Luận văn thạc sĩ Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống aspergllu, trichoderma và ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
------------------------

Lê Thò Huệ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HP
ENZYME CHITINASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SI
THUỘC GIỐNG ASPERGILLUS, TRICHODERMA VÀ
ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học
PGS. TS. ĐỒNG THỊ THANH THU

Thành phố Hồ Chí Minh - 2010


DANH MC VIT TT
CPE

ch phm enzyme

CT

Canh trng

DNS

3,5-dinitrosalicylic axit

MT

Mụi trng

OD

Mt quang

OD

Hiu s gia mt quang ca mu th tht v th khụng

UI

n v hot enzyme (tớnh theo n v quc t)

PTHQ

Phng trỡnh hi qui

TB

Giỏ tr trung bỡnh

topt

Nhit ti u

pHopt

pH ti u

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


MỞ ĐẦU
Vi sinh vật là nhóm sinh vật có số lượng nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất
trong thiên nhiên mạnh nhất. Hiện nay người ta khai thác nhiều enzyme từ vi sinh vật và được ứng
dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn khai thác enzyme từ động vật và thực vật,
nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp
enzyme từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), ngun liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hồn tồn
theo qui mơ cơng nghiệp. Nhiều enzyme được khai thác từ vi sinh vật được tập trung nghiên cứu và
có nhiều ứng dụng trong thời gian qua như protease, amylase, cellulase, pectinase … Những năm
sau này người ta đang chú ý nhiều hơn về một loại enzyme khác nữa là chitinase, đây là enzyme
thủy phân chitin.
Chitin là một polymer sinh học có thể so sánh với các polysaccharide như cellulose, keratin.
Chitin phân bố rất rộng rãi ở dạng cấu trúc cơ bản trong thành tế bào của nấm và là bộ xương ngồi
của tơm cua và cơn trùng. Đây là một polymer có trọng lượng phân tử cao, khơng tan trong nước,
chứa các đơn phân là N-acetyl-glucosamine liên kết bởi liên kết 1,4-β. Chitin có nhiều cơng dụng
trong nhiều lĩnh vực như y học và cơng nghiệp…
Những enzyme có liên quan đến chuyển hóa và phân giải chitin đang được nghiên cứu nhiều
trong những năm gần đây. Chitin bị phân giải bởi hệ enzyme có tên gọi chung là chitinase. Enzyme
này được sản xuất bởi các tổ chức sống dưới tế bào để phục vụ nhu cầu chức năng sinh lý của
chúng. Sự phân giải chitin dưới tác động enzyme phụ thuộc vào các yếu tố hóa lý (tỉ lệ giữa cơ chất

và enzyme, pH, nhiệt độ…). Trong các nguồn thu nhận chitinase thì chitinase từ vi sinh vật là
nguồn quan trọng. Những nguồn sinh vật để thu nhận enzyme chitinase đáng kể là các chủng vi
khuẩn thuộc các chi Enterobacter và Streptomyces, các chủng nấm sợi thuộc các chi Asperillus,
Penicillium, và Trichoderma, và một số động vật ngun sinh.
Những năm gần đây có nhiều cơng trình nghiên cứu tập trung vào enzyme chitinase do tiềm
năng ứng dụng to lớn của enzyme này trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong thu nhận tế bào
trần (thể ngun sinh), sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine và N-acetyl glucosamine, sản
xuất thuốc trừ sâu sinh học, ứng dụng trong y học, trong việc kiểm sốt nấm kí sinh trên cây
trồng…v.v…
Vì những ứng dụng rộng rãi của chitinase như trên, mục đích đề tài chúng tơi nhằm nghiên
cứu sinh tổng hợp chitinase nhằm thu nhận chế phẩm chitinase từ một số chủng nấm sợi và bước
đầu khảo sát một số ứng dụng của enzyme này. Chúng tơi thực hiện đề tài: Khảo sát khả năng sinh
tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và
ứng dụng.

Luận văn thạc só

Cao học K18


Mc tiờu ti: La chn chng nm si cú kh nng tng hp chitinase cao, thu nhn ch
phm chitinase t canh trng v bc u nghiờn cu mt s ng dng ca chitinase.
Nhim v ca ti
- Kho sỏt kh nng sinh tng hp chitinase ca mt vi chng nm si thuc ging
Aspergillus, Trichoderma. Chn chng nm si nghiờn cu tip.
- Kho sỏt mt s yu t nh hng quỏ trỡnh sinh tng hp chitinase ca chng nm si ó
chn v ti u húa bng phng phỏp qui hoch thc nghim.
- Thu nhn ch phm chitinase.
- Kho sỏt cỏc iu kin hot ng ti u ca ch phm chitinase: nhit , pH, nng c
cht, thi gian thy phõn c cht.

- Bc u th nghim ng dng nm si sinh enzyme chitinase hoc ch phm chitinase.
Thi gian v a im nghiờn cu ti
Thi gian

: t thỏng 8/2009 7/2010

a im

: ti c thc hin ti Phũng Thớ nghim Vi sinh, khoa Sinh

Trng i hc S Phm Thnh ph H Chớ Minh.

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


Chng 1: TNG QUAN TI LIU
1.1.

H ENZYME CHITINASE T NM SI

1.1.1. Khỏi quỏt v enzyme
1.1.1.1. Cu trỳc [1, 23]
Enzyme l mt loi phõn t protein c sinh vt tng hp nờn v tham gia xỳc tỏc cho cỏc
phn ng sinh hc.
Enzyme cú phõn t lng t 20.000 n 1.000.000 dalton, c cu to t cỏc L-acid amin
liờn kt nhau bi liờn kt peptid. B phn c hiu tham gia phn ng gi l trung tõm hot ng
ca enzyme.
Enzyme gm hai nhúm: nhúm enzyme mt cu t gm nhng enzyme cú thnh phn húa hc

duy nht l protein; nhúm enzyme hai cu t gm nhng enzyme cú hai thnh phn: phn protein
thun gi l apoenzyme cú vai trũ xỳc tỏc, phn th hai phi protein l coenzyme l nhng cht hu
c c hiu cú vai trũ thỳc y quỏ trỡnh xỳc tỏc. Ngoi ra cú mt s kim loi nh Zn, Cu, Mn, Fe ...
úng vai trũ liờn kt enzyme v c cht trong quỏ trỡnh xỳc tỏc phn ng, liờn kt gia apoenzyme
v coenzyme, tham gia trc tip vo quỏ trỡnh vn chuyn in t.
1.1.1.2. C ch hot ng [16, 23]
Trung tõm hot ng ca enzyme (E) cú cu trỳc khụng gian tng ng vi c cht m
chỳng xỳc tỏc, phn ng hỡnh thnh trong quỏ trỡnh enzyme tip xỳc vi c cht nh chỡa khúa-
khúa to phc hp enzyme-c cht. Quỏ trỡnh tỏc ng ca enzyme vo c cht to sn phm
tri qua ba giai on:
Giai on 1: Enzyme (E) tng tỏc vi c cht (S) nh nhng liờn kt to phc E-S
Giai on 2: Khi c cht (S) to phc vi enzyme (E), c cht s b thay i cu hỡnh khụng
gian v mc bn vng cỏc liờn kt, liờn kt b phỏ v to sn phm.
Giai on 3: Enzyme tỏch ra, c gii phúng nguyờn vn. Sn phm (P) to thnh.
S c ch tỏc ng enzyme:
E

+

S



E-S



E

+

P

1.1.1.3. Phõn loi enzyme [16, 23]
Cú nhiu cỏch phõn loi enzyme, õy chỳng tụi cp n cỏch phõn loi da vo kiu xỳc
tỏc ca enzyme. Ti Hi ngh Sinh Húa hc nm 1961 hp ti Moscow ó ra mt bng phõn loi
mi, trong ú enzyme c chia ra lm 6 lp chớnh:
-

Oxydoreductase (lp enzyme oxy húa hon nguyờn sinh hc)

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


-

Transferase (lớp enzyme vận chuyển)

-

Hydrolase (lớp enzyme thủy phân)

-

Liase (lớp enzyme phân giải chất khơng theo con đường thủy phân)

-

Ligase hay Syntetase (lớp enzyme tổng hợp chất)

-

Isomerase hay Mutase (lớp enzyme đồng phân hóa)

1.1.2. Enzyme chitinase [32]
1.1.2.1. Cấu trúc
Chitinase [Poly- Beta- 1- 4 – (2-acetalmido-2-deoxy) - D-glucoside glucanohydrolase]
thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay
chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử Nacetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14.
3 → Hydrolase
2 → Glycosylase
1 → Glycosidase
14 → Chitinase
Chitinase còn có các tên gọi khác (tùy theo xuất xứ enzyme) là chitodextrinase, β-poly-Nacetyl glucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC
(Streptomyces griceus) ...
Căn cứ vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18 và
Glycohydrolase 19 và Glycohydrolase 20.
 Họ Glycohydrolase 18
Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, được tìm thấy ở hầu hết các lồi thuộc Eukaryote,
Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngồi ra còn có các enzyme khác
như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase.
Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β
cuộn tròn, chúng hoạt động thơng qua một cơ chế kiểm sốt mà trong đó các đoạn β polymer bị
phân cắt tạo ra sản phẩm là β anomer. [32]
Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như Aeromonas
hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia
marcescens…

Luận văn thạc só

Cao học K18


Hỡnh 1.1. Cu trỳc khụng gian ca chitinase thuc h Glycohydrolase 18 [68]
H Glycohydrolase 19
H ny gm hn 130 chi, thng thy ch yu thc vt, ngoi ra cũn cú x khun
Streptomyces griceus, vi khun Haemophilus influenzae Chỳng cú cu trỳc hỡnh cu vi mt
vũng xon v hot ng thụng qua c ch nghch chuyn.
H Glycohydrolase 19 bao gm nhng chitinase thuc nhúm I, II,IV.

Hỡnh 1.2. Cu trỳc khụng gian ca chitinase thuc h Glycohydrolase 19 [68]
H Glycohydrolase 20
H Glycohydrolase 20 bao gm -N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase t vi
khun, Streptomyces v ngi.
Ngoi ra, da vo trỡnh t u amin (N), s nh v ca enzyme, im ng in, peptide
nhn bit v vựng cm ng, ngi ta phõn loi enzyme chitinase thnh 5 nhúm:
Nhúm I: l nhng ng phõn enzyme trong phõn t cú u N giu cystein ni vi tõm xỳc
tỏc thụng qua mt on giu glycin hoc prolin u carboxyl (C) (peptide nhn bit). Vựng giu
cystein cú vai trũ quan trng i vi s gn kt enzyme v c cht chitin nhng khụng cn cho hot
ng xỳc tỏc.
Nhúm II: l nhng ng phõn enzyme trong phõn t ch cú tõm xỳc tỏc, thiu on giu
cystein u N v peptid nhn bit u C, cú trỡnh t amino acid tng t chitinase nhúm I.
Chitinase nhúm II cú thc vt, nm, v vi khun.
Nhúm III: trỡnh t amino acid hon ton khỏc vi chitinase nhúm I v II

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18

Nhúm IV: l nhng ng phõn enzyme ch yu cú lỏ cõy hai lỏ mm, 41-47% trỡnh t
amino acid tõm xỳc tỏc ca chỳng tng t nh chitinase nhúm I, phõn t cng cú on giu
cystein nhng kớch thc phõn t nh hn ỏng k so vi chitinase nhúm I.
Nhúm V: da trờn nhng d liu v trỡnh t, ngi ta nhn thy vựng gn chitin (vựng giu
cystein) cú th ó gim i nhiu ln trong quỏ trỡnh tin húa thc vt bc cao.
1.1.2.2. C ch hot ng ca enzyme chitinase [11]
Enzyme phõn gii chitin bao gm: endochitinase, chitin 1-4-- chitobiosidase, N-acetyl- D-glucosaminidase (exochitinase) v chitobiase.
Endochitinase l enzyme phõn ct ni mch chitin mt cỏch ngu nhiờn to cỏc on
olygosaccharides, ó c nghiờn cu t dch chit mụi trng nuụi cy nm Trichoderma
harzianum (2 loi endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 ( 0,2) v M2 = 40kDa, pI2 = 3,9),
Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8).
Chitin 1,4- - chitobiosidase l enzyme phõn ct chitin to thnh cỏc sn phm chớnh l cỏc
dimer chitobiose, c th enzyme ny c thu t Trichoderma harzianum (M = 36kDa, pI = 4,4
0,2).
N-acetyl - D - glucosaminidase (exochitinase) l enzyme phõn ct chitin t mt u cho
sn phm chớnh l cỏc monomer N-acetyl-D-glucosamine.
Chitobiase l enzyme phõn ct chitobiose thnh hai n phõn N-acetyl-D-glucosamine.

Hỡnh 1.3. V trớ phõn ct enzyme chitinase [69]
Endochitinase phõn ct ngu nhiờn trong ni mch ca chitin v chitooligomer, sn phm to
thnh l mt hn hp cỏc polymer cú trng lng phõn t khỏc nhau, nhng chim a s l cỏc
diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hot tớnh endochitinase khụng th phõn ct thờm c na.

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18

Hỡnh 1.4. C ch hot ng ca enzyme chitinase Trichoderma [11]
Chitin 1,4-chitobiosidase phõn ct chitin v chitooligomer mc trựng hp ln hn hay
bng 3 [(GlcNAc)n vi n 3] t u khụng kh v ch phúng thớch diacetylchitobiose (GlcNAc)2.
N- acetyl hexosaminidase phõn ct cỏc chitooligomer hay chitin mt cỏch liờn tc t u
khụng kh v ch phúng thớch cỏc n phõn N-acetyl glucosamine (GlcNAc).
Ngoi ra, kho sỏt kiu phõn ct, ngi ta s dng N-acetyl-chito-oligosaccharide lm
c cht. Cỏc oligsaccharide thng c thy phõn bờn trong trờn mt vi v trớ xỏc nh hoc mt
cỏch ngu nhiờn. Mt s enyme chitinase cú kh nng thy phõn trisaccharid, mt s khỏc thỡ
khụng. Cú hai dng chitinase thy phõn pentasaccharide: mt phõn ct bờn trong to disaccharid v
trisaccharid; mt phõn ct bờn ngoi to cỏc monosaccharid v tetrasaccharid. Túm li chitinase
thc cht l enzyme ct ngu nhiờn.
Endochitinase, chitobiosidase v N- acetylhexosaminidase cú th hot ng trờn c cht
l dch huyn phự chitin, vỏch t bo nm, chitooligomer v hot ng kộm hn trờn chitin thụ thu
t v tụm. Chitin v vỏch t bo nm cha chitin l nhng c cht thớch hp cho endochitinase hn
l chitobiosidase v -N-acetylhexosaminidase. Chitooligomer (GluNAc)3 v cao hn na l si
chitin u l c cht ca c 3 loi enzyme trờn nhng -N-acetylhexosaminidase thỡ hot ng chm
hn trong vic lm gim c ca huyn phự chitin. (GlcNAc)2 l c cht tt nht ca -Nacetylhexosaminidase nhng khụng l c cht ca endochitinase hay chitobiosidase. Chớnh vỡ th cú
th s dng phõn bit hot tớnh gia endochitinase, chitobiosidase v -N- acetylhexosaminidase.
Sn phm sau cựng ca s phõn ct l N-acetyl glucosamine.

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


1.1.2.3. Cỏc c tớnh c bn ca h enzyme chitinase [11]
* Trng lng phõn t
Enzyme chitinase tỡm thy thc vt bc cao v to bin cú trng lng phõn t khong
30kDa (kilodalton). cỏc loi thõn mm, chõn t, ng vt cú xng (cỏ, lng c, thỳ), mt s
chitinase cú trng lng phõn t khong 40-90 kDa hoc cao hn c l khong 120kDa. Trng

lng phõn t ca enzyme chitinase thu nhn t nm v vi khun cú khong bin i rng, t 30
n 120 kDa.
* im ng in, hng s Michaelis
Enzyme chitinase cú giỏ tr im ng in pI thay i rng, t 3- 10 thc vt bc cao v
to; pI t 4,7-9,3 cụn trựng, giỏp xỏc, thõn mm v cỏ; pI t 3,5 8,8 vi sinh vt. Hng s
Michaelis : 0,010 0,011 (g/100ml)
* nh hng ca nhit [32, 62]
Theo nhiu nghiờn cu, chitinase hot ng gii hn nhit t 20 500C (Frandberg v
Schnure, 1994; Huang v cng s, 1996; Bhushan v Hoondal, 1998; Wiwat v cng s, 1999;
Bendt v cng s, 2001).
Nhỡn chung nhit ti u cho h enzyme chitinase vi sinh vt hot ng l 400C, ngoi
tr chitinase ca Aspergillus niger hot ng trờn c cht l glycol chitin cú nhit ti thớch l
50OC (Jeuniaux, 1963). Tuy nhiờn, tựy theo ngun gc thu nhn m cỏc enzyme chitinase cú th cú
nhng giỏ tr nhit ti thớch khỏc nhau. Cỏc enzyme chitinase thc vt thuc nhúm III v
chitinase t Bacillus licheniformis phõn lp sui nc núng cho thy kh nng chu ng nhit
cao n 800C. Bendt v cng s (2001) phỏt hin hot tớnh thy phõn chitin mnh nht ca chitinase
t Vibrio sp. T 30-450C v chitinase chu nhit t chng Bacillus sp. BG-11 hot tớnh cao nht
40-600C.
Lorito (1998) ó kho sỏt hot tớnh enzyme chitinase t chng Trichoderma harzianum
Rifai nhn thy enzyme ny cú kh nng hot ng trong khong nhit rng t 25-600C, nhit
ti u l 400C.
* nh hng ca pH [32]
Giỏ tr pH ti thớch (pHop) ca h enzyme chitinase t 4-9 i vi cỏc enzyme chitinase
thc vt bc cao v to; h enzyme chitinase ng vt l 4,8- 7,5 v vi sinh vt l 3,5- 8,0.
Theo cỏc nh khoa hc, pHop ca enzyme chitinase cú th cú s ph thuc vo c cht c
s dng. a s cỏc enzyme chitinase ó c nghiờn cu cú pHop khong 5,0 khi c cht l glucol
chitin nm trong khong pH kim yu.

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


Cỏc nghiờn cu ó chng t rng chitinase hot ng c trong khong pH t 4,0-8,5
(Morrisey v cng s, 1976; Wiwat v cng s, 1999; Bendt v cng s, 2001). Chitinase ca nm
hot tớnh cao nht pH = 5, trong khi vi khun pH ti thớch l 8,0. Theo Bhushan v Hoondal
(1998), hot tớnh ca chitinase t Bacillus sp. BG-11 cao nht pH = 8,5.
1.1.2.4. Cỏc ngun thu nhn enzyme chitinase [11, 27]
Enzyme chitinase hin din hu ht cỏc sinh vt.
Enzyme chitinase c tỡm thy trong vi khun nh Chromobacterium, Klebsiella,
Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus v c bit nhúm Streptomycetes. Vi khun tng hp
enzyme chitinase nhm phõn gii chitin trong mụi trng nhm s dng ngun cacbon cho s sinh
trng v phỏt trin.
Chitinase cng c to ra bi cỏc loi nm si thuc cỏc chi Trichoderma, Aspergillus,
Gliocladium, Calvatia ... v c cỏc nm ln nh Lycoperdon, Coprinus ...
Enzyme chitinase c thc vt tng hp nhm mc ớch chng li cỏc nm kớ sinh gõy
bnh cho cõy trng. Nhng thc vt bc cao cú kh nng to chitinase nh thuc lỏ (Nicotiana sp.),
c rt, u nnh (ht), khoai lang (lỏ) ... v c bit mt s loi to bin cng l ngun cung cp
enzyme chitinase.
T mt s ng vt nguyờn sinh, t cỏc mụ v tuyn khỏc nhau trong h tiờu húa ca nhiu
loi ng vt khụng xng nh rut khoang, giun trũn, thõn mm, chõn t ... cú th thu nhn c
enzyme chitinase. i vi ng vt cú xng sng, enzyme chitinase c tit ra t tuyn ty v
dch d dy ca cỏc loi cỏ, lng c, bũ sỏt n sõu b, trong dch d dy ca nhng loi chim, thỳ
n sõu b.
Ngoi ra, enzyme chitinase cũn c thu nhn t dch biu bỡ ca giun trũn trong sut quỏ
trỡnh phỏt trin v dch tit biu bỡ ca cỏc loi chõn t vo thi im thay v, lt da. Enzyme
chitinase giỳp cụn trựng tiờu húa mng ngoi (cuticun) ca chỳng trong quỏ trỡnh bin thỏi hay lt
xỏc.
1.1.3. Chitin (c cht ca chitinase)
1.1.3.1. Lch s nghiờn cu chitin [55]

Chitin c mụ t ln u tiờn bi Braconnot vo nm 1811, khi nghiờn cu loi nm
Agaricus volvaceus v mt vi loi nm khỏc x lý vi dung dch kim, ụng thu c sn phm v
t tờn l chitin (chitin cú ngun gc t Hy Lp l tunnic ngha l lp v bc).
Hai nm sau Odier bt u chỳ ý n bn cht, cu trỳc ca chitin.
Nm 1843, Lassaige chng minh rng trong chitin cú s cú mt ca nitrogen.

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


1.1.3.2. Chitin trong t nhiờn [30, 56, 57]
Chitin l mt polysaccharide ph bin trong t nhiờn, l mt polyme sinh hc c tng hp
vi s lng ln t sinh vt. Lng chitin c sn xut hng nm trờn th gii ch ng sau
cellulose, chỳng c to ra trung bỡnh 20g trong 1 nm/1m2 b mt trỏi t. Trong t nhiờn chitin
tn ti c ng vt v thc vt.
Trong gii ng vt, chitin l mt thnh phn cu trỳc quan trng trong lp v ca mt s
ng vt khụng xng sng nh cụn trựng, nhuyn th, giỏp xỏc v giun trũn. Trong gii thc vt,
chitin cú thnh t bo ca nm v mt s to Chlorophiceae.
Chitin tn ti trong t nhiờn dng tinh th, ú l cu trỳc gm nhiu phõn t c ni vi
nhau bng cỏc liờn kt hydro to thnh mt h thng si. Trong t nhiờn, chitin him khi tn ti
trng thỏi t do m gn nh luụn luụn liờn kt di dng phc hp chitin- protein. iu ny dn n
s khỏng vi cỏc húa cht v cỏc enzyme thy phõn, gõy nhiu khú khn cho vic chit tỏch, tinh
ch chỳng. Tựy thuc vo cỏc c tớnh c th v s thay i tng giai on sinh lý m trong cựng
mt loi cú th thy s thay i v lng v cht ca chitin.
Trong ng vt thy sn, c bit l trong v tụm, cua gh, mai mc, hm lng chitin
chim khỏ cao t 14-35% so vi trng lng khụ. Vỡ vy v tụm, cua gh, mai mc l ngun
nguyờn liu chớnh sn xut chitin v cỏc sn phm t chỳng.
Chitin c tỡm thy t nhiu ngun khỏc nhau vi hm lng khỏc nhau [45,51]
B cỏnh cng

37%

Nhn

38%

Bũ cp

30%

Sõu

20-38%

Nm

5-20%

Tụm

33%

Cua

70%

Mc

3-20%

Mc dự chỳng c ph bin rng rói nhng cho n nay ngun thu nhn chớnh ca chitin l
t v cua v tụm. Trong cụng ngh ch bin, do chitin tn ti dng phc hp vi mt s cht nh:
CaCO3, protein, lipid, cỏc cht hu c nờn vic tỏch chit cũn khú khn vỡ phi m bo c hai
yu t cựng mt lỳc l va loi ht tp cht ng thi khụng lm bin i tớnh cht ca chitin.

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


1.1.3.3. Cu trỳc phõn t v tớnh cht ca chitin
Cu trỳc phõn t [57, 58]
Qua nghiờn cu v s thy phõn chitin bng enzyme hay HCl m c thỡ ngi ta thy rng
chitin l mt polymer c to thnh t cỏc n v N-acetyl--D-Glucosamine liờn kt vi nhau bi
liờn kt 1-4 glucoside.

Hỡnh 1.5. Cu trỳc chitin [61]
Chitin cú cu trỳc lp th gm 3 dng nh : , v , s khỏc nhau ny th hin s sp xp
cỏc chui. Cỏc chui chitin xp xuụi, ngc xen k nhau, tuy nhiờn, chỳng cú mt cp xp cựng
chiu, chui chitin cỏc chui sp xp theo mt chiu nht nh, cũn chui chitin cú cỏc
cp chui xp cựng chiu so le vi mt chui ngc chiu trong cu trỳc.

Hỡnh 1.6. Cu trỳc ca alpha-chitin [61]
Tớnh cht ca chitin [27, 31]
Chitin th rn, cú cu trỳc bn vng nh cỏc liờn kt hydro trong v gia cỏc mch. Chitin
khụng tan trong nc, trong dung dch acid v kim loóng, trong cn v trong cỏc dung mụi thụng
thng. Nú ch tan c trong mt s acid vụ c c (HCl, H2SO4, H3PO4).

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


1.1.4. Cỏc yu t nh hng n s to thnh enzyme ca nm si trờn mụi trng lờn men
bỏn rn [14, 35, 36]
1.1.4.1 Thnh phn mụi trng nuụi cy nm si sinh chitinase [4, 11, 29]
Ngun dinh dng cacbon
Nm si cú kh nng ng húa nhiu ngun cacbon khỏc nhau, trong ú ngun
cacbonhydrat l d hp thu nht, trong ú glucose l ngun cacbon duy nht tham gia vo phn ng
trong ba chu trỡnh chuyn húa: con ng Embden Meyerhof (1930), Pentose v Entner Doudoroff.
Do chitinase va l enzyme cu trỳc, va l enzyme cm ng nờn trong mụi trng nuụi
cy nm si sinh chitinase, cn cú ngun chitin l cht cm ng v l ngun cacbon nhm tng kh
nng sinh tng hp enzyme chitinase. C cht dựng cm ng nm si sinh enzyme chitinase l
chitin (cú th dng huyn phự, dng bt hay dng thụ) v cỏc dn xut ca chitin. Nghiờn cu ca
Jesỳs de la Cruz v cng s (1922) ch ra rng Trichoderma harzianum ch to ra chitinase khi cú
ngun cacbon t chitin ch khụng t ngun khỏc nh cellulose hay chitosan.
Ngun dinh dng nit
Ngun nitrogen cú ý ngha ln n quỏ trỡnh sinh tng hp enzyme ca nm si. Theo
Kapat v cng s (1996), khi loi ure ra khi mụi trng nuụi cy s lm tng kh nng tng hp
chitinase. Takashi v cng s (2002) nghiờn cu kh nng sinh chitinase t nm si Aspergillus sp.
ó ch ra rng hot tớnh chitinase cao khi s dng ngun nit t (NH4)2SO4. Theo Nampoothiri v
cng s (2003), khi b sung 2,0% (w/w) cao nm men vo mụi trng nuụi cy bỏn rn thỡ kh
nng to chitinase Trichoderma harzianum tng ỏng k. Tuy nhiờn, theo Kovacs v cng s
(2003), trong nuụi cy bỏn rn, ngun nitrogen b sung vo mụi trng cỏm go-chitin khụng nh
hng n kh nng to chitinase. Suresh v Chandrasekharan (1999) cng ghi nhn s gia tng sn
lng enzyme ny khi mụi trng nuụi cy Trichoderma harzianum c cung cp mui amonium
phosphat v cao nm men. N. N. Nawani v B. P. Kapadnis trong quỏ trỡnh nghiờn cu ti u húa
bng phng phỏp thit k thớ nghim da trờn toỏn thng kờ cho thy i vi Streptomyces sp. NK
1057 khi cung cp ngun nit t c hai ngun l cao nm men v (NH4)2SO4 thỡ sn lng chitinase

tng t 4 10% so vi dựng riờng l cỏc ngun ny. [33]
Ngun dinh dng khoỏng
Cỏc cht khoỏng nh Fe, Mn, Zn, Mo, Cu ... cú vai trũ quan trng nh tham gia vo quỏ
trỡnh chuyn húa vt cht qua mng v thnh t bo nm si, tham gia thnh phn cu to protein,
enzyme, iu hũa pH mụi trng nuụi cy nờn nh hng n kh nng sinh tng hp enzyme núi
chung, chitinase núi riờng.

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


1.1.4.2. Yu t mụi trng nh hng n kh nng sinh enzyme chitinase ca nm si
- nh hng ca m
m cú ý ngha trong nuụi cy bỏn rn. Theo Matsumoto v cng s (2001), vi m
75%, chng Verticillium lecanii ATCC 26854 sinh chitinase cú hot tớnh cao nht. i vi
Trichoderma harzianum, hot tớnh chitinase cao nht m mụi trng l 65% (Nampoothiri v
cng s, 2003). Takashi v cng s (2002) ch ra rng nm si Aspergillus sp. tng hp chitinase
cú hot tớnh cao iu kin m mụi trng 57%.
- nh hng ca pH
Giỏ tr pH mụi trng ban u nh hng quan trng n kh nng sinh tng hp chitinase
ca cỏc chng nm si. Tựy thuc vo tng loi, tng chng m pH mụi trng ban u thớch hp
l acid, trung tớnh hay kim. Aspergillus sp. tng hp chitinase cú hot tớnh cao nht iu kin pH
= 5-6 (Takashi v cng s, 2002). Nhiu nghiờn cu trờn Trichoderma harzianum ch ra rng pH
thớch hp cho nm ny sinh trng to chitinase cú hot tớnh cao khong pH = 4-6 (Nguyn Th
Hng Thng v cỏc ng tỏc gi, 2003).
- nh hng ca nhit
Nhit nh hng ln n tc sinh trng v kh nng sinh enzyme ca nm si. Nhit
ti u cho s sinh trng ca a s nm si t 28-320C, ti a di 500C. Nhit quỏ cao hoc
quỏ thp cú th kỡm hóm s sinh trng, thm chớ cú th git cht si nm, quỏ trỡnh tng hp

enzyme s b c ch. Aspergillus sp. tng hp chitinase cú hot tớnh cao nht iu kin nhit
370C (Takashi v cng s, 2002)
- nh hng ca c cht cm ng
Chitinase cú th l enzyme cm ng hoc enzyme cu trỳc. Tuy nhiờn trong cỏc mụi trng
nuụi cy vi sinh vt ngi ta u b sung thờm c cht chitin nhm tng kh nng to chitinase.
Nhỡn chung s hin din ca chitin trong mụi trng nuụi cy hu ớch cho vic to chitinase
(Monreal v Reese, 1969; Ulhoa v Peberdy, 1993). Trong s cỏc c cht, chitin huyn phự cú kh
nng kớch thớch to chitinase cao nht (Bhushan, 2000; Nampoothiri v cng s, 2003). Trong hu
ht cỏc trng hp, khi nng chitin khong 1-1,5% l vi sinh vt cú kh nng to chitinase (Felse
v Panda, 2000).
Nm 2003, Binod v cng s ó s dng nhiu c cht khỏc nhau (nh vỏch t bo nm, v
tụm, cua ...) to chitinase t nm si nuụi cy trờn mụi trng bỏn rn. Vic tn dng ph liu
ny va em li hiu qu kinh t, va gúp phn gim thiu ụ nhim mụi trng.
Nghiờn cu ca inh Minh Hip v cỏc ng tỏc gi (2003) ch ra rng h enzym chitinase
ca Trichoderma sp. cú th c cm ng bi vỏch t bo vi nm (Curvularia oryzae, Phytophthora

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


primulae), vỏch t bo nm ln (Schizophyllum commune, Trametes versicolor) hoc chitin v tụm,
trong ú vỏch t bo nm cm ng quỏ trỡnh sinh tng hp h enzyme chitinase ca Trichoderma tt
hn chitin v tụm.
1.1.5. Nhng ng dng ca enzyme chitinase [30, 33]
1.1.5.1. ng dng trong vic thu nhn t bo trn (th nguyờn sinh)
Th nguyờn sinh ca t bo nm ó c s dng nh mt cụng c thớ nghim cú hiu qu
trong vic nghiờn cu quỏ trỡnh hỡnh thnh thnh t bo, quỏ trỡnh tng hp enzyme, quỏ trỡnh bi
tit cht cng nh vic ci tin cỏc chng nm ng dng trong cụng ngh sinh hc. Do trong thnh
t bo nm cú cha chitin, h enzyme thy phõn chitin l mt trong nhng nhõn t cú th s dng

phỏ v thnh t bo, to t bo trn t t bo nm.
Dahiya v cng s (2005) ó mụ t hiu qu ca enzyme chitinase thu nhn t chng
Enterobacter sp. NRG 4 trong vic to t bo trn t nm Trichoderma reesei, Aspergilllus niger,
Pleutotus florida ...
Mizuno v cng s (1997) tỏch t bo trn t Schizophyllum commune bng cỏch s dng
dch lc mụi trng nuụi Bacillus circulans KH 304. Phc hp enzyme t Bacillus circulans WL
12 vi hot tớnh chitinase cao ó rt hiu qu trong vic thu nhn t bo trn t Phaffia rhozyme
(Johnson v cng s, 1979).
1.1.5.2. ng dng trong vic sn xut chitooligosaccharides, glucosamine v N- acetyl
glucosamine
Chitooligosaccharides, glucosamine v N- acetyl glucosamine l cht cú tim nng rng ln
trong y dc. Chitooligosaccharides cú li ớch tim nng i vi sn xut thuc cho ngi. Vớ d,
chitohexaose v chitoheptaose c phỏt hin cú tớnh khỏng cỏc khi u.
Chitinase thu nhn t Vibrio alginolyticus ó c s dng sn xut chitopentaose v
chitotriose t c cht chitin huyn phự (Murao v cng s, 1992).
S kt hp gia cỏc enzyme thy phõn chitin cn thit thu nhn nhng oligomer cú chiu
di chui mong mun. Vớ d, to chitooligosaccharides cn t l endochitinase, t l thp N-acetyl
glucosamindase v exochitinase; trong khi to N- acetyl glucosamine thỡ cn t l cao
exochitinase v N-acetyl glucosamindase. (Aloise v cng s, 1996) nhn thy khi enzyme
chitinase vi tetramer hoc pentamer thu nhn t Nocardia oritentalis thỡ thy cú s hỡnh thnh cỏc
hexamer.
Sashiwa v cng s (2002) ó sn xut N- acetyl glucosamine t -chitin bng cỏch s dng
dch enzym thụ t Aeromonas hydrophila H-2330.

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


1.1.5.3. Ứng dụng trong việc nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học

Chitin có mặt trong lớp vỏ ngồi và ống tiêu hóa của cơn trùng. Villagomez-Castro và
Lopez-Romero (1996) đã chỉ ra rằng các sự sự kiện thuộc về hình thái học ở nấm ln có sự tham
gia của enzyme chitinase. Allosamidin, một chất ức chế mạnh của enzyme chitinase, được nhận
thấy có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của các lồi như ve bét, ấu trùng nhặng sau khi chúng ăn
vào (Sakuda và cộng sự, 1987).
1.1.5.4. Ứng dụng trong việc ước tính sinh khối nấm
Các nhà nghiên cứu đã mơ tả một loại phương pháp khác để ước tính lượng nấm có trong
đất. Kỹ thuật bao gồm việc quan sát dưới kính hiển vi và ly trích những chất chỉ thị đặc trưng cho
nấm như glucosamine ergosterol.
Có sự liên quan chặt chẽ giữa hoạt tính của chitinase và lượng nấm có trong đất. Sự liên quan
như thế khơng thấy xuất hiện với vi khuẩn và xạ khuẩn. Chính vì thế, chitinase trở thành yếu tố chỉ
thị thích hợp cho mức sinh trưởng của nấm trong đất (Miller và cộng sự,1998). Tương tự, chitinase
và protein gắn kết với chitin có thể được sử dụng để dự báo sự lây nhiễm nấm trên con người (Laine
và Lo, 1996).
1.1.5.5. Ứng dụng trong việc kiểm sốt muỗi
Chitinase đóng vai trò quan trọng đối với hình thái nấm men, cơn trùng. Kuranda và Robbins
(1991) chỉ ra vai trò của chitinase trong sự phân chia tế bào trong suất q trình sinh trưởng của
nấm men Sacharomyces cerevisiae.
Người ta chỉ ra rằng ấu trùng muỗi Aedes aegypti có thể bị giết trong vòng 48 giờ với sự tác
động của chế phẩm thơ từ nấm Myrothecium verrucaria. Nấm gây bệnh cơn trùng như Beauveria
bassiana có thể gây nhiễm trứng của muỗi Aedes aegypti. Điều này mở ra tiềm năng trong việc sản
xuất chất kiểm sốt cơn trùng truyền bệnh như muỗi.
1.1.5.6. Ứng dụng trong y học
Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu sử dụng enzyme chitinase trong việc chẩn đốn
các bệnh truyền nhiễm do nấm gây ra. Chitin hiện diện trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất
là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm. Hay ở nấm men thì chitin hiện diện trong những vết
chồi. Do đó có thể dùng phương pháp nhuộm chitin đặc hiệu cho nấm, tạo cơ sở xây dựng một
phương pháp chẩn đốn nhanh các lồi nấm gây bệnh. Các nhà khao học đã đề xuất một phương
pháp chẩn đốn bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng chitinase đã được phân lập tạo dòng
từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên chitinase VP1), enzyme này kết hợp chặt chẽ với chitin và có thể

Luận văn thạc só

Cao học K18


sử dụng như một mẫu dò trong việc chẩn đốn với độ nhạy cao để nhận diện một cách đặc hiệu các
vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mơ bệnh. [32]
Ngồi ra, chitinase có tiềm năng trong việc sản xuất các loại kem hay thuốc bơi ngồi da
chứa chất chống nấm bệnh thường xảy ra các nước vùng nhiệt đới bởi khả năng phân hủy vách tế
bào vi nấm của chúng.
1.1.5.7. Ứng dụng trong việc kiểm sốt nấm gây bệnh trên cây trồng
Nhiều lồi cơn trùng và nấm mốc có hại cho cây trồng và vật ni do gây ra nhiều loại dịch
bệnh, ảnh hưởng trực tiếp đến sản xuất nơng nghiệp. Vì chitin khơng phải là thành phần phổ biến ở
thực vật và động vật có xương nên người ta sử dụng các tác nhân kìm hãm sự sinh tổng hợp chitin
trong các nấm và cơn trùng như 1-(2,6-dichlorobenzoyl)-3-(3,4-dichlorophenol), nikkomycin,
polyoxin D ...Khi áp dụng trên cây cảnh, cây lương thực và trên động vật, những tác nhân trên
chứng tỏ có nhiều ưu thế trong việc tiêu diệt nấm mốc, cơn trùng có hại mà khơng gây hại đáng kể
cho thực vật hoặc động vật có xương sống.
Theo Hirohi Ihui, enzyme chitinase ln có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây
khơng chứa chitin. Chitinase và β-1,3-glucanase được tạo ra trong mơ thực vật khi tế bào bị kích
thích bởi nấm gây bệnh chứa chitin, xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển
của bệnh. Chitinase sản xuất bởi Enterobacter sp. NRG4 có hoạt tính cao đối với Fusarium
moniliforme, Aspergillus niger, Mucor rouxii và Rhizopus nigricans (Dahiya và cộng sự, 2005).
Bhushan và Hoodal (1998) nghiên cứu về tính tương thích của những chitinase chịu nhiệt từ
Bacillus sp. BG-11 với thuốc diệt cơn trùng và thuốc diệt nấm thường được sử dụng. Chitinase từ
Bacillus cereus YQ308 ức chế sự phát triển của nấm bệnh thực vật như Fusarium oxyporum, F.
Solani, Penicillium ultimum (Change và cộng sự, 2003). CHIT42, CHIT40 và CHIT72 từ
Trichoderma harzianum P1 và Trichoderma virens 41 có thể tác động trên sự nảy mầm và sự kéo
dài của sợi nấm của nhiều nấm gây bệnh thực vật như Fusarium spp., Alternaria spp., Ustilago

avenae, ... khi chúng được ủ với dịch enzyme.
1.1.5.8. Ứng dụng trong sản xuất protein đơn bào
Chất thải rắn từ q trình chế biến tơm chứa chủ yếu là chitin, CaCO3 và protein. RevahMoiseev và Carrod (1981) đã đề nghị sử dụng loại chất thải này để chuyển đổi bằng phương pháp
sinh học chitin thành protein đơn bào nhờ sử dụng enzyme thủy phân chitin. Họ sử dụng enzyme
chitinase thu nhận từ Saccharomyces marcescens để thủy phân chitin và Pichia Kudriavazevii để
sản xuất protein đơn bào (với 45% protein và 8-11% acid nucleic). Những nấm thường được dùng

Luận văn thạc só

Cao học K18


sn xut protein n bo l Hansenula polymorpha, Candida tropicalis, Sacharomyces
cerevisiae v Myrothecium verrucaria.
Vyas v Deshpande (1991) ó dựng enzyme thy phõn chitin thu nhn t Myrothecium
verrucaria v dựng Sacharomyces cerevisiae sn xut protein n bo t cht thi cha chitin.
Tng hm lng protein thu c l 61%, vi t l rt thp acid nucleic (3,1%). Cỏc nghiờn cu ch
ra rng Sacharomyces cerevisiae l chng tt nht sn xut protein n bo (60% protein v ch
1-3% acid nucleic).

1.2.

C IM SINH HC CA CC CHNG NM SI NGHIấN CU

1.2.1. Cỏc chng thuc chi nm Aspergillus [7,8, 60]
1.2.1.1. V trớ phõn loi
Gii: Nm
Ngnh: Ascomycota
Lp: Eurotiomycetes
B: Eurotiales

H: Trichocomaceae
Ging: Aspergillus
1.2.1.2. c im hỡnh thỏi
Si nm cú vỏch ngn, phõn nhỏnh, khụng mu, mu nht, mt s trng hp tr nờn nõu
hay mu sm khỏc mt vựng nht nh ca khun lc.
Aspergillus niger khi nuụi cy trờn mụi trng thch-khoai tõy-dextrose 250C cho khun
lc ban u mu trng, sau nhanh chúng chuyn sang mu en vi vic to vụ s bo t ớnh, mt
trỏi khun lc mu hi vng nht v khi trng thnh cú th to ng rónh phúng x trờn b mt
thch. Aspergillus awamori khi nuụi cy trờn mụi trng Czapek cho khun lc t kớch thc 4,55,0cm sau 7 ngy nhit 250C, cũn trờn mụi trng MEA (cao malt) cho kớch thc khun lc
ln hn. Khun lc cú mu nõu nht, dn chuyn sang m. H si trng dn ng vng sm.
Cung mang bo t bi phng lờn ngn, cỏc chui bo t bi t u phng mc ta khp
mi hng. Bo t trn khụng cú vỏch ngn, khỏc nhau v hỡnh dng, kớch thc, mu sc ... cỏc
loi khỏc nhau.
Theo Bựi Xuõn ng, Aspergillus niger cú bo t ớnh trng thnh hỡnh cu, phn ln 4,05,0àm, xự xỡ khụng u vi nhng g rừ v gai khụng sp xp thnh vch k dc theo chiu di.

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


Aspergillus awamori cú bụng mau chúng chuyn mu nõu hi , mt trỏi khun lc mu tng t,
cung bo t ớnh phn ln phỏt trin di 1,0-1,5mm, bo t ớnh phn ln ng kớnh 4,0 n 4,5
àm.

A

B

Hỡnh 1.7. Hỡnh thỏi nm Aspergillus niger [62, 63]
(A): bo t, (B): Khun lc trờn mụi trng PGA

Hỡnh 1.8. Hỡnh thỏi nm Aspergillus awamori [63]
(A): Khun lc trờn MT Czapek; (B): Khun lc trờn MT MEA
(C), (D), (E): hỡnh thỏi bo t
1.2.1.3. c im sinh lý, húa sinh
Nm Aspergillus cú mt khp ni trong t nhiờn, chỳng phõn b rng v d thớch nghi vỡ
chỳng cú th hỡnh thnh khun lc trờn nhiu ngun c cht khỏc nhau.

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


Nghiờn cu ca Andrea Astoreca v cng s cho thy nhit thớch hp cho s sinh trng
ca Aspergillus niger, Aspergillus awamori khong 25 - 300C. Theo Takashi v cng s (2002),
nhit thớch hp Aspergillus sp. tng hp chitinase cú hot tớnh cao nht l 370C.
Wainwright v cng s ó ch ra rng, pH thớch hp cho s sinh trng ca nm Aspergillus
awamori l khong 5.0-7.0. pH quỏ acid (khong 2-3) s ngn cn s to thnh bo t, dn n
h si b phõn tỏn khi nuụi cy chỡm.
ó cú nhiu nghiờn cu tỡm hiu v enzyme ca nm Aspergillus niger, gm amylase,
amyloglucosidase, cellulase, lactase, invertase, pectinase ... Ngoi ra chitinase ca nm ny cng
c cp n trong Hi ngh Quc t v Aspergillus ti Nertheland vo thỏng 3 nm 2010 [60].
Vn c t ca Aspergillus niger cng c cp n, phn ln chỳng khụng cú hi,
nhng mt s cú th to c t gõy hi n ng vt v con ngi. S an ton ca Aspergillus niger
c cp n trong nhiu bi bỏo ca cỏc tỏc gi Schuster v cng s (2002), Van Dijck v cng
s (2003), Blumenthal (2004), Olemspka-Beer v cng s (2006) [41]. Theo thụng tin túm tt t
nhng bi bỏo ca cỏc tỏc gi ny, khong 3-10% cỏc chng Aspergillus niger cú kh nng sinh ra
c t trong nhng iu kin nuụi cy xỏc nh nh ochratoxin A.

1.2.2. Trichoderma harzianum [5, 12, 54]

1.2.2.1. V trớ phõn loi
Trichoderma l mt trong nhng nhúm vi nm gõy nhiu khú khn trong phõn loi do cỏc
c im cn thit cho vic phõn loi vn cũn cha c bit y .
Theo Rifai (1969), Barnett v Hunter (1972), Trichoderma thuc lp nm, nm bt ton
Deuteromycetes (Fungi imperfect), chỳng c phõn loi nh sau:
Gii:

Nm

Nghnh:

Ascomycota

Lp:

Deuteromycetes

B:

Moniliales

H:

Moniliceae

Ging:

Trichoderma

Mt s ti liu phõn loi ging Trichoderma thuc h Moniliacae, b Moniliales, lp nm,

nm bt ton (Fungi imperfecti).

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


1.2.2.2. c im hỡnh thỏi [62, 63]
Khun lc Trichoderma harzianum ban u cú mu lc trng, sau dn dn chuyn sang mu
lc sm, mt di khun lc khụng mu.
Bo t ỏo hỡnh cu, nhn, khụng mu, ng kớnh 6-12 m, gia si nm hoc ớnh cỏc
nhỏnh.
Giỏ bo t trn ngn vỏch, phõn nhỏnh 2-3 ln, ng kớnh 4 - 5 m, di ti 250 m. Th
bỡnh cú kớch thc 3-4 x 5-7m, thng thnh 2-5 cỏi nh nhỏnh tn cựng, dc cỏc nhỏnh
thng n c. Th bỡnh gia thng di ti 17 m v cú ng kớnh nh hn, phn rng nht
khong 2-3 m. Bo t trn hỡnh gn cu, hỡnh trng, phn gc hi bt, nhn, mu lc nht, khụng
vỏch ngn, kớch thc 2-3 x 3-3,5 m, nhy th bỡnh.

Hỡnh 1.9. Hỡnh thỏi bo t v khun lc ca Trichoderma harzianum [64]
1.2.2.3. c im sinh lý, húa sinh
Trichoderma harzianum c tỡm thy nhng vựng m ỏp. Theo nghiờn cu ca Domsch
v cng s (1980), nhit ti u cho s sinh trng, phỏt trin ca Trichoderma harzianum vo
khong 30C, ti a khong 36C. Trichoderma harzianum cng cú th phỏt trin nhit khong
5C, nhng sinh trng rt chm v yu .
Trichoderma harzianum tng hp enzyme chitinase v cỏc cht khỏng sinh (Trichodermin,
glyotosin).Vn c t ca Trichoderma harzianum cha c bit n.

1.3.

S LC CC NGHIấN CU V CHITINASE

1.3.1. Trờn th gii
So vi cỏc enzyme khỏc nh protease, amylase, pectinase ... thỡ h enzyme chitinase c
nghiờn cu chm hn v cỏc cụng trỡnh nghiờn cu v chỳng cũn hn ch. i tng c nghiờn
cu sm nht v khỏ nhiu l x khun Streptomyces (L.R. Berger v D.M. Renolds, 1958; R.
Grupta, R. K. Saxena, P. Chatuvedi v J. S. Windi, 1995). Nhng nghiờn cu trờn i tng ny
nhm thu nhn chitinase ng dng ch yu vo vic phỏ v vỏch t bo nm. Nm 1978, P.A.

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


Carroad v R. A. Tom cú cụng trỡnh nghiờn cu vic s dng phng phỏp sinh hc trong x lý
cht thi cha chitin, v tip ú l nghiờn cu ca I. G. Cosio, R. A. Fisher, P. A (1982) cp n
quỏ trỡnh sn xut enzyme nhm x lý cht thi cha chitin.
V sau, trong nhng nm 1989, vic thu nhn chitinase c tip tc nghiờn cu trờn cỏc i
tng khỏc nh Serratia liquefaciens (S. Joshi, Kozlowski), Myrothecium verrucaria (P. Vyas v
M. V. Deshpand) v vn ch yu tỡm hiu ng dng ca chitinase trong vic phỏ v vỏch t bo
nm.
Nhng nm gn õy, chitinase c nghiờn cu nhiu trờn i tng nm si Trichoderma.
Nm 1991, C. J. Ulhoa, J. F. Peberdy nghiờn cu s iu hũa quỏ trỡnh sinh tng hp chitinase ca
Trichoderma harzianum. Nm 1999, P. A. Felse v T. Panda nghiờn cu ti u húa quỏ trỡnh sinh
tng hp chitinase t Trichoderma hazianum. Nm 2000, P. A. Felse v T. Panda nghiờn cu quỏ
trỡnh nuụi cy chỡm thu nhn chitinase t Trichoderma harzianum trong b lc. Nm 2003, Ashok
Pandey v cng s nghiờn cu ti u húa quỏ trỡnh tng hp chitinase cú tớnh khỏng nm t
Trichoderma harzianum nuụi cy trờn mụi trng bỏn rn. Dng nh Trichoderma l chi nm n
nay c phỏt hin cú hot tớnh chitinase khỏ cao, ng dng nhiu trong cỏc lnh vc, c bit trong
bo v thc vt. i vi chi nm Aspergillus cng ó cú mt s cụng trỡnh nghiờn cu v kh nng
sinh chitinase ca chỳng trờn mụi trng bỏn rn (Nopakarn Rattanakit v cng s, 2002). Nhng

chng thuc chi nm ny c nghiờn cu thu nhn chitinase l Aspergillus carneus (A. A. Sherief,
1990); A. Fumigatus (Jin-Ian Xia v Jing Xiong, 2009). A. A. Shubakow v P. S. Kucheryavykh
(2003) ó nghiờn cu nuụi cy nhiu chng nm khỏc nhau trong ú cú cỏc chng thuc cỏc chi
nm Aspergillus v Trichoderma... Tuy nhiờn nhng nghiờn cu v chitinase t nm si phn ln
thc hin trờn mụi trng nuụi cy lng.
Vi khun cng l mt i tng c nghiờn cu v vic sinh tng hp chitinase. Nm 1998,
B. Bhushan, G. S. Hoondal nghiờn cu enzyme chitinase chu nhit t Bacillus sp G-1. V gn õy
nht, nm 2009, S. M. Akhir v cng s nghiờn cu ti u húa mụi trng nuụi cy thu nhn
enzyme chitinase t Bacillus licheniformis bng phng phỏp nghiờn cu b mt ỏp ng (RSM).
u im ca chitinase thu nhn t vi khun ny l tớnh bn nhit ca chỳng.
Trờn i tng thc vt, cng cú mt vi nghiờn cu thu nhn chitinase. Nm 2004, Isabela
S. Santos v cng s cú cụng trỡnh nghiờn cu v chitinase thu nhn trờn i tng thc vt (ht cõy
Adenanthera pavonina L.), cõy h u Phaseolumungo. Kt qu cho thy chitinase t ht cõy
Adenanthera pavonina L. l loi enzyme bn nhit. Tỏc gi Wen-Chi Hou, Yaw-Huei Lin, YingChou Chen (1998) nghiờn cu thu nhn chitinase chit rỳt t lỏ khoai lang.

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


1.3.2. Trong nc
Nhỡn chung nhng nghiờn cu v enzyme chitinase trong nc cũn rt hn ch cho dự tim
nng ng dng rng rói ca enzyme ny l khụng th ph nhn. Nm 2001, tỏc gi inh Minh Hip
cú cụng trỡnh nghiờn cu c tớnh ca enzyme chitinase thu nhn t nm mt Coprinus fimentarius
v mt s ng dng trong lnh vc bo v thc vt v y dc.
Nm 2003, cỏc tỏc gi Nguyn Th Hng Thng, inh Minh Hip, ng Th Thanh Thu cú
cụng trỡnh nghiờn cu kho sỏt mt s yu t tỏc ng lờn quỏ trỡnh sinh tng hp h enzyme
chitinase ca cỏc chng nm mc Trichodrema sp. Nm 2004, tỏc gi Tụ Duy Khng thc hin
ti kho sỏt s sinh tng hp chitinase Trichoderma spp. v kh nng i khỏng vi mt s nm
gõy bnh. Nm 2008, tỏc gi Nguyn ỡnh Nga v cng s kho sỏt kh nng tỏc ng lờn nm

Candida albicans ca enzyme chitinase thu nhn t thc vt v t nm Trichoderma.
Trờn i tng thc vt, nm 2008, tỏc gi ng Trung Thnh ó nghiờn cu quỏ trỡnh thu
nhn enzyme chitinase t cõy khoai lang Ipomoea batatas, thu enzyme chitinase cú hot tớnh khỏ
cao (hot t 192 UI/ml)
Nhỡn chung, nhng nghiờn cu v chitinase trong nc cha nhiu, ch yu vn trờn nm
Trichoderma, ng dng ch yu mi cp n trong lnh vc bo v thc vt v khi u trong
lnh vc y dc.

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18


Chng 2: VT LIU V PHNG PHP
2.1

NGUYấN VT LIU

2.1.1 Ging vi sinh vt
Cỏc chng nm si Aspergillus niger v Aspergillus awamori, Aspergillus sp., Trichoderma
harzianum do phũng thớ nghim, b mụn Sinh húa, trng i Hc Khoa Hc T Nhiờn Thnh ph
H Chớ Minh v b mụn Vi sinh, trng i Hc S Phm Thnh ph H Chớ Minh cung cp.
2.1.2 Cỏc mụi trng s dng trong thớ nghim
2.1.2.1. Mụi trng nuụi cy v gi ging nm si
MT 1: Cao nm men agar Yeast Extract Agar (YEA) [1, 12]
Cao nm men

4g

Agar

20g

Glucose

20g

Nc

1000ml

pH = 5,5 6,0
Kh trựng 1atm/30 phỳt
MT 2: Thch khoai tõy Dextrose (PDA) [6, 10, 26]
Nc chit khoai tõy

200ml

Agar

20g

Glucose

20g

Nc

1000ml

pH = 5,5 6,0
Kh trựng 1atm/30 phỳt
MT 3: Malt Extract Agar (YEA) [11,26]
Cao Malt

20g

Pepton

1g

Agar

20g

Glucose

20g

Nc

1000ml

pH = 5,5 6,0
Kh trựng 1atm/30 phỳt
2.1.2.2. Mụi trng cm ng tng hp enzym chitinase [12, 13, 29]

Luaọn vaờn thaùc sú

Cao hoùc K18