Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình tăng trưởng và tạo chồi của cây bạc hà á mentha arvensis l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG
ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA
CNSH–TP–MT

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN
QUÁ TRÌNH TĂNG TRƯỞNG VÀ TẠO CHỒI CỦA
CÂY BẠC HÀ Á MENTHA ARVENSIS L.

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh
SVTH: Phạm Thụy Ngọc Trân
Lớp: 12DSH02

TP.HCM, tháng 8/ 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG
ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA
CNSH–TP–MT

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN
QUÁ TRÌNH TĂNG TRƯỞNG VÀ TẠO CHỒI CỦA
CÂY BẠC HÀ Á MENTHA ARVENSIS L.

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD: ThS. Trịnh Thị Lan Anh
SVTH: Phạm Thụy Ngọc Trân
Lớp: 12DSH02

TP.HCM, tháng 8/2016


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC ....................................................................................................................i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................v
DANH MỤC BIỂU ĐỒ .............................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................vii
LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài ......................................................................................................1
2.
Mục
đích
nghiên
................................................................................................2

cứu

3. Nội dung đề tài .........................................................................................................3

4.
Ý
nghĩa
khoa
học
và
.................................................................3

thực

tiễn

của

đề

tài

5. Kết quả đạt được của đề tài ......................................................................................3
6. Kết cấu của đồ án .....................................................................................................4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................5
1.1.
Giới
thiệu
sơ
lược
........................................................5

kỹ

thuật

nuôi

cấy

in

vitro

1.1.1. Khái niệm ...........................................................................................................5
1.1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam ................................................5
1.1.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô .........................................................................................6
1.1.4. Ưu và nhược
........................................8

điểm

của

kỹ

1.1.5.
Thành
phần
các
....................................................................9

thuận
chất

nhân

giống

khoáng

in
vô

vitro
cơ

1.1.5.1. Các nguyên tố đa lượng ..................................................................................9
1.1.5.2. Các nguyên tố vi lượng .................................................................................11
1.1.6. Dinh dưỡng hữu cơ...........................................................................................12
1.1.7. Các hợp chất tự nhiên.......................................................................................14
1.1.8.
Carbon
và
nguồn
...........................................................................17
i

năng

lượng


Đồ án tốt nghiệp

1.1.9. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật............................................................18
1.1.10. Các thành phần khác ......................................................................................18

i


1.1.11. Sự phát sinh hình thái thực vật.......................................................................20
1.2. Giới thiệu sơ lược về Bạc hà ...............................................................................21
1.2.1. Tình hình nghiên cứu Bạc hà trên thế giới và Việt Nam.................................21
1.2.2. Giới thiệu sơ lược về giống Bạc Hà Á Mentha arvensis L. ............................23
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................31
2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài ................................................................31
2.2. Vật liệu ................................................................................................................31
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu.......................................................................................31
2.2.2. Môi trường nuôi cấy.........................................................................................31
2.2.3. Điều kiện thí nghiệm ........................................................................................31
2.3. Phương pháp ........................................................................................................31
2.4. Bố trí thí nghiệm..................................................................................................32
2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính lên khả
năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L ..............................................32
2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát hàm lượng của nước dừa đến khả năng sinh
trưởng và phát triển của Bạc hà Á Mentha arvensis L. ..................................33
2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của đậu đen lên quá trình hình thành
chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha
arvensis L. ..........................................................................................33
2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của đậu xanh lên quá trình hình thành
chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha
arvensis L. ..........................................................................................34
2.5. Chỉ tiêu theo dõi ..................................................................................................35
2.6. Thống kê và xử lý số liệu ....................................................................................35

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................37
3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính lên khả năng tăng
trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy. ...............................37

ii


3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của hàm lượng của nước dừa đến khả năng
sinh trưởng và phát triển của Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần
nuôi cấy..............................................................................................................45
3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của đậu đen lên quá trình hình thành chồi và
tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L.
sau 8 tuần nuôi cấy ............................................................................................52
3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và
tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L.
sau 8 tuần nuôi cấy ............................................................................................60
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................67
4.1. Kết luận................................................................................................................67
4.2. Kiến nghị .............................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................68

3


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ABA

Abscisic Acid

ACC

1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid

ACS

ACC synthase

AND

Acid deoxiribonucleic

AOA

Aminooxyacetic acid

ARN

Acid ribonucleic

AVG

Aminoethoxyvinylglycine

B1

Thiamine

B3

Nicotinic Acid

B6

Pyridoxine

BAP

6-benzylaminopurin

IBA

Indole-3-butyric acid

MET

Methionine

MS

Murashige và Skoog, 1962

NAA

Alpha-naphtalenacetic acid

PVP

Polyvinylpyrolidone

SAM

S-adenosine-methionine

TDZ

Thidiazuron

2,4,5-T

Acid Trichlorophenoxyacetic

2,4-D

2,4-dichlorophenoxyacetic acid

4


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa ......................................................15
Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của 100 g đậu xanh ............................................16
Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của 100 g đậu đen ..............................................17
Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính lên quá trình hình thành chồi và
tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha
arvensis L. .................................................................................................32
Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình hình thành chồi và
tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. ..33
Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo
cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. ........34
Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo

cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L. ........35
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của các nồng độ than hoạt tính khác nhau lên quá trình
hình thành rễ và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau
8 tuần nuôi cấy .........................................................................................38
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các nồng độ nước dừa khác nhau lên quá trình hình
thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8
tuần nuôi cấy .............................................................................................46
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu đen khác nhau lên quá trình hình
thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8
tuần nuôi cấy .............................................................................................53
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu xanh khác nhau lên quá trình
hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà
sau 8 tuần nuôi cấy ..................................................................................60

5


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến trọng lượng tươi và trọng lượng
khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy.........39
Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà
Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy .................................................39
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều
cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L.
sau 8 tuần nuôi cấy...................................................................40
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của nước dừa đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô
của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ................47
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của nước dừa đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á
Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy .....................................................47
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của nước dừa đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều

cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L.
sau 8 tuần nuôi cấy......................................................................................48
Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của đậu đen đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô
của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ................54
Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của đậu đen đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á
Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy .....................................................54
Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của đậu đen đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao
cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8
tuần nuôi cấy ...............................................................................................55
Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của đậu xanh đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô
của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy ................61
Biểu đồ 3.11. Ảnh hưởng của đậu xanh đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á
Mentha arvensis L. sau 8 tuần nuôi cấy .....................................................61
Biểu đồ 3.12. Ảnh hưởng của đậu xanh đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều
cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L.
sau 8 tuần nuôi cấy......................................................................................62

6


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Bạc Hà Á Mentha arvensis L. ............................................................................ 23
Hình 3.1. Ảnh hưởng của các nồng độ than hoạt tính khác nhau lên quá trình hình
thành rễ và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi
cấy........................................................................................................................ 41
Hình 3.2. Ảnh hưởng của các nồng độ nước dừa khác nhau lên quá trình hình thành chồi
và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi
cấy........................................................................................................................ 49
Hình 3.3. Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu đen khác nhau lên quá trình hình
thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần

nuôi cấy................................................................................................................ 56
Hình 3.4. Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu xanh khác nhau lên quá trình hình
thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần
nuôi cấy................................................................................................................ 63

vii


LỜI MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Việt Nam có điều kiện tự nhiên, khí hậu thuận lợi nên là nước có hệ thực vật
rất phong phú và đa dạng. Tổng số loài thực vật ở Việt Nam được ước tính có
khoảng 12.000 loài. Trong số này, nguồn tài nguyên dược liệu rất phong phú và đa
dạng, chiếm một phần lớn đáng kể.
Qua các số liệu điều tra đã thống kê được trên 4.000 loài thực vật được dùng
làm thuốc. Từ lâu, cộng đồng các dân tộc Việt Nam đã biết dùng cây thuốc để chữa
bệnh, với kinh nghiệm điều trị nhiều loại bệnh khác nhau.
Hàng năm, nước ta có nhu cầu từ 40.000 - 60.000 tấn dược liệu và công tác
phát triển dược liệu đã được Nhà nước quan tâm. Nhiều địa phương đã đầu tư các
vùng trồng dược liệu bền vững, góp phần tăng thu nhập cho người dân và đáp ứng
nhu cầu nguyên liệu đảm bảo chất lượng.
Hiện nay người ta có xu hướng quay trở về với cây thuốc và thuốc có nguồn
gốc thiên nhiên tạo ra. Xu hướng này đã tác động đến việc sản xuất, thu hái, chế
biến, lưu thông, tiêu thụ và sử dụng dược liệu thảo mộc.
Trước nhu cầu về dược liệu thiên nhiên, do sự tác động của người thu mua,
nhận thức và ý thức của người dân, công tác quản lý chưa đáp ứng yêu cầu,... nên
việc khai thác tài nguyên dược liệu thường diễn ra bừa bãi, không chú ý đến khả
năng tái sinh của các loài. Do vậy đã làm nguồn tài nguyên dược liệu của Việt Nam
suy giảm nghiêm trọng.
Trong số các loài thảo dược phổ biến, thì cây Bạc hà Mentha arvensis L.

thuộc họ hoa môi (Lamiaceae) là một trong những loài thảo mộc quý đang rất được
ưa chuộng, đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp dược liệu, có giá trị
kinh tế, sử dụng rộng rãi cả trong Tây y và Đông y ở nước ta và trên thế giới.
Cây Bạc hà tuy được sử dụng rộng rãi, có tác dụng dược lý cao trong Đông y
và Tây y ở hầu hết các nước trên thế giới nhưng các nghiên cứu về chúng còn ít so
với nhiều cây trồng và cây dược liệu khác. Theo Khotin (1963), nhiều loài Bạc hà
để lấy tinh dầu có nguồn gốc ở một số nước phía Tây châu Âu; điều này phù hợp

1


với các nghiên cứu về phân loại thực vật bậc cao là bộ, họ Hoa môi phân bố tập
trung ở vùng Địa Trung Hải, Tiểu Á và Trung Á,... (Võ Văn Chi và Dương Đức
Tiến, 1978).
Ở Việt Nam theo GS.TS Đỗ Tất Lợi, cây Bạc hà mọc hoang dại và được
trồng ở nhiều vùng, chúng mọc hoang dại cả ở đồng bằng, trung du và miền núi như
ở Sa Pa (Lào Cai); Tam Đảo (Vĩnh Phúc); Ba Vì (Hà Nội) và Bắc Kạn, Sơn La, Hải
Dương, Hưng Yên, Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang,... Từ năm 1955 nước ta đã trồng
Bạc hà, đến năm 1972 cả nước đã tự sản xuất được khoảng 60 tấn tinh dầu Bạc hà
và 1 tấn menthol tinh thể.
Hầu hết cây Bạc hà được nhân giống chủ yếu bằng các phương pháp truyền
thống như giâm cành, gieo hạt,… Trong những nơi khô hạn, việc nhân giống của
Bạc hà gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, kỹ thuật vi nhân giống được coi là phương pháp
hữu hiệu cho phép nhân nhanh và bảo tồn các loài thực vật, trong đó có loài dược
thảo quan trọng như Bạc hà Mentha arvensis L. Nhân giống in vitro đã được chứng
minh là công nghệ tiềm năng cho sản xuất quy mô lớn các loài thực vật (Wawrosch
et al., 2001; Martin, 2003; Azad, 2005; Hassan và Roy, 2005; Hassan et al., 2009).
Hiện nay, các công trình nghiên cứu về nhân nhanh giống cây trồng đã đạt
nhiều thành tựu trên các loài thực vật có giá trị như Lan, Cúc, Lily,… tuy nhiên về
cây Bạc hà vẫn còn hạn chế. Một số công trình nghiên cứu nổi bật về Bạc hà như:

nhân giống in vitro Mentha arvensis L. thông qua nuôi cấy mô sẹo (Maity, 2013),…
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình tăng trưởng và tạo chồi của
cây bạc hà Á Mentha arvensis L.”. Với mục đích ứng dụng công nghệ sinh học
trong việc phát triển nông nghiệp bền vững, vừa tăng năng suất cây trồng, giống
không bị thoái hoá,không sâu, bệnh.
2. Mục đích nghiên cứu
Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính, bột từ đậu đen, đậu xanh, và nước
dừa lên khả năng tăng trưởng của cây Bạc hà Á Mentha arvensis L.


Xây dựng môi trường cải tiến để nhân giống cây Bạc hà Á Mentha arvensis L.
tốt nhất bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào in vitro.
3. Nội dung đề tài
 Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á
Mentha arvensis L.
 Khảo sát bổ sung nước dừa vào môi trường nhân nhanh cây Bạc hà Á
Mentha arvensis L.
 Khảo sát ảnh hưởng của bột đậu đen lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á
Mentha arvensis L.
 Khảo sát ảnh hưởng của bột đậu xanh lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á
Mentha arvensis L.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học:
Kết quả nghiên cứu sẽ đưa ra một biện pháp kỹ thuật nhân giống Bạc hà Á
Mentha arvensis L. bằng phương pháp in vitro để đánh giá hoạt tính kích thích tăng
trưởng khi bổ sung hoặc thay thế các yếu tố trong môi trường nuôi cấy Bạc hà Á
Mentha arvensis L. Duy trì hình thái và khắc phục các trường hợp hay gặp trong
nuôi cấy mô khi môi trường đặc biệt sử dụng agar, cấy chuyền mẫu nhiều lần.
Ý nghĩa thực tiễn:

Kết quả của nghiên cứu là cơ sở để tạo môi trường nuôi cấy thích hợp nhân
nhanh giống Bạc hà Á Mentha arvensis L. ở quy mô lớn, cây sạch bệnh nhằm cung
cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị cao
dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
5. Kết quả đạt được của đề tài
 Xác định được nồng độ thích hợp của than hoạt tính lên khả năng
tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L.
 Xác định được nồng độ thích hợp của nước dừa lên khả năng tăng trưởng
Bạc hà Á Mentha arvensis L.


 Xác định được nồng độ bột đậu đen thích hợp lên khả năng tăng trưởng của
cây Bạc hà Á Mentha arvensis L.
 Xác định được nồng độ bột đậu xanh thích hợp lên khả năng tăng trưởng
của cây Bạc hà Á Mentha arvensis L.
6. Kết cấu của đồ án
Đồ án bao gồm các chương sau:
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy in vitro
1.1.1. Khái niệm
Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô
trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô
dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (giống cây trồng), sản
xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các

nguồn gen quý,…
Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn
thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù
hợp với điều kiện vô trùng của ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện
vô trùng với các mục đích khác nhau. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng
thích hợp như muối khoáng, các phytohormone, vitamin và đường.
1.1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở
miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ năm
1980. Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là lĩnh vực
nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Nhiều tỉnh thành trong cả nước đã xây
dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi
cấy mô này và đã mang lại nhiều thành tựu nổi bật:
Ở miền Bắc, nhân giống vô tính ở thực vật được ứng dụng ở hầu hết các loài
thực vật nông, lâm sản, bảo tồn thành công các loại gỗ quý như: Vù hương (loại gỗ
tiết tinh dầu dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm), cây Đăng lấy gỗ, Chè vang (một
loại chè rất khó trồng). Kỹ thuật này giúp lai tạo thành công giống Lúa chịu hạn
DR1, nhân giống nhiều loại khoai tây, mía,...
Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung
cấp hàng vạn cây giống Bạch đàn Eucalyptus urophylla.


Trung tâm ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc ứng
dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây Lô hội,
một loài dược liệu quý ở địa phương.
Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất Phong lan lớn trong khu vực.
Chỉ với 3 người, phòng nuôi cấy mô – trung tâm giống và kỹ thuật cây trồng Phú
Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu của khách hàng. Hiện nay
100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô.
Năm 2002, Lê Thị Kim Đào và cộng sự tại Trung tâm Ứng dụng Khoa học

Kỹ thuật Bình Định đã nhân giống thành công 4 loại cây Trầm hương, Bạch đàn
Urophylla, cây Hông, Giổi xanh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho chất lượng cây
giống tốt và hiệu quả kinh tế cao.
Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: nhân
giống thành công giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) quý hiếm từ một số tế
bào gốc của sâm Ngọc Linh bằng công nghệ sinh khối tế bào, nhóm nghiên cứu học
viện Quân y đã thành công trong việc nuôi cấy thành số lượng lớn, toàn bộ quy
trình chỉ mất 10 đến 20 ngày, trong khi bình thường phải mất khoảng 6 năm sâm
mới cho thu hoạch. Đã khôi phục nhiều loài lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt
chủng, đặc biệt là loài lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) – loài lan duy nhất
có hương thơm trên thế giới,…
1.1.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô
Các bước nhân giống:
Giai đoạn 1: chọn lọc cây mẹ và khử trùng mô nuôi cấy.
Cây mẹ phải là cây sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh
trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế
độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ làm
giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Tuỳ thuộc
vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần
chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn,
đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá.


Giai đoạn 2: tái sinh mẫu nuôi cấy.
Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô
nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất
auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh điều
kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường mô non, chưa phân
hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hoá sâu. Người ta
cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây trong

mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi.
Giai đoạn 3: nhân nhanh.
Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Ở giai đoạn này
bao gồm nhiều lần cấy chuyền mô lên các môi trường nhân nhanh nhằm kích thích
tạo cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Để
tăng hệ số nhân, người ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các
chất điều hoà sinh trưởng thực vật như: auxin, cytokynin, gibberellin,… và các chất
bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ,
ánh sáng thích hợp.
Giai đoạn 4: tạo cây hoàn chỉnh.
Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở
giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này
sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ
sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormone thực vật quan trọng có
chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.
Giai đoạn 5: đưa cây ra vườn ươm.
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra vườn ươm là bước cuối cùng
của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá
trình này trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng
thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện
ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống
cao trong vườn ươm cũng như ở đồng ruộng.


1.1.4. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro
Ưu điểm
 Phương pháp nhân giống in vitro có những ưu điểm vượt trội so với các
phương pháp nhân giống truyền thống (giâm, chiết, ghép,…) như:
 Cây con đồng nhất về mặt di truyền;
 Cây có hệ số nhân cao, sản xuất được số lượng cây giống trong một thời gian

ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại;
 Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây
như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn,… mà
ngoài tự nhiên không thể thực hiện được;
 Tạo cây sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng;
 Tạo dòng toàn cây cái (cây Chà là) hoặc toàn cây đực (cây Măng tây) theo
mong muốn;
 Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như
nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,…
 Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm;
 Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen;
 Ngoài ra, phương pháp nhân giống in vitro còn giảm được nhiều công sức
chăm sóc, nguồn mẫu dự trữ lâu dài và chiếm ít không gian so với phương pháp
nhân giống truyền thống.
Nhược điểm:
 Dễ xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
được bổ sung vào môi trường nuôi cấy;
 Quá trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng
thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm;
 Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo
ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình;


 Nhân giống trên môi trường bán rắn có giá thành sản xuất vẫn còn cao (do sử
dụng agar) và thời gian cấy chuyền dài. Khi sản xuất ở quy mô công nghiệp, chi phí
cho năng lượng và nhân công vẫn còn rất lớn.
1.1.5. Thành phần các chất khoáng vô cơ:
Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: môi
trường Murashige và Skoog (1962) viết tắc là MS, môi trường Linsmainer và Skoog
(1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974),... Trong số đó, môi

trường MS được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật (Smith và
Gould) và chính Murashige (1974) đã dùng môi trường này để nuôi cấy nhiều loại
cây trồng.
Theo Lê Văn Hòa và cộng sự (1999) khoáng đa lượng rất cần cho cây, có
ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và chúng không gây độc. Các nguyên
tố khoáng đa lượng gồm các nguyên tố được sử dụng ở nồng độ trên 30 mg/l.
Các nguyên tố khoáng vi lượng là các nguyên tố được sử dụng với nồng độ
thấp hơn 30 mg/l. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của
các enzyme (Nguyễn Xuân Linh, 1998).
1.1.5.1. Các nguyên tố đa lượng:
Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng
trong tự nhiên. Trong nhóm này gồm 3 nguyên tố chính: N, P, K.
Nitrogen (N)
Nitrogen là thành phần cấu tạo nên nucleotide, acid amine, protein, diệp lục
và một số hormone thực vật nên nitrogen là nguyên tố dinh dưỡng hàng đầu trong
môi trường nuôi cấy, được cung cấp dưới dạng muối ammononium (NH4+) và dạng
nitrate (NO3-).
Các muối phổ biến dùng cung cấp nguồn nitrate là:
KNO3: Potassium nitrate (14% N)
NH4NO3: Ammonium nitrate (34% N)
NaNO3: Sodium nitrate (16,4% N)
Ca(NO3)2: Calcium nitrate (15,5% N)


Các muối phổ biến dùng cung cấp nguồn ammononium là:
CO(NH2)2: Urea (46% N)
(NH4)2SO4: Ammonium sunfate (22% N)
Phosphosrus (P)
Có tác dụng quan trọng đối với việc phân chia tế bào, tích lũy và chuyển hóa
năng lượng trong quá trình quang hợp, hô hấp, đồng thời là thành phần cấu tạo nên

acid nucleid, protein và nhiều hợp chất có tính sinh học quan trọng.
Dạng phosphorus mô thường hấp thu là H2PO4- và HPO42- có tác dụng như
một hệ đệm làm ổn định pH của môi trường nuôi cấy. Các dạng muối thường gặp:
• (NH4)2HPO4: Diammonium hydrogen phosphate (46% P2O5)
• (NH4)3HPO4.3H2O: Triammonium hydrogen phosphate (15,21% P)
• KH2PO4: Monopotassium phosphate (10,35% P).
Potassium (K)
Potassium tham gia vào việc phân chia tế bào, hợp thành protein và diệp lục
tố, oxy hóa khử muối nitrate, tạo các bó mạch trong cây, giúp cây cứng cáp, chắc,
đứng thẳng, giúp cây ra hoa,…
Trong môi trường nuôi cấy, muối potassium thường được sử dụng là:
KH2PO4: Monopotassium phosphate (40% K2O).
K2SO4: Potassium sulfate (48% K2O).
KNO3: Potassium nitrate (44% K2O).
KCl: Potassium chlorur (60% K2O).
Calcium (Ca)
Tác dụng trọng yếu nhất của calcium là calcium được xem là tín hiệu thứ cấp
trong phản ứng của cây đối với môi trường và hormone. Ngoài ra còn giúp cây tạo
vách tế bào, giúp cây cứng chắc,…
Các muối thường dùng (với nồng độ trung bình 2,57 mmol/l) là:
CaCl2.4H2O: Calcium chlorur
Ca(NO3)2.2H2O: Calcium nitrate


Magnesium (Mg)
Là thành phần của diệp lục tố làm lá cây xanh phát triển, rất nhiều enzyme
cần Mg biểu hiện hoạt tính sinh học của nó.
Hàm lượng Mg2+ trong môi trường nuôi dưỡng tương đối thấp, trung bình
khoảng 1,43 mmol/l.
Muối Magnesium thường dùng là:

MgSO4.7H2O: Magnesium sulphate
MgHPO4: Dimagnesium phosphate
MgCl2.6H2O: Magnesium chloride
Ngoài ra còn có nguyên tố sodium và chlorine (thường được bổ sung với
nồng độ thấp) để điều tiết nồng độ ion các nguyên tố cần thiết khác.
1.1.5.2. Các nguyên tố vi lượng
Mặc dù sử dụng với nồng độ rất ít (không quá 5 mg/l) nhưng nhóm này là
các nguyên tố vô cùng thiết yếu cho tế bào thực vật. Một số nguyên tố vi lượng là:
Mn, Zn, Cu, Bo, Fe, Mo,…
Sắt (Fe)
Là thành phần của diệp lục, giúp cây quang tổng hợp tốt, làm cho lá cây có
màu xanh. Thiếu sắt làm lá cây có màu xanh nhạt, cây không quang hợp được, cây
ngừng phát triển, đầu rễ kém phát triển có thể dùng FeEDTA để cung cấp Fe cho
cây.
Đồng (Cu)
Thiếu đồng dễ làm ngọn lá khô, cây không phát triển, ra chồi nhiều ở dưới
gốc. Lá bạc mất màu xanh và đầu lá đốm trắng rồi héo khô. Dùng CuSO4 để cung
cấp cho cây.
Kẽm (Zn)
Giữ vai trò sinh tổng hợp protein và auxin. Thiếu Zn làm thân ngắn lại, lá
mọc chụm ở đầu. Nguyên nhân là do tưới phân lân quá nhiều để kích thích ra hoa.
Có thể dùng ZnSO4 để cung cấp Zn cho cây đồng thời giảm tưới lân.


Manganse (Mn)
Thiếu Mangan lá vàng nhạt, ở lá già thường có chấm vàng. Dùng MnSO4 để
cung cấp Mn cho cây.
Molydenum (Mo)
Điều hòa tăng trưởng cho cây. Dùng Na2MoO4 để cung cấp Mo cho cây.
1.1.6. Dinh dưỡng hữu cơ

Vitamin
Các vitamin rất cần thiết cho sự phát triển và tăng trưởng của thực vật.
Vitamin thường có chức năng xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Đại đa
số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng số lượng
thấp, không đủ để duy trì sự sinh trưởng của nó nên cần bổ sung từ môi trường nuôi
cấy. Các vitamin thường được dùng trong nuôi cấy mô là thiamine (Vitamin B1),
Acid nicotinic (B3), Pyridoxine (B6) và myo-inositol, B5, B12.
Vitamin được thêm vào môi trường nuôi cấy ở nhiều dạng và nồng độ khác
nhau. Vitamin cần thiết trong các chuỗi phản ứng sinh hóa của cây. Hầu hết các môi
trường nuôi cấy mô thực vật, Thiamine (Vitamin B1) được thêm vào. Linsmaier và
Skoog (1965) xác nhận rằng sau khi bổ sung vitamin vào môi trường MS thì ảnh
hưởng đến sự phát triển của cây. Tầm quan trọng của Thiamine cũng được nhấn
mạnh bởi nhiều nhà nghiên cứu khác.
Vitamin B1 (thiamine) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi
cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzyme xúc tác quá trình oxy hoá khử
cacbon ở acid hữu cơ. Nồng độ thường dùng từ 0,1- 10 mg/l.
Vitamin B6 (piridoxin) tham gia vào thành phần các enzyme khử cacbon và
thay đổi vị trí nhóm amin trong các acidamin. Nồng độ dùng từ 0,1 - 1 mg/l.
Inositol thường được đề cập như là một loại vitamin ảnh hưởng quan trọng
đến quá trình lớn và phát triển của cây. Myo - inositol cần được bổ sung một lượng
khá lớn từ 50 - 500 mg/l và tỏ ra có tác dụng rất rõ đến sự phân chia của mô.
Vitamin có tác dụng thúc đẩy sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong
nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn carbon của môi trường nuôi cấy.


Tuy nhiên, Vitamin không phải là nhân tố chính cho sự phát triển của cây.
Đối với các loại vitamin khác, thật khó để nói tầm quan trọng của chúng. Ảnh
hưởng của Vitamin trong nuôi cấy mô in vitro khác nhau tùy theo loài hoặc cũng có
thể gây hại cho mô.
Các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng hợp

được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng nên phải bổ sung
thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin nhóm B.
Pepton
Pepton là tên gọi chung các sản phẩm chuyển hóa chưa hoàn toàn của protein
có nguồn gốc khác nhau như thịt, casein, gelatin được thủy phân bằng protease hoặc
bằng các acid sau đó làm khô thành dạng bột. Pepton có chứa các chất đạm hữu cơ,
đường, muối khoáng và các vitamin. Pepton tan trong nước, không tan trong ether,
có màu vàng nhạt.
Pepton được sử dụng như là một nguồn nitrogen hữu cơ trong môi trường
nuôi cấy vi sinh vật cho nhiều loại vi khuẩn và nấm. Trong nuôi cấy in vitro, nguồn
nitrogen giúp giữ vai trò tạo lập protein cho cây, giúp hình thành cơ quan, thân, lá,
rễ phát triển, quang tổng hợp mạnh. Việc bổ sung nguồn nitrogen hữu cơ vào môi
trường nuôi cấy in vitro nhằm thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của cây,
đặc biệt là những cây sinh trưởng chậm và khó nhân giống như lan Hồ điệp.
Những nghiên cứu trước đây đã cho thấy những ảnh hưởng tích cực của
pepton lên sự nảy mầm và phát triển của các loại lan. Pepton nâng cao tỷ lệ nảy
mầm và phát triển của PLB ở lan Cattleya (Curtis et al., 1943); Dendrobium
(Alberts, 1953); Vanilla (Bouriquet, 1947).
Bùi Thị Tường Thu và cộng sự (2007) khi nghiên cứu ảnh hưởng của pepton
lên sự phát sinh phôi và tế bào lan Dendrobium đã đưa ra kết quả khi bổ sung 1g/l
pepton vào môi trường VW thì tỷ lệ phôi soma đạt được là 100% trên các mẫu nuôi
cấy.


Pepton đã được chứng minh có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành PLB
lan Dendrobium . Các nghiên cứu cho thấy rằng khi bổ sung 2g/l pepton thì số
lượng PLB đạt được là cao nhất (Kanjilal và Datta, 2008).
1.1.7. Dịch chiết các hợp chất tự nhiên
Bổ sung các hợp chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy in vitro thường được
thực hiện với mục đích thúc đẩy quá trình trao đổi chất của một số cây sinh trưởng

chậm.
Dịch chiết hữu cơ có thể kích thích có hiệu quả qua việc cung cấp các thành
phần dinh dưỡng acid hữu cơ không xác định và các thành phần có tác dụng như
chất kích thích sinh trưởng (Trần Văn Minh, 2004).
Sự bổ sung các hợp chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy in vitro nhằm thúc
đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, đặc biệt là những cây sinh trưởng
chậm và khó nhân giống.
Các nghiên cứu của Pierik và cộng sự (1988), Li và cộng sự (2001), Chyuam
và cộng sự (2010), Songjun và cộng sự (2012, 2013) đều cho thấy, khi bổ sung các
hợp chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy, tỷ lệ tái sinh cây, hệ số nhân chồi của
một số loài cao hơn hẳn môi trường không bổ sung các chất này.
Các hợp chất hữu cơ được dùng phổ biến trong nuôi cấy in vitro như nước
dừa, dịch chiết chuối, cà rốt, khoai tây, pepton và triptone, đây là những nhân tố
đóng vai trò không kém phần quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro. Ngày
càng nhiều các hợp chất hữu cơ khác nhau được phát hiện và bổ sung vào môi
trường nuôi cấy in vitro như mầm ngô, mầm đậu, dịch chiết cà chua, để nâng cao
hiệu quả nhân giống.
Nước dừa
Nước dừa được sử dụng vào nuôi cấy in vitro từ những năm 1941, được ứng
dụng khá rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in vitro. Theo kết quả phân tích
thành phần nước dừa của Tulecke và cộng sự (1990) trong nước dừa có các amino
acid, acid hữu cơ, đường sucrose, glucose, fructose,… các hợp chất có hoạt tính
auxin, cytokinin dạng glycoside với thành phần và hàm lượng rất cân đối.


Trong nuôi cấy in vitro thực vật từ năm 1941, nước dừa đã được sử dụng để
nuôi cấy phôi Datura metel L. và năm 1949 nuôi cấy mô Daucus carota. Nước dừa
thường chứa các acid amin, acid hữu cơ, đường, ARN, ADN. Đặc biệt trong nước
dừa có chứa các hợp chất quan trọng cho nuôi cấy in vitro đó là myo-inositol, các
hợp chất có hoạt tính auxin, các glucose của cytokinin (Pierik, 1987).

Nước dừa được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô lan giúp phôi tăng
trưởng và nảy mầm (Hegarty, 1955; Niimoto và Sagawa, 1961).
Nước dừa giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối
tượng thực vật khó nuôi cấy (Trần Văn Minh. 2004) . Một lít nước dừa có 40 g
carbohydrate, 2-3 g acid amin, 4 g chất khoáng (48 meq potassilum, 2 meq sodium,
45 meq chlorur, 7 meq calcium, 6 meq magnesium…và các yếu tố vi lượng như sắt,
manganese, lithium), vitamin, hầu như không có lipid và có rất ít.
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa
Thành phần

Hàm lượng

Nước

95,5 %

Nitrogen

0,05 %

Acid phosphoric

0,56 %

Potassium

0,25 %

Calcium

0,69 %

Magnesium oxid

0,59 %

Sắt

0,5 g

Chất khô tổng số

4,71 g

Đường khử

0,80 g

Đường tổng số

2,08 g

Tro

0,62 g
(Nguồn: Pandalai, 1958)

Đậu xanh
Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ và Trung Á, phân bố chủ yếu ở các vùng
nhiệt đới và á nhiệt đới, là cây trồng khá quen thuộc ở Châu Á và rất phổ biến ở