Thử nghiệm cố định saccharomyces cerevisiae và pichia anomala trên chất mang PVA alginate và ứng dụng trong lên men thu nhận ethanol từ vỏ cacao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM CỐ ĐỊNH SACCHAROMYCES
CEREVISIAE VÀ PICHIA ANOMALA TRÊN CHẤT
MANG PVA – ALGINATE VÀ ỨNG DỤNG TRONG
LÊN MEN THU NHẬN ETHANOL TỪ VỎ CACAO

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn

: ThS. Trần Thị Tưởng An

Sinh viên thực hiện

: Ngô Lê Hồng Duyên

MSSV: 1211100062

Lớp: 12DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2016

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, đồ án tốt nghiệp “Thử nghiệm cố định
Saccharomyces cerevisiae và Pichia anomala trên chất mang PVA-alginate và
ứng dụng trong lên men thu nhận ethanol từ vỏ cacao” là công trình nghiên cứu
thực sự của cá nhân tôi, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức
và dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và dựa trên sự hướng dẫn khoa học của Th.S
Trần Thị Tưởng An.
Các số liệu sử dụng trong đồ án là trung thực và có nguồn gốc cụ thể, rõ
ràng. Nội dung đồ án có tham khảo và sử dụng các tài liệu thông tin được đăng tải
trên các sách, tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của khóa
luận.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Ngô Lê Hồng Duyên

i


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ
Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học – Môi trường – Thực phẩm đã
tạo điều kiện cho em được thực hiện đồ án này. Em xin cảm ơn toàn thể thầy cô
trong khoa Công nghệ sinh học – Môi trường – Thực phẩm đã tận tình truyền đat
các kiến thức và kỹ năng để em có thể hoàn thành khóa luận này.
Trong suốt khoảng thời gian làm khóa luận tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm
Năng Lượng Sinh Học và Biomass – Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh. Em xin

chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Cô Trần Thị Tưởng An, trường Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh. Cảm ơn
cô đã gợi ý đề tài, tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tại đại học Bách Khoa,
tận tình hướng dẫn chi tiết công việc, luôn theo sát chỉ dẫn, động viên em, hỗ trợ
kinh phí suốt quá trình làm khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh, các chị làm việc trong phòng thí nghiệm
đã nhiệt tình hỗ trợ em trong suốt thời gian làm việc ở đây.
Cảm ơn ba mẹ người đã luôn luôn bên cạnh động viên tinh thần em trong
những lúc em cảm thấy khó khăn nhất.
Cuối cùng, cảm ơn tất cả các bạn trong phòng thí nghiệm những người bạn đã
luôn bên cạnh và giúp đỡ em trong mọi việc.
Mặc dù đã cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất. Song do
buổi đầu mới làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, tiếp cận với thực nghiệm
và máy móc hiện đại cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không
tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong được sự góp của quý thầy cô và các bạn
để kiến thức của em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Ngô Lê Hồng Duyên

ii


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC .............................................................................................................................
i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẲT ......................................................................................
v DANH MỤC BẢNG ...........................................................................................................

vi

DANH

MỤC

HÌNH

..................................................................................................vii

ẢNH
LỜI

MỞ

ĐẦU....................................................................................................................... 1
1.

Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1

2.

Mục tiêu đề tài ........................................................................................................... 2

3.

Nội dung nghiên cứu.................................................................................................. 2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................
3

1.1

Giới thiệu về bioethanol ......................................................................................... 3

1.1.1

Khái niệm........................................................................................................ 3

1.1.2

Các thế hệ bioethanol...................................................................................... 6

Bioethanol thế hệ thứ nhất ..................................................................................... 6
Bioethanol thế hệ thứ hai ....................................................................................... 6
Bioethanol thế hệ thứ ba ........................................................................................ 6
1.2

Quy trình sản xuất ethanol ..................................................................................... 7

1.2.1

Tiền xử lý ........................................................................................................ 8

1.2.2

Thủy phân ..................................................................................................... 10

1.2.3

Lên men ........................................................................................................ 11

1.2.4

Chưng cất, thu hồi bioethanol ....................................................................... 11

1.3

Nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol ............................................................... 13

1.3.1

Một số nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol ............................................ 13

1.3.2

Sản xuất bioethanol sử dụng nguồn nguyên liệu vỏ cacao ........................... 15

1.3.2.1

Giới thiêu về vỏ cacao............................................................................... 15

1.3.2.2

Tình hình sản xuất cacao ở Việt Nam ....................................................... 15

1.4

Cố định tế bào ...................................................................................................... 17

1.4.1

Định nghĩa và các phương pháp cố định....................................................... 17

1.4.2

Ưu điểm & nhược điểm ................................................................................ 20

1.4.3

Chất mang .................................................................................................... 22

1.4.4

Saccharomyces & Pichia .............................................................................. 26

1.4.5

Một số nghiên cứu về cố định tế bào ............................................................ 28

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................
32
2.1

Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ................................................................. 32
3


2.1.1

Đồ án tốt nghiệp

Thời gian nghiên cứu .................................................................................... 32

2.1.2

Địa điểm nghiên cứu ..................................................................................... 32

4


Đồ án tốt nghiệp

2.1.3

Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 32

2.1.4

Nội dung nghiên cứu..................................................................................... 32

2.2

Vật liệu và thiết bị ................................................................................................ 32

2.2.1

Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu........................................................ 32

2.2.2

Hóa chất sử dụng .......................................................................................... 33

2.2.3

Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................... 34

2.3

Phương pháp nghiên cứu...................................................................................... 35

2.3.1

Sơ đồ bố trí thí nghiệm ................................................................................. 35

2.3.2

Phương pháp bố trí thí nghiệm ..................................................................... 36

2.4

Phương pháp phân tích......................................................................................... 39

2.4.1

Phương pháp Vi sinh..................................................................................... 39

2.4.2

Phương pháp sinh hóa ................................................................................... 42

2.4.3

Xử lý số liệu.................................................................................................. 43

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................................ 44
3.1

Quá trình cố định tế bào ....................................................................................... 44

3.1.1

Cảm quan nồng độ sodium alginate.............................................................. 44

3.1.2

Ảnh hưởng của nồng độ PVA....................................................................... 45

3.2 Kết quả sử dụng chế phẩm S.cerevisia và P.anomala cố định trên PVA để lên
men thu bioethanol từ vỏ cacao ...................................................................................... 48
3.2.1

Ảnh hưởng của thời gian (giờ) lên men ........................................................ 48

3.2.2

Ảnh hưởng của pH ........................................................................................ 52

3.2.3

Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men ...................................................................... 54

3.3 Khả năng tái sử dụng chế phẩm lên men S.cerevisiae và P.anomala cố định trên
gel PVA để lên men ........................................................................................................
57
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................
61
4.1

Kết luận ................................................................................................................ 61

4.2

Kiến nghị .............................................................................................................. 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 62
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT................................................................................................. 62
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI ............................................................................................. 62
TÀI LIỆU TỪ INTERNET............................................................................................. 63

5


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẲT

3
d
lic
P
o

l

P

S Sa
c e
e
Sa
D
A
Sa
D
B
Se
h
s
S
i
m
S
m
l

6


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Đặc tính hóa lý của ethanol

Bảng 1.2 Thông số của bioethanol so với xăng
Bảng 1.3 Các phương pháp tiền xử lý
Bảng 1.4 Các kỹ thuật lên men thu nhận bioethanol

Bảng 2.1 Thông tin thiết bị sử dụng trong quá trình nguyên cứu
Bảng 2.2 Các nghiệm thức khảo sát khả năng cố định tế bào của Saccharomyces
cerevisiae
Bảng 2.3 Các nghiệm thức khảo sát khả năng cố định tế bào của Pichia anomala
Bảng 2.4 Bố trí các nghiệm thức thí nghiệm

7


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo ethanol
Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa sinh khối lignocellulose thành bioethanol
Hình 1.3 Trái cacao
Hinh 1.4 Công thức cấu tạo của phân tử polyvinyl alcohol
Hinh 1.5 Công thức cấu tạo của phân tử polyvinyl acetate
Hình 1.6 Saccharomyces cereviciae
Hình 1.7 Pichia anomala

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.1. Mật độ tế bào cố định trên PVA
Hình 3.2. Hiệu suất cố định tế bào
Hình 3.3. Mật độ tế bào cố định trên PVA
Hình 3.4. Hiệu suất cố định tế bào

Hình 3.5 Sự thay đổi các thành phần theo thời gian lên men
Hình 3.6 Sự thay đổi các thành phần theo pH trong môi trường lên
men.
Hình 3.7 Sự thay đổi các thành phần theo tỷ lệ nấm men cố định bổ sung vào môi
trường lên men.
Hình 3.8 Sự thay đổi các thành phần qua số lần tái sử dụng.

vii


Đồ án tốt nghiệp

LỜI MỞ ĐẦU
1.

Đặt vấn đề
Như chúng ta đã biết, nền kinh tế thế giới hiện nay và trong tương lai phụ

thuộc rất nhiều vào nhiên liệu hóa thạch, mặc dù nguồn tài nguyên này trong đó có
dầu thô là tác nhân gây ô nhiễm môi trường rất lớn và được báo động là đang đi
vào giai đoạn cạn kiệt như một sự tất yếu khi tài nguyên tự nhiên hữu hạn bị khai
thác tối đa.
Bên cạnh đó, nhu cầu bảo vệ môi trường sống trên trái đất được trong sạch
dài lâu cũng như cần phát triển kinh tế với một tốc độ cao và trên quy mô rộng làm
cho an ninh năng lượng toàn cầu ngày càng bị đe dọa nghiêm trọng. Do đó, nhiệm
vụ tìm kiếm nguồn thay thế cho nhiên liệu hóa thạch đã được đặt ra trong gần nửa
thế kỷ qua và ngày càng trở nên cấp thiết.
Bioethanol là nguồn nhiên liệu đầy hứa hẹn trong tương lai thay thế cho
nguồn nhiên liệu hóa thạch, bởi nó là nguồn nhiên liệu có thể tái tạo. Bioethanol
tồn tại ở dạng lỏng có thể được sử dụng làm nguồn nhiên liệu mới cho tương lai.

Tuy nhiên, những sản phẩm bioethanol có nguồn gốc từ tinh bột dễ bị biến động do
tinh bột là nguồn lương thực của con người. Việc sử dụng tinh bột hoặc nguyên
liệu giàu đường sẽ lập tức đẩy giá của lương thực và bioethanol tăng cao hơn so với
sản xuất bằng con đường hóa học. Trong khi đó, giá của vật liệu phải chi trả 40–
75% tổng chi phí của sản xuất ethanol. Vì vậy, việc thay thế nguồn nguyên liệu để
sản xuất bioethanol là vô cùng cần thiết. Các nguồn nguyên liệu là các phụ phẩm
của ngành nông nghiệp như rơm rạ, bã mía, vỏ cacao…đang là sự lựa chọn hàng
đầu hiện nay, việc sản xuất bioethanol từ các phụ phẩm nông nghiệp giúp giảm giá
thành bioethanol, hạn chế rác thải nông nghiệp, tăng năng suất lao động của người
nông dân, ….
Bioethanol thường được sản xuất bằng nấm men tự do, tuy nhiên lên men
bằng nấm men tự do gặp một số vấn đề như thời gian lên men dài, năng suất lên
men thấp, tiêu tốn khá nhiều năng lượng để tách nấm men sau quá trình lên men.
Để khắc phục, ta dùng phương pháp cố định nấm men với nhiều ưu điểm như: tốc
1


Đồ án tốt nghiệp

độ sử dụng glucose, tốc độ sinh tổng hợp ethanol cao hơn dù diện tích bề mặt dùng
để vận chuyển chất dinh dưỡng nhỏ hơn, và khả năng tái sử dụng nấm men cố định
giúp giảm thời gian nuôi cấy và thời gian lên men, ổn định hoạt tính của nấm men.
Bên cạnh đó, vỏ cacao là nguồn phế phẩm nông nghiệp giàu lignocellulose
nên có thể sử dụng để lên men tạo bioethanol rất hiệu quả, tận dụng được nguồn vỏ
phế phẩm. Với sản lượng hằng năm khoảng 1-2 tấn/ha, lượng vỏ thải ra là gánh
nặng rất lớn đối với môi trường. Bên cạnh đó, cây cacao cho thu hoạch gần như
quanh năm nên nguồn cung nguyên liệu khá thuận lợi. Nguồn vỏ ca cao khổng lồ
bị bỏ phí bấy lâu nay có thể được tận dụng rất hiệu quả để thử nghiệm lên men
ethanol sinh học.
Do vậy, đề tài “Thử nghiệm cố định Saccharomyces cerevisiae & Pichia

anomala trên chất mang PVA-alginate và ứng dụng trong lên men thu nhận
ethanol từ vỏ ca cao” thực hiện để khảo sát lên men ethanol bằng phương pháp cố
định tế bào và ứng dụng nguồn nguyên liệu phế phẩm nông nghiệp là vỏ trái
cacao.
2.

Mục tiêu đề tài
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae và Pichia anomala sử dụng chất mang PVA-alginate,
ứng dụng trong lên men ethanol từ vỏ cacao.
3.

Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu đề tài, tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:
- Khảo sát chất mang PVA-alginate để cố định S. cerevisiae và P.anomala
- Khảo sát các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men khi sử dụng chế

phẩm lên men S.cerevisiae và P.anomala cố định trên chất mang PVA-alginate.
- Thử nghiệm khả năng sử dụng chế phẩm S.cerevisiae và P.anomala cố định
trên chất mang PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về bioethanol
1.1.1

Khái niệm

Bioethanol hay còn gọi là ethanol sinh học, là một dạng ethanol (hình 2.1)
không tổng hợp bằng con đường hóa học mà được sản xuất bởi các vi sinh vật
thông qua quá trình lên men đường từ các vật liệu sinh học có chứa đường hay các
vật liệu có thể chuyển đổi thành đường như tinh bột, cellulose, lignocellulose,
thường là từ các loại ngũ cốc như ngô, lúa mì, đậu tương hoặc từ vỏ cây, bã mía,...
nhờ tác dụng của enzyme.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo ethanol (wikipedia)
Quá trình lên men đường tạo thành ethanol và carbon dioxide:
C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2
Ethanol dùng làm nhiên liệu cho động cơ đốt trong sẽ bị đốt cháy hòa trộn
với oxygen trong động cơ tạo ra carbon dioxide, nước và nhiệt lượng:
C2H6O + 3O2 → 2CO2 + 3H2O+ nhiệt lượng
Tổng hợp 2 công thức trên như sau:
C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O+ nhiệt.
Nhiệt lượng sinh ra trong quá trình dùng để chạy máy. CO2 được sinh ra
trong quá trình này là carbon trung tính (Carbon neutral) khác với loại khí carbon
được tạo thành sau khi đốt các nhiên liệu hóa thạch. Carbon được tạo ra sau khi đốt
các nhiên liệu hóa thạch không nằm trong chu trình carbon nên việc đốt chúng sẽ
làm tăng hàm lượng carbon trong không khí gây hiệu ứng nhà kính.
3


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.1 Đặc tính hóa lý của ethanol
C C2

ô H
K 46
h ,0
H C
ìn hấ
Đ H
ộ òa
K 0,
h 78
N 78
hi ,5
N hi 11
Đ 12
iể ,8
Đ 42
iể 5o
G T
iớ hấ
Á 50
p m
G 29
iá .8
G 21
iá .0
N 60
hi K
Đ 15
ộ ,9
Đ 1.
ộ 20

C 1,
hỉ 36
C 99
hỉ
(nguồn: Graeme M.Walker)
4


Đồ án tốt nghiệp

Quá trình sản xuất rượu ethanol làm nhiên liệu sinh học sạch gồm có 3 giai
đoạn:
- Lên men đường với chất men (microbial yeast).
- Cất rượu: Rượu ethanol dùng để làm nhiên liệu cho xe ô tô phải chứa rất ít
nước bằng phương pháp chưng cất rượu, nhưng rượu thuần chỉ đạt đến giới
hạn 95-96%. Loại rượu này có thể dùng chạy máy, nhưng không thể hòa trộn
với xăng dầu.
- Làm khô: Đây là phương pháp làm khô rượu ethanol bằng cách dùng sàng
phân tử ZEOCHEM Z3-03, hoặc thêm chất hydrocarbon benzene hoặc dùng
chất calcium oxide như là chất làm khô để khử nước trong rượu.
Ethanol thu được sau quá trình chưng cất ngũ cốc lên men có dạng hỗn hợp
gồm nước và ethanol, cần phải tách nước để lấy ethanol khan trước khi trộn với
xăng. Cũng có thể dùng ethanol chưa khan nước (hydrous ethanol) nhưng chỉ cho
các loại động cơ xe có chế tạo tương thích.
Bioethanol có thể được sử dụng như một nguyên liệu lỏng trong động cơ đốt
trong do nó có chỉ số octane cao và tính chất hóa lý tương đương với xăng (bảng
2.2). Chỉ số octane càng cao thì chỉ số chống gõ (anti-knocking index) tránh được
tiếng gõ làm tổn thương lòng máy. Có thể sử dụng bioethanol nguyên chất hoặc
pha trộn với xăng dầu. Nếu sử dụng E10 (10% ethanol) thì không cần phải thay đổi
kết cấu xe.

Bảng 1.2 Thông số của bioethanol so với xăng
T Đ
ộ
ỷ
n
h
t ớt

Đ N N
iể
ă ă
m
n n
ch
ớ g g
p
r
X 0, 0, < l4 l3
ăn 7 6 2 2, 2,

C N
hi
h
ên
ỉ
li
s
ệ
ố9 1
2

Bi 0, 1, < 2 2 1 0,
oe 7 5 2 6, 1, 2 65
(nguồn: paul 2006)
5


1.1.2

Các thế hệ bioethanol

Hiện nay dựa trên nguồn nguyên liệu sản xuất mà nguời ta chia bioethanol
thành các thế hệ khác nhau. Bioethanol duợc chia thành 3 thế hệ chính:
Bioethanol thế hệ thứ nhất
Bioethanol thế hệ thứ nhất được sản xuất từ đuờng bằng quá trình lên men
các loại đường có nguồn gốc từ lúa mì, ngô, củ cải đường, mía, mật rỉ đuờng.
Hạn chế của việc sản xuất bioethanol thế hệ thứ nhất là tạo gánh nặng cho
sản xuất nông nghiệp. Ðất nông nghiệp ngày một giảm, không thể cung cấp đủ cho
việc sản xuất bioethanol mà không ảnh hưởng đến nguồn cung cấp thực phẩm
trong nước và bioethanol được tao ra cạnh tranh chi phí với các nguồn năng lượng
hóa thạch.
Bioethanol thế hệ thứ hai
Ðể khắc phục nhược điểm của bioethanol thế hệ thứ nhất, người ta đã sử
dụng nguồn nguyên liệu phế thải hay nguồn nguyên liệu không phải là thực phẩm
để có thể cung cấp nguyên liệu lâu dài, chi phí thấp và có lợi ích cho môi truờng.
Nguồn cung cấp chủ yếu là thân cây, rơm rạ cũng như các loại cây trồng
không phải cây lương thực như cỏ, jatropha… hay các phế phẩm trong sản xuất
nông nghiệp như vỏ chuối, vỏ cacao… với hàm lượng lignocellulose cao.
Biothanol thế hệ thứ hai được sản xuất từ sinh khối lignocellulose (bộ khung
tạo nên tính chất “gỗ” của thực vật) đang trở thành xu hướng hiện nay.Tuy nhiên,

quá trình tiền xử lý lại tiêu tốn khá nhiều chi phí.
Bioethanol thế hệ thứ ba
Là những nhiên liệu (dầu thực vật, biodiesel, bioethanol, biogas,
biomethanol, biobutanol và nhiên liệu sinh học khác) trong đó có bioethanol được
sản xuất từ tảo.
Ðặc điểm nổi bật của nhiên liệu từ tảo là không ảnh hưởng đến nguồn nước
ngọt, có thể sản xuất bằng cách sử dụng nước biển và nước thải, tương đối vô hại


cho môi trường. Nhưng chi phí cho các dự án sản xuất rất cao nên chỉ dừng ở việc
thử nghiệm mà chưa ứng dụng trong quy mô sản xuất lớn.
Cho đến nay, sản xuất cồn sinh học ở Việt Nam vẫn sử dụng nguồn nguyên
liệu từ đường (mía, rỉ đường) và tinh bột (sắn).
1.2 Quy trình sản xuất ethanol
Có rất nhiều nguồn nguyên liệu để sản xuất bioethanol trong đó nguồn
nguyên liệu lignocellulose là nguồn nguyên liệu phong phú nhất. Sau đây là quy
trình sản xuất bioethanol từ nguồn lignocellulose được thể hiện qua sơ đồ hình 2.2.

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa sinh khối (Nguồn: Bioresource Technology, 2009)


Quá trình lên men ethanol từ các nguồn nguyên liệu lignocellulose cũng
giống như từ tinh bột hay rỉ đường. Bao gồm bốn bước cơ bản:
-

Tiền xử lý nguyên liệu.

-

Thủy phân nguyên liệu.

-

Lên men.

-

Tinh chế sản phẩm (chưng cất, tách nước, bốc hơi, tách lỏng rắn) tùy
vào nồng độ cồn mà có phương pháp tinh chế khác nhau. Quá trình này
phụ thuộc nhiều vào công nghệ hóa học nên trong giới hạn của đề tài xin
được không trình bày.

1.2.1

Tiền xử lý

Trong sinh khối lignocellulose thì cellulose là thành phần chính để lên men
bioethanol.
Cellulose và hemicellulose được bảo vệ bởi lớp lignin dày đặc chống lại sự
thủy phân của enzyme.Vì vậy, cần thiết phải có một bước tiền xử lý để phá vỡ
lignin để lộ cellulose và hemicellulose cho quá trình thủy phân của enzyme được
dễ dàng. Tiền xử lý nhằm mục đích giảm kết tinh của cellulose, tăng diện tích bề
mặt sinh khối, loại bỏ hemicellulose, và phá vỡ lignin. Tiền xử lý làm cho cellulose
dễ tiếp cận hơn với các enzyme để chuyển đổi polyme carbohydrate thành đường
lên men có thể đạt được nhanh hơn, dẫn đến yêu cầu enzyme sử dụng sẽ giảm, chi
phí cũng sẽ giảm. Quá trình tiền xử lý phải đáp ứng những yêu cầu:
•

Nâng cao được hiệu quả của quá trình thủy phân tiếp theo.

•

Hạn chế sự mất mát của hydrocarbon.

•

Tránh sự tạo thành các sản phẩm phụ làm ức chế quá trình thủy phân và
quá trình lên men.

•

Phá vỡ được lớp bao bọc của lignin và hemicellulose với cellulose.

•

Tiết kiệm được chi phí.
Vì các nguyên liệu lignocellulose khác nhau có các đặc tính lý hóa khác

nhau, nên cần áp dụng các công nghệ tiền xử lý phù hợp với các đặc điểm của từng


nguyên liệu sinh khối lignocellulose. Tiền xử lý bao gồm các phương pháp cơ học,
hóa lý, hóa học, sinh học,...được tóm tắt trong bảng 2.3.
Bảng 1.3. Các phương pháp tiền xử lý
P T
N T
h
á g L
ư
ơ c u T

T R Hi
ác ơ de
đ m n
ộn rạ o
g
V cơ M et
ật h ản al,
lý ọc h 2
0
gỗ 0
N cứ
9
ổ ng
h , G
A
X
ci T
ue
d h
bi
â n
g
n
Z
D
ha
H u
o
ó
c

et
a n
â al,
h g
ọ
y 2
c
0
m
14
n
ô
g Ja
i
C
Si Vi
Pa
n si á tel
h n c et


1.2.2

Thủy phân

Sau quá trình tiền xử lý, cellulose và hemicellulose sẽ bị thủy phân thành
các đường đơn (hexose và pentose). Ở đây, ta quan tâm nhiều đến sự thủy phân
cellulose, do nó là thành phần chính trong sinh khối lignocellulose. Phương trình
phản ứng tổng quát (PT2):
(C5H10O5)n + nH2O →nC6H12O6

(PT2)

Dùng acid hoặc enzyme để thủy phân cellulose.
2.3.3.2.1 Thủy phân bằng acid
Vào cuối thế kỉ 19 và đầu thế kỉ 20, quá trình thủy phân được thực hiện bởi
phản ứng giữa cellulose với acid. Acid loãng được sử dụng dưới điều kiện nhiệt độ
cao và áp suất cao, còn acid đậm đặc được sử dụng ở nhiệt độ thấp và áp suất khí
quyển. Quá trình thủy phân bằng acid loãng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất
cao dẫn đến sự tạo thành các chất độc hại có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình
lên men như các acid hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất furan và các
hợp chất vô cơ .
2.3.3.2.2 Thủy phân bằng enzyme
Các mắt xích của cellulose có thể bị phân cắt thành các phân tử đường
glucose riêng lẻ bằng cellulase. Cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thuỷ
phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose tạo
ra sản phẩm glucose. Nguồn thu cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật (nấm,vi
khuẩn). Nhiều loài nấm như Trichoderma, Penicillium, Aspergillus, và T.
emersonii có thể sản sinh ra một số lượng lớn cellulase và hemicellulase ngoại bào.
Vật liệu lignocellulose bị thủy phân bằng enzyme ở điều kiện ôn hòa (50oC và
pH~5), cho phép phân cắt cellulose và hemicellulose một cách hiệu quả mà không
hình thành nên các sản phẩm phụ có thể ức chế hoạt động của enzyme.
Quá trình thủy phân bằng enzyme bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như : cấu trúc
nguyên liệu, nhiệt độ , pH, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, ảnh hưởng của các


chất kìm hãm. Mỗi yếu tố đều có sự ảnh hưởng nhất định, tuy nhiên yếu tố nhiệt
độ và pH là ảnh hưởng mạnh nhất .
1.2.3

Lên men

Trong quá trình lên men, các sản phẩm của quá trình thủy phân bao gồm
đường hexose (glucose, mannose và galactose) và pentose (xylose và arabinose) sẽ
được lên men thành ethanol nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae, tổ hợp nhiều
loại nấm men hoặc vi khuẩn (Zymomonas spp).
Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử diễn ra trong cơ thể
sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme gọi là quá trình oxy hóa sinh học.
Có rất nhiều phương pháp lên men để tạo bioethanol, bước cuối để biến đổi
sinh khối lignocellulose thành ethanol là thủy phân và lên men có thể được thực
hiện một cách độc lập (SHF), đồng thời (SSF), hay đồng thời kết hợp nhiều chủng
vi sinh vật (SSCF).
Các phương pháp lên men bioethanol được tóm tắt trong bảng 1.4.
1.2.4

Chưng cất, thu hồi bioethanol

Bioethanol cần phải được tách chiết ra khỏi dịch lên men và được tinh chế
thì mới có thể sử dụng. Thu hồi ethanol từ dịch lên men bằng quá trình chưng cất
hoặc kết hợp quá trình chưng cất với quá trình hấp phụ. Để thu cồn tuyệt đối người
ta có thể dùng các phương pháp sau:
•
•

Chưng phân tử, chưng trích ly.
Hấp phụ rây phân tử.

•

Dùng Na2SO4, CaSO4, CaCO3, CuSO4 khan để hấp phụ nước.

•

Thẩm thấu qua màng lọc.

•

Chưng cất và thẩm thấu qua màng.
Giai đoạn này phụ thuộc vào các kỹ thuật, máy móc và quá trình thiết bị nên

trong giới hạn đề tài này không nghiên cứu.


Bảng 1.4. Các kỹ thuật lên men thu nhận bioethanol
Phương pháp

Nguyên tắc

Ưu điểm

Nhược điểm

• Ức chế hoạt tính
quá • Thủy phân và lên
enzyme bởi sản phẩm
men riêng rẽ
trình gồm hai men được thực hiện
cuối.
trong điều kiện tối ưu
pha

tách
biệt,
(separate hydrolysis
của mỗi quá trình, • Thời gian thủy phân
thủy
phân
and fermentation –
không phụ thuộc vào dài nhiễm khuẩn rất cao.
nguyên
liệu
và
SHF)
nhau.
lên men glucose
• Ứng dụng quy mô
tạo ethanol.
công nghiệp.
• Không thể tái sử dụng
Thủy phân và lên Là

một

phải nấm men vì nó ở trạng
tách glucose khỏi cơ thái hỗn hợp của dịch sau
chất
lignocellulose lên men.
tránh được thất thoát • Ethanol tạo thành sẽ

Thủy phân và lên Là quá trình lên • Không
men

đồng

thời men đồng thời

(Simultaneous

với thủy phân

Saccharification

cơ chất.

and Fermentation-

glucose.

SSF)

•

Thời

cần

quay lại ức chế cellulase
gian

lên Ethanol thu được không

men ngắn tránh được cao.
hiện tượng tạp nhiễm.
• Sản phẩm

Thủy phân và lên

Là quá trình lên

men đồng thời kết
hợp các giống vi

men kết hợp với hemicellulose sau tiền
các giống vi xử lý không cần tách

sinh vật

sinh vật diễn ra

khỏi thành phần sợi

(Simultaneous

đồng thời với

cellulose.

saccharification and quá trình đường
cofermentationSSCF)

hóa cơ chất.

• Nhiệt độ của quá trình
thủy phân bằng enzyme
và lên men ethanol khác
nhau đáng kể , làm cho
việc tối ưu hóa đồng thời
hai hoạt động rất khó.


1.3 Nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol
1.3.1

Một số nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol

Công nghệ sản xuất bioethanol gồm 3 bước chính:
Tinh bột, cellulose → glucose → ethanol
Dựa vào 3 bước đơn giản ta có các nguồn nguyên liệu sản xuất:
-

Ethanol được sản xuất từ đường
Đây là cách nhanh chóng và dễ dàng xử lý nguyên liệu đơn giản, nấm men

sử dụng đường trong điều kiện kỵ khí… nấm men tiết ra các enzyme thủy phân
đường (C6H12O6) tạo ra một số sản phẩm bao gồm acid lactic, hydrogen, carbon
dioxide (CO2), và ethanol (C2H5OH).
-

Ethanol sản xuất từ tinh bột
Sản xuất ethanol từ nguyên liệu tinh bột (như bắp, lúa mì, và sắn) có bổ

sung nước. Tinh bột đầu tiên phải được thủy phân thành các loại đường đơn. Qua
trình này được gọi là saccharification, đòi hỏi nhiều năng lượng hơn và làm tăng
chi phí sản xuất. Nhưng do nguyên liệu dồi dào nên hiện đang là quy trình sản xuất
công nghiệp.
-

Ethanol sản xuất từ Cellulose
Nguyên liệu vô tận, nhưng enzyme để thủy phân chúng còn đắt đỏ, quá trình

thủy phân cũng khó khăn vì vậy làm tăng giá thành, nhưng đây là hướng nghiên
cứu của nhiều nhà khoa học, vì nếu thành công sẽ cho hiệu quả kinh tế cao, không
đe dọa an ninh lương thực thế giới.
Xuất phát từ điều kiện Việt Nam là một nuớc nông nghiệp có sản phẩm
nông nghiệp rất phong phú nên có thể sản xuất ethanol từ các nguồn nguyên liệu
khác nhau trong đó lignocellulose là nguồn nguyên liệu phong phú nhất.
Các loại cây trồng như liễu, bạch dương, bạch đàn..., các phế phẩm nông
nghiệp (rơm, bã mía, fruit watse), các phế thải của công nghiệp gỗ, gỗ thải đều
thích hợp để làm nguyên liệu sản xuất bioethanol.


Cứ khoảng 2-4 tấn vật liệu gỗ khô hoặc cỏ khô đã có thể cho 1 tấn
bioethanol Nguyên nhân khiến nguời ta chuyển sang sản xuất bioethanol từ sinh
khối lignocellulose là vì các nguyên liệu này sẵn có và rẻ tiền hơn so với các loại
tinh bột ngũ cốc hoặc cây trồng khác, đặc biệt là với những nguồn chất thải hầu
như không có giá trị kinh tế nên giúp tiết kiệm chi phí nguyên liệu, tuy nhiên quá
trình chuyển hóa các vật liệu này sẽ khó khăn hơn.
Nguyên liệu chứa lignocellulose khác nhau có thành phần cấu tạo không
giống nhau nhưng về cơ bản chúng được cấu tạo từ 3 hợp chất cellulose,
hemicellulose, lignin. Các thành phần cấu tạo nên lignocellulose (cellulose,
hemicellulose, lignin) là các đối tượng khó bị phân hủy. Tính khó phân hủy gia

tăng lên nhiều lần khi chúng liên kết với nhau và với các thành phần khác nữa tạo
thành một thể cấu trúc chặt chẽ và phức tạp.
Các vi sợi cellulose, lignin, hemicellulose được sắp xếp theo những nguyên
tắc nhất định để hình thành nên cấu trúc vi sợi. Với cấu trúc nhiều lớp gồm nhiều
thành phần có bản chất hóa học khác nhau, lignocellulose có độ bền vật lý cao, rất
khó xâm nhập đối với các vi sinh vật và enzyme. Hơn nữa để phân hủy bất cứ
thành phần nào của phức hợp một cách hiệu quả và triệt để cần phải tác động đến
nhiều thành phần khác. Ví dụ, để phân giải lignocellulose thì cần đồng thời tác
động lignin, cellulose và hemicellulose.
Cellulose chiếm 40-60% trọng lượng khô. Công thức phân tử (C6H10O5)n.
Là thành phần cấu tạo chủ yếu của màng tế bào thực vật và là hợp chất chính của
nguyên liệu chứa cellulose để sản xuất ethanol. Nguyên liệu càng giàu cellulose thì
sản xuất ethanol càng đạt hiệu quả cao.
Hemicellulose chiếm 20-40% trọng lượng khô, dễ bị thủy phân hơn so với
cellulose. Khi thủy phân đến cùng, hemicellulose tạo ra các monosaccaride chủ yếu
là hexose, pentose. Trong đó hexose có khả năng lên men tạo ethanol còn pentose
không có khả năng này.
Lignin chiếm 10-25% trọng lượng khô, lignin là một polyphenol có cấu trúc
mở. Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào


thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose. Rất khó để có thể
tách lignin ra hoàn toàn trong quá trình sản xuất ethanol từ cellulose và nó hoàn
toàn không bị thủy phân để tạo các hợp chất có khả năng lên men tạo ethanol. Vì
vậy, lignin là thành phần không mong muốn trong quá trình sản xuất ethanol từ
cellulose.
1.3.2

Sản xuất bioethanol sử dụng nguồn nguyên liệu vỏ cacao

1.3.2.1 Giới thiêu về vỏ cacao
-

Tên khoa học: Musa Paradisiaca

-

Giới: Plantae

-

Ngành: Magnoliophyta

-

Lớp: Zingiberiadae

-

Bộ: Zingiberales

-

Họ: Musaceae

-

Chi: Musa

Hình 1.3. Trái cacao (Nguồn: navitasnaturals)

1.3.2.2 Tình hình sản xuất cacao ở Việt Nam
Theo các nhà chuyên môn, sản xuất ca cao của Việt Nam đang có nhiều lợi
thế và cơ hội như chất lượng tốt, nhu cầu tiêu thụ trên thế giới cao, đặc biệt là châu
Á.


Ông Lương Văn Tự, Chủ tịch Vicofa cho biết, tính đến tháng 11/2013, diện
tích cacao cả nước đạt 22.110 ha. Trong đó, có nhiều tỉnh hiện có diện tích trên
1.000 ha như Bến Tre 7.342 ha; Bà Rịa-Vũng Tàu 2.787 ha; Tiền Giang 2.578 ha;
Đắk Lắk 2.554 ha; Bình Phước 1.310 ha; Đồng Nai 1.015 ha; Lâm Đồng 1.700 ha;
Vĩnh Long 1.244 ha… Mục tiêu đến năm 2015, diện tích cacao cả nước sẽ đạt
60.000 ha và được nâng lên 80.000 ha vào năm 2020.
Từ năm 2006-2010: Trung tâm Khuyến nông Khuyến ngư đã phối hợp với
các địa phương triển khai được gần 1.000 ha, với tổng kinh phí là 4.466 triệu đồng
xây dựng mô hình trồng thâm canh ca cao ,kinh phí khuyến nông dành cho mô hình
thâm canh ca cao ngày càng tăng (cụ thể năm 2009 là 1,2 tỷ đồng; năm 2010 là
2,170 tỷ đồng). Mô hình trồng thâm canh cacao đã giúp cho người nông dân thay
đổi tập quán canh tác lạc hậu bằng những kỹ thuật sản xuất ca cao tiên tiến (giống,
thâm canh tổng hợp, tưới nước tiết kiệm, sử dụng phân bón sinh học....) đang được
áp dụng rộng rãi trong nước và thế giới nhằm nâng cao năng suất, chất lượng. Năng
suất bình quân của mô hình trình diễn đạt 2 tấn hạt/ha có nơi đạt 2,5 tấn hạt/ha
(trồng 2000- Bù Đăng Bình Phước), năng suất của mô hình hết thời kỳ kiến thiết cơ
bản (KTCB) đạt 500 đến 1000 kg hạt khô/ha (năm 2005).
Đã có nhiều điển hình thâm canh cacao tốt ở các tỉnh, mô hình cacao hữu cơ
ở Bà Rịa Vũng Tàu. Đào tạo, tập huấn cho khoảng 7.500 lượt người về kỹ thuật
trồng thâm canh cây cacao. Tổ chức diễn đàn công nghệ về cacao tại Bến Tre;
cacao trồng xen trong vườn điều tại Bình Phước. Thông tin tuyên truyền: đã hoàn
thiện nội dung cuốn sách “Kỹ thuật trồng cây cacao” và đã phát hành 1.200 cuốn
sách “Trồng thâm canh cacao” đến các tỉnh có trồng cacao. Năm 2011 sẽ phát hành
tiếp 1.000 cuốn nữa. Thiết lập trên trang Web Khuyến nông chuyên mục. Ca cao

Việt Nam nhằm cập nhật thông về kỹ thuật, kinh tế, giá cả cacao trên thế giới cũng
như trong nước (WCF).