BÁO CÁO THỰC TẬP SINH HỌC PHÂN TỬ

BÁO CÁO THỰC TẬP SINH HỌC PHÂN TỬ
Bài 2: Pha đệm điện di
- Các loại nồng độ thường được sử dụng trong sinh học phân tử: µg/ml, mM,
µM, U/µL…
- Tính nồng độ các hóa chất trong TBE 1x:
Số mol Tris base = x 1000 8.92 mmol
 Nồng độ mol của Tris base = = 89.2 mM
Số mol acid boric = x 1000 8.90 mmol
 Nồng độ mol của acid boric = = 89 mM

1


Bài 3: Biến nạp
Giải thích các bước:
ST
T
1

2

3

4

5

Tiến hành

Giải thích mục đích

Lấy ống tế bào khả biến từ tủ -80oC, đặt
vào hộp đá, ủ 5-10 phút cho hỗn hợp
trong ống thành dạng lỏng.
Để 40µL tế bào khả biến vào ống 1.5mL
và bổ sung 2µL plasmid, trộn đều bằng
cách đập nhẹ vào thành ống, để trong
đá 10 phút.
Chuyển ống vào bể ổn nhiệt 42oC, ủ 1
phút, nhanh chóng chuyển ngay lại hộp
đá để 1-2 phút
Bổ sung 950 µL LB lỏng, giữ ở trạng
thái tĩnh trong 15 phút ở 37oC sau đó
lắc trong 30 phút.
Hút 50 µL dung dịch tế bào cho vào đĩa
LB có bổ sung ampicilin, nhanh chóng
gạt đều dung dịch tế bào trên mặt
thành.
Pha loãng dung dịch tế bào khả biến
ban đầu 5000 lần, lấy 50 µl trải trên đĩa
LB không có ampicilin.
Chuyển các đĩa vào tủ ấm nuôi cấy qua
đêm.

Hỗn hợp ở dạng lỏng
mới pha trộn được ở
các bước tiếp theo.
Tăng khả năng gặp
nhau của plasmid và
các tế bào khả biến.

2

Sốc nhiệt cho màng tế
bào dãn ra để các
plasmid đi vào tế bào
Để tế bào ổn định lại.

Nuôi cấy vi khuẩn để
đánh giá hiệu quả
biến nạp.


Bài 4: Tách plasmid

ST
Tiến hành
T
1 Cho 1.5ml môi trường nuôi
cấy qua đêm vào ống
eppendorf, ly tâm
10000rpm- 5’ – 4oC. Bỏ
phần dịch nổi, để cặn tế bào
khô.
2 Hòa cặn trong 100µL Sol I
→ vortex → ủ nhiệt độ
phòng 5 phút.

3

4

5

6

7

Giải thích tác dụng
Thu tế bào để làm thí nghiệm

Phá vỡ màng tế bào giải phóng các
thành phần trong tế bào, EDTA ức
chế hoạt động của các kim loại hóa
trị II là coenzym của các enzym thủy
phân nhờ đó bảo vệ DNA.
Thêm 200µL Sol II → đảo 3 - Sol II có tác dụng tạo pH biến
lần, ủ trên đá 3 phút.
tính DNA sợi đôi thành sợi đơn.
- Đảo 3 lần để các sợi đôi tách hẳn
- Ủ đá 3 phút để tránh Sol II kết tủa
làm đứt gãy plasmid.
Thêm 150 µL Sol III → đảo
Tạo môi trường hồi tính ổn định lại
5 lần, ủ trên đá 5 phút.
DNA, các DNA plasmid có kích
thước nhỏ hơn hồi tính nhanh hơn,
còn DNA của vi khuẩn kích thước
lớn hồi tính chậm nên kết tủa cùng
SDS.
o

Ly tâm 12000rpm – 4 C – 10 Cặn là DNA của vi khuẩn nên không
phút → thu dịch trong được thu.
400µL.
Bổ sung 1 thể tích phenol:
Kết tủa protein
chloroform:isoamyl (25:24:1)
→ vortex
Ly tâm 12000rpm– 4oC – 5
Loại bỏ protein
phút → thu dịch trong được
3


300µL.
8 Thêm 0.6 thể tích
isopropanol → đảo 3-5 lần,
ủ nhiệt độ phòng 17 phút
9 Ly tâm 12000rpm– 4oC – 15
phút → bỏ dịch nổi
10 Bổ sung EtOH 70% lạnh
11 Ly tâm 12000rpm– 4oC – 5
phút → bỏ dịch nổi, để khô
tủa.

Kết tủa các chuỗi acid nucleic tỷ
trọng cao, các mảnh acid nucleic tỷ
trọng thấp không bị kết tủa.
Loại bỏ các mảnh DNA tỷ trọng thấp
trong dịch nổi
Loại bỏ NaOH, SDS, CH3COOK

Bỏ dịch EtOH chứa tạp chất

Các phương pháp tách plasmid khác:
- Phương pháp đun sôi.
- Phương pháp dựa vào Lithium.

4


Bài 5: Xác định nồng độ DNA
Kết quả:
Nhóm
2.1
2.2
2.3
2.4

Nồng độ
(ng/µL)
2612
1593
2186
1393

A260

A280

A260/ A280

52,25
31,88
43,74
27,86

25,23
15,4
20,85
13,6

2,07
2,07
2,1
2,05

Nhận xét:
Nồng độ DNA cao hơn hai tổ 2.2 và 2.4 nhờ thu được nhiều dung dịch hơn
ở bước 7 nhưng tại bước 5 chỉ thu được 400µL dung dịch nên thấp hơn tổ
2.1
Tỷ lệ A260/ A280 là 2,1, cao nhất trong cả 4 tổ, tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,82,0 là đạt yêu cầu nên kết quả chưa đạt, có thể do DNA bị biến tính, đứt
gãy, phân hủy một phần.

5


Bài 6 : Xử lý plasmid với enzym cắt giới hạn.
Để xử lý không hoàn toàn plasmid có thể giảm lượng enzym EcoRI và/hoặc
giảm thời gian ủ.
Để xử lý hoàn toàn plasmid có thể tăng lượng EcoRI và/hoặc tăng thời gian ủ.

Bài 7 : PCR phân đoạn gen đặc hiệu.
- Vai trò của các thành phần trong phản ứng PCR:
Thành phần
H2O
Đệm 10X
(MgCl2 20mM)

dNTP (2mM)
M13F (10µM)
M13R (10µM)
Taq polymerase
(2U/µL)
DNA khuôn

Vai trò
Môi trường cho phản ứng xảy ra.
Cân bằng pH cho hoạt động của enzym
Taq polymerase.
Ion Mg2+ là cofactor của enzym Taq
polymerase.
Gồm 4 loại nucleotide là nguyên liệu để
tổng hợp DNA
Gắn vào sợi DNA khuôn để enzym Taq
polymerase bám vào.
Gắn vào sợi DNA khuôn để enzym Taq
polymerase bám vào.
Xúc tác tổng hợp DNA có thể hoạt động ở
nhiệt độ cao.
Khuôn tổng hợp sợi bổ sung

Nồng độ
2 mM

2/15 mM
2/3 µM
2/3 µM
1/15 U/µL
µg/µL

Tính nồng độ DNA khuôn:
Nồng độ DNA ở bài 5 là: 2186 µg/µL
Lấy 3 µL DNA ở bài 5 chuyển sang phản ứng tách plasmid ở bài 6 và lấy sản
phẩm pha loãng 2 lần thực hiện phản ứng PCR ở bài 7 nhưng kết quả điện di
ở bài 9 cho thấy phản ứng không xảy ra hoàn toàn nên không thể tính chính
xác lượng DNA khuôn cho phản ứng PCR được.

6


Bài 8: MULTIPLEX PCR
Thành phần
H2O
Đệm 10X
(MgCl2 20mM)
dNTP (2mM)
Mồi F1 (10µM)
Mồi R1 (10µM)
Mồi F2 (10µM)
Mồi R2 (10µM)
Taq polymerase

(2U/µL)
DNA khuôn
Tổng thể tích

Thể tích (µL)
6

Nồng độ

1,5

2 mM

1
1
1
1
1
0,5

2/15 mM
2/3 µM
2/3 µM
2/3 µM
2/3 µM
1/15 U/µL

2
15

Tính nồng độ DNA khuôn: tương tự như bài 7 - không thể tính chính xác được.

Bài 9: Điện di các sản phẩm DNA trên gel Agrasoe
- Thành phần và tác dụng của dye điện di:
+ Glycerol : có tỷ trọng lớn kéo sản phẩm DNA xuống giếng nếu không
DNA sẽ lơ lửng trên buffer mà không xuống được giếng.
+ Chất chỉ thị màu (thường dùng Bromophenol Blue) di chuyển cùng với
DNA để ta quan sát được quá trình điện di đã đi đến vị trí nào.
+ EDTA: liên kết với các nhóm kim loại hóa trị II để tránh ảnh hưởng đến
quá trình điện di, bảo vệ DNA.
- Thang chuẩn (marker) là một tập hợp các đoạn DNA đã biết trước kích
thước do nhà sản xuất cung cấp, có nồng độ đủ cao để thấy được trên
gel agarose khi điện di. Tác dụng: ước lượng được kích thước của DNA
bằng mắt thường nhờ so sánh với vị trí của băng DNA tương ứng với
marker.

Bài 10: Phân tích kết quả
 Bài 3 : Biến nạp:
7


- Số khuẩn lạc thu được:
+ Đĩa có ampicillin: do gạt không đều và phần trung tâm mọc quá dày
nên không thể đếm chính xác số lượng khuẩn lạc. Ước tính có khoảng
5000 khuẩn lạc.
+ Đĩa không có ampicillin: 819 khuẩn lạc.
- Hiệu suất biến nạp = 0,122%.
- So sánh kết quả biến nạp với các tổ trong nhóm:
+ Số khuẩn lạc mọc trong môi trường không có ampicilin lớn nhất nhưng số
khuẩn lạc trong môi trường có ampicillin lại ít hơn tổ 1 và tổ 2 có thể do các tổ

còn lại để que gạt nóng (trong trường hợp mọc ít) hoặc nhiễm khuẩn đĩa làm vi
khuẩn chết.
+ Hiệu suất thấp hơn tổ 1 và tổ 2 nhưng do lượng khuẩn lạc mọc trên môi
trường bình thường lớn nên hiệu suất biến nạp như vậy có thể coi là đạt.
Ảnh điện di:

8


 Bài 4: Tách plasmid.
- Ảnh điện di có 2 băng, băng đi xa hơn là dạng siêu xoắn của plasmid,
băng đi ngắn hơn là các mảnh plasmid bị đứt gãy thành mạch thẳng do
plasmid có ở dạng siêu xoắn có kích thước gọn đi được nhanh hơn dạng
mạch thẳng bị đứt gãy.
- Đánh giá kết quả tách plasmid tốt hay không dựa vào băng dạng siêu
xoắn phải đậm rõ nét, băng dạng đứt gãy mạch thẳng mờ, ngắn. Kết quả
điện di của tổ: băng dạng siêu xoắn khá đậm nhưng băng dạng đứt gãy
mạch thẳng cũng đậm và dài có thể do trong quá trình vận chuyển, pha
trộn làm đứt gãy plasmid, còn sót lại enzym nuclease cắt plasmid, lẫn
các mảnh DNA của vi khuẩn.
Các bài 6,7,8 do không có thông tin về marker nên không xác định được
kích thước DNA.
 Bài 6: Xử lý plasmid với enzym cắt giới hạn.
- Sau khi điện di thu được 2 băng: một băng sắc nét đi xa hơn là DNA
dạng vòng, băng còn lại là DNA dạng mạch thẳng.
- Kết quả như vậy cho thấy phản ứng xử lý không hoàn toàn do vẫn còn
plasmid dạng vòng.
 Bài 7: PCR nhân đoạn gen đặc hiệu
- Mẫu đối chứng âm không lên băng chứng tỏ không bị nhiễm DNA, mẫu
kiểm tra lên 1 băng mờ.

9


- Kết quả PCR lên băng mờ, không rõ có thể do nồng độ DNA sau phản
ứng PCR thấp do DNA khuôn là kết quả từ bài 6 phản ứng xử lý không
hoàn toàn, tra mẫu vào giếng không chính xác làm mẫu trôi ra ngoài.
 Bài 8: Multiplex PCR
- Mẫu đối chứng âm không lên băng chứng tỏ không bị nhiễm khuẩn, mẫu
kiểm tra lên 2 băng mờ.
- Kết quả PCR lên đủ 2 băng cho thấy phản ứng PCR phản ứng tốt với hai
cặp mồi nhưng hiệu quả chưa cao do thu được nồng độ DNA nhỏ khiến
băng mờ hoặc tra DNA vào giếng chưa chính xác.
 Bài 9: Điện di
So với các tổ còn lại trong nhóm, tổ có hình ảnh điện di tốt hơn ở chứng
âm không lên băng (tổ 2 chứng âm lên băng) và phản ứng PCR đặc hiệu
hơn giúp lên băng chính xác (ở các nhóm còn lại multiplex PCR không
lên băng, PCR đặc hiệu lên 2 băng có thể do bị nhiễm khuẩn), nhưng
băng còn mờ chưa rõ nét và trong tách plasmid chưa xảy ra hoàn toàn.

10