch lọc sau khi thuỷ
phân. Dịch lọc được ổn định hàm lượng peptid và axitamin, loại bỏ tủa, và được
tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm. Tuỳ vào nồng độ enzyme, nhiệt độ
thuỷ phân và thời gian sẽ cho ta kết quả thuỷ phân khác nhau như sau.

3

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.1)

Nguồn phế liệu tôm.

1.1.1) Thành phần hóa học trong đầu tôm.
Thành phần hóa học trong vỏ tôm:chitin 27.2%, canxi 10%, tro 31,7 %, photpho
3,16 %, lipit 0.4 %...Trong đầu tôm có 25-28% protein, trong đó có 4-5% lizin,
2,7% metionin, giàu canxi, photpho, các khoáng vi lượng và chất màu.
-

Protein: thành phần protein trong phế liệu tôm thường tôn tại ở 2 dạng: dạng
tự do và dạng liên kết
• Dạng tự do: dạng này là tồn tại ở phần thịt tôm từ một số tôm bị biến
đổi và vứt đi lẫn vào phế liệu hoặc phần đầu và thịt còn sót lại trong
đầu và nội tạng của tôm. Nếu công nhân vặt đầu không đúng kĩ thuật
thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều làm tăng tiêu hao
nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu này khó xử lý hơn.
• Dạng phức tạp: ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết
với chitin,canxicacbonat, với lipit tạo thành lipoprotein, với sắc tố tạo
proteincarotenoit…như một phần thống nhất quyết định tính bền vững
của vỏ tôm.

-

Chitin: tồn tại dưới dạng liên kết bởi những liên kết đồng hóa trị với các

protein dưới dạng phức hợp chitin – protein, liên kết với các hợp chất khoáng
và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng.

-

Canxi: trong vỏ, đầu tôm…có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là
muối CaCO3, hàm lượng Ca3(PO4)2 mặc dù không nhiều nhưng trong quá
trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl gây
khó khăn cho quá trình khử khoáng.

-

Sắc tố: trong vỏ tôm thường có nhiều loại sắc tố nhưng chủ yếu là
astaxanthin.


4

1.1.2) Tình hình sử dụng nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm.
Vấn đề xử lí phụ phế phẩm (đầu, vỏ) từ tôm và các phế phẩm từ tôm xuất khẩu hiện
nay đang là vấn đề khó khăn. Hiện tại, các công ty, cơ sở chế biến thuỷ sản cũng đã
có một số giải pháp:
-

Bán tươi (hoặc khô) một phần phụ phế phẩm làm thức ăn gia súc. Việc sử
dụng tươi phế rất đòi hỏi phải tiến hành nhanh chóng nếu chậm nguồn phế
liệu này phân hủy gây ô nhiễm môi trường và là chất độc đối với gia súc, gia
cầm. Việc sấy khô đòi hỏi năng lượng lớn, tốn kém. Phơi nắng thì phụ thuộc
vào thời tiết, mất vệ sinh, và gây ô nhiễm môi trường. Dù phơi nắng hay sấy
khô đều không loại được khoáng và chitin mà 2 chất này gây khó tiêu cho

gia súc, gia cầm. Phần phế phẩm dư không bán dược hoặc bỏ làm rác thải
gây ô nhiểm môi trường.Giải pháp này không cho giá trị kinh tế cao, nguồn
phế phẩm dư không xử lý hết gây ô nhiễm môi trường.

-

Một vài phương pháp tận dụng nguồn phế thải này làm thức ăn gia súc theo
phương pháp vi sinh cũng đã được tiến hành : sử dụng vỏ đầu tôm ủ chua
nuôi heo. Phương pháp này chỉ thực hiện nhỏ giọt, không đồng bộ, hiệu suất
không cao, tốn kém.

-

Sản xuất chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp thuỷ phân protein theo phương
pháp hoá học.Quy trình này cần khử protein trong đầu tôm, phương pháp phổ
biến hiện nay là khử protein bằng NAOH hoặc KOH. Quy trình như sau:

Quy trình khử protein bằng NAOH hoặc KOH
• Khử protein bằng NAOH là phương pháp sử dụng NAOH ở nồng độ thấp để
thủy phân các liên kết peptit của protein không hòa tan tạo thành các dạng
peptit,acid amin hòa tan trong nước và dễ dàng loại bỏ ra khỏi nguyên liệu. Nồng
độ NaOH thường dùng được sử dụng trong khoảng 1 – 10 % và ở nhiệt độ 50
– 100 0C. Hiệu quả của quá trình khử protein phụ thuộc vào nhiệt độ, nồng


5

độ và tỉ lệ của dung dịch với khối lượng vỏ giáp xác. Quá trình khử protein
thích hợp cũng có thể đạt được bằng việc xử lý với dung dịch KOH.
• Quá trình khử protein thường kèm theo quá trình khử lipid do lipid có thể

phản ứng với kiềm tạo thành xà phòng theo phương trình phản ứng sau:

CH2OCOR1

CH2OH

CHOCOR2 + 3NaOH

CHOH + R1COONa + R2COONa + R3COONa

CH2OCOR3

CH2OH

Triaxylglycerol

Glycerol Xà phòng

• Khi khử protein chỉ bằng NaOH năng lượng hoạt hóa cho giai đoạn đầu
khá lớn vì vậy cần sử dụng NaOH có nồng độ cao, trong thời gian dài, dẫn
đến suy giảm chất lượng chitin đồng thời cũng làm giảm chất lượng của
protein tách ra. Bên cạnh đó, quy trình này còn tạo ra một lượng chất thải
lớn, trong đó có chứa các chất ăn mòn, các chất lơ lửng khó xử lý với khối
lượng lớn. Chính vì vậy, cần thiết phải có các biện pháp xử lý trước khi
thải ra môi trường.
 Do vậy, việc nghiên cứu và đưa ra giải pháp xử lý protein trong đầu tôm là
cần thiết nhằm giảm thiểu chi phí cho việc xử lý, nâng cao giá trị sử dụng
của phụ, phế phẩm từ tôm. Đồng thời nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành
công nghiệp chế biến tôm và hạn chế ô nhiễm môi trường do phụ, phế phẩm
từ tôm cũng như lượng chất thải từ việc xử lý nguồn phế phẩm này.

6

1.1.3) Hiệu quả môi trường mà đề tài mang lại :
- Hàng năm, ngành chế biến thuỷ hải sản thải ra hàng chục ngàn tấn phế liệu
đầu và vỏ tôm, chỉ một phần nhỏ của lượng phế thải này thải ra môi trường
cũng đủ làm ô nhiễm nguồn nước, không khí…nếu không được xử lý triệt
để, nguy cơ gây ô nhiễm môi trường là rất lớn.
- Các phương pháp xử lý truyền thống đã được thực hiện nhằm tận dụng
nguồn phế thải nay, tuy nhiên từ các phương pháp truyền thống như phơi,
sấy…sẽ gây ra mùi khó chịu, ảnh hưởng đến môi trường sống và làm việc
của những hộ dân gần các cơ sở tái chế này.
- Việc tận dụng nguồn phế thải này bằng phương pháp hoá học sẽ tiêu tốn một
lượng lớn hoá chất, bên cạnh đó cũng tạo ra một lượng nước thải hóa học và
các chất phân giải protein thải ra môi trường kéo theo việc phải xử lý nguồn
nước thải này nhằm tránh gây ô nhiễm môi trường.
 Như vậy, việc xử dụng enzyme thủy phân protein mang lại hiệu quả môi
trường là rất lơn : vừa tránh được việc dùng hóa chất như NAOH, KOH
để khử protein, bên cạnh đó cũng giảm được phần lớn các chất phân giải
protein thải ra môi trường góp phần làm giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi
trường .
1.2)

Giới thiệu proteaza.

1.2.1) Giới thiệu chung về protease :
-

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ

tế bào,cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng
từ vi sinh vật(vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật
(gan, dạ dày bê...).

-

So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm
khácbiệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiềuenzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân
tử nên rất khótáchra dưới dạng tinh thể đồng nhất.

-

Cũng do phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật
thường cótinh đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.

-

Protease được phân chia thanh hai loại: endopeptidase va exopeptidase.


7

-

Dựa vào vị tri tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia
thành hai loại:
• Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗipolypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide
hoặc một tripeptide.

• Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của
chuỗi polypeptidevà giải phóng ra một amino acid hoặc một
dipeptide.

-

Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
• Serin proteinase: la những proteinase chứa nhom –OH của gốc serine
trong trung tâmhoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với
hoạt động xúc tác của enzyme.Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ:
chymotrypsin va subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme
động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao
gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin
BPN. Các serineproteinase thường hoạt động mạnh ở vung kiềm tính
và thể hiện tính đặc hiệu cơ chấttương đối rộng.
• Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như
papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh
chung. Các cystein proteinase thường hoạt độngở vùng pH trung tính,
có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
• Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm
pepsin. Nhóm pepsin bao gồm cac enzyme tiêu hóa như : pepsin,
chymosin, cathepsin, renin. Các asparticproteinase có chứa nhóm
carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH
trung tính.


8

• Metallo proteinase: là nhóm proteinase được tim thấy ở vi khuẩn,nấm
mốc cũng như cac vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase
thường hoạt động vùng pH trung tính va hoạt độ giảm mạnh dưới tac
dụng của EDTA.
-

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
• Protease acid: pH 2-4
• Protease trung tính: pH 7-8
• Protease kiềm: pH 9-11

1.2.2) Tính chất chung của một enzyme:
-

Hòa tan được trong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trung
tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào những đặc tính
này để tách chiết chúng.

-

Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium),
ethanol, acetone…để thu nhận chế phẩm enzyme.

-

Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạt
hóa hay ức chế.

-

Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: nhiệt độ,
pH môi trường.

Yếu tố chính ảnh hưởng hoạt tính enzyme
-

Ảnh hưởng của nhiệt độ : giống như các phản ứng hóa học, các phảnứng cho
enzyme xúc tác phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ. Theo quy luật của phản
ứng hóa học thì khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng, nhưng vì bản chất
của enzyme là protein nên nhiệ tđộ chỉ tăng cao đến mức nhất định. Đa
số các enzyme sẽ bị mất hoạt tính ở nhiệt độ 60oC trở lên, trong nhiệt độ
thích hợp nếu cứ tăng lên 10oC thì tốc độ phản ứng tăng lên 1,5-2 lần.
Nhiệt độ thích hợp của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố : thời gian
tác dụng dài thì nhiệt độ thích hợp của enzyme càng thấp. Ngoài ra còn phụ


9

thuộc vào nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme cũng
sẽ làm biến đổi tác dung của nhiệt độ.
-

Ảnh hưởng của pH : enzyme rất nhạy cảm với pH của môi
trường.Mỗienzyme chỉ thích hợp ở một pH xác định gọi là pH tối thích của
enzyme
• Một số enzyme hoạt động ở pH thấp như pepsin pH=1,8-2,2 và hoạt
động ở pH cao như tripsine pH=5-9, cùng một số loại enzyme thu
được ở các nguồn khác nhau cũng có pH tối thích khác nhau. pH của
môi trường ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng có thể do:
- PH làm thay đổi trạng thái ion hóa của các nhóm định chức ở trung

tâm hoạt động của enzyme, làm thay đổi khả năng phản ứng của các
nhómnàytrongphản ứng xúc tác và có thể làm thay đổi cấu trúc trung
tâm của enzyme.
• PH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa cơ chất, tại pH tối thích, phân
tử cơ chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp
vớienzyme, nhờ đó phản ứng có vận tốc cao nhất.

-

Ảnh hưởng của thời gian: trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của
enzyme lên cơ chất có ảnh hưởng tới hoạt động của nó và đến chất lượng
của sản phẩm. Thời gian tác dụng càng dài thì sự tác dụng càng triệt để. Mặt
khác nếu thời gian tác dụng quá ngắn thì sự phân giải protein chưa triệt để,
như vậy hiệu suất thủy phân thấp gây khó khăn cho công đoạn tiếp theo, gây
lãng phí nguyên vật liệu, không tận dụng hết nguyên liệu ban đầu.

-

Ảnh hưởng của nồng độ muối: muối ăn có tác dụng kìm hãm hoạt độngcủa vi
sinh vật gây thối rữa và các vi sinh vật không chịu muối, có tác dụng
bảo quản nguyên liệu trong quá trình thủy phân. Mặt khác, muối ăn còn điều
vị mặn tùy theo lượng muối bổ sung vào, ở nồng độ giới hạn cho phép thì
thúc đẩy enzyme hoạt động mạnh, nếu vượt qua giới hạn cho phép thì sẽ kìm
hãm sự hoạt động của enzyme.


10

-

Ảnh hưởng của ion kim loại: một số enzyme không bị ảnh hưởng rõ rệtcủa
sự có mặt hay không có mặt đối với ion kim loại, nhưng có nhiều
enzyme khác chịu ảnh hưởng sâu sắc của nồng độ và bản chất của ion kim
loại. Có những ion kim loại hầu như tuyệt đối cần thiết cho sự hoạt động của
một số enzyme, nhưng một số ion kim loại lại ức chế hoạt động của enzyme
này.

-

Ảnh hưởng của chất kìm hãm: chất kìm hãm là chất làm yếu hoặcchấm dứt
toàn bộ phản ứng của enzyme. Có hai loại chất kìm hãm :
Kìm hãm cạnh tranh: là những chất kìm hãm thuận nghịch enzyme, có
cấu trúc tương tự với cấu trúc cơ chất, do đó có khả năng kết hợp vào trung
tâm hoạt động của enzyme, do vậy nó chiếm chổ kết hợp của cơ chất làm
giảm vận tốc xúc tác .
Kìm hãm không cạnh tranh: là chất kết hợp ở vị trí khác với trung
tâm hoạt động làmthay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo
hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme, làm giảm vận tốc
phản ứng xúc tác.
Ảnh hưởng của chất hoạt hóa : chất hoạt hóa là những chất có khả
nănglàm tăng hoạtđộng xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme ở dạng
không hoạt động thành dạng hoạt động. Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay
phục hổi hoạt động của enzyme một cách gián tiếp hay trực tiếp.
Hoạt hóa không gián tiếp: làm tăng tốc độ phản ứng của enzyme bằng cách
loại trừ chất kìm hãm ra khỏi hỗn hợp phản ứng hoặc tham gia trực tiếp
phản ứng, nhưng không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme.
Hoạt hóa gián tiếp: chất này có tác dụng trực tiếp vào trung tâm hoạt động
của enzyme hoặc làm thay đổi cấu hình không gian của phân tử enzyme theo
hướng có lợi cho hoạt động xúc tác.

-

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme:
Đối với các phản ứng enzyme, tốc độ phản ứng thủy phân tỉ lệ với nồng
enzyme. Khi nồng độ enzyme quá cao nếu tiếp tục thêm enzyme, sự biến đổi


11

của tốc độ thủy phân là không đáng kể. Vì vậy, tốt hơn là sử dụng nồng độ
enzyme thích hợp để đạt hiệu quả thủy phân cực đại và giảm giá thành.
-

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:
Trong các phản ứng do enzyme và cơ chất, trước hết phải tạo thành phức
trung gian giữa enzyme và cơ chất. Sau đó, phức này chuyển hóa tiếp tục tạo
thành sản phẩm cuối cùng và enzyme tự do, enzyme lại kết hợp với phân tử
của cơ chất khác. Nếu nồng độ cơ chất đầy đủ thích hợp với lượng enzyme sẽ
làm quá trình thủy phân diễn ra đều đặn nhanh chóng.


12

Proteaza từ thực vật

Enzyme

Cấu trúc và chức năng

Bromelin

Papain

Ficin

Là một

Là protease-

Thuỷ phân các

glycoprotein, mỗi

thiol, trung tâm

liên kết

phân tử có glycan

hoạt động có

peptide của

gồm 3 maltose, 2

nhóm –SH

nhiều loại

glucosamine, 2

quyết định hoạt

protein tự

xylose và 1

tính của papain. nhiên (protein
sữa, đậu

fructose.

nành,…)

Nhiệt độ

Nhiệt độ thay đổi

Chịu được

Hoạt động 30 -

làm ảnh hưởng

nhiệt độ tương

80 C. Nhiệt độ

hoạt tính của

đối cao

tối hảo xúc tác

enzyme

0

0

50 - 65 C

Yếu tố chính

Bromelin có biên

ảnh hưởng

độ pH từ 3-10, pH định (cấu trúc

từ 4 – 9.5, pH

hoạt tính

tối thiểu 5-8 tuỳ

không gian của

tối thích phụ

thuộc cơ chất

enzym ổn định)

thuộc vào loại

có thể chịu

cơ chất:

được pH = 1,5

gelatin: pH =

và pH = 8,5.

5, casein: pH =

enzyme
pH

Papain dạng ổn

pH hoạt động

9.5
Bảng 1: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ thực vật.


13

Proteaza từ động vật

Enzyme

Pepsin

Renin

Pancreatin

Tripsin

Chymotripsi
n

Thủy phân
LK
peptide, là
Là
polypeptide
cấu tạo bởi
329 amino
Cấu trúc

acid, đầu C là
alanin và đầu
N là
isoleusine

enzym
đông tụ
sữa
Rennin
chứa nhiều
a.acid tính
acid hơn
a.acid
kiềm (thấp

Xúc tác phản
ứng chuyển
hóa đạm,
đường, chất
béo và một số
chất khác ở
trong ruột

Cắt LK

Cấu tạo từ 3

của lysine

sợi

a.acid bất

polypetide:

kì và

Sợi A: a.acid

không cắt

1–13

liên kết

Sợi B: a.acid

giữa lysine 16-146
và

Sợi C: a.acid

arginine.

149–245

hơn
pepsin)

Có hoạt tính

pH

pH tối hảo

pH = 2,3 –

1.5 - 2.4

6,8

pH tối ưu

trong kiềm và 8
bất hoạt trong pH thích
acid mạnh.

hơp là 7,8-

pH tối ưu là
8-9

9,5
Bảng 2: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ động vật.


14

Giới thiệu Enzyme proteaza sử dụng :
Enzyme Protease sử dụng ở đây là TEGALASE R660L thủy phân protein trong đầu
tôm thành polypeptid.
-

Liều lượng: 0.5 - 1kg enzyme/1 tấn protein khô

-

Nhiệt độ15-60 độ C. Nhiệt độ tối ưu: 50-60 độ C.

-

Đóng gói: thùng 25kg. Dạng lỏng. Xuất xứ: Áo.

1.3)

Ứng dụng của proteaza:

Các protease nói chung được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
1.3.1) Trong công nghiệp:
-

Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,…

-

Công nghệ dệt: Protease VSV làm sạch tơ tằm, làm bong và tách rời các loại
tơ tằm

-

Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng dụng
giặt sạch vết máu, sữa trên vải.

-

Trong công nghiệp sữa, các protease như renine, pepsine được dùng trong
sản xuất formate, sữa đông tụ.

-

Sản xuất bia: pepsin, ficin,…rất tốt trong quá trình ổn định chất lượng bia

-

Sản xuất chất tẩy rửa: Enzyme có những tác dụng giảm thời gian giặt, giảm
lượng nước tiêu thụ

-

Trong thực phẩm : do bản chất sinh hóa khác nhau giữa các bộ phận hình
thái học của động vật thủy sản, người ta có thể sử dụng enzyme để thực hiện
quá trình phân giải một cách có định hướng vào những mục đích như loại da
cá đuối, cá trích, các loại cá da trơn…., tách vỏ hàu, hến, tôm, mực…Phương
pháp cho hiệu suất cao hơn nhiều lần so với thực hiện thủ công hay hóa học.
• Bên cạnh đó protease còn có thể làm sạch vảy cá, bóc tách màng và
cơ quan nội tạng thủy sản.


15

• Sử dụng enzyme protease trong tách chiết carotenoprotein từ phế liệu
của quá trình chế biến các loài giáp xác hiện nay là một hướng nghiên
cứu đang rất được chú ý vì giúp nâng cao lợi nhuận sản xuất giảm
thiểu ô nhiễm môi trường. Carotenoprotein từ đầu, vỏ tôm hiện đang
rất được quan tâm để sử dụng làm thực phẩm chức năng cho người vì

thành phần carotenoid chủ yếu là astaxanthin, một hợp chất chống oxy
hóa thiên nhiên
-

Công nghệ sữa: sản xuất phomat nhờ enzyme renin…

-

Chế biến nước mắm: bromelin, papain rút ngắn thời gian ủ và cải thiện
hương vị nước mắm.

-

Công nghệ chế biến thịt: Papain, bromelin, ficin…thủy phân protein trong
thịt nên làm thịt mềm.

-

Sản xuất bánh kẹo: tăng mùi vị của bánh, kẹo.

1.3.2) Trong nông nghiệp :
Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân làm giàu đạm bổ sung vào
thức ăn của lợn và gia cầm.
1.3.3) Trong mỹ phẩm :
Người ta trộn một lượng nhỏ protease vào kem xoa, kem cạo râu, dầu gội,
dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già.
1.3.4) Trong y học :
-

Protease được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật, sản

xuất huyết thanh miễn dịch.

-

Ứng dụng đặc tính của papain, trypsin, bromelin…để SX dược phẩm.

-

Sử dụng enzyme collagenase trong điều trị cơ gân, mạch máu… bị sơ cứng

-

Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh
mạch…