quy trình định tính salmonella

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNGNhóm 6
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

PHÂN TÍCH VI SINH
THỰC PHẨM
Đề tài: Quy trình định tính Salmonella

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh
Thực hiện nhóm 6
Lớp Thứ 3, Buổi chiều, Tiết 7-8
Thành Phố Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 04 năm 2016
GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh

Trang 1


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm
DANH SÁCH NHÓM VÀ BẢN PHÂN CÔNG VIỆC NHÓM 6

MỤC LỤC

Trang 2

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh

Nhóm 6

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC VIẾT TẮT
TPCN: Thực phẩm chức năng

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh

Trang 3


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

LỜI MỞ ĐẦU
Những năm gần đây vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm luôn là tâm điểm của các
phương tiện truyền thông đại chúng. Ngày càng có nhiều vụ ngộ độc thực, nhất là vấn
đề ngộ độc thực phẩm do tình trạng mất vệ sinh an toàn thực phẩm của các cơ sở chế
biến có xu hướng ngày càng gia tăng. Các báo cáo cho thấy phần lớn chúng là do vi
sinh vật gây nên.
Có rất nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, ví dụ như Clostridium
butolinum, Escherichia Coli, Listeria monocytogenes... Trong đó, Salmonella là loài vi
sinh vật gây ngộ độc rất nguy hiểm. Salmonella thuộc họ Enterobactriaceae, gây ra
bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết và nhiều bệnh nghiêm trọng khác.
Hiện nay có khoảng 4% người thường mang mầm bệnh. Tất cả các tiêu chuẩn
vệ sinh thực phẩm điều không cho phép có Salmonella trong thành phẩm. Sự hiện diện

của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các cơ quan chức năng.
Để kiểm soát được chúng, các cơ quan nhà nước đã đưa những quy trình phát
hiện Salmonella được quy định bằng các văn bản rất cụ thể. Nhằm giới thiệu một trong
những quy trình trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Quy trình trình định tính
Salmonella”
Chúng tôi hy vọng qua đề tài lần này sẽ cung cấp thêm cho các bạn một số kiến
thức về Salmonella, các phương pháp có thể dùng để phát hiện Salnonella và quá trình
phát hiện Salmonella. Trong quá trình thực hiện đề tài không tránh khỏi một số sai sót,
mong cô và các đóng góp để giúp nhóm hoàn thiện đề bài.
Nhóm 6

Trang 4

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

1

Nhóm 6

TỔNG QUAN VỀ SALMONELLA
1.1 Lịch sử phát hiện

Năm 1885 Slamon và Smith (Mỹ) tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả
và gọi tên là Bacỉlus cholerasuỉs, hiện nay gọi là Salmonella. Nhưng sau đó
Schweinittz và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một loại vi rút gây nên
và đã xác định S.choleraesuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn.
Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh,

ông gọi vi khuẩn này là Bacillus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh

Trang 5


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

S.enterỉtỉdỉs. Vi khuẩn này cũng được gọi bằng nhiều tên khác như: Bacterium
enteritidis, Bacillus gartner...
Năm 1889 Klein phân lập được S.gallinarum và Rettger cũng đã phân lập được
S.pullorum năm 1909. Trước đây người ta cho ràng đây là hai loại vi khuẩn gây ra hai
bệnh khác nhau lên đã gọi chung là bệnh phó thương hàn gà Typhus avium) và căn
bệnh có tên chung là S.gallinarum - pullorum.
Năm l896 C.Archard và Rbensauded đã phân lập được vi khuẩn Sparatyphi
equi và Sparatyphi bacilus. Ngày nay vi khuẩn này được gọi tên là Sparatyphi B và
đến năm 1898, Sparatyphi A đã tìm được do N.Guyn và H Keyser.

1.2 Phân loại
Về phân loại khoa học, Salmonella được xếp vào:
Giới:

Bacteria

Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma
Bộ:

proteobacteria
Enterobacteriales

Họ:

Enterobacteriaceae

Chi:

Salmonella

Loài:

Salmonella bongori
Salmonella enterica
Hiện nay theo phân loại của hệ thống Viện Pasteur thê giới, Trung tâm Kiêm
soát và ngăn ngừa dịch bệnh của Mỹ CDC (Control and Prevent Disease Center),
giống Salmonella được chia làm hai loài: S. enterica và S. bongori. Trong đó S.
bongori gồm tất cả các kiểu huyết thanh (serotype) cua loài phụ số V, và S. enterica
được chia làm 6 loài phụ đánh số: I, II. IIIa, IIIb, IV và VI. Các loài và loài phụ này có
thể phân biệt được bằng phan ứng sinh hóa. Trong mồi loài phụ có nhiều kiểu huyết
thanh.
Cho đến nay đã xác định được trên 2463 kiểu huyết thanh thuộc giống Salmonella.
Theo hệ thống của Kauffman White, các kiểu huyết thanh này được chia dựa trên
kháng nguyên thân O, kháng nguyên tiêm mao H và kháng nguyên bề mặt Vi. Phần
lớn các kiểu huyết thanh được đặt tên theo công thức kháng nguyên, một số khác được

Trang 6

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

đặt tên riêng như Enteritidis (S. enteritidis), Typhi (S. typhi), Paraphi ( S. paraphi),
Typhimurim ( S.typhimurium)….

Loài phụ
enterica
như
chiếm đa
(99%), nó
được tìm
ờ hầu hết
động vật
nóng.

S.
hầu
số

thấy
các
máu
Loài phụ này chiếm 59% (1454/2463) trong tổng số kiểu huyết thanh của Salmonella
có khả năng xâm nhập và gây nhiễm cao cho người và động vật máu nóng, trong khi
đó các loài phụ khác hầu như ờ động vật máu lạnh và môi trường. Như vậy có tới 41%

(1009/2463) số kiểu huyết thanh không được phân lậpp từ bệnh phẩm của người, đây
là một tỉ lệ rất có ý nghĩa để các cơ quan chức năng xem xét và sửa đổi các tiêu chuẩn
hiện hành trong thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho các nhà sản xuất tiêu thụ thực
phẩm.

1.3 Các loài điển hình
Salmonella typhi: Gây bệnh thương hàn
Hình 1.1. Vi khuẩn Salmonella typhi
Salmonella paratyphi: Gây bệnh phó thương hàn

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh

Trang 7


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

Salmonella cholera_suis: Gây bệnh nhiễm trùng máu

Hình 1.2 Vi khuấn Salomonella cholera _suis
Salmonella entertidis: Gây rối loạn tiêu hóa
Hình 1.3 Vi khuẩn Salmonella entertidis
Một số chủng Salmonella khác: s. thompson, s. derbv, s. newport, s. kissangani,
s. sen/lenberg, s. meleagnidis, s. anatum, s. aberdeeh, s. panama, s. montevideo, s.
dubỉin, s. london, s. anatum, s. minnesota, s. gaỉỉỉnarum...
Một số bệnh thường gặp ở động vật do Salmonella gây ra: phó thương hàn ở bò
và lợn, bệnh sảy thai ở cừu và ngựa, bệnh bạch lỵ ở gà, bệnh thương hàn chuột, bệnh
viêm phổi bò...

1.4 Đặc điểm của Salmonella
1.4.1 Đặc điểm hình thái
Salmonella là trực khuẩn gram (-), hình que, kích thước trung bình từ 2 – 3 x
0.5 – 1µm, hiếu khí và kị khí tùy nghi, có tiên mao, có thể di động (trừ S.gallinarum
và S.pullorum), không tạo bào tử, sinh acid từ glucose và mantinol nhưng không len
mên saccharose, không sinh indol và không phân giải urê. Hầu hết chủng đều dinh H 2S
(trừ S.typhi), chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 6°C - 42°C, thích hợp nhất ở 35°C - 37°C,
pH từ 6 - 9 và thích hợp nhất ở pH = 7,2. Ở nhiệt độ từ 18°C - 40°C có thể sống đến
15 ngày.

Trang 8

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển được trên các môi trường
nuôi cấy thông thường. Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ.
Có thể mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate
citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate), trong đó môi trường XLD ít chất
ức chế hơn nên thường được dùng để phân lập Salmonella. Khẩn lạc đặc trưng của
Salmonella trên môi trường này là tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, đôi khi tâm đen lớn
bao trùm khẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ.
1.4.2 Đặc điểm hóa sinh
Salmonella không lên men lactose, lên men đường glucose hầu hết chúng đều
sinh H2S, có thể sinh hơi. Thường không lên men sucrose, salicin và inositol, sử dụng

được citrate ở môn trường Simmons.
Tuy nhiên không phải loài Salmonella nào cũng có những tính chất trên, các
ngoại lệ được xác định là s.typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử
dụng citrate trong môi trường Simmon, hầu hết các chùng s.paratyphi và S.Cholerasuis
không sinh H2S, khoảng 5% các chủng Salmonella sinh độc tố sinh bacteriocin chống
lại E.Coli, Shigella và ngay cả 1 số chủng Salmonella khác.
1.4.3 Cấu trúc
Salmonella có ba loại kháng nguyên là những chất khi xuất hiện trong cơ thể thì
tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sản phẩm của sự
kích thích đó gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và kháng nguyên vỏ
K. Vi khuẩn thương hàn (S.typhi có kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố chống thực
bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu.

Hình 1.4 Các kháng nguyên trên bề mặt Salmonella

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh

Trang 9


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm
1

Nhóm 6

Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O)

Thành phân cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp. Trong cùng
là một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng
ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và

lipopolysaccharide.
Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết định độc tố
của Nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide không mang tính đặc hiệu. Kháng
nguyên của nội độc tố có bản chất hóa học là lypopolysaccharide (LPS). Tính đặc hiệu
của kháng nguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì khác nhau: kháng
nguyên O ngoài LPS còn bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch của
nó mạnh hơn LPS. Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid
hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8-10
nm gồm 3 thành phần: Lipid A, Polysaccharide lõi, Kháng nguyên O. Màng ngoài còn
có thêm các protein:
 Protein cơ chất: protein ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng
cho phép một số loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô
cơ.
 Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua
màng ngoài.
 Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài.
2

Kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K – kháng nguyên Vi)

Bản chất hóa học của vỏ vi khuẩn là polypeptid hoặc polysaccharide. Vỏ của vi
khuẩn gây miễn dịch không mạnh nhưng khi gắn với tế bào vi khuẩn vỏ vẫn gây được
miễn dịch. Kháng nguyên vỏ được dùng để phân loại các chủng Salmonella.
Kháng nguyên K: Không phức lạp, có một kháng nguyên vỏ là kháng nguyên
Vi và cũng có ở 2 Ivpe huyết thanh s.typhi và s.paratyphi. Kháng nguyên Vi - angtigen
được Felix và các cộng sự phát hiện năm 1935. Kháng nguyên Vi gây hiện tượng
ngưng kết chậm và xuất hiện các hạt vỏ, kháng nguyên Vi là kháng nguyênn vỏ bao
bọc bên ngoài kháng nguyên o, khánh nguyên Vi không tham gia vào quá trình gây
bệnh.

Trang 10

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm
3

Nhóm 6

Kháng nguyên lông (kháng nguyên H)

Được tổng hợp từ các acid amin dạng D (dạng ít gặp trong tự nhiên). Do đó
việc xử lý kháng nguyên của các tế bào miễn dịch không thuận lợi và đáp ứng kháng
thể không mạnh. Khi các sợi lông bị kết hợp bởi các kháng thể đặc hiệu, lông sẽ bị bất
động, vi khuẩn không thể di chuyển được. Kháng nguyên lông được dùng để phân loại
một số chủng Salmonella.
Kháng nguyên H: Chỉ có ở các Salmonella có lông. Hầu hết Salmonella đều có
lông chỉ trừ S.galHarum, s.pulorum gây bệnh cho gia cầm. Kháng nguycn H là một
loại kháng nguyên có bản chất là protit, kém bền hơn kháng nguyên O. Kháng nguyên
H rất dề bị phá huỷ ở nhiệt độ cao hoặc xử lý bằng cồn, axit yếu.
Kháng nguyên H chia làm 2 phase:
 Phase 1: Có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng nguyên lông được biểu thị
bằng chữa số La tinh thường: a, b, c...
 Phase 2: Không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với các loại khác
đôi khi thành phần này có thể gặp ở E.coli. Pha 2 gồm có 6 loại được biểu thị bàng
chừa số Ả Rập 1-6 hay chữa sổ La Tinh e, n, X...
Bảng 1.1 Bảng phân biệt các kháng nguyên O, K, H

Kháng nguyên

Tính chịu nhiệt

O

Ổn nhiệt 2h30 ở 100°C

K
H

Tác động
của alcohol Formol 50%
50%
Bị ngăn trở ngưng
Kháng
kết

Biến nhiệt 15’06” ở 100°C Nhạy cảm
Biến nhiệt 2h ở 100°C

Nhạy cảm

Kháng
Kháng

1.4.4 Điều kiện sinh trưởng
Salmonella phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Trên
môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ. Có thể mọc trên những môi
trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose
lysine deoxycholate), trong đó môi trường XLD ít chất ức chế hơn nên thường được

dùng để phân lập Salmonella. Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường
XLD là tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khẩn lạc, môi
trường xung quanh chuyển sang màu đỏ.

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh

Trang 11


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

Salmonella kém đề kháng với điều kiện bên ngoài, bị phá hủy bởi quá trình
tuyệt trùng bằng phương pháp Pasteur, Tia bức xạ và đun sôi nấu kĩ. Tuy nhiên,
Salmonella có thể sống sót trong 1 thời gian dài ở các thực phẩm khối và ướp lạnh. Do
đó, khi làm tan thực phẩm đông lạnh vi khuẩn này dễ phát triển trở lại.
Chúng phát triển tốt nhất ở 6°C - 42°C thích hợp nhất ở 35°C - 37°C , pH từ 6-9
và thích họp nhất ở pH= 7,2. Ở nhiệt độ từ 18°C - 40°C vi khuẩn có thể sống đến 15
ngày.
Khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn này rất kém: ở 50°C trong 1 giờ, ở 70°C
trong 15 phút và 100°C trong 5 phút . Chúng bị tiêu diệt bởi phenol 5%, Chloramin
1% và chlorur thủy phân 0,2% trong 5 phút. Với nồng độ muối 8 -19% thì sự phát triển
của vi khuẩn ngừng lại.
Vi khuẩn này không gây mùi vị khó chịu cho thực phẩm, chúng hiện diện trong
tất cả các loại thực phẩm như: trứng, thịt, thủy hải sản, rau.
Salmonella có khả năng len men glucose và manitol, sinh acid nhưng không lên
men saccharose và lactose, không phân giải urea, không có khả năng tách nhóm amine
từ tryptophane. Salmonella không sinh indol, không làm lỏng gelatin.
Bảng 1.2 Các tính sinh hóa cơ bản của Salmonella

Tính chất
Khử Nitrate
Lên men Glucid

Kết quả
(+)
(+)

Lên men Glucose sinh khí

(+)

Sử dụng Citrate

(+)

Sinh H2S

(+)

Sử dụng Lactose
Sử dụng Saccharose
Hệ enzyme:
+ Catalase
+ Beta -galactosidase
+ Urease
+ Decarboxylase Lysine
(LDC)
Ornithine (ODC)

(-)
(-)

Trang 12

Ghi chú
Kèm theo sự tồng hợp acid
Trừ một số chúng thuộc loài s.
ty phi và s. gallinarnm
Trừ s. typhi và s. paratyphi A
Trừ một sồ chủng thuộc loài s.
paratyphi A và s. choleraesuis
Trừ s. anizonae

(+)
(-)
(-)

Trừ một số loài phụ

(+)

T rừ s. paratyphi A

(+/-)

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Arginine dihydrolase
(ADH)
Desaminase Phenylalanine
Tryptophane
Tetrathionate reductase
Các tính chất khác
Mannitol
Indole
Acetylmethylcarbinol
(VP)

Nhóm 6
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)

Ghi chú: (+): dương tính; (-): âm tính; (+/-): có thể dương tính hay âm tính tùy
chủng.
1.4.5 Yếu tố độc lực
Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc tố.
 Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét, độc
tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật.
 Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào tủi colodion rồi
đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấy truyền như vậy từ 5
đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây bệnh cho động vật thí
nghiệm. Ngoại độc tố chỉ hĩnh thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí.

Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột.
4

Nội độc tố - Endotoxin

Màng ngoài tế bào vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn Salmonella nói
riêng, được cấu tạo bởi thành phần cơ bản là lipopolysaccharide (LPS). LPS có cấu tạo
phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt với đặc tính và chức năng riêng biệt: Vùng ưa
nước, vùng lõi và vùng lipit A.
Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi polysaccharide chứa các đơn vị cấu trúc
kháng nguyên O. Vùng lõi có bản chất là acid heterooligosaccharide, ở trung tâm nối
kháng nguyên o với vùng lipit A. Vùng lipit A đảm nhận chức năng nội độc tố của vi
khuẩn. Cấu trúc nội độc tố gần giống cấu trúc của kháng nguyên O. Cấu trúc nội độc
tố biến đổi sẽ dẫn đến sự thay đổi độc lực của Salmonella.
Nội độc tố thường là lipopolysaccharide (LPS) được phóng ra từ vách tế bào vi
khuẩn khi bị dung giải. Trước khi thể hiện độc tính của mình, LPS cần phải liên kết
với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Te bào lâm ba

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh

Trang 13


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

cầu B, lâm ba cầu T, tế bào đại thực bào, tiểu thực bào, tế bào gan, lách.Rất nhiều các
cơ quan trong cơ thể chịu sự tác động của nội độc tố LPS: Gan, thận, cơ, hệ tim mạch,
hệ tiêu hoá, hệ thống miễn dịch; với các biểu hiện bệnh lý: Tắc mạch máu, giảm

trương lực cơ thiếu oxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hoá, mất tính thèm ăn...
Nội độc tố tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ, kích
thích hĩnh thành kháng thể.
LPS tác động lên các tế bào tiểu cầu, gây sốt nội độc tố, theo cơ chế :
 Giải phóng các chất hoạt động mạnh như: Histamin.
 Ngưng kết các tiểu cầu động mạch.
 Đông vón, tắc mạch quản.
LPS tác động lên quá trình trao đổi gluxit: LPS làm tăng cường hoạt lực của các
men phân giải glucoz, các men phân giải glycogen, làm giảm hoạt lực các men tham
gia quá trình tổng họp glycogen…
5

Độc tố đường ruột

Về cơ chế miễn dịch và di truyền các Enterotoxin của Salmonella có quan hệ
gần gũi với Choleratoxin, nên được gọi là Choleratoxin like enterotoxin (CT). Còn về
đặc tính sinh học Enterotoxin của Salmonella không chỉ với giống CT mà còn giống
với Enterotoxin của E.Coli.
Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: Độc tố
thẩm xuất nhanh Rapid permeability facto (RPF) và độc tố thẩm xuất chậm Delayed
permeability facto (DPF).
RPF giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, nó thực hiện khả
năng thẩm xuất sau 1-2 giờ và kéo dài 48 giờ và làm trương các tế bào CHO (Chinese
Hamster Ovary cell). Độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc, thành phần giống với độc tố
chịu nhiệt của E.Coli, được gọi là độc tố chịu nhiệt của Salmonella. ST có khả năng
chịu được nhiệt độ 100°c trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, có thể bảo quản ở
nhiệt độ -20°c. Cấu trúc phân tử gồm một chuỗi polysaccharide và một chuỗi
polypeptide.
RPF kích thích co bóp nhu động ruột, làm tăng sự thẩm thấu thành mạch, phá
huỷ tổ chức tế bào biểu mô ruột, giúp vi khuẩn Salmonella xâm nhập vào tế bào và

phát triển tăng nhanh về số lượng. Vi khuẩn tích cực tăng cường sản sinh độc tố làm

Trang 14

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

rối loạn cân bằng trao đổi muối, nước và chất điện giải. Quá trình bệnh lý đường ruột
và hội chứng tiêu chảy càng thêm phức tạp và nghiêm trọng.
DPF của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của
vi khuẩn E.Coli, nên được gọi là độc tố không chịu nhiệt của Salmonella. Nó thực hiện
chức năng phản ứng chậm từ 18-24 giờ. LT bị phá huỷ ở 70°c trong vòng 30 phút và ở
56°c trong vòng 4 giờ. LT có cấu trúc gồm 3 chuỗi polypeptid.
DPF làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải, dẫn đến tăng cường
bài xuất nước và chất điện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái
hoá lóp tế bào villi của thành ruột, gây tiêu chảy.
6

Độc tố tế bào

Khi cơ thể người và động vật bị tiêu chảy thi kèm theo hiện tượng mất nước và
mất chất điện giải là hiện tượng hàng loạt các tế bào biểu mô ruột bị phá huỷ hoặc bị
tổn thương ở các mức độ khác nhau. Sự phá huỷ hay tổn thương đó là do độc tố tế bào
của Salmonella gây nên, theo cơ chế chung là: ức chế tổng hợp protein của tế bào
Eukaryotic và làm trương tế bào CHO.
Ít nhất 3 dạng độc tố của tế bào:

 Dạng thứ nhất: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với trypsin. Dạng này được
phát hiện ở rất nhiều serovar Salmonella', có trọng lượng phân tử trong khoảng từ
56 đến 78 kDa; không bị trung hoà bởi kháng thể kháng độc tố Shigella toxin hoặc
Shigella - like. Độc tố dạng này tác động theo cơ chế là ức chế tổng họp protein
của tế bào Hela và làm teo tế bào.
 Dạng thứ hai: Có nguồn gốc từ protein màng ngoài tế bào vi khuẩn có cấu trúc và
chức năng gần giống các dạng độc tố tế bào do Shigella và các chủng (ETEC) sản
sinh ra. Dạng độc tố này cũng phổ biến ở hầu hết các serovar Salmonella gây bệnh.
 Dạng thứ ba: Có trọng lượng phân tử khoảng 62 kDa; có liên hệ với độc to
Hemolysin. Hemolysin liên hệ với các độc tố tế bào có sự khác biệt với các
Hemolysin khác về trọng lượng phân tử và phương thức tác động lên tế bào theo cơ
chế dung giải các không bào nội bào.
1.4.6 Cơ chế gây bệnh
Tất cả các kiểu huyết thanh Salmonella đều mang cụm gen inv (invasion) giúp
cho quá trình xâm nhiễm vào trong thành ruột của người và động vật, mở đầu của tiến
trình gây bệnh. Cụm gen này nằm trong hệ thống gen SPI - 1 {Salmonella

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh

Trang 15


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

pathogenicity island) có mặt trong tất cả các Salmonella, từ nhóm tiến hoá thấp nhất là
s.bongori đến nhóm tiến hoá cao nhất là s.enterica.
7

Cơ chế gây bệnh thương hàn

Bệnh thương hàn do s.typhi và s.paratyphi A, B, c gây ra. Các yếu tố độc lực
chính của vi khuẩn thương hàn là khả năng bám và xâm nhập vào tế bào chủ, khả năng
nhân lên trong đại thực bào và nội độc tố. Kháng nguyên Vi có mặt ở s.typhỉ và
Spararatyphi c là yếu tố độc lực quan trọng, những chủng vi khuẩn gây bệnh thương
hàn không có kháng nguyên Vi thi số lượng cần thiết để gây bệnh cao hơn rất nhiều so
với những chùng có kháng nguyên này.
Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa do thức ăn hay nước uống bị
nhiễm bẩn, số lượng cần thiết để gây bệnh vào khoảng 105 đến 107
Đầu tiên, vi khuẩn thương hàn phải vượt qua môi trường axit của dạ dày, mặc
dù chúng có khả năng đề kháng với axit nhờ có gen art (acid response tolerance),
nhưng ở người bĩnh thường, vi khuẩn thương hàn không thể tồn tại lâu, nuôi cấy dịch
dạ dày âm tính sau 30 phút. Sau khi vượt qua được rào cản ở dạ dày, vi khuẩn di
chuyển xuống ruột non rồi nhân lên ở đó, nhưng trong tuần đầu sẽ có 1 ít vi khuẩn đào
thải theo phân, cấy phân dương tính trong 5 ngày không có nghĩa là bệnh thương hàn
sẽ xảy ra. Từ ruột non, vi khuẩn thương hàn đi vào hạch mạc treo ruột nhờ tế bào M,
một đại thực bào của mảng Peyer. Sau đó theo đường bạch huyết và máu gây nhiễm
trùng toàn thân. Sau khoảng một tuần, nhiễm khuẩn huyết thứ phát xuất hiện. Vi khuẩn
theo gan qua đường mật lại tiếp tục xâm nhập vào một non, tiếp tục nhân lên ở các
mảng Peyer. Từ máu, vi khuẩn tới lách và các cơ quan khác. Trong một non, vi khuẩn
chết và giải phóng ra nội độc tố. Nội độc tố kích thích dây thần knh giao cảm ở một
gây ra hoại tử chảy máu và có thể gây thủng một, vị trí gây tổn thương thường nằm ở
các mảng Peyer. Đây là biến chứng hay gặp ở cá bệnh nhân ăn sớm khi chưa bĩnh
phục, nhất là ăn các thức ăn cứng. Nội độc tố theo máu lên hệ thần kinh và kích thích
trung tâm thần kinh thực vật ở não thất ba. Giai đoạn toàn phát bệnh, bệnh nhân sốt
cao, biểu đồ thân nhiệt tăng lên theo thỏi gian. Thân nhiệt tăng những nhiệt độ không
tăng gây ra hiện tượng mạch và nhiệt độ phân ly.
Thời kĩ chưa có điều trị bằng kháng sinh, khoản một tuần ủ bệnh, diễn biến điển
hĩnh của bệnh thương hàn trải qua 4 giai đoạn, mỗi giai đoạn khoảng một tuần, Tuần

thứ nhất thân nhiệt tăng cao, tuần thứ hai thì đau bụng, gan và lách to dồng thời có sự
xuất hiện của các đốm hồng trên da, tuần thứ 3 có thể xuất hiện thêm các biến chứng
như xuất huyết, thủng ruột, tuần thứ 4 sẽ xuất hiện thêm các biến chứng nguy hiểm
dẫn đến tử vong, nếu không bệnh nhân sẽ bĩnh phục.

Trang 16

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

Bệnh nhân thường đau đầu, buồn nôn hoặc nôn, chướng bụng, tiêu chảy, khoản
50% bệnh nhân sờ thấy gan và lá lách dưới sườn. Những trường họp nặng thường có
dấu hiệu ly bĩ, hôn mê, trụy tim mạch, không chữa trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong.
Những biến chứng khác như viêm phổi cấp,, viêm màng não, viêm gan, viêm tủy
xương cũng có thể gặp.
Những bệnh nhân qua khỏi có khoảng 5 - 10% vẫn tiếp tục thải vi khuẩn qua
phân trong quá trình hồi phục và 1- 4% trở thành người mang vi khuẩn lâu dài do vi
khuẩn vẫn tồn tại trong tủi mật. Tĩnh trạng này có thể kéo dài đến nhiều năm và họ trở
thành nguồn mang bệnh rất nguy hiểm.
8

Cơ chế gây nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn

Bênh thường xảy ra do ăn phải thức ăn bị nhiễm Salmonella, nhưng cũng có thể
lây truyền trực tiếp. Căn nguyên thường do vi khuẩn S.enteritidis và s.typhimurỉum.
Vi khuẩn xâm nhập qua ruột non nhờ các tế bào M của mảng Peyer. Trên bộ

gen của Salmonella có các tác nhân gây ức chế các chất kháng khuẩn có trong
lysosome, biến đổi tế bào chủ đảm bảo cho sự tồn tại của vi khuẩn, làm cản trở hoạt
động nội bào như giảm lượng NADH oxidase rất cần thiết cho việc sản xuất các họp
chất kháng khuẩn.
Sự hủy hoại của đại thực bào và các tế bào biểu mô lân cận, sự chết của vi
khuẩn giải phóng nội độc tố đã gây nên tổn thương cho cơ thể vật chủ và gây ra các
triệu chứng. Thời gian ủ bệnh trung bĩnh từ 10-48 giờ. Sau thời gian ủ bệnh, người
nhiễm thường có biểu hiện như sốt, nôn, đau bụng và tiêu chảy. Mức độ sốt khác nhau
tùy vào thể trạng từng người, tiêu chảy phân thường không có máu. Ở người lớn
thường chỉ dẫn đến tình trạng rối loạn đường tiêu hóa, nhưng ở trẻ sơ sinh thường gây
ra nhiễm trùng rất nặng, có thể dẫn đến tình trạng nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não
và viêm xương. Ở những người khỏe mạnh, nhiễm trùng do nhiễm độc thức ăn thường
tự khỏi sau 2- 5 ngày rồi tự khỏi.
1.4.7 Nguồn gốc lây nhiễm
Các sản phẩm thịt nói chung, nhất là thịt gia cầm và thịt lợn. Tất cả các thức ăn
tươi sống có nguồn gốc động vật đều có thể là nguồn vi khuẩn Salmonella. Vi khuẩn
này sống tự do trong ruột động vật và có trên lông. Gia cầm có nhiều Salmonella nhất,
tiếp theo là các động vật nuôi trong nhà và động vật hoang (vẹt, rùa, chó, ếch, chim
mông biển, loài gặm nhấm, rắn). Vi khuẩn này có thể có trong thành phần dẫn xuất các
chất từ động vật như gelatin hoặc nước bọt động vật, bởi côn trùng, loài gặm nhấm,
chim hoặc các sản phẩm thịt nhiễm khuẩn gây nhiễm vào thực phẩm. Ngoài ra có thể

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh

Trang 17


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

bị nhiễm từ người khỏe mạnh có mang vi khuẩn này. Thực phẩm có nguồn gốc thực
vật ít có nguy cơ nhiễm khuẩn. Vĩ lí do bị ức chế bởi pH < 4 và có mặt vi khuẩn lactic
nên các sản phẩm lên men ít bị nhiễm. Trứng và các sản phẩm trứng ví dụ như bột
nhào, nước sốt mayonnaise, protit đông tụ tách từ sữa, gia cầm là nguồn mang nhiều
Salmonella, nên trứng của nó cũng bị nhiễm vĩ vi khuẩn này có thể xuyên qua vỏ trứng
và sinh sản trong lòng đỏ trứng.
Các sản phẩm sữa như sữa không thanh trùng, phomát từ sữa tươi, kem chất
béo sữa, và các sản phẩm từ sữa nói chung được chế biến từ các nông trại, các thiết bị
đều có thể gây nhiễm vào nguyên liệu, tạo môi trường thuận lợi choSalmonella, và từ
đó gây nhiễm độc cho sản phẩm sữa. Neu tiến hành axit hóa chậm thi vi khuẩn dễ
dàng sinh sản trong phomát nhưng nó bị phá hủy với pH < 4,5. Những sản phẩm có
sữa phải được giám sát chặt chẽ bởi chúng không được thanh trùng nữa, vì vậy nếu có
Salmonella trong sữa bột thi chúng vẫn có thể sinh sản được bởi chúng có khả năng
tồn tại ở điều kiện khô hạn và lây nhiễm sang các sản phẩm khác.

CHƯƠNG 2

PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SALMONELLA

2.1 Phương pháp truyền thống
2.1.1 Nguyên tắc
Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một qui trình bao
gồm 4 bước: bước tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella

thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với
một số lượng lớn vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh, ức
chế sự tăng trưởng của Salmonella.
2.1.2 Một số môi trường hóa chất
 Buffered pepton water (BPW)

 Rappaport Vassiliadis Soya Pepton (RVS)
 Malachite Green Magnesium Chloride
 Tetrethionate Muller- Kauffmanm ( MKTTn)

Trang 18

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

 Xylose Lysine Deoxycholate (XLD)
 Hektoen Entric Agar (HE)
 Bismuth Sulphite Agar (BS)
 Brillian Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS)
 Triple Sugar Iron (TSI)
 Urea
 Lysine Decarboxylase
 Ornithine Decarboxylase
 Manitol
 Sucrose
 Sorbitol
 Tryptone
 Thuốc thử Kovac’s
 Kháng huyết thanh Salmonella đa giá
2.1.3 Các bước thực hiện
9

Bước tăng sinh:

Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu mà cần chọn qui trình tăng sinh
phù hợp. Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường là 1:9 nhưng có thể thay đổi.
Đối với các loại mẫu thông thường, tiến hành cân 25g mẫu vào túi PE vô
trùng,bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở
37oC trong 18-24 giờ. Đối với một số loại mẫu có chứa các chất gây độc hoặc ức chế
sự phát triển của Salmonella cần tiến hành quy trình đặc biệt.
Đối với thịt gia cầm tươi sống: đặt gia cầm trong túi PE lớn, cho thêm 1 lít
BPW, lắc bằng máy lắc 30 giây để môi trường thấm vào toàn bộ mẫu.
Đối với mẫu sữa khô: cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng , cho thêm 225ml BPW,
để yên ở nhiệt độ phòng khoảng 60 phút. Sau đóa lắc cho tan hoàn toàn .

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh

Trang 19


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

Đối với các mẫu gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị: đồng nhất
mẫu với tỉ lệ 1/100 trong BPW( thay vì 1/10 như bình thường) trước khi tăng sinh.
Biện pháp này nhằm giảm nồng độ các chất ức chế sự sinh trưởng của Salmonella
trong bước tăng sinh.
Đối với các loại mẫu như casein , phomat, bơ và các sản phẩm tương tự khác:
thực hiện đồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh đã được làm ấm đến 40 oC.
Đối với các sản phẩm chứa coca: đồng nhất mẫu trong môi trường Skim Milk
Broth được làm ấm đến 40 oC.

Đối với dừa, các sản phẩm từ dừa và các mẫu có hàm lượng chất béo cao: đồng
nhất mẫu trong môi trường BPW, sau đó cho thêm 2-3 giọt Triton X-100 trước khi ủ
tăng sinh.
10

Bước tăng sinh chọn lọc:

Các môi trường tăng sinh chọn lọc dùng dể phát hiện Salmonella trong mẫu thực
phẩm là Rappaport Vassiliadis (RV), Selenite Cystein Broth,Tetrathionate Mueler
KauíẾmanm Broth (TT)...những nghiên cứu gàn đây cho thấy môi trường RV có thể thay thế
cho các môi trường khác. Hiện nay, người ta khuyến khích là nên dùng ít nhất 2 loại môi
trường tăng sinh chọn lọc để phát hiện tất cả Serotype Salmonella nếu có hiện diện trong mẫu.

11

Bước phân lập

Nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quàn thể vi sinh vật khác trong
mẫu. Nhiều loại môi trường rắn khác nhau được sử dụng để phân lập Salmonella. Hiện
nay, vcác tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích sử dụng ít nhất 2 loại
môi trường phân lập khác nhau để tăng cường khả năng phát hiện tất cả các dòng
Salmonella, đặc biệt là môi trường XLD được sử dụng nhiều nhất.
12

Bước khẳng định

Nhằm xác định lại các khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella xuất hiện trên môi
trường phân lập. Bước này được thực hiện trên các thử nghiệm sinh hóa và các thử
nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salomonella. Các thử nghiệm sinh hóa được khuyến
khích sử dụng là KIA/TSI, Indol, LDC (lysine decarboxylase), ODC (omithine

decarboxylase), urea, Manitol, sorbitol, các thử nghiệm huyết thanh O hay H.
13

Báo cáo kết quả
Qui trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính Salmonella, giúp

Trang 20

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong 25 g mẫu, không cho phép phân
biệt được các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu. Để khẳng định được tên chủng
Salmonella phân lập được cần phải tiến hành thử nghiệm ngưng kết với các loại kháng
huyết thanh đơn giá khác nhau hay cần gửi các chủng Salmonella phân lập được đến
các phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh vật.
Cần lưu ý Salmonella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm. Do vậy càn
tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Salmonella dùng làm
đối chứng (+) cũng như khi thao tác trên các chủng phân lập được. Các môi trường
hay mẫu vật sau khi nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa.

2.2 Phương pháp hiện đại
Với phương pháp truyền thống sẽ mất thời gian dài từ 3 đến 5 ngày, do đó các
chuyên gia của các hãng phát triển các phương pháp nhanh để rút ngắn thời gian phân
tích, độ chính xác cao và các bước đơn giản hơn. Với bộ dụng cụ sàng lọc và kiểm tra
nhanh được sẵn để sử dụng với các công nghệ khác nhau như công nghệ môi trường

tiên tiến, lai DNA, PCR hoặc Real time PCR. Tất cả các công nghệ đều trải qua quá
trình tăng sinh và sử dụng kỹ thuật chuyên biệt của từng hãng để phát hiện Salmonella
và thời gian có kết quả không quá 48 giờ.
2.2.1 Phương pháp định tính Salmonella sử dụng kit thử nhanh 3MTM PetrifilmTM
Salmonella Express System
14

Nguyên tắc.

Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô có chọn
lọc, sau đó sử dụng 1 đĩa sinh hóa bổ sung để khẳng định chính xác sự có mặt của
Salmonella. Dung dịch mẫu sẽ được tăng sinh Salomonella trong môi trường “3M
Salmonella Enrichment Base plus 3M Salmonella Enrichment Supplement medium”
sau đó cấy chuyển sang đĩa đếm 3M TM PetrifilmTM Plate ủ ở 41,5oC trong 24±2h, các
khuẩn lạc có mầu nâu đỏ hoặc vàng trên đĩa đếm 3M TM PetrifilmTM Plate và chuyển
màu xanh sau khi đặt đĩa khẳng định sinh hóa 3M TM PetrifilmTM Salmonella Epress
Confirmation Disk lên chính là những khuẩn lạc Salmonella.
15

Môi trường – thuốc thử
Môi trường R-V R10 (RAPPAPORT-VASSILIADIS R10 BROTH)
Bộ test nhanh 3MTM PetrifilmTM Salmonella:

 Dung dịch 3M Salmonella Enrichment Base

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh

Trang 21

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

 Chất bổ sung 3M Salmonella Enrichment Supplement
 Đĩa đếm 3MTM PetrifilmTM Plate
 Đĩa khẳng định sinh hóa 3MTM PetrifilmTM Salmonella Epress Confirmation Disk.

Hình 2.1 Bộ test nhanh 3MTM PetrifilmTM Salmonella
16

Thiết bị phụ trợ
Thiết bị trộn mẫu
Tủ ấm
Thiết bị đếm khuẩn lạc
Nồi hấp tiệt trùng

17

Quy trình
a.

Các bước thực hiện

Bước 1: Tăng sinh Salomonella: trộn X(g) mẫu (X<25g) với Y(ml) dung
dịch tăng sinh “3M Salmonella Enrichment Base plus 3M Salmonella Enrichment
Supplement medium” với tỉ lệ X/Y=1/9 , ủ ở 41,5oC trong 18h.
Đối với nền mẫu nhiễm vi khuẩn cao (>10 4CFU/g): chuyển 0,1ml dịch
đã tăng sinh vào 10ml môi trường R-V R10 (RAPPAPORT-VASSILIADIS R10
BROTH), ủ ở 41,5oC trong 8h, sử dụng dịch mẫu sau bước ủ này làm mẫu thử.

Bước 2: Cấy 0,01 ml dịch mẫu sau tăng sinh lên đĩa Petrifilm, ủ ở
41,5 C trong 24±2h. Đánh dấu những khuẩn lạc nghi ngờ (có màu đỏ nâu hoặc vàng
sáng).
o

Bước 3: Đặt thêm đĩa khẳng định sinh hóa vào, tiếp tục ủ ở 41,5 oC trong

Trang 22

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

4-5h và đọc kết quả ngay sau khi ủ.
b.

Báo cáo kết quả thử nghiệm.

Mẫu dương tính: Khuẩn lạc đã được đánh dấu chuyển màu xanh
Mẫu âm tính: Không có sự chuyển màu của khuẩn lạc được khoanh hay không
có khuẩn lạc nghi ngờ được đánh dấu.

Hình 2.2 Mẫu dương tính với Salmonella
2.2.2 Phương pháp định tính Salmonella sử dụng kit thử nhanh IRIS Salmonella
18

Nguyên tắc.

Đây là phương pháp phát hiện nhanh Salmonella trong thực phẩm, sữa, trứng,
thức ăn chăn nuôi và mẫu môi trường trong vòng 37 giờ dựa vào sự phát triển và hình
thành khuẩn lạc đặc trưng trong môi trường chọn lọc của Salmonella. Mẫu sẽ được
tăng sinh Salmonella trong môi trường Salmonella Enrichment, sau đó được cấy
chuyền sang môi trường trường IRIS Salmomella Agar ủ ở 37±1oC với thời gian 24±3
h. Các khuẩn lạc có màu hồng sau ủ chính là khuẩn lạc Salmonella.
19

Môi trường – thuốc thử
Bộ kit thử nhanh IRIS SalmonellaR:

 Salmonella Enrichment
 IRIS Salmonella Supplement
 IRIS Salmomella Agar
20

Thiết bị phụ trợ
Thiết bị trộn mẫu

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh

Trang 23


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm

Nhóm 6

Tủ ấm

Thiết bị đếm khuẩn lạc
Nồi hấp tiệt trùng
21

Quy trình
a

Các bước thực hiện

Bước 1: Tăng sinh Salmonella: cân X(g) mẫu (X<25g), bổ sung Y(ml) môi
trường Salmonella Enrichment với tỉ lệ X/Y=1/9 (g/ml) và thêm Z(ml) chất bổ sung
chọn lọc IRIS Salmonella Supplement với tỉ lệ Z/X=1/10(ml/g). Ủ ở nhiệt độ
41,5±1oC với thời gian 18±2 giờ.
Bước 2: Cấy 0,01ml dung dịch mẫu sau tăng sinh lên môi trường IRIS
Salmomella Agar. Ủ ở nhiệt độ 37±1oC với thời gian 24±3 giờ.
Đọc kết quả ngay sau khi kết thúc ủ.
c.

Báo cáo kết quả thử nghiệm.

Mẫu xuất hiện khuẩn lạc màu hồng là mẫu có chứa Salmonella

Hình 2.3 Mẫu âm-dương tính với Salmonella
2.2.3 Phương pháp phát hiện Salmonella sử dụng bộ kit xét nghiệm MCC test
(Mỹ)
22

Nguyên tắc.

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi màu của chất chỉ thị màu đặc trưng

được gắn trên các que thử của bộ kit xét nghiệm MCC test (Mỹ) khi có mặt của
các enzym đặc trưng sinh ra bởi Salmonella.

Trang 24

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh


Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm
23

Nhóm 6

Môi trường – thuốc thử
Nước dùng để pha loãng mẫu
Bộ kit thử E.coli - MCC test:

 Dung dịch Buffer
 12 que thử Salmonella (Salmonella test trip)/ 12 que thử E.coli (E.coli test trip)

Hình 2.4 Bộ kit thử E.coli/Salmonella MCC Test
24

Quy trình
a

Các bước thực hiện

Bước 1: Rửa mẫu hoặc pha loãng mẫu cần phân tích bằng nước vô trùng.
Bước 2: Lấy 32ml của phần nước rửa mẫu/ huyền phù đã pha loãng đựng vào

trong túi nhựa.
Mở chai nước rửa buffer, thêm 3 giọt của buffer, thực hiện thao tác bóp dung
dịch trong túi nhựa 5 giây, để yên trong 3-4 phút.
Bước 3: Mở túi MCC test và lấy test trip (tùy thuộc vào mục đich xác định
E.coli hay Salmonella sẽ sử dụng E.coli test trip hay Salmonella test trip)
Mở bao nhựa và nhúng test trip trong dung dịch để 30 giây
Lấy test trip ra, đặt lên bề mặt sạch và đợi trong 20 phút cho kiểm tra
Salmonella và 45-50 phút cho kiểm tra E.coli rồi đọc kết quả.
d.

Báo cáo kết quả thử nghiệm.

Test trip không có màu là âm tính, chuyển màu là dương tính với vi khuẩn:

GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh

Trang 25