Nghiên cứu quy trình chế tạo và đánh giá hiệu quả tác động của hệ nano đa chức năng (polymer drug fe3o4 folate) lên tế bào ung thư (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

……..….***…………

LÊ THỊ THU HƢƠNG

Nghiên cứu chế tạo và đánh giá hiệu quả tác động của hệ nano
đa chức năng (polymer-drug-Fe3O4-folate) lên tế bào ung thƣ
Chuyên ngành: Vật liệu điện tử
Mã số: 9.44.01.23

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

Hà Nội – 2018


Công trình đƣợc hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 1: TS. Hà Phƣơng Thƣ
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 2: GS.TSKH. Nguyễn Xuân Phúc

Phản biện 1: …
Phản biện 2: …
Phản biện 3: ….

Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp tại Học

viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 201….

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thƣ viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Ngày nay, sự phát triển của khoa học và công nghệ đã đem lại nhiều
tiến bộ vƣợt bậc trong sinh y học nhƣng loài ngƣời vẫn đang phải đối diện
với nhiều loại bệnh nan y, điển hình nhất là bệnh ung thƣ. Hiện nay có rất
nhiều thuốc điều trị ung thƣ trên thị trƣờng. Tuy nhiên, nhƣợc điểm lớn nhất
của các loại thuốc điều trị ung thƣ là ít tan trong nƣớc hoặc dễ bị đào thải,
tính định hƣớng chọn lọc không cao và dù ít hay nhiều đều ảnh hƣởng không
tốt đối với sức khỏe bệnh nhân vì có tác dụng phụ kèm theo nhƣ các triệu
chứng buồn nôn, tiêu chảy, gây thiếu máu, giảm miễn dịch của cơ thể.
Nguyên nhân là do phần lớn các phƣơng thức điều trị không chỉ tác động cục
bộ lên khối u mà còn ảnh hƣởng đến một bộ phận lớn các mô và cơ quan
lành của cơ thể [1].
Để khắc phục những nhƣợc điểm của phƣơng pháp nêu trên, các nhà
nghiên cứu đã ứng dụng công nghệ nano, sử dụng vật liệu với kích thƣớc
nano mét làm phƣơng tiện dẫn các loại thuốc đặc trị ung thƣ nhƣ Curcumin,
Paclitaxel, Doxorubicin… đến khối u một cách an toàn [2–4]. Bên cạnh đó
vật liệu nano từ đã và đang đƣợc nghiên cứu mạnh mẽ nhằm ứng dụng trong
sàng lọc tế bào ung thƣ, chẩn đoán ung thƣ bằng hình ảnh cộng hƣởng từ
MRI, nhiệt trị bằng cách làm tăng nhiệt độ vùng khối u khi đƣợc đặt trong từ
trƣờng, và đặc biệt là dẫn truyền thuốc dƣới ảnh hƣởng của nam châm... [5,
6] Các hạt nano từ và thuốc chống ung thƣ đƣợc bọc bởi các lớp vỏ là các

polymer thiên nhiên hoặc polymer tổng hợp … và có thể đƣợc gắn thêm một
số yếu tố hƣớng đích. Hệ nano đa chức năng nhƣ vậy sẽ tăng hiệu quả tác
động đối với các tế bào ung thƣ nhất định, giải quyết phần nào yêu cầu của
phƣơng pháp hóa trị là phải có tính chọn lọc cao đối với tế bào ung thƣ. Lợi
ích là: Sử dụng vật liệu này cho phép giảm liều thuốc dùng, giúp ngƣời bệnh
tránh đƣợc các tác dụng phụ không mong muốn; tập trung thuốc vào vị trí
khối u, tránh tác động đến tế bào lành [7, 8]. Nhƣ vậy, có thể sử dụng hạt
nano lõi Fe3O4, lớp vỏ bọc là các polime nhƣ chitosan biến tính, dextran biến
tính, alginate, copolime…, gắn thêm đuôi folate nhƣ một phƣơng tiện chuyên
chở thuốc Curcumin (Cur) hoặc Doxorubicin (Dox) đến đúng đích là khối u
ung thƣ một cách an toàn. Trên thế giới, một số nghiên cứu về hệ nano đa
chức năng dùng trong y sinh học, đặc biệt là trong điều trị ung thƣ đã đƣợc
1


công bố [9–11], tuy nhiên, đây vẫn là hƣớng nghiên cứu mới với nhiều triển
vọng.
Ở Việt Nam, một số nhóm nghiên cứu đã công bố các công trình liên
quan đến việc tổng hợp hạt nano từ và ứng dụng trong xử lí môi trƣờng. Các
nghiên cứu định hƣớng sử dụng hạt nano từ trong y sinh chủ yếu khai thác
khả năng nhiệt từ trị của vật liệu này [14–16]. Tính chất quang và khả năng
hƣớng đích đƣợc nghiên cứu rất hạn chế.
Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện luận án “Nghiên cứu chế tạo và
đánh giá hiệu quả tác động của hệ nano đa chức năng (polymer-drugFe3O4-folate) lên tế bào ung thƣ”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
- Chế tạo đƣợc hệ nano đa chức năng gồm: vật liệu kích thƣớc nano Fe 3O4
(có tính chất từ) đƣợc bọc bởi polyme tƣơng thích sinh học, gắn yếu tố
hƣớng đích (folate), mang thuốc (drug) ((Curcumin, Doxorubicin) (tính chất
quang)), phân tán tốt trong nƣớc, có khả năng nhắm đích ung thƣ.
- Thử nghiệm và đánh giá đƣợc hiệu quả tác động của hệ hạt nano lên các

dòng tế bào ung thƣ nhƣ HT29; HeLa; HepG2... và trên động vật thực
nghiệm.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
- Tổng hợp các vật liệu nano đa chức năng mang thuốc curcumin và
doxorubicin trên nền hạt nano Fe3O4 bọc bằng các polime thiên nhiên (Ocacboxylmetyl chitosan và alginate) có gắn yếu tố hƣớng đích folate.
- Xác định đặc trƣng của các vật liệu chế tạo đƣợc bằng các phƣơng pháp
hoá lí hiện đại: FTIR, UV-Vis, phổ huỳnh quang, XRD, VSM, TGA, SEM,
TEM…
- Xác định tác động của hệ nano đa chức năng trên các dòng tế bào ung thƣ:
Hep-G2, HeLa, LU-1,… và trên chuột nhắt trắng mang khối u.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
Trong chƣơng này, chúng tôi đã tổng quan các vấn đề liên quan đến việc
chế tạo hệ nano đa chức năng và đánh giá hiệu quả tác động của các hệ này
lên tế bào ung thƣ. Hệ đa chức năng chứa các thành phần: nano Fe 3O4 đƣợc
bọc bằng polime, mang thuốc (drug) và gắn folate. Cụ thể: Tổng quan về tính
chất, các phƣơng pháp tổng hợp và ứng dụng của hạt nano Fe 3O4. Đặc biệt
2


đã chỉ rõ các vấn đề cần giải quyết để sử dụng đƣợc hạt nano Fe 3O4 trong
lĩnh vực y sinh; Tính chất và khả năng ứng dụng các loại polime thiên nhiên
thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ O-cacboxyl metyl chitosan, alginate, dextran; Đặc
trƣng tính chất và một số nghiên cứu sử dụng các dƣợc chất: curcumin và
Doxorubicin; Phƣơng pháp gắn folate lên hệ hạt nano và hiệu quả hƣớng
đích của tác nhân này.
CHƢƠNG 2. ĐIỀU KIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.1. Tổng hợp vật liệu
Các hệ nano đa chức năng đƣợc tổng hợp theo sơ đồ hình 2.1. Trong
đó, lõi hạt nano từ (Fe3O4) đƣợc tổng hợp theo phƣơng pháp đồng kết tủa ion

Fe2+ và Fe3+ (với tỉ lệ mol 1:2) trong điều kiện đồng kết tủa thông thƣờng
[41] hoặc đồng kết tủa có sử dụng kĩ thuật vi sóng trên thiết bị Sineo-Uwave
1000. Hạt nano Fe3O4 sau đó đƣợc bọc bằng OCMCS (1 mg/ml) hoặc
alginate với nồng độ khác nhau. Trong bƣớc tiếp theo, Curcumin hoặc
Doxorubicin đƣợc mang lên hệ nhờ tƣơng tác hấp phụ với lõi từ hoặc phản
ứng với lớp vỏ polime. Cuối cùng hệ mang thuốc đã đƣợc tối ƣu hóa đƣợc
lựa chon để gắn thêm yếu tố hƣớng đích folate hoặc chấm lƣợng tử CdTe.

Hình 2.1: Sơ đồ tổng hợp các hệ dẫn thuốc đa chức năng

2.2. Các phƣơng pháp đặc trƣng tính chất của hệ
Tính chất của hệ đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp hiện đại: Nhiễu
xạ tia X, phổ hồng ngoại, phổ UV-Vis, phổ huỳnh quang, phân tích nhiệt,
3


hiển vi điện tử quét, hiển vi điện tử truyền qua. Hiệu suất, dung lƣợng mang
thuốc và khả năng giải phóng thuốc đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phổ
UV-Vis.
Độc tính tế bào của các mẫu đƣợc xác định theo phƣơng pháp của
Skehan và Likhiwitayawuid [171, 172].
Phƣơng pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) đƣợc sử dụng để định
lƣợng Fe có trong các mô của chuột.
Đánh giá tác động của hệ đa chức năng trên chuột:
Chuột mang u kích thƣớc 7-10 mm đƣợc chia thành 4 nhóm, mỗi nhóm
6 con, gồm có: nhóm chứng (chuột có u không điều trị) và các nhóm đƣợc
điều trị lần lƣợt bằng FA, FAD, FADF. Trong mỗi chu kì điều trị, thuốc
đƣợc tiêm trực tiếp vào khối u với liều 50 l/con. 40 phút sau tiêm, chuột
đƣợc cố định trong ống nhựa và đƣa vào trong cuộn dây của hệ đốt từ RDOHFI với tần số 178 kHz, cƣờng độ từ trƣờng 90 Oe, thời gian đốt 30
phút/con. Hai chu kì liền nhau cách nhau 3 ngày. Ghi nhận sự thay đổi kích

thƣớc khối u. Qua đó đánh giá tác dụng điều trị của hạt nano từ mang
Doxorubicin trên mô hình chuột mang khối ung thƣ phổi.
Phương pháp xử lí số liệu: Excel 2010, OriginPro 8 hoặc SPSS 22.0.
CHƢƠNG 3. HẠT NANO Fe3O4 BỌC BẰNG OCMCS MANG
CURCUMIN
3.1. Tổng hợp hạt nano Fe3O4
Hạt Fe3O4 đã đƣợc tổng hợp thành công theo phƣơng pháp đồng kết tủa
(liên kết Fe-O đặc trƣng bởi đỉnh hấp thụ tại 575 cm-1 trên phổ hồng ngoại),
cấu trúc spinel đảo (phổ XRD), từ độ bão hoà 70,5 emu/g, có tính chất siêu
thuận từ với giá trị Mr và Hc  0 và có kích thƣớc trung bình khoảng 15 nm.
3.1.2. Hạt nano Fe3O4 tổng hợp bằng kĩ thuật vi sóng
3.1.2.1. Tính chất từ
Từ trễ Mr và lực kháng từ Hc của các mẫu chế tạo đƣợc đều  0 chứng
tỏ vật liệu có tính chất siêu thuận từ (bảng 3.1). Vi sóng không làm thay đổi
tính chất này của vật liệu. Từ độ bão hoà của mẫu M5 là cao nhất so với các
mẫu còn lại, đạt 69 emu/g. Giá trị này không khác biệt nhiều so với mẫu
Fe3O4 đồng kết tủa trong điều kiện thông thƣờng (70,5 emu/g).
Bảng 3.1: Các thông số từ của các mẫu Fe3O4 tổng hợp bằng kĩ thuật vi sóng

Mẫu

M1

M2

M3

M4

M5

M6

M7

M8

M9 M10 M11
4


Ms
53,9 56,2 56,7 63,0 69,0 64,6 59,6 60,6 60,7 62,7 64,5
(emu/g)
Hc
2,5 14 4 2,5 0 20 0 18 2 2 21
(Oe)
Mr
0,5 1,0 0,2 0,4 0 1,7 0 2 0,1 0,2 1,9
(emu/g)
Nhƣ vậy, M5 là mẫu tốt nhất về mặt từ tính.
3.1.2.2. Phổ nhiễu xạ tia X
Giản đồ XRD của mẫu M5 xuất hiện đầy đủ các pic đặc trƣng của Fe 3O4
và không có pic nào khác chứng tỏ mẫu M5 đã hình thành cấu trúc spinel
đơn pha. Kết quả này khẳng định M5 là mẫu tốt nhất về cấu trúc pha tinh thể.
3.1.2.3. Phổ hồng ngoại
Trên hình 3.4 có thể thấy các mẫu Fe3O4 đều xuất hiện pic đặc trƣng
cho liên kết Fe-O tại vị trí khoảng 570 cm-1. Tuy nhiên ở một số mẫu xuất
hiện thêm pic cƣờng độ thấp hơn ở khoảng 630 cm-1 tƣơng ứng với sự có
mặt của thành phần Fe2O3 trong mẫu [174]. Phổ đồ này cho thấy M5 là mẫu

có độ tinh khiết cao nhất với chỉ 1 pic đặc trƣng và cƣờng độ pic lớn.
Nhƣ vậy, qua khảo sát từ độ, cấu trúc tinh thể và phổ hồng ngoại,
chúng tôi lựa chọn mẫu M5 để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng curcumin lên tính chất các hệ mang
curcumin (FOC1-FOC5)
Lƣợng curcumin đƣợc thay đổi từ 20 - 100 mg và khảo sát tính chất từ
cũng nhƣ độ bền của hệ thông qua đo giá trị thế Zeta của hệ. Kết quả đƣợc
trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát hàm lượng curcumin

Mẫu
FOC1 FOC2 FOC3 FOC4 FOC5
Khối lƣợng curcumin (mg)
20
40
60
80
100
Từ độ bão hoà (Ms, emu/g)
54,9 52,9 49,0 35,3 25,8
Thế Zeta (mV)
40,2 32,6 30,4 18,2 8,1
Kết quả đo từ độ bão hoà các mẫu FOC1-5 cho thấy khi lƣợng curcumin
tăng dần từ 20 đến 100 mg, từ độ bão hoà của các mẫu giảm dần, đặc biệt ở
mẫu FOC4 và FOC5.
Thế Zeta của các mẫu FOC1-5 đều có giá trị dƣơng do hạt từ đã đƣợc bọc
bằng lớp polime O-cacboxylmetyl chitosan với nhiều nhóm chức NH2 trên
bề mặt. Xu hƣớng biến đổi trị số thế Zeta trong các mẫu này tƣơng tự nhƣ sự
5

biến đổi về từ độ bão hoà. Các mẫu FOC1-3 có thế lớn hơn 30 mV chứng tỏ
các mẫu này có thể duy trì đƣợc trạng thái ổn định [170]. Trong khi đó, mẫu
FOC4 và FOC5 có thế Zeta thấp hơn hẳn (dƣới 20 mV).
Do đó, để đảm bảo hệ đa chức năng mang đƣợc nhiều thuốc nhất và vẫn
giữ đƣợc các tính chất từ và độ bền tốt, chúng tôi sử dụng khối lƣợng
curcumin khi chế tạo là 60 mg. Khối lƣợng này cũng đƣợc dùng để chế tạo
hệ Fe3O4/OCMCS/Cur/Fol. Hàm lƣợng curcumin thực tế đi vào trong hệ
đƣợc định lƣợng theo phƣơng pháp phân tích nhiệt (mục 3.3.4).
3.3. Hệ nano mang curcumin FOC và mang curcumin gắn folate FOCF
3.3.1. Phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại của FOC và FOCF đƣợc so sánh với phổ hồng ngoại của
từng thành phần: Fe3O4, OCMCS, Curcumin và axit folic. Sự chuyển dịch
các pic đặc trƣng chứng tỏ hệ đã đƣợc tổng hợp thành công.
3.3.2. Phổ huỳnh quang
Curcumin là hợp chất có khả
năng phát huỳnh quang. Sau khi
nhận kích thích bởi bức xạ có bƣớc
sóng 442nm, dung dịch FOC phát xạ
phổ huỳnh quang với bƣớc sóng cực
đại ở 515 nm.
So với phổ huỳnh quang của
curcumin
trong
dung
môi
Hình 3.11: Phổ huỳnh quang của FOC và curcumin etanol/nƣớc (tỉ lệ 1:1) với cực đại tại
542 nm, trên phổ của FOC có sự chuyển dịch xanh (chuyển dịch 27nm về
phía bƣớc sóng ngắn) có thể giải thích là do có tƣơng tác của phân tử
curcumin với Fe3O4/OCMCS. Về cƣờng độ, dung dịch FOC phát huỳnh

quang yếu hơn hẳn so với curcumin tự do. Nguyên nhân là do sự có mặt
Fe3O4 trong mẫu làm giảm khả năng phát huỳnh quang của curcumin [132].
3.3.3. Ảnh hiển vi điện tử quét (FeSEM)
Hình thái học bề mặt của hệ FOC và FOCF đƣợc xác định trên ảnh
SEM cho thấy kích thƣớc của các hạt này vào khoảng 30 nm, lớn hơn kích
thƣớc của hạt Fe3O4 ban đầu (khoảng 20 nm) chứng tỏ rằng curcumin và axit
folic đã hấp phụ lên bề mặt của hạt nano Fe3O4.
3.3.4. Phân tích nhiệt
Trên đƣờng TGA của FOC và FOCF xuất hiện tƣơng ứng 2 và 3 khoảng
6


mất khối lƣợng khi tăng nhiệt độ. Giai đoạn mất khối lƣợng trong dải nhiệt
độ từ 360 đến 430oC xuất hiện ở giản đồ phân tích nhiệt của cả 2 mẫu tƣơng
ứng với sự phân hủy của OCMCS và curcumin, và do đó, giai đoạn mất khối
lƣợng thứ hai tại 299oC của mẫu FOCF là do axit folic bị chuyển hóa. Từ các
thông số trên giản đồ phân tính nhiệt có thể xác định đƣợc hàm lƣợng của
curcumin và Fe3O4 trong FOC là 45% và 48%, hàm lƣợng axit folic,
curcumin và Fe3O4 trong mẫu FOCF lần lƣợt là 26%, 25% và 46%. Nhƣ vậy,
dung lƣợng hấp phụ curcumin tƣơng ứng là 0,95 mg và 0,54 mg/mg Fe3O4
trong 2 mẫu FOC, FOCF. Dung lƣợng hấp phụ curcumin của FOCF giảm đi
so với FOC. Mặc dù vậy, FOCF vẫn mang đƣợc lƣợng curcumin nhiều hơn
so với các nghiên cứu khác [134, 176, 177]. Hình 3.14 mô tả cấu trúc của
FOC và FOCF, trong đó curcumin đƣợc hấp phụ trên bề mặt của hạt Fe3O4.

Hình 3.1: Mô hình cấu trúc hệ FOC và FOCF

3.3.5. Giản đồ nhiễu xạ tia X và tính chất từ
80

(a)Fe3O4
(440)
(b) Fe3O4/OCMCS/Cur
(c) Fe3O4/OCMCS/Cur/Fol
(511)
(400)
(422)

(200)

(a)

60
40

Ms (emu/g)

(311)

(c)

(b)

20

1.5

(b)

1.0

(c)

0.5
0.0

-25

-20

-15

-10

-5

0

0
-20

(c) Fe3O4/OCMCS/Cur/folic
(b) Fe3O4/OCMCS/Cur

-40
(a)

(a) Fe3O4

-60

30

40

50
o
2theta ( )

60

70

Hình 3.15: Giản đồ nhiễu xạ tia X của
(a) Fe3O4, (b) FOC và (c)
Fe3O4/OCMCS/Cur/Fol

-80
-15000 -10000

-5000

0

5000

10000

15000

H (Oe)

Hình 3.16: Đƣờng cong từ trễ của (a)
Fe3O4,(b) FOC và (c) FOC /Fol tại nhiệt độ
phòng

Giản đồ nhiễu xạ tia X của FOC và FOCF (hình 3.15) xuất hiện các pic
tƣơng ứng với 6 mặt phẳng mạng đặc trƣng của Fe3O4 là (200), (311), (400),
7


(422), (511) và (440), chứng tỏ cấu trúc spinel của Fe3O4 không thay đổi
trong quá trình dẫn thuốc. Các phép đo từ cũng chứng minh hệ nano mang
thuốc giữ nguyên đƣợc cấu trúc tinh thể (hình 3.10). Từ độ bão hòa của FOC
và FOCF NPs vào khoảng 50 emu/g, thấp hơn 20 emu/g so với Fe3O4 tự do
do sự hấp phụ của curcumin hoặc axit folic lên bề mặt của Fe3O4. Ngoài ra,
giá trị từ dƣ Mr và lực kháng từ Hc của cả 2 hệ đều gần bằng 0 chứng minh
tính chất siêu thuận từ của hạt Fe3O4 kích thƣớc dƣới 30 nm [169].
3.3.6. Kết quả đốt nóng cảm ứng từ
Kết quả đốt nóng cảm ứng đƣợc trình bày trong bảng 3.4. Khi nồng độ
oxit sắt từ giảm, cả nhiệt độ bão hòa Ts và tốc độ tăng nhiệt ban đầu dT/dt
(xác định tại t=0) đều giảm. Nồng độ hạt từ từ 0,3 mg/ml trở lên đều cho
nhiệt độ bão hòa lên tới hơn 42oC và cao hơn sau 10 phút.
Bảng 3.4: Thông số đốt nóng cảm ứng của các mẫu mang curcumin

Nồng
độ (mg/ml)
0,1

FOC

Ts (1500 s)
45,5

dT/dt
0,02

FOCF
Ts (1500 s)
38,6

dT/dt
0,01

0,3

50,0

0,03

44,2

0,02

0,5

54,6

0,04

54,7

0,03

0,7

58,6

0,06

58,9

0,04

1

64,3

0,09

67,5

0,06

Thời gian lƣu 10 phút và có thể kéo dài hơn có thể thiết lập đƣợc khi
duy trì điều kiện từ trƣờng đốt. Vì tế bào ung thƣ có thể trải qua quá trình
apoptosis (chết theo chƣơng trình) trong khoảng nhiệt độ từ 42–46◦C [73], hệ
FOCF hoàn toàn có thể ứng dụng trong điều trị ung thƣ bằng phƣơng pháp
nhiệt trị.
3.3.9. Độc tính tế bào
Các ảnh chụp huỳnh quang cho thấy sự xâm nhập của curcumin vào

bên trong tế bào HT29 (tín hiệu màu xanh) khi ủ với FOC (hình 3.21).
Nguyên nhân của tín hiệu màu xanh lục ở đây là do curcumin có khả năng tự
phát huỳnh quang khi kích thích bằng laze Agon. Ở mẫu đối chứng không
xuất hiện tín hiệu này. Kết quả này đồng thời chứng tỏ rằng kết hợp
curcumin lên hệ mang nano không ảnh hƣởng tới khả năng nhập bào của
curcumin, hệ nano vẫn đảm bảo đƣa đƣợc curcumin vào trong tế bào.
8


Curcumin

Kết hợp: Đỏ - actine; xanh lam –
nhân; xanh lục – curcumin

Hình 3.21: Ảnh huỳnh quang của tế bào HT29 trong điều kiện bình
thƣờng (control) và trong điều kiện ủ 15 giờ với hệ FOC

3.3.10. Phân bố sinh học
Phân bố của FOC và FOCF trong các cơ quan trên chuột mang khối u
Sarcoma 180 đƣợc xác định dựa trên hình ảnh giải phẫu các mô này (hình
3.23). Các chấm màu nâu đậm trên ảnh giải phẫu mô là các đám hạt nano
oxit sắt từ bị kết tụ lại với nhau. Các nghiên cứu in vivo theo dõi phân bố
sinh học của các mẫu nano Fe3O4 (đƣợc chức năng hóa bề mặt khác nhau)
trên chuột khỏe mạnh đã chỉ ra rằng các hạt nano từ này sẽ phân bố chủ yếu
tại gan và lá lách và chuyển hóa một phần thành các dạng hợp chất không
độc khác nhau của sắt dƣới tác động của các đại thực bào đơn nhân. Sau 14
ngày tiêm nano Fe3O4, dấu vết của các hệ này vẫn còn trong gan nhƣng
không gây ảnh hƣởng đến tế bào gan, sau 58 ngày thì các dấu vết này hoàn
toàn biến mất [181]. Trong nghiên cứu này, hệ nano FOC và FOCF cũng
phân bố đến gan và lách, ngoài ra, trên khối u ghi nhận rõ sự xuất hiện của

các hệ này.
Hàm lƣợng FOCF trong khối u Sarcoma 180 (đã đƣợc chứng minh có
biểu hiện quá mức thụ thể folate [182]) cao hơn nhiều so với FOC sau khi
tiêm 2,5 h. Sau 5 h, hàm lƣợng hạt từ có folate vẫn cao hơn hệ không có
folate chứng minh tính hƣớng đích của gốc folate. Từ đƣờng cong đốt từ có
9


thể thấy rằng hàm lƣợng Fe3O4 càng cao thì khả năng tăng nhiệt và nhiệt độ
bão hòa càng cao, do đó khi tăng nồng độ Fe3O4 nhờ yếu tố hƣớng đích folat,
hệ có thể đƣợc dùng hiệu quả hơn trong nhiệt trị ung thƣ. Ngoài ra, khi áp
một nam châm vào lƣng chuột điều trị bằng FOCF, sau 5h, lƣợng hạt từ xuất
hiện ở thận và lá lách cao hơn chuột điều trị bằng FOC. Điều này cho thấy,
gốc folate và từ trƣờng có thể giúp hƣớng đích tới những khối u xuất hiện ở
các cơ quan này.
CHƢƠNG 4: HẠT NANO Fe3O4 BỌC BẰNG ALGINATE MANG
DOXORUBICIN
4.1. Ảnh hƣởng của nồng độ alginate đến khả năng mang Dox và các
tính chất của hệ đa chức năng
Khác với curcumin, Dox là thuốc tan tốt trong nƣớc. Do đó, Dox khó
có thể tƣơng tác với bề mặt kị nƣớc của Fe3O4. Để đƣa Dox lên hệ đa chức
năng, cần phải gắn kết Dox với bề mặt hạt bằng liên kết hoá học. Nghiên cứu
đã chỉ ra rằng lớp vỏ polime là yếu tố quyết định đến khả năng mang Dox
của hạt nano Fe3O4 [143].
4.1.1. Phổ hồng ngoại và phổ huỳnh quang
Liên kết Fe-O của Fe3O4 trong các mẫu FA4, FA10, FA4D đƣợc đặc
trƣng bởi các pic trong vùng 570 cm-1. So với Fe3O4 nguyên chất (575 cm-1),
số sóng của dao động Fe-O trong các mẫu bọc alginate giảm đi (lần lƣợt là
566, 574 và 563 cm-1 trên phổ của FA4, FA10, FAD) chứng tỏ quá trình bọc
polime alginate lên bề mặt hạt từ Fe3O4 đã thực hiện đƣợc. Bên cạnh đó, sự

chuyển dịch về số sóng đặc trƣng cho các liên kết hữu cơ chứng tỏ
Doxorubicin đã đƣợc mang lên hệ hạt nano. Hình 4.2 là phổ huỳnh quang
của FA4D so với Dox tự do. Liên kết
hóa học giữa Dox và hạt nano từ có thể
đƣợc khẳng định bằng sự thay đổi vị trí
đỉnh huỳnh quang của mẫu FA4D
(chuyển dịch 17 nm so với Dox tự do)
[132]. Hơn nữa, cƣờng độ huỳnh
quang của FA4D giảm mạnh có thể là
do hiệu ứng dập tắt huỳnh quang của
Fe3O4 có mặt trong mẫu [183].
Hình 4.2: Phổ huỳnh quang của Dox và
FA4D (cùng nồng độ Dox)

10


4.1.2. Dung lượng thuốc (LC) và hiệu suất mang thuốc (EE)
Dung lƣợng mang thuốc của các mẫu đƣợc trình bày trong bảng 4.1.
Các dữ kiện cho thấy nồng độ alginate là yếu tố quan trọng tác động tới hiệu
suất mang Dox. Nồng độ alginate càng cao, khả năng mang Dox càng lớn.
Hiện tƣợng này có thể đƣợc giải thích do sự hình thành liên kết giữa Dox và
alginate trên bề mặt của hạt nano Fe3O4. Tuy vậy, do hàm lƣợng alginate
tăng từ FA2D đến FA10D, khối lƣợng cả hệ tăng nên dung lƣợng thuốc
không tăng một cách liên tục. Dung lƣợng thuốc trong hệ đạt giá trị cực đại ở
mẫu FA4D, do đó chúng tôi lựa chọn mẫu này cho thử nghiệm sinh học.
Bảng 4.1: Giá trị EE và LC

Mẫu
EE (%)

FA2D
61,2±0,5

FA4D
78,5±0,3

FA6D
85,0±0,9

FA8D
87,2±0,8

FA10D
90,8±0,7

LC (%)

17,9±0,2

19,0±0,1

17,5±0,2

15,6±0,1

14,4±0,1

4.1.3. Phân bố kích thước và ảnh TEM của hệ
Dải phân bố kích thƣớc hạt của hệ nano xác định bằng phổ DLS phụ

thuộc rất nhiều vào nồng độ alginate. Trƣớc khi mang thuốc Dox, hạt Fe3O4
bọc bằng alginate FA4 và FA8 có kích thƣớc thuỷ động là 18 nm và 91 nm.
Nồng độ cao của alginate ở mẫu FA8 tạo ra lớp vỏ bọc dày hơn và mở rộng
kích thƣớc thuỷ động của hạt do tính ƣa nƣớc của alginate. Mang Dox trong
hệ mẫu FA4D và FA8D làm tăng rõ rệt kích thƣớc hạt trong dung dịch
(tƣơng ứng là 255 và 480 nm), đồng thời dải phân bố kích thƣớc cũng trở
nên rộng hơn so với FA4 và FA8.
Tƣơng ứng với lƣợng thuốc Dox, FA8D chứa nhiều Dox hơn FA4D
nên sự tăng kích thƣớc cũng nhiều hơn so với FA4D. Hệ FA4D có kích
thƣớc thích hợp hơn so với FA8D cho các ứng dụng y sinh. Ảnh TEM cho
thấy kích thƣớc hạt thay đổi từ 6 đến 13 nm, kích thƣớc trung bình vào
khoảng 9,3 nm tƣơng ứng với kích thƣớc tính đƣợc từ phƣơng pháp nhiễu xạ
tia X (Hình 4.5) theo phƣơng trình Scherrer (D=K/(cos)8 nm [161].
4.1.4. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) và tính chất từ

11


Lin (cps)

(400)

(440)

(422)

-10000

-1

-5000

40
20
0

H (Oe)
0

5000

10000
-1

(511)

60

Ms (emu g )

(220)

FA2
FA4
FA6
FA8
FA10
FA4D
FA8D

Fe3O4
FA4D

Ms (emu g )

(311)

-20

4

3

-40
30

40

50
o
2theta ( )

60

2

1

70

-60

0

H (Oe)

Hình 4.5: Giản đồ XRD của FA4D

-40

-20

0

Hình 4.6: Tính chất từ của các hệ hạt

Các pic đặc trƣng của tinh thể Fe3O4 trong mẫu FA4D xuất hiện đầy đủ
trên giản đồ XRD của FA4D (hình 4.5). Các pic này có cƣờng độ tƣơng đối
thấp so với Fe3O4 tự do do sự có mặt của các thành phần hữu cơ (alginate và
Dox) trong hệ.
Bảng 4.2: Các thông số từ của các mẫu bọc bằng alginate

Mẫu

FA2

Ms
61,2
(emu/g)
Hc (Oe) 18

Mr
1,5
(emu/g)

FA4 FA6 FA8 FA10

FA4D

FA8D

69,5 65,3 65,8 63,9

51,6

33,9

Fe3O4 Fe3O4
[176] [177]
43
25

14
1,4

50
4,1

52
3,2

45
2

12
1,0

13
1,1

17
1,6

108
6

Trên hình 4.6 có thể nhận thấy cả từ dƣ và hệ số kháng từ của các mẫu
đều xấp xỉ bằng 0, chứng minh rằng các hệ hạt đều là siêu thuận từ. Thêm
vào đó, giá trị Hc và Mr của FA4D và FA8D lớn hơn nhiều so với các mẫu
không mang thuốc. Điều này có thể là do Dox làm thay đổi tính chất dị
hƣớng từ của vật liệu [186]. Từ độ giảm khi tăng nồng độ alginate (từ FA4
đến FA10). Giá trị từ độ của mẫu FA4 là cao nhất trong dãy mẫu này.
Nguyên nhân của hiện tƣợng này là do hàm lƣợng alginate, một chất phi từ,
tăng dần trong các mẫu. Riêng đối với FA2, từ độ bão hoà thấp nhất trong
dãy của mẫu này có thể đƣợc giải thích là do ở nồng độ alginate nhỏ, polime
này không đủ bao phủ bề mặt hạt từ, do đó chúng có thể bị oxi hoá một phần
bởi không khí trong quá trình sấy mẫu, trở thành Fe 2O3 có từ độ thấp hơn
[164]. Từ độ bão hoà của FA4D và FA8D, 2 mẫu mang Dox giảm mạnh so
với các mẫu không mang thuốc (tƣơng ứng là 51,6 và 33,9 emu/g) chứng tỏ
Dox đã đƣợc mang lên hệ với lƣợng đáng kể. Sự giảm sâu hơn của từ độ mẫu
12

FA8D so với FA4D là kết quả của việc mang lƣợng Dox lớn hơn trong hệ
này. Tuy giảm, các giá trị từ độ bão hoà của FA4D và FA8D vẫn đủ lớn để
tách khỏi hệ phản ứng dễ dàng, nhanh chóng bằng từ trƣờng ngoài.
4.1.5. Kết quả đốt nóng cảm ứng từ
Kết quả đốt nóng cảm ứng từ mẫu FA4 và FA4D với các nồng độ khác
nhau (từ 0,5 đến 3,0 mg/ml), và các mẫu Fe3O4 tự do, FA4, FA8, FA4D cùng
nồng độ 3,0 mg/ml xác định tại cùng điều kiện từ trƣờng tần số 178 kHz và
cƣờng độ 80 Oe đƣợc trình bày trên hình 4.7 và bảng 4.3. Các đặc trƣng đốt
nóng cảm ứng từ hình 4.7a và 4.7b cho thấy giá trị nhiệt độ bão hoà Ts (xác
định ở thời gian đốt 1500 s) phụ thuộc vào nồng độ. Khi nồng độ hạt từ giảm
(bằng cách pha loãng với nƣớc), cả nhiệt độ bão hoà Ts và tốc độ tăng nhiệt
ban đầu dT/dt đều giảm. Tất cả các mẫu đều đạt nhiệt độ 42°C và cao hơn
trong 20 phút. Hệ có khả năng duy trì đƣợc khoảng nhiệt độ này nếu tiếp tục
chiếu từ. Do tế bào ung thƣ có thể bị tiêu diệt trong vùng nhiệt độ 42–46oC
[73], các hệ nano từ đã chế tạo (cả hệ không mang thuốc FA4 và hệ mang
thuốc FA4D) đều có khả năng làm hạt nhân tạo nhiệt tốt cho ứng dụng nhiệt
trị. Mặc dù từ độ bão hoà có chênh lệch lớn (hình 4.6), nhƣng khả năng đốt
nóng của các mẫu này không khác nhau nhiều. Do đó, FA4D có thể trở thành
tác nhân điều trị ung thƣ kết hợp: vừa có khả năng hoá trị liệu, vừa có khả
năng nhiệt trị.
Bảng 4.3: Số liệu đốt nóng cảm ứng từ của các mẫu FA4, FA4D, FA8 và Fe3O4

Mẫu

FA4

FA4D

Nồng độ
(mg/ml)

T1500s
(oC)

dT/dt

SAR
(W/g)

0,5

49,7

0,03

225,7

1

52,1

0,03

129,6

2

62,1

0,04

85,7

3

68,4

0,06

85,0

0,5

48,1

0,02

150,5

ILP
(nHm2.kg-1)

11,6

13


1

50,5

0,03

112,9

2

59,2

0,04

73,2

3

65,1

0,05

66,9

9,2

FA8

3

62,1

0,05

64,1

8,8

Fe3O4

3

60,1

0,07

103,1

14,1

Công suất toả nhiệt (SAR) của FA4 và FA4D giảm theo nồng độ của
chất lỏng từ. Hiện tƣợng này có thể đƣợc giải thích là do khi nồng độ tăng,
khoảng cách giữa các hạt từ giảm, tạo ra tƣơng tác lƣỡng cực từ mạnh hơn
giữa chúng. Ở nồng độ thấp, các hạt đủ xa nhau để sinh nhiệt hiệu quả ra môi
trƣờng. Hiện tƣợng tƣơng tự cũng quan sát đƣợc đối với hạt nano Fe3O4 bọc
PAA [189] hoặc nano ferrit tổ hợp [15].
4.1.6. Phân tích nhiệt
Cả 2 mẫu đều mất khối lƣợng ở khoảng nhiệt độ từ 80-550oC. Giai
đoạn mất khối lƣợng thứ hai của 2 mẫu rất khác nhau, FA4 xuất hiện 2 pic
toả nhiệt nhƣng chỉ mất 12% khối lƣợng trong suốt quá trình đốt nóng. Sự
mất khối lƣợng này là do quá trình phân huỷ alginate trong mẫu, Ngƣợc lại,

FA4D chỉ có 1 pic mất 24% khối lƣợng (gấp đôi so với FA4) ở 380 oC. Sự
mất khối lƣợng này là do thành phần hữu cơ trong hệ bị phân huỷ. Pic năng
lƣợng duy nhất chứng minh sự tạo phức giữa Dox với lớp vỏ alginate trong
hệ.
5

14

0

12
10

-5

8

-15
-20

6
4
2

-5
-10
-15
-20
-25

0
100 200 300 400 500 600 700 800
o
Nhiet do ( C)

-30

b)

20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
100 200 300 400 500 600 700 800
TG
dong nhiet

Dong nhiet (V)

0

-10

a)

16

Dong nhiet (V)

TG (/%)

5

TG
dong nhiet

TG (/%)

10

o

Nhiet do ( C)

Hình 4.9: Giản đồ phân tích nhiệt của FA4 (a) và FA4D(b)

Hình 4.10 mô tả cấu trúc chung của các hạt nano Fe3O4 bọc bằng
alginate mang doxorubicin (FA4D hoặc FAD) và hạt tƣơng ứng gắn thêm
folate (FADF). Trong đó, Dox đƣợc mang trên lớp vỏ alginate nhờ tƣơng tác
hóa học
14

Hình 4.1: Sơ đồ cấu trúc của FAD và FADF

4.1.7. Quá trình giải phóng thuốc in vitro
Trong 12 h đầu tiên, tốc độ nhả thuốc là lớn nhất (đƣờng biểu diễn có độ
dốc lớn) và lƣợng thuốc tách ra đạt 21,0% và 29,5 % sau 12 h tại pH=7,4 và
pH=5 tƣơng ứng. Nói chung, lƣợng Dox tách ra ở môi trƣờng trung tính ít
hơn so với môi trƣờng axit. Sau 120 h, khoảng 61% tổng lƣợng Dox trong
FA4D tách khỏi hệ ở pH=5 và 42% ở pH=7,4. Quá trình giải phóng Dox
khỏi hệ nano đƣợc thực hiện bởi sự thuỷ phân phức chất tạo thành giữa Dox
và alginate hoặc sự phân huỷ lớp vỏ alginate bởi quá trình thuỷ phân. Cả 2
quá trình thuỷ phân này đều đƣợc tăng tốc trong môi trƣờng axit. Do môi
trƣờng khối u ung thƣ là môi trƣờng axit, hiện tƣợng này cho thấy hệ dẫn
thuốc nano FA4D phù hợp để điều trị ung thƣ.
70

% Dox giai phong

60
50
40
30

pH=7.4
pH=5

20
10
0

0

20

40

60
80
Thoi gian (h)

100

120

Hình 4.11: Quá trình nhả thuốc của FA4D ở pH 7,4 và pH 5

4.1.8. Độc tính tế bào
Doxorubicin là hợp chất có độc tính cao với tế bào thƣờng [140] và có
giá trị IC50 rất thấp với một số dòng tế bào ung thƣ (thấp hơn 1 g/ml) [147].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 5 dòng tế bào Hep-G2, LU-1, RD,
FL và Vero (hình 4.12). Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy hệ nano mang
15


Dox có độc tính cao trên các dòng tế bào này (giá trị IC50 từ 0,60 đến
1,41g/ml). Các giá trị này đều cao hơn so với của Dox tự do. Điều này đƣợc
lí giải bởi quá trình nhả chậm của Dox từ hệ nano [147]. Bên cạnh đó, giá trị
IC50 đối với các dòng tế bào ung thƣ Hep-G2, LU-1, RD và FL thấp hơn so
với dòng tế bào thƣờng (Vero) chứng tỏ rằng hệ nano biểu hiện độc tính đối
với tế bào ung thƣ cao hơn so với tế bào lành. Do đó, hệ dẫn thuốc này cho
phép hoá trị liệu an toàn hơn cho điều trị ung thƣ do giảm đƣợc độc tính với

tế bào thƣờng.
1.4

60
40
20
0

a)

0.8 0.72

25

b)

0.60

0.6
0.39

0.4

0.0

01
05
Nong do (g/ml)

1.20

1.41
1.30

0.96

1.0

0.2

0.2

FA4D
DOX

1.2

Hep-G2
LU-1
RD
FL
Vero

80

IC50 (g/ml)

Ti le te bao con song (%)

100

0.21
Hep-G2 LU-1

0.11
RD

0.16
FL

Vero

Dong te bao

Hình 4.12: Đƣờng cong đáp ứng liều và tƣơng quan giá trị IC50 của hệ FA4D

4.2. Ảnh hƣởng của lõi Fe3O4 tổng hợp vi sóng tới tính chất hệ nano
Kĩ thuật vi sóng đƣợc sử dụng để tổng hợp nano Fe3O4 với nhiều ƣu
điểm, đáng kể nhất là kĩ thuật này cho phép rút ngắn thời gian phản ứng và
tổng hợp đƣợc lƣợng lớn. Trong phần này, chúng tôi khảo sát các điều kiện
tổng hợp nano Fe3O4 với kĩ thuật vi sóng và so sánh hiệu quả diệt tế bào của
hệ đa chức năng với lõi là hạt Fe3O4 tổng hợp vi sóng với hạt Fe3O4 đồng kết
tủa đơn thuần. Để đánh giá khả năng đốt nóng cảm ứng và tƣơng tác với các
hệ sinh học của vật liệu, chúng tôi tiến hành tạo mẫu FA và FAD với các
thành phần và phƣơng pháp nhƣ FA4 và FA4D từ hạt Fe3O4 M5 chế tạo bằng
kĩ thuật vi sóng.
4.2.1. Một số đặc trưng vật liệu và kết quả đốt nóng cảm ứng
Các mẫu FA và FAD đều có độ bền cao, thể hiện ở giá trị thế Zeta âm
lớn. Đƣờng cong đốt nhiệt thể hiện xu hƣớng tƣơng tự so với mẫu tổng hợp
trong điều kiện đồng kết tủa thông thƣờng.

So sánh nhiệt độ bão hoà (xác định ở thời điểm 1500 s) của FA và FAD
(bảng 4.6) với kết quả tƣơng ứng của FA4 và FA4D (bảng 4.3) nhận thấy
không có khác biệt đáng kể về hiệu ứng đốt nóng của các mẫu tổng hợp nhờ
vi sóng so với điều kiện tổng hợp thông thƣờng.
16


4.2.2. Độc tính tế bào
Kết quả so sánh giá trị IC50 của các mẫu chế tạo vi sóng và chế tạo đồng
kết tủa thông thƣờng đƣợc trình bày trên bảng 4.7.
Bảng 4.7: IC50 của hệ mẫu vi sóng so với mẫu đồng kết tủa thông thường

Dòng tế HepLU-1
RD
FL
Vero
HeLa
bào
G2
1
Dox
0,11
0,16
0,21
0,39
1,30
2
Dox
0,25
0,18

0,35
1,34
FA4D
0,60
1,20
0,72
0,96
1,41
FAD
0,81
0,67
1,02
1,43
FADF
0,44
0,87
1,39
0,68
1
Mẫu đối chứng trong thí nghiệm xác định IC50 của FA4D
2
Mẫu đối chứng trong thí nghiệm xác định IC50 của FAD và FADF
Kết quả trên bảng 4.7 cho thấy mẫu FAD gây tác động lên các dòng tế
bào Hep-G2, LU-1 và Vero không khác biệt đáng kể so với mẫu FA4D. Điều
này cho thấy việc sử dụng kĩ thuật vi sóng để chế tạo Fe 3O4 không chỉ đáp
ứng về mặt vật liệu mà còn đảm bảo về mặt tƣơng tác với hệ sinh học. Sự
bảo toàn tính chất về vật liệu hoặc tƣơng tác sinh học này của hệ FAD so với
FA4D có thể là do bản chất phƣơng pháp của kĩ thuật vi sóng chúng tôi sử
dụng vẫn là phƣơng pháp đồng kết tủa. Ƣu điểm của kĩ thuật này là thao tác
đơn giản, thời gian phản ứng đƣợc rút ngắn. Đặc biệt, kĩ thuật này cho phép

tổng hợp đƣợc lƣợng lớn hạt nano Fe3O4. Do đó, trong các nghiên cứu tiếp
theo để tổng hợp hệ mang Dox gắn folat hoặc quantum dots và mẫu thực
hiện thử nghiệm điều trị in vivo, chúng tôi đều sử dụng hạt Fe3O4 điều chế
bằng kĩ thuật vi sóng.
4.3. Hệ nano mang Dox gắn folate (FADF) hoặc CdTe (FADQ)
4.3.1. Phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại chứng minh sự tồn tại của axit folic trong hệ FADF.
4.3.2. Phổ huỳnh quang
Phổ huỳnh quang của FADF so với axit folic đã có sự chuyển dịch rõ
ràng về đỉnh phát xạ (từ 420 nm thành 428 nm). Đỉnh phổ tại 428 nm cách xa
rất nhiều so với đỉnh phổ của Dox chứng tỏ trong 2 thành phần huỳnh quang,
axit folic chiếm ƣu thế hơn trong mẫu FADF. Kết quả này một lần nữa khẳng
định sự có mặt của axit folic trong hệ. Mặt khác, phổ huỳnh quang của mẫu
FAD có cƣờng độ thấp hơn rất nhiều so với Dox, trong khi đó huỳnh quang
17


của Dox bị dập tắt hoàn toàn trong mẫu FADF (không có đỉnh phổ trong
vùng 612 nm). Trong trƣờng hợp FADF, cƣờng độ huỳnh quang của mẫu
này giảm ít so với axit folic cho phép dùng FADF làm đầu dò huỳnh quang
để quan sát tƣơng tác của hệ nano với các hệ sinh học.
50000

cuong do

420
428

30000

S1 (Counts)

40000

folic
FADF
FAD
DOX

70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0

20000

450
20000

10000

10000

0
400

450

500

550

600

buoc song (nm)

a)

650

0

700

580 nm

FAQ 0.05 mg Fe3O4/ml
FAQ 0.1 mg Fe3O4/ml
FAQ 0.2 mg Fe3O4/ml
FAQ 0.4 mg Fe3O4/ml
FAQ 0.8 mg Fe3O4/ml

450

b)

500

550

FAQD 0.05 mg Fe3O4/ml
FAQD 0.1 mg Fe3O4/ml
FAQD 0.2 mg Fe3O4/ml
FAQD 0.4 mg Fe3O4/ml
FAQD 0.8 mg Fe3O4/ml

500

550

600

650

700

612 nm

600

Wavelength (nm)

650

700

Hình 4.17: Phổ huỳnh quang của FAD, FADF so với axit folic và Dox (a) và các mẫu
chứa chấm lƣợng tử CdTe (b)

Các mẫu FAQ và FADQ chứa CdTe đều có pic huỳnh quang tại vị trí
580 nm đặc trƣng của CdTe. Ngoài ra, các mẫu FADQ mang Dox cho huỳnh
quang tại vị trí 612 nm, tƣơng tự nhƣ FAD.
4.3.6. Quá trình giải phóng Dox thụ động và chủ động nhờ hiệu ứng đốt
nóng cảm ứng
Mô hình phóng thích Dox thụ động ở điều kiện 37oC từ mẫu FADF đƣợc
thực hiện và cho kết quả tƣơng tự nhƣ mẫu FAD.
Thay đổi pH của dung dịch gần nhƣ không ảnh hƣởng tới khả năng đốt
nóng của hệ FADF trong từ trƣờng. Ngay ở nhiệt độ tƣơng đƣơng với nhiệt
độ cơ thể (khoảng 37oC), Dox đƣợc giải phóng từ 4,7 đến 11,2% từ FAD
hoặc FADF. Từ trƣờng cƣờng độ 80 Oe cho nhiệt độ đốt nóng cao hơn, quá
trình giải phóng thuốc cũng diễn ra nhanh hơn, đồng thời lƣợng Dox đƣợc
giải phóng lớn hơn. Khác với quá trình giải phóng thuốc thông thƣờng, quá
trình đốt nóng cảm ứng sinh nhiệt từ bên trong hạt đã kích thích quá trình
giải phóng thuốc diễn ra nhanh hơn. Nhƣ vậy, có thể điều chỉnh từ trƣờng
ngoài để điều khiển tốc độ và lƣợng thuốc phóng thích. Một số nghiên cứu
khác cũng chỉ ra rằng có thể giải phóng thuốc một cách chủ động.
Bảng 4.9: Thông số giải phóng Dox khi đốt nóng với từ trường khác nhau
FAD pH 5
FAD pH7.4
FADF pH 5
FADF pH 7.4
Thời
gian

Nhiệt % Dox

Nhiệt % Dox

Nhiệt % Dox

Nhiệt % Dox

(s)

độ

độ

độ

độ

giải

giải

giải

giải phóng

18


(oC)

phóng ±

(oC)

SD
0

30

0

phóng ±

(oC)

SD
30

phóng ±

(oC)

± SD

30

0

SD

0

30

0

70 Oe
750

39,27 11,2±1,3

40,23 6,0±0,7

37,63 10,9±0,4

38,11

4,7±1,0

1500

43,08 28,8±0,8

44,52 25,3±1,3

42,35 29,1±0,6

43,48

24,4±0,7

2250

45,32 49,5±0,9

46,05 37,9±1,8

43,68 46,7±1,7

44,99

37,2±1,3

3000

45,87 56,3±1,5

46,81 41,5±1,2

44,30 51,6±1,0

45,71

39,4±2,0

80 Oe
750

46,13 30,1±1,5

45,56 21,5±0,5

45,87 28,2±2,0

46,22

20,6±0,9

1500

51,25 53,5±0,6

50,78 38,8±2,1

50,19 48,0±1,4

51,74

35,4±0,9

2250

51,98 67,6±0,9

51,43 49,4±1,7

51,16 62,7±0,9

52,10

45,1±1,7

3000

52,16 78,1±1,6

51,83 56,4±1,2

51,24 74,2±1,8

52,31

51,0±1,5

Nhƣ vậy, cả 2 hệ FADF và FADQ đều có các tính chất vật liệu phù hợp
để sử dụng đƣợc cho các đối tƣợng sinh học.
4.3.7. Độc tính tế bào
4.3.7.1. Độc tính tế bào của FADF
1.4

CdTe
FAQ
FAQD

4.0
3.5

1.0
0.8
0.6
0.4

3.0
2.5
2.0
1.5
1.0

0.2
0.0

IC50>5 ug/ml

4.5

IC50 (g/ml)

IC50 (gml)

1.2

DOX
FAD
FADF

0.5

Hep-G2

LU-1
Vero

Dong te bao

HeLa

Hình 4.24: Độc tính tế bào của các
hệ mẫu chứa doxorubicin

0.0

Hep-G2

LU-1

RD

Vero

Hình 4.26: Độc tính tế bào của các hệ mẫu
chứa CdTe (CdTe, FAQ và FADQ)

So với Dox nguyên chất, FADF có độc tính trên 4 dòng tế bào Hep-G2,
LU-1, Vero và HeLa thấp hơn (IC50 lớn hơn). Nguyên nhân có thể là do quá
trình nano hoá làm Dox tạo liên kết hoá học với bề mặt hạt nano, làm chậm
quá trình tác động của Dox trên tế bào. So với FAD, FADF thể hiện độc tính
cao hơn do trong mẫu này, yếu tố folat đã giúp mẫu này bám đích tế bào tốt
19


hơn. Mặc dù vậy, cả FAD và FADF với IC50 thấp (dƣới 2 g/ml) đều cho
thấy khả năng hoá trị tốt đối với các dòng tế bào nghiên cứu.

4.3.7.2. Độc tính tế bào của các hệ chứa chấm lượng tử CdTe
Đối với mỗi dòng tế bào, giá trị IC50 của FAQ cao hơn một chút so với
CdTe, có nghĩa là khi gắn kết CdTe với hạt nano Fe3O4 bởi ma trận polyme
alginate thì độc tính của CdTe sẽ giảm đi (hình 4.26). Mẫu mang đồng thời
CdTe và Dox (FADQ) có hiệu quả nhất để điều trị ung thƣ (giá trị IC50 cho
Hep-G2, LU-1, RD và Vero lần lƣợt là 1,34; 3,83; 1,35 và 2,13 g/ml) nhờ
sự kết hợp của Dox thuốc ung thƣ và chấm lƣợng tử CdTe.
Nhƣ vậy, các mẫu FAD, FADF, FADQ đều có thể thực hiện nhiều chức
năng nhƣ nhiệt từ trị, phát huỳnh quang hoặc hoá trị diệt tế bào ung thƣ.
FADQ biểu hiện diệt tế bào tốt và đồng thời cũng thể hiện độc tính cao với
động vật thực nghiệm (chuột nhắt trắng) mang khối u (chuột chết hoặc rất
yếu sau tiêm 50 l/con). Do đó, chỉ tiếp tục tiến hành thử nghiệm hiệu quả
tác động của các mẫu FAD, FADF trên chuột, mẫu FA đƣợc sử dụng thêm
để so sánh.
4.3.8. Độ bền của FAD, FADF và FADQ trong môi trường sinh lí
FAD, FADF và FADQ đƣợc xác định độ bền trong dung dịch có nồng độ
muối 0,2 M và các pH khác nhau nhờ phép đo thế Zeta. Kết quả đƣợc trình
bày trong bảng 4.12.
Bảng 4.1: Thế Zeta (mV) của FAD, FADF và FADQ trong dung dịch có nồng độ
NaCl 0,2 M và các pH khác nhau

pH
FAD
FADF
FADQ

3
-19,2 ± 1,9
-18,5 ± 2,1
-9,4 ± 2,1

5
-32,0 ± 2,6
-30,4 ± 1,7
- 13,8 ± 2,3

7
-33,2 ± 1,5
-32,2 ± 2,9
-15,6 ± 1,8

9
-43,1 ±1,2
-39,0 ± 2,5
-19,4± 1,4

Kết quả trong bảng 4.12 cho thấy các mẫu Fe3O4 bọc bằng alginate mang
Dox đều có thế Zeta âm, kể cả ở pH 3. Nguyên nhân của hiện tƣợng này là
do lớp vỏ alginate của các hạt từ rất giàu các nhóm COO-, tƣơng tự nhƣ kết
quả đã đƣợc công bố trƣớc đây liên quan đến hạt từ bọc bằng alginate [194].
Thế Zeta của FADF không khác biệt đáng kể so với FAD. Trong vùng pH từ
5 đến 9, FAD và FADF có độ bền tốt (với trị số thế Zeta trên 30 mV). Mẫu
FADQ có độ bền thấp hơn 2 mẫu trên.
20


4.3.9. Kết quả thử nghiệm in vivo
4.3.9.2. Phân bố sắt ở các cơ quan
Định lƣợng Fe trong các mẫu mô và cơ quan cho thấy, lƣợng Fe trong các
mô và đặc biệt trong khối u (trừ máu) của các chuột nhóm FADF cao hơn so

với nhóm chứng. Tuy nhiên so sánh thống kê chƣa thấy sự khác biệt có ý
nghĩa thống kê. So sánh hàm lƣợng Fe từ
các cơ quan trong nhóm FAD so với
nhóm chứng cũng có xu hƣớng tƣơng tự
(p=0,08).
Hình 4.29: Kết quả định lƣợng sắt ở các cơ
quan sau tiêm tĩnh mạch (G: gan, L: lách, M:
máu, T: thận, U: u)

4.3.9.3. Kết quả điều trị in vivo bằng các hệ nano kết hợp với đốt nóng cảm
ứng từ
Trong suốt quá trình điều trị, trọng lƣợng chuột của các nhóm không khác
biệt đáng kể tại mỗi thời điểm đo.
Kích thƣớc trung bình khối u tại thời điểm phân nhóm không có sự
khác biệt đáng kể giữa các nhóm. Sau khi đốt từ 3 lần, kích thƣớc khối u
nhóm FADF đã có dấu hiệu không phát triển. Đƣờng biểu diễn kích thƣớc
khối u có xu hƣớng đi ngang. Nhóm chuột này có khối u nhỏ hơn rõ rệt so
với 3 nhóm còn lại sau 3 lần đốt từ, tƣơng ứng thời điểm đo thứ 5 (p<0,05).
Tại lần đo và kiểm tra thứ 8, hầu nhƣ các khối u trên chuột nhóm FADF
giảm kích thƣớc còn tƣơng đƣơng với thời điểm đo 1. Kích thƣớc u nhóm
FA có sự giảm rõ rệt so với nhóm chứng sau đốt từ tại thời điểm đo lần 6 trở
đi (p<0,05). Nhóm đƣợc trị liệu bằng FAD có kích thƣớc khối u giảm chậm
hơn so với hai nhóm trị liệu (FA và FADF), tại lần đo thứ 8, kích thƣớc trung
bình khối u mới nhỏ hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng. Khối u ở
nhóm chuột không đƣợc điều trị có kích thƣớc rất lớn, ảnh hƣởng lớn tới vận
động của chuột. Nhóm chuột đƣợc điều trị, đặc biệt đƣợc điều trị bằng
FADF, kích thƣớc u giảm dần, giai đoạn cuối thí nghiệm, một số chuột mất
khối u.
Kết quả này cho thấy hiệu quả đáng khích lệ của phƣơng pháp nhiệt trị.
Với mẫu FA không mang thuốc, tác động nhiệt đã góp phần tiêu diệt tế bào

ung thƣ.
21


ĐỐT TỪ

Hình 4.31: Sự thay đổi kích thƣớc khối u trong quá trình điều trị in vivo

Nhƣ đã chỉ ra trong mục 4.2.1., FA có khả năng sinh nhiệt tốt hơn so với
FAD. Đây có thể là lí do nhóm chuột đƣợc điều trị với FA giảm u nhanh hơn
so với FAD. Nhƣ vậy, trong mẫu FA hoặc FAD, hạt nano oxit sắt từ thể hiện
rõ vai trò sinh nhiệt diệt khối u của mình. Tuy nhiên, kết quả đo u tại lần đo
thứ 7 và thứ 8 đã cho thấy ƣu thế của phƣơng pháp nhiệt trị kết hợp với hoá
trị ở mẫu FAD. Sau 8 lần điều trị, kích thƣớc khối u trên các chuột nhóm
FAD đã giảm mạnh. Ngƣời ta đã chỉ ra rằng kết hợp hóa trị đồng thời với
nhiệt trị có thể tạo ra hiệu ứng hiệp đồng làm tăng hiệu quả điều trị của cả
hóa trị và nhiệt trị [195]. Cơ chế của hiệu ứng hiệp đồng này là do dƣới tác
động nhiệt, tế bào ung thƣ trở nên nhạy cảm hơn với độc tính của thuốc hóa
trị (tăng hấp thu vào tế bào, ức chế quá trình sửa chữa AND, tăng cƣờng các
phản ứng gây độc). Đồng thời, sự kết hợp này làm tăng mức độ giải phóng
và tích lũy thuốc trong khối u [77]. Kết quả giải phóng thuốc bằng từ trƣờng
ở mục 4.3.6 trong luận án này cũng khẳng định điều này. Ngoài ra, phƣơng
thức kết hợp này cũng có thể hạn chế đƣợc sự tái phát khối u sau điều trị
[195].
Mặt khác, mặc dù khả năng sinh nhiệt trong từ trƣờng thấp hơn FA, hệ
FADF cho hiệu quả tốt nhất so với 2 hệ còn lại có thể là do vai trò của gốc
folate trong hệ. Khối u ung thƣ phổi Lewis đƣợc chứng minh là biểu hiện
mạnh thụ thể folate [196]. Do gốc folate có khả năng kết hợp chặt chẽ với
các thụ thể folate trên các tế bào ung thƣ [150], hệ nano mang folate sẽ tƣơng
tác với khối u chặt chẽ hơn và làm tăng nồng độ hạt từ tại khối u, do đó tăng

hiệu quả nhiệt trị in vivo và đồng thời phát huy tác dụng hoá trị của Dox giải
phóng ra từ hệ. Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc gắn folate trên hạt từ
22


cho phép hƣớng đích hiệu quả, giảm độc tính và tăng hiệu quả điều trị trên
mô hình in vivo [197].
KẾT LUẬN
Trong luận án này, chúng tôi đã thực hiện đƣợc những nội dung sau
đây:
1. Tổng hợp đƣợc hạt nano Fe3O4 có từ độ cao bằng phƣơng pháp đồng kết
tủa và đồng kết tủa có sử dụng kĩ thuật vi sóng. Điều kiện vi sóng tối ƣu xác
định đƣợc là: nhiệt độ 70oC, thời gian vi sóng 15 phút với tốc độ khuấy 600
vòng/phút.
2. Tổng hợp đƣợc hệ nano mang curcumin trên nền hạt nano Fe 3O4 tổng hợp
bằng phƣơng pháp đồng kết tủa, bọc bằng OCMCS. Trong đó, hàm lƣợng
curcumin đƣợc khảo sát và tỉ lệ curcumin tối ƣu xác định đƣợc là 60 mg cho
50 ml dung dịch Fe3O4/OCMCS.
3. Các hệ mang curcumin FOC và mang curcumin gắn folate FOCF có dung
lƣợng hấp phụ curcumin cao: 0,95 và 0,54 mg/mg Fe3O4. Bên cạnh đó, các
hệ này có khả năng sinh nhiệt tốt, cho phép diệt tế bào ung thƣ bằng nhiệt trị.
Đặc biệt, hệ gắn folate cho thấy khả năng hƣớng đích tới khối u Sarcoma 180
tốt, cho phép cải thiện hiệu quả điều trị của hệ mang thuốc.
4. Tổng hợp đƣợc các hệ nano mang Dox từ hạt nano Fe 3O4 tổng hợp đồng
kết tủa thông thƣờng và có hỗ trợ vi sóng. Nồng độ chất bọc alginate đƣợc
tối ƣu hóa là 4 mg/ml (tƣơng ứng với tỉ lệ khối lƣợng Alg/Fe 3O4 = ½) tại
mẫu FA4D. Hệ này có hiệu suất mang thuốc 78,5%, từ độ 51,6 emu/g. Các
mẫu FA4D nồng độ thay đổi từ 0,5-3 mg/ml đều đạt nhiệt độ diệt tế bào
(42oC) sau thời gian 20 phút đốt nóng với từ trƣờng 80 Oe, giá trị ILP đạt 9,2
nHm2.kg-1. Hệ có độc tính cao với 5 dòng tế bào đƣợc nghiên cứu. Các hệ

chứa lõi Fe3O4 tổng hợp vi sóng có tính chất vật liệu và sinh học tƣơng tự hệ
chứa Fe3O4 tổng hợp trong điều kiện thông thƣờng.
5. Các quá trình giải phóng thuốc (curcumin hoặc Doxorubicin) in vitro đều
diễn ra theo mô hình giải phóng từ từ, trong đó điều kiện pH 5 (tƣơng tự khối
u) làm giải phóng thuốc nhanh và nhiều hơn so với điều kiện môi trƣờng sinh
lí pH 7,4. Có thể sử dụng từ trƣờng xoay chiều để phóng thích thuốc từ hệ
nano một cách chủ động.
23