Tạo hạt nano từ chitosan, ứng dụng sản xuất thuốc bảo vệ thực vật và thửñộc tính trên sâu khoang

BỘ GIÁO DỤC VÀ đÀO TẠO
TRƯỜNG đẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

đỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TẠO HẠT NANO TỪ CHITOSAN, ỨNG DỤNG SẢN
XUẤT THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT VÀ THỬ đỘC TÍNH
TRÊN SÂU KHOANG

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: THỰC PHẨM

Giảng viên hướng dẫn : CN. đỗ Thị Tuyến
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151110313

: Võ Phùng Tuyết Thanh
Lớp: 11DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2015


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến quý thầy, cô khoa Công nghệ sinh
học – Thực phẩm – Môi trường ñã tận tình chỉ dạy và truyền ñạt những kiến thức và kinh
nghiệm quý báu trong suốt thời gian tôi học tập tại trường đại học Công Nghệ TP. Hồ

Chí Minh. đó là những hành trang quý giá giúp tôi bước vào ñời hòa nhập tốt vào xã hội.
Và tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc ñến cô đỗ Thị Tuyến – người ñã tận tình hướng
dẫn tôi trong quá trình làm thí nghiệm và viết ñồ án.
đồng thời tôi chân thành cảm ơn ñến ban lãnh ñạo Viện Sinh học Nhiệt ñới ñã tạo
mọi ñiều kiện ñể tôi có thể thực hiện tốt ñược ñồ án, sự ủng hộ và ñộng viên của bạn bè
và gia ñình trong quá trình thực hiện ñồ án.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 08 năm 2015

Võ Phùng Tuyết Thanh


LỜI CAM đOAN
Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong bản này là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất kì công trình nào
khác.

Võ Phùng Tuyết Thanh


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn
Lời cam ñoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng, sơ ñồ và ñồ thị
Danh mục hình
Mở ñầu

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan tài liệu về chitosan và nano chitosan

4

1.1.1. Chitosan

4

1.1.2. Nano chitosan

8

1.2. Tổng quan về dầu neem

13

1.2.1. Nguồn nguyên vật liệu

13

1.2.2. Phương pháp tách chiết dầu neem

13

1.2.3. Các nhóm hoạt chất của dầu neem

13

1.2.4. Cơ chế tác ñộng của azadirachtin lên côn trùng

15

1.2.5. Mối tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc

18

1.2.6. Một số nghiên cứu tạo công thức thuốc BVTV từ hạt neem

18

1.2.7. Một số ứng dụng của neem

21

1.2.8. Tình hình nghiên cứu cây neem ở Việt Nam

23

1.3. Sơ lược về vi nhũ tương

25

1.3.1. Giới thiệu

25

1.3.2. Các loại cấu trúc vi nhũ tương

25


1.3.3. Ưu và nhược ñiểm của sản phẩm vi nhũ tương

26

1.3.4. Thành phần cơ bản của vi nhũ tương

27

1.4. Sơ lược về sâu khoang

28

1.4.1. Giới thiệu

28

1.4.2. đặc ñiểm hình thái – sinh học

28

1.4.3. Biện pháp phòng chống

31

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và ñịa ñiểm thí nghiệm

32

2.2. Vật liệu

32

2.2.1. Vật liệu thí nghiệm

32

2.2.2. Hóa chất thí nghiệm

32

2.2.3. Dụng cụ và thiết bị

33

2.3. Phương pháp nghiên cứu

34

2.3.1. Phương pháp tách chiết, tinh sạch và xác ñịnh hàm lượng hoạt chất từ nhân
hạt neem

34

2.3.2. Tạo vi hạt nano chitosan mang dầu neem (CN) bằng phương pháp vi nhũ

tương

34

2.3.3. Xác ñịnh tính chất hóa lý của chế phẩm

38

2.3.4. đánh giá hoạt lực của chế phẩm

40

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Chiết tách, tinh sạch, xác ñịnh hàm lượng của azadiractin

43

3.1.1. Chiết tách, tinh sạch

43

3.1.2. Xác ñịnh ñộ tinh sạch trên phổ HPLC

46

3.1.3. Xác ñịnh hàm lượng Azadirachtin tổng có trong dầu Neem

47

3.2. Tạo vi hạt nano chitosan mang dầu neem

51

3.2.1. Tạo nguyên liệu dạng dung dịch giàu azadirachtin

51

3.2.2. Kết quả tạo vi hạt nano chitosan mang dầu neem (CN)

53


Đồ án tốt nghiệp

3.3. Kết quả xác ñịnh tính chất hóa lý của chế phẩm

59

3.3.1. Kết quả ño tỉ trọng và ñộ nhớt

59

3.3.2. đánh giá ñộ bền nhũ tương

60

3.3.3. Kết quả ñánh giá ñộ tạo bọt

60

3.4. Kết quả ñánh giá hiệu lực của chế phẩm lên sâu khoang

61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

65


DANH MỤC BẢNG VIẾT TĂT
AZRL (Azadirachtin related limonoid)

Hoạt chất Azadirachtin trong nhóm limonoid

Bt

Vi khuẩn Bacillus thuringensis

DMSO

Dimethyl –sulfoxide

HPLC (High Performance Liquid

Sắc ký lỏng cao áp

Chromatography)
EtOAc

Ethyl acetat

JH (Juvenile hormon)

Hóc môn trẻ

LD50

Liều gây chết 50%

MIC (Minimum inhibition concentration) Nồng ñộ ức chế tối thiểu
PHHT

Hóc môn ñốt ngực trước

TCN

Tiêu chuẩn ngành

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

UV – Vis

Quang phổ tử ngoại khả kiến


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG, SƠ đỒ VÀ đỒ THỊ

DANH MỤC BẢNG
Bảng
1.1
1.2
1.3
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
3.1
3.2
3.3
3.4

Nội dung
Hàm lượng ba hoạt chất chính trong dầu và bánh dầu của cây Neem
Một số sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật từ dầu Neem
Một số sản phẩm thương mại dùng trong y học
Thành phần các chất trong dựng ñường chuẩn Azadirachtin
Thành phần các chất pha ñể ño mẫu
Khảo sát nồng ñộ Chitosan hòa tan trong acid acetic
Khảo sát thời gian khuấy chế phẩm CN
Khảo sát nồng ñộ dầu Neem
Bố trí thí nghiệm
Hỗn hợp dung môi rửa giải mẫu qua cột
Kết quả ñánh giá ñộ bền nhũ tương
Số lượng sâu chết trung bình qua các ngày
Hiệu lực gây chết sâu khoang của chế phẩm CN

Trang
15
22
23
36
37
39
40
40
44
47
60
61
62

DANH MỤC SƠ đỒ
Sơ ñồ

1.1
1.2
1.3
3.1
3.2

Nội dung
Tác ñộng kiềm hãm trực tiếp lên hệ nội tiết côn trùng của
Azadirachtin
Vai trò tham gia của các sản phẩm trong quản lý dịch hại tổng hợp
Thành phần quả Neem

Quy trình tách, tinh sạch hoạt chất Azadirachtin
Quy trình thu nhận dịch chiết cồn giàu Azadirachtin từ nhân hạt
Neem

Trang
17
19
21
49
53

DANH MỤC đỒ THỊ
đồ thị
3.1

Nội dung
đường chuẩn Azadirachtin

Trang
48


DANH MỤC HÌNH
Hình
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6

1.7
1.8
1.9
1.10
1.11
1.12
1.13
1.14
2.1
2.2
2.3
2.4
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
3.12
3.13
3.14
3.15
3.16
3.17
3.18

3.19
3.20

Nội dung
Công thức phân tử của Chitosan
Các nhóm chức của Chitin, Chitosan và Cellulose
Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp khâu mạch nhũ
tương
Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp giọt tụ/ kết tủa
Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ
tương
Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp tạo gel ion
Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp mixen ñảo
Cấu trúc phân tử Azadirachtin“A”
Cấu trúc phân tử Azadirachtin“D”
Cấu trúc phân tử của Nimbin
Sơ ñồ hình thành nhũ tương ñơn lớp và ña lớp
Phương pháp tạo vi nhũ tương
Sâu khoang (Spodoptera litura )
Vòng ñời sâu khoang
Phương pháp nghiên cứu ñề ra ñể tạo chế phẩm CN
Sâu ñược nuôi ñể làm nguồn tiến hành thử nghiệm
Kén sâu
Ngài sâu
Xác ñịnh ñộ tinh sạch Azadirachtin bằng HPLC
Hệ thống máy UV – Vis Agilent
Phần mềm ño quang phổ UV-Visible
Nghiệm thức C-0,5 %
Nghiệm thức C-1,0 %
Nghiệm thức C-1,5 %

Nghiệm thức C-2,0 %
Chế phẩm CN khuấy 120’, 90’, 60’, 30’ñể yên sau 24h

độ tự nhũ của nghiệm thức 30’
độ tự nhũ của nghiệm thức 60’
độ tự nhũ của nghiệm thức 90’
độ tự nhũ của nghiệm thức 120’
Chitosan 2% khuấy 120’ ở các nồng ñộ dầu Neem ñể yên sau 24h
độ tự nhũ của nghiệm thức Neem 15%
độ tự nhũ của nghiệm thức Neem 20%
độ tự nhũ của nghiệm thức Neem 25%
độ tự nhũ của nghiệm thức Neem 30%
độ tự nhũ của nghiệm thức Neem 35%
Chế phẩm CN dưới kính hiển vi
Máy ño ñộ nhớt

Trang
4
5
9
9
10
11
11
14
14
15
26
27
28

29
38
43
43
44
50
51
51
54
54
54
54
55
56
56
56
56
57
57
57
58
58
58
59
60


Đồ án tốt nghiêp
nghiệp

3.21
3.22
3.23
3.24

Kết quả ño ñộ nhớt
Chế phẩm tự nhũ hoàn toàn trong nước
Các khay ñựng sâu
Khay ñựng sâu

61
61
63
64


Đồ án tốt nghiêp
nghiệp

1


MỞ đẦU

Đồ án tốt nghiêp
nghiệp

1. Tính cấp thiết của ñề tài
Chitosan là một polysaccharide có ứng dụng quan trọng trong các ngành công
nghiệp, nông nghiệp, y dược và bảo vệ môi trường. Nó ñược sản xuất từ vỏ các loại giáp

xác như tôm cua.
Việt Nam là quốc gia không những có diện tích vùng biển rộng mà còn có nhiều
ao hồ sông suối nên các ngành nuôi và chế biến thủy hải sản phát triển mạnh và chiếm tỷ
trong cao trong cơ cấu ngành kinh tế. Trong ñó giáp xác là nguồn nguyên liệu dồi dào
chiếm 1/3 tổng sản lượng thủy hải sản. Hàng năm các nhà máy chế biến ñã thải bỏ một
lượng phế liệu giáp xác khá lớn lên ñến 70.000 tấn/năm. Chính lượng phế thải này gây ra
hiện tượng ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, gây ảnh hưởng lớn ñến sức khỏe người
dân.Việc sản xuất sản sản phẩm ứng dụng từ Chitosan có nguồn gốc từ vỏ giáp xác giúp
giảm bớt lượng chất thải này vào môi trường mà còn tạo ra một sản phẩm mới an toàn
cho sức khoẻ con người và thân thiện với môi trường.
Ngoài ra, nước ta còn là một nước nông nghiệp với sự phát triển kỹ thuật và quy
mô không ñồng ñều, ña số là quy mô hộ gia ñình. Nên việc quản lý sử dụng thuốc bảo vệ
thực vật rất khó khăn.Việc sử dụng bừa bãi và thiếu hợp lý thuốc trừ sâu tổng hợp ñã dẫn
ñến những hậu quả nặng nề như sự kháng thuốc, bùng nổ dịch bệnh, ảnh hưởng ñến sự
tồn tại và phát triển của các loài thiên ñịch, cũng như gây ra một tác ñộng không nhỏ ñối
với môi trường. Vì vậy, các hoạt chất có nguồn gốc thực vật từ lâu ñã ñược nhiều nước
khuyến khích sử dụng thay cho các loại thuốc trừ sâu tổng hợp.
Từ những nghiên cứu và báo cáo ñã cho thấy cây Neem là một ứng cử viên ñầy
tiềm năng với hơn 120 hoạt chất sinh học ñược phát hiện. Tiêu biểu nhất là Azadirachtin:
Một trong những chất chính có tác ñộng xua ñuổi sâu bọ ở cây Neem, còn gọi là
xoan Ấn độ (Azadirachta indica A. Juss), là Azadirachtin. Nó có tác ñộng xua
ñuổi và gây ngán ăn ñối với nhiều loại côn trùng gây bệnh cũng như một số loại
tuyến trùng. Ngoài ra Azadirachtin còn có tác ñộng ức chế côn trùng phát triển và

2


Đồ án tốt nghiêp

sinh sản thông qua việc kiểm soát và làm thay ñổi sự biến thái bình thường của

côn trùng.
Nhiều mô hình nghiên cứu tác ñộng của Azadirachtin ñối với cá thể côn trùng ñã
ñược thực hiện (Aritakula và cộng sự, 2007; Dennis, 1992).
Theo các nhà khoa học, hợp chất azadiractin có tác dụng trừ sâu mạnh vì chúng
vừa có ñộc tính diệt trừ (S.A Rudwandki, 1980) vừa gây ngán ăn (H.Rembold,
1980, vừa có tác dụng làm bất lực và ức chế sinh trưởng (F.A Masous), 1983). Từ
1980, ñã có 8 hội nghị quốc gia và quốc tế ở CHLB đức, Ấn độ, Philippin, Kenya
và Úc khẳng ñịnh giá trị của cây Neem.
Các nghiên cứu về nhóm hoạt chất limonoid từ nguồn nguyên liệu cây Neem cũng
ñã ñược thực hiện ở nước ta (Dương Anh Tuấn và cộng sự, 2001; Nguyễn Tiến
Thắng và cộng sự 2003; Trần Kim Qui, 2005), chủ yếu liên quan ñến nghiên cứu
thu nhận và sử dụng hoạt chất limonoid trong công tác ñấu tranh sinh học, sau thu
họach…
Từ sau năm 2000, diện tích trồng Neem phát triển mạnh ở vài tỉnh phía Nam, ñặc
biệt là ở Ninh Thuận và Bình Thuận, trong ñó hang nghìn ha ñã cho quả.Tạo ñiều
kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu và phát triển sản phẩm chứa hoạt chất
azadiractin quy mô công nghiệp.
Vấn ñề cơ bản của hai ngành sản xuất nông nghiệp và chế biến thủy hải sản của
Việt Nam suy cho cùng vẫn là gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng sức khỏe con
người. Chính từ ñó nảy sinh ý tưởng sử dụng nguồn nguyên liệu ñược sản xuất từ phế
thải của ngành chế biến hải sản kết hợp với một chất có hoạt tính sinh học ñể tạo nên
thuốc bảo vệ thực vật thân thiện với môi trường. đó là bước ñầu tiên trong quá trình tiến
hành ñề tài: “Tạo hạt Nano từ Chitosan, ứng dụng sản xuất thuốc bảo vệ thực vật và thử
ñộc tính trên sâu khoang”
2. Mục tiêu của chuyên ñề tốt nghiệp:
Chiết tách, tinh sạch Azadirachtin trong nhân hạt cây Neem.
Tạo hạt Nano từ Chitosan, ứng dụng sản xuất thuốc bảo vệ thực vật chứa hoạt chất


Đồ án tốt nghiêp

Azadirachtin có trong nhân hạt Neem.


Đồ án tốt nghiêp

3. Nội dung của chuyên ñề tốt nghiệp:
Chiết tách và tinh sạch Azadirachtin trong nhân hạt Neem.
Nghiên cứu tạo Nano từ Chitosan và ứng dụng vào sản xuất thuốc bảo vệ thực vật
chứa hoạt chất Azadirachtin có trong nhân hạt Neem..
đánh giá hiệu quả diệt sâu của chế phẩm trong phòng thí nghiệm.
4. Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài:
Xây dựng ñược quy trình sản xuất thuốc bảo vệ thực vật mới, góp phần tạo thêm
thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc thảo mộc, thúc ñẩy sản xuất Chitosan từ phế thải
trong chế biến thủy hải sản.
5. Kết cấu của chuyên ñề tốt nghiệp: gồm 3 chương:
Chương 1. Tổng quan tài liệu
Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3. Kết quả và thảo luận


Đồ án tốt nghiêp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan tài liệu về Chitosan và nano Chitosan
1.1.1. Chitosan
Chitosan là một polysacchararide mạch thẳng, là dẫn xuất của chitin thông qua quá
trình deacetyl hóa. Chitosan ñược tạo ra từ các phân tử D- glucosamine liên kết với nhau
bởi các liên kết β – 1,4 – glycoside nên còn ñược gọi là poly (1,4) – 2 amino – 2 deoxy –
β – D – glucose hoặc poly β – 1,4 – D –glycosamine.

Công thức phân tử [C6H11O4N]n
Phân tử lượng MChitosan= (161,07)n

Hình 1.1 Công thức phân tử của Chitosan (Mahapatro và Singh, 2011)
1.1.1.1.

Tính chất vật lý

Chitosan là chất xơ giống như cellolose, tồn tại ở thể rắn, có màu từ trắng ngà ñến
vàng nhạt, xốp, nhẹ, hình vảy hoặc dạng bột, không mùi, không vị và có thể xay nhỏ
thành các kích cỡ khác nhau. Chitosan còn có khả năng tạo màng và có ñầy ñủ các tính
chất của cấu trúc quang học.
1.1.1.2.

Tính chất hóa học

Trong phân tử Chitosan có chứa các nhóm chức -OH, -NH, -CH2OH nên chúng có
các tính chất hóa học của ancol, amin và cả amit.
Bên cạnh ñó, các liên kết β – 1,4 – glycoside cấu tạo nên Chitosan tác nhân. Nhìn
chung, Chitosan là các chất hóa học khá hoạt ñộng.


Đồ án tốt nghiêp

Hình 1.2 Các nhóm chức của Chitin, Chitosan và Cellulose
1.1.1.3.

Mức ñộ deacetyl hóa

Mức ñộ deacetyl hóa là một ñặc tính quan trọng của Chitosan, nó ảnh hưởng ñến

tính chất hóa lý và khả năng ứng dụng của nó. Deacetyl hóa là quá trình loại nhóm acetyl
ra khỏi phân tử chitin trong môi trường kiềm, kết quả là nhóm –COCH3 ñược thay thế bởi
–H ở vị trí C2, tạo thành nhóm NH2 hoạt ñộng. Chitosan thông thường có ñộ deacetyl hóa
khoảng từ 60% trở lên (Nitar New, 2009), riêng Chitosan dùng trong thực phẩm hay dược
phẩm thường có ñộ deacetyl hóa từ 80% trở lên (Liu Liwei, 2011).
1.1.1.4.

Tính tan

Chitosan là chất không tan trong nước mà tan trong các acid loãng và các acid hữu
cơ như acid acetic. Chitosan khi hòa tan trong acid acetic loăng, (thường sử dụng acid
acetic 1 - 3 % (Sunil A Agnihotri, 2004)) sẽ tạo thành dạng keo nhớt trong suốt.


Đồ án tốt nghiêp

1.1.1.5.

độ nhớt

Chitosan là chất có ñộ nhớt cao phụ thuộc vào nhiều yếu tố như ñộ acetyl hóa,
khối lượng nguyên tử, nồng dộ dung dịch, pH, nhiệt dộ… Trong dung dịch, Chitosan có
khả năng tích ñiện dương, vì thế nó dễ dàng kết hợp với những chất tích ñiện âm như
lipid và acid mật … (Trần Thị Luyến, 2000; Nguyễn Thị Huệ và Bùi Thị Huyền, 2005).
1.1.1.6.

Trọng lượng phân tử

Chitosan có khối lượng phân tử cao, Chitosan thương mại thường có khối lượng
phân tử khoảng từ 1.000.000 – 1.200.000 Dalton. Khối lượng phân tử Chitosan có thể xác

ñịnh bằng phương pháp sắc ký, phân tán ánh sáng hoặc ño dộ nhớt (Viện Công nghệ Sinh
học – Thực phẩm).
1.1.1.7.

Một số ứng dụng của Chitosan

Nhờ vào khả năng kháng khuẩn và khả năng tạo phức liên kết với kim loại nặng,
Chitosan ñược ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực ñặc biệt là trong nông nghiệp, y tế,
bảo quản thực phẩm, xử lý môi trường…
Trong nông nghiệp, Chitosan ñược ứng dụng chủ yếu trong việc phòng trừ bệnh
gây hại cây trồng. Ví dụ như chế phẩm Olicide 9DD chứa 9% Chitosan ñã ñược ñăng kí
sử dụng ở nước ta dùng trong việc phòng trừ nhiều loại bệnh hại cây trồng như bệnh ñạo
ôn trên lúa, bệnh thán thư hại ớt, bệnh rỉ sắt hại chè… Theo danh mục bảo vệ thực vật
Việt Nam hiện nay có khoảng 20 sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật từ Chitosan ñã ñăng kí,
bao gồm cả dạng hỗn hợp với dạng chất khác.
Trong y học, Chitosan ñược sử dụng nhờ ñặc tính kháng khuẩn của nó ñể ñiều trị
các bệnh như viêm loét dạ dày, theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu đức và Hồ Thị Tú Anh
(1999) Chitosan ở dạng dung dịch gel 1,7%, pH = 6 có tác dụng ức chế một số chủng
Helicobacter pylori, nồng ñộ ức chế tối thiểu MIC – Minimum Inhibitory Concentration
trong khoảng 0,85 ñến 6,8 mg/ml. Trong ñiều trị bỏng, Viện bỏng Quốc gia ñã ñiều chế
ñược Chitosan phục vụ trong ñiều trị bỏng và ñã ñược ñưa vào sử dụng rộng rãi. Các nhà


Đồ án tốt nghiêp

khoa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2011) ñã nghiên cứu
sử dụng Chitosan ñể chế tạo gốm y sinh sử dụng trong phẫu thuật chỉnh hình và bước ñầu
ñã ñạt ñược kết quả khả quan. Chitosan còn ñược sử dụng ñể làm chỉ khâu trong phẫu
thuật, ñiều chế glusosamine hỗ trợ ñiều trị xương khớp…
Trong bảo quản thực phẩm, Chitosan ñược sử dụng ñể tạo màng kháng khuẩn giúp

kéo dài thời gian bảo quản. Có nhiều nghiên cứu ñã công bố về vấn ñề này tiêu biểu như
nghiên cứu của Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Vệ (2008) ñã sử dụng màng Chitosan 0,25%
kết hợp với màng PE giúp thời gian bảo quản trái quýt ñường lên ñến 8 tuần, nghiên cứu
của Trần Thị Luyến và Lê Thanh Long (2007) sử dụng Chitosan nồng ñộ 1,5% có bổ
sung 0,05% Sodium Benzoat hoặc 1% Sorbitol giúp duy trì chất lượng trứng gà ở hạng A
trong 15 – 20 ngày sau khi ñẻ (so với trứng gà tươi không bảo quản chỉ duy trì ñược
không quá 5 ngày). Chitosan ñã ñược cho phép làm chất phụ gia thực phẩm ở Nhật từ
năm 1983 và Hàn Quốc từ năm 1995 (Viện Sinh học – Thực phẩm).
Trong lĩnh vực xử lý môi trường, các nhà khoa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam (2011) ñã sử dụng Chitosan ñể tổng hợp nanocomposit
Fe3O4/CộNG Sự và Al(OH)3/ Fe3O4/CộNG Sự với dung lượng hấp phụ cao , ứng dụng ñể
hấp phụ các ion kim loại nặng trong nước và bước ñầu cho hiệu quả khá tốt, mở ra tiềm
năng ứng dụng lớn trong lĩnh vực này.
Trong các ngành công nghiệp khác, Chitosan cũng ñược sử dụng rộng rãi và ngày
càng khẳng ñịnh vai trò của nó trong mọi lĩnh vực. Trong công ngiệp sản xuất nước quả,
Chitosan ñược sử dụng như chất làm trong thay cho các chất thường sử dụng như gelatin,
bentonite, kali caseinat, tannin… (Viện Sinh học - Thực phẩm). Trong công nghiệp sản
xuất giấy, Chitosan ñược sử dụng ñể tạo ra giấy có ñộ bền hơn, dai hơn. Trong công
nghiệp sản xuất bao bì, Chitosan ñược kết hợp ñể tạo nên túi nilon với ñặc tính kháng
khuẩn, dễ phân hủy trong tự nhiên, thân thiện với môi trường.


Đồ án tốt nghiêp

1.1.2. Nano Chitosan
1.1.2.1.

định nghĩa về nano Chitosan

Nano Chitosan là Chitosan ñược ñiều chế có kích thước nano và có tính ưu việt

vượt trội hơn hẳn so với Chitosan. Nano Chitosan có kích thước siêu nhỏ (từ 10 ñến 1000
nm) nên dễ dàng ñi qua màng tế bào, ngoài ra chúng có diện tích bề mặt cực lớn nên
ñược ứng dụng rộng rãi trong việc làm chất mang, dẫn truyền hay hấp phụ (Dương Thị
Ánh Tuyết, 2011).
1.1.2.2.

Các phương pháp chế tạo nano Chitosan

Hiện nay có nhiều phương pháp ñể tạo nano Chitosan với những ưu ñiểm riêng.
Tùy theo mục ñích sử dụng và ñiều kiện thí nghiệm mà người ta lựa chọn phương pháp
chế tạo phù hợp. Trong ñó có năm phương pháp chủ yếu ñể tạo hạt nano Chitosan (S.A.
Agnihotri, 2004)[15] là:
a) Phương pháp khâu mạch nhũ tương (emulsion cross-linking)
Dung dịch Chitosan ñược phân tán trong dầu ñể tạo thành dạng nhũ tương nước
trong dầu (w/o), sau ñó ñược làm bền bằng chất hoạt ñộng bề mặt, cuối cùng mạch nhũ
tương ñược khâu lại nhờ tác nhân tạo nối, phản ứng xảy ra ở nhóm NH2 của phân tử
Chitosan.


Đồ án tốt nghiêp

Hình 1.3 Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp khâu mạch nhũ tương
b) Phương pháp giọt tụ/ kết tủa(coacervation/ precipitation)
Phương pháp này dựa vào tính chất không tan trong kiềm của Chitosan, do ñó sẽ
bị kết tủa. Dung dịch Chitosan sẽ ñược phun vào dung dịch kiềm ñể tạo hạt nano bằng
một thiết bị nén phun.

Hình 1.4 Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp giọt tụ/ kết tủa

Đồ án tốt nghiêp

c) Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương (emulsion-droplet coalescence)
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc của cả hai phương pháp tạo nối ngang và
kết tủa. Hai hệ nhũ tương bền sẽ ñược tạo ra kết hợp với nhau bằng cách khuấy ở tốc ñộ
cao, một hệ chứa dung dịch Chitosan cùng với thuốc, một hệ khác chứa dung dịch gồm
Chitosan và các giọt NaOH. Khi chúng kết hợp với nhau, các giọt từ mỗi hệ sẽ va chạm
một cách ngẫu nhiên và kết tủa thành những hạt nhỏ.

Hình 1.5 Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương
d) Phương pháp tạo gel ion (ionic gelation)
Phương pháp này dựa trên sự tương tác tĩnh ñiện giữa Chitosan (polycation) và
một poly anion. Kỹ thuật này khá ñơn giản, ñầu tiên Chitosan ñược hòa tan trong acid
acetic, sau ñó ñược trộn lẫn với polyanion bằng cách khuấy liên tục ở nhiệt ñộ phòng ñể
tạo hạt nano Chitosan. Tỷ lệ giữa nano Chitosan và polyanion sẽ quyết ñịnh kích thước
và diện tích bề mặt.

10


Đồ án tốt nghiêp

Hình 1.6 Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp tạo gel ion
e) Phương pháp mixen ñảo (reserve micellar)
Trong phương pháp này, dầu tiên người ta tạo ra những hạt mixen ñảo bằng cách
hòa tan chất hoạt ñộng bề mặt vào dung môi hữu cơ, sau ñó cho từ từ dung dịch chứa
Chitosan và giữ nguyên tốc ñộ khuấy ñể hỗn hợp trở thành pha vi nhũ dạng trong suốt.
Tác nhân tạo nối ngang dược thêm vào và khuấy qua ñêm, cô quay ñể loại dung môi,
phần còn lại phân tán trong nước. Thêm dung dịch muối ñể kết tủa chất hoạt ñộng bề
mặt, sau ñó ly tâm và chiết phần dung dịch ở trên có chứa nano Chitosan, cho qua màng

thẩm tích sau ñó ñông khô thu dạng bột.

Hình 1.7 Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp mixen ñảo

11


Đồ án tốt nghiêp

Trong 5 phương pháp trên thì phương pháp tạo gel ion là phương pháp ñược sử
dụng phổ biến nhất với ưu ñiểm là ñơn giản, dễ thực hiện và không cần máy móc thiết bị
hiện ñại.
1.1.2.3.

Ứng dụng của vật liệu nano Chitosan

Nano Chitosan nhờ có kích thước nhỏ, ổn ñịnh, diện tích bề mặt lớn, phân hủy
sinh học tốt, khả năng bám dính cao, không ñộc hại nên ñược ứng dụng nhiều ñể làm chất
mang, chất dẫn truyền, chất hấp phụ… dùng trong y học, nông nghiệp và các lĩnh vực
khác. Chitosan ở dạng nano giữ ñược hoạt lực của Chitosan lâu hơn, nhờ có kích thước
nhỏ nên dễ dàng ñi sâu vào tế bào, tác dụng kháng khuẩn trực tiếp thông qua cơ chế liên
kết với ion trên màng tế bào vi khuẩn dẫn ñến ức chế hô hấp, khả năng bám dính cao hơn
và khả năng hấp phụ tốt hơn Chitosan. ở nước ta cũng ñã có những nghiên cứu bước ñầu
về ứng dụng vật liệu nano Chitosan chủ yếu là trong y học và nông nghiệp.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Hà (2011), nano Chitosan có hiệu suất hấp
phụ kháng nguyên cúm A/H1N1 cao từ 93,75% ñến 100% và cho ñáp ứng miễn dịch,
hiệu giá kháng thể HI cao hơn so với Chitosan và hydroxide nhôm thông thường. Cũng
trong nghiên cứu này, tác giả cho rằng nano chiotosan có tính an toàn sinh học khi sử
dụng làm tá chất cho vaccine cúm A/H1N1 và tốt hơn các tá chất khác trong thí nghiệm.
Dương Thị Ánh Nguyệt và các cộng sự (2011) ñã tiến hành nghiên cứu chế tạo nano

Chitosan làm chất hấp phụ protein ứng dụng trong dẫn truyền thuốc với hiệu suất hấp phụ
ñạt 96,41%, hiệu suất hấp phụ này khá cao và khả năng ứng dụng trong y học là hoàn
toàn có thể.
Trong nông nghiệp nano Chitosan ñược sử dụng ñể bảo quản các loại nông sản sau
thu hoạch. Ở Việt Nam, chế phẩm nano Chitosan của trung tâm nghiên cứu Công nghệ
Sinh học Biosun ñã ñược chấp nhận và ñược lưu hành trên thị trường với các công dụng
chủ yếu như ñiều trị các bệnh rỉ sắt, thán thư, ñặc trị nấm và vi khuẩn có hại trên cà phê,
cao su, thanh long…

12


Đồ án tốt nghiêp

1.2. Tổng quan về dầu Neem
1.2.1. Nguồn nguyên vật liệu
Dầu Neem ñược sản xuất từ hạt quả Neem. Cây Neem tên khoa học là Azadirachta
indica A. Juss, thuộc họ xoan (Melieae) ñược trồng phổ biến trên thế giới. Ở Việt Nam,
cây Neem còn dược gọi là cây xoan chịu hạn hay cây xoan Ấn độ ñã ñược trồng thử
nghiệm từ những năm 1980 – 1982 ở Ninh Thuận và Bình Thuận với mục ñích phủ xanh
vùng ñất cằn cỗi dọc ven biển và chống sa mạc hóa [4, 5].Theo ñánh giá sơ bộ, hiện nay
riêng ở các tỉnh phía Nam, ñã ñược trồng trên 5.000 ha Neem, trong ñó có ñến hơn 700
ha cây Neem ñã cho quả. điều này chứng tỏ cây Neem thích hợp với vùng sinh thái ở
phía Nam nước ta, ñặc biệt là với vùng ñất cát khô hạn ven biển, nên việc gia tăng diện
tích trồng Neem là dễ dàng thực hiện. Qua ñó cho thấy nguồn nguyên vật liệu sản xuất
dầu Neem ñã có sẵn trong nước và khá dồi giàu.
1.2.2. Phương pháp tách chiết dầu Neem
Quả Neem chín ñược hái trực tiếp trên cây và xử lý ngay trong ngày. Hạt ñược
O

làm sạch phần vỏ và thịt quả, sau ñó sấy khô trong tủ sấy ở 50 C, ñể nguội, tách vỏ thu
nhân hạt. Ép nhân hạt Neem bằng máy ép dầu chuyên dụng KOMET (đức) với nhiệt ñộ
O

ép 40 – 45 ñể thu dầu và bánh dầu.
1.2.3. Các nhóm hoạt chất của dầu Neem
Những năm gần ñây, các chất có hoạt tính sinh học của cây Neem ñã ñược nghiên
cứu mạnh mẽ. Thế giới ñã tổ chức 7 hội nghị quốc tế về cây Neem, ba hôi nghị ñầu chủ
yếu ñề cập ñến việc áp dụng dịch chiết thô từ hạt Neem trong phòng thí nghiệm và tiến
hành phòng trừ sâu bệnh trên ñồng ruộng. Hơn 100 chất ñã ñược tách ra từ các phần khác
nhau của cây Neem. Nhóm tetranortriterpenoid ñược nghiên cứu nhiều nhất, sau ñó là
diterpenoid, triterpenoid, pentanortriterpenoid và một số ít các chất không thuộc nhóm
terpenoid (nonterpenoidal ingredients).

13