KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LIGNIN VÀ CELLULOSE TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ TỰ NHIÊN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LIGNIN VÀ CELLULOSE
TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM ĐƯỢC PHÂN LẬP
TỪ TỰ NHIÊN

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN NGÔ YẾN NGỌC

Niên khóa

: 2009 - 2013

Tháng 6/2013
1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LIGNIN VÀ CELLULOSE

TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM ĐƯỢC PHÂN LẬP
TỪ TỰ NHIÊN

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. LƯƠNG BẢO UYÊN

NGUYỄN NGÔ YẾN NGỌC

TS. BÙI MINH TRÍ

Tháng 6/2013
2


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và trao dồi kiến thức tại trường Đại học Nông Lâm
thành phố Hồ Chí Minh, với sự giúp đỡ, chỉ dạy tận tình của các Thầy Cô; sự hỗ trợ
nhiệt tình từ bạn bè, sự động viên, chia sẻ và là nguồn động lực từ gia đình, tôi có cơ
hội thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Với lòng biết ơn sâu sắc:
Tôi xin cảm ơn quý Thầy Cô, Anh Chị trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và
Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường trường Đại Học Nông Lâm
thành phố Hồ Chí Minh; các Thầy Cô, Anh Chị và các bạn tại Bộ Môn Sinh Hóa
trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và truyền đạt nhiều
kiến thức quý báu trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Thầy Bùi Minh Trí, Cô Lương
Bảo Uyên và Anh Trần Văn Khuê đã hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện giúp đỡ cũng
như củng cố kiến thức cho tôi để có thể hoàn thành khóa luận.

Xin cảm ơn nhóm Kute8girl, Anh Hiếu, bạn Đạt, Khanh, Linh và Kha đã luôn
bên cạnh động viên, chia sẽ và giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong học tập và trong
cuộc sống. Cảm ơn các anh chị khóa DH08SH, các anh chị em trong phòng thí nghiệm
Công Nghệ Sinh Học Thực Vật và cùng toàn thể các bạn lớp DH09SH luôn gắn bó với
tôi trong suốt chặng đường đại học.
Và tôi xin gửi lời cảm ơn thân thương và sâu sắc nhất đến Cha Mẹ và Chị tôi,
những người luôn yêu thương và quan tâm tôi nhất, những người mang lại cuộc sống
này cho tôi, làm tôi luôn hướng về cuộc sống tốt đẹp và không ngừng nỗ lực để đi tìm
cuộc sống tươi đẹp cho chính bản thân.
Cuối cùng xin chúc trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh và
trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên ngày càng lớn mạnh. Chúc quý Thầy Cô gặt hái
được nhiều thành công và luôn tràn đầy sức khỏe.
Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 6 năm 2013
Nguyễn Ngô Yến Ngọc

i


TÓM TẮT
Nhu cầu về nhiên liệu ngày càng gia tăng, nhưng nguồn nhiên liệu thì ngày càng cạn
kiệt, trong khi đó, một lượng lớn lignocelluloses chứa trong các phụ, phế phẩm nông nghiệp
vẫn chưa được tận dụng triệt để. Nhiều phương pháp xử lý đã được tiến hành nhưng hiệu
quả chưa cao và không có tính bền vững đối với môi trường. Do đó, khóa luận “Khảo sảt
khả năng phân hủy lignin và cellulose từ một số chủng nấm phân lập được từ tự nhiên” đã
được tiến hành nhằm tìm ra các chủng nấm có hoạt tính phân hủy lignin tốt cho phép loại
bỏ lignin từ các nguồn phế thải nông nghiệp để sử dụng tối đa nguồn cellulose tiến tới sản
xuất nhiên liệu sinh học hoàn toàn bằng con đường sinh học.
Các chủng nấm phân lập đã được khảo sát khả năng phân hủy lignin và cellulose dựa
trên tốc độ lan tơ và đường kính vòng phân giải trên môi trường cơ chất lignin và CMC,
nhằm mục đích loại bỏ các chủng có hoạt tính yếu và tuyển chọn các chủng có hoạt tính vượt

trội hơn. Sau đó các chủng nấm này tiếp tục được tuyển chọn dựa trên cơ sở xác định hoạt
tính enzyme bao gồm Lignin peroxidase (LiP), Mangan peroxidase (MnP) và Cellulase.
Nghiên cứu này cũng tiến hành khảo sát nhằm xác định loại môi trường và thời gian nuôi
cấy cho phép tối ưu hóa khả năng sinh tổng hợp enzyme phân giải lignin và cellulose.
Trong 25 chủng nấm đã phân lập và thu nhận được, có 4 chủng: 5; 10; 14 và P201
được đánh giá là có hoạt tính cao hơn so với các chủng còn lại. Sau thí nghiệm xác định
hoạt tính enzyme, chủng 10 (với các giá trị: 163,391 UI/L đối với enzyme LiP; 0,838 UI/L
đối với enzyme MnP và 1098,914 UI/L đối với enzyme cellulase) được nhận xét là chủng
có hoạt tính cao nhất trên cả hai hệ ligninase và cellulase. Chủng này được tiếp tục đi vào
thí nghiệm khảo sát thời gian và loại môi trường tối ưu cho sự sinh tổng hợp enzyme phân
giải lignin và cellulose. Kết quả cho thấy, môi trường Avicel thích hợp cho sự biểu hiện
của hệ enzyme cellulase, còn môi trường PGB lại thích hợp cho sự biểu hiện đối với hệ
enzyme ligninase. Thời gian tối ưu cho sự biểu hiện các enzyme này là từ ngày thứ 3 đến
ngày thứ 5 kể từ khi bắt đầu nuôi cấy. Hoạt tính LiP cao nhất vào ngày thứ 5 (223,587
UI/L) trên môi trường PGB; hoạt tính MnP cao nhất vào ngày thứ 3 (0,935 UI/L) cũng
trên môi trường PGB. Đối với hệ cellulase, hoạt tính đạt giá trị cao nhất (2340,148 UI/L)
vào ngày 3 trên môi trường Avicel.

ii


SUMMARY
Thesis entitled "Investigation of lignin and cellulose biodegradation of some
fungal strains isolated from nature" was conducted in order to to find out active strains
those can well decompose and remove lignin from agricultural waste sources for the
production of biofuels by biological pathways.
Thesis research included four main contents. The first, fungal strains were
isolated from nature. The next step, the thesis assessed the degree of lignin and
cellulose degradation based on speed and diameter of round-resolution on the lignin
medium and CMC medium. The the experiment was expected to select outstanding

strains in biomass degradation ability. Then, the selected strains were determined
enzyme activities including Lignin peroxidase, Mangan peroxidase and Cellulase.
Finally, we also tested factors those could affect the biosynthesis of lignin and
cellulose enzymes.
From 25 samples were taken and isolated, it was indicated that the 4 strains:
strains 5, 10, 14 and P201 were superior as compared with other strains. Based on
enzyme assay, the strain 10 shown up to 163.391 UI/L; 0.838 UI/L and 1098.914 UI/L
for LiP, MnP and cellulase activities, respectively. This strain was considered to be
the most highly active on both ligninase and cellulase systems. In experiment - time
and medium survey for the biosynthesis of lignin and cellulose enzymes, the results
showed that Avicel medium was suitable for the biosynthesis of cellulase enzyme;
PGB medium was suitable for biosynthesis enzyme ligninase system. The optimal time
for the enzyme activity was from the third to the fifth day of incubation. LiP activity
was the highest on the fifth day in PGB medium; with a value of 223.587 UI/L. MnP
activity reached maximal value on the third day in PGB medium with a value of 0.935
UI/L. For cellulase enzyme systems, enzyme activity on Avicel medium was higher
than on PGB medium and achieved the highest value on the third day with a value of
2340.148 UI/L.
Keywords: Lignin peroxidase, Mangan peroxidase, Cellulase, Phanerochate
chrysosporium, ligninase, lignocelluloses.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .......................................................................................................................i
Tóm tắt ........................................................................................................................... ii
Summary ....................................................................................................................... iii
Mục lục ..........................................................................................................................iv

Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... vii
Danh sách các bảng .................................................................................................... viii
Danh sách các hình ........................................................................................................ix 
Chương 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................................. 1 
1.2 Yêu cầu của đề tài................................................................................................................. 2 
1.3 Nội dung thực hiện ............................................................................................................... 2 
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................................... 3 
2.1. Tổng quan về giới nấm ........................................................................................................ 3 
2.1.1. Đặc điểm chung của giới Nấm ......................................................................................... 4 
2.1.1.1 Đặc điểm chung về cấu tạo ............................................................................................. 4 
2.1.1.2 Phương thức dinh dưỡng ................................................................................................ 4 
2.1.1.3 Phương thức sinh sản...................................................................................................... 4 
2.1.2 Vai trò của nấm ................................................................................................................. 4 
2.2 Tổng quan về lignocellulose ................................................................................................. 5 
2.3 Tổng quan về hemicellulose ................................................................................................. 7 
2.4. Cellulose và quá trình phân hủy cellulose ......................................................................... 7 
2.4.1 Tổng quan về cellulose ...................................................................................................... 7 
2.4.2. Hệ enzyme phân hủy cellulose – cellulase ....................................................................... 8 
2.4.2.1 Enzyme exoglucanase ................................................................................................... 9 
2.4.2.2 Enzyme endoglucanase .................................................................................................. 9 
2.4.2.3 Enzyme β-glucosidase ................................................................................................. 10 
2.4.3 Ứng dụng của hệ enzyme cellulase ................................................................................. 10 
2.5. Lignin và quá trình phân hủy lignin .................................................................................. 10 
2.5.1 Sơ lược về lignin.............................................................................................................. 10 
2.5.2 Thành phần cấu trúc của lignin........................................................................................ 12 
iv


2.5.3 Các phương pháp xử lý loại bỏ lignin trong sản xuất cồn sinh học ................................ 13 

2.5.4. Hệ enzyme tham gia phân hủy lignin (Ligninase) .......................................................... 14 
2.5.4.1 Lignin peroxidase (LiP) ................................................................................................ 14 
2.5.4.2 Mangan peroxidase (MnP) ........................................................................................... 15 
2.5.4.3 Laccase ......................................................................................................................... 16 
2.5.4.4 Các enzyme khác .......................................................................................................... 16 
2.5.5 Ứng dụng của các enzyme phân hủy lignin..................................................................... 17 
2.5.6 Nấm và sự phân hủy lignin .............................................................................................. 17 
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 21 
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................................... 21 
3.2. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................................ 21 
3.2.1 Thu nhận mẫu .................................................................................................................. 21 
3.2.2. Thiết bị và hóa chất sử dụng ........................................................................................... 21 
3.2.2.1 Dụng cụ và thiết bị ....................................................................................................... 21 
3.2.2.2 Hóa chất sử dụng .......................................................................................................... 21 
3.3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................................... 22 
3.3.1. Phân lập và bảo quản các chủng thu nhận được ............................................................. 23 
3.3.1.1 Phân lập mẫu ................................................................................................................ 23 
3.3.1.2 Làm thuần và giữ giống ................................................................................................ 24 
3.3.2. Định tính khả năng phân hủy Lignin/CMC .................................................................... 24 
3.3.2.1 Khảo sát khả năng phân hủy lignin/CMC dựa vào sự lan tơ trên môi trường cơ chất
lignin/CMC ............................................................................................................................... 24 
3.3.2.2 Khảo sát khả năng phân hủy lignin/CMC dựa trên vòng phân giải trên ...................... 24 
3.3.3. Xác định hoạt tính của enzyme....................................................................................... 25 
3.3.3.1 Hoạt tính LiP ................................................................................................................ 25 
3.3.3.2 Hoạt tính MnP .............................................................................................................. 26 
3.3.3.3 Hoạt tính cellulase ........................................................................................................ 27 
3.3.4 Khảo sát một số điều kiện tối ưu cho sự sinh tổng hợp enzyme phân giải lignin và
cellulose .................................................................................................................................... 28 
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................. 30 
4.1 Quá trình phân lập các mẫu nấm ........................................................................................ 30 

4.2. Nhận dạng sự tương đồng và định tính khả năng phân giải lignin và cellulose ................ 34 
4.2.1 Mô tả đặc điểm hình thái các chủng phân lập ................................................................. 34 
4.2.2. Kết quả định tính khả năng phân hủy lignin và cellulose............................................... 38 
v


4.2.2.1 Sự lan tơ của các chủng nấm trên hai loại môi trường lignin và CMC ........................ 38 
4.2.2.2 Vòng phân giải của các chủng nấm trên môi trường cơ chất lignin và CMC ................... 41 
4.2.3 Quan sát tơ nấm của các chủng có hoạt tính cao dưới kính hiển vi ................................ 45 
4.3. Hoạt tính enzyme của các chủng 5, 10; 14 và P201 sau 4 ngày nuôi lắc .......................... 46 
4.4. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme phân giải lignin và
cellulose .................................................................................................................................... 48 
4.4.1 Hoạt tính LiP ................................................................................................................... 48 
4.4.2 Hoạt tính MnP ................................................................................................................. 50 
4.4.3 Hoạt tính cellulase ........................................................................................................... 51 
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 53 
5.1 Kết luận .............................................................................................................................. 53 
5.2 Đề nghị ............................................................................................................................... 53 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 54 

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABTS

2,2’-Azinibis (3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonate)

CMC

Carboxyl Methyl Cellulose

C-1

Exocellulase

Cx

Endocellulase

Ctv

Cộng tác viên

DNS

Dinitrosalisilic Acid

Lac

Laccase

LiP

Lignin peroxidase

LLL

Lần lặp lại

MnP

Mangan peroxidase

MT

Môi trường

NT

Nghiệm thức

OD

Optical Density

PGA

Potato glucose agar

TB

Trung bình

SE

Standard Error

vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Thành phần lignocelluloses trong rác thải và trong phế phụ nông nghiệp ..... 6
Bảng 3.1 Quy trình xây dựng đường chuẩn glucose .................................................... 27
Bảng 3.2 Quy trình đo mẫu thí nghiệm........................................................................ 27
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian và môi trường nuôi lắc tối ưu ............. 29
Bảng 4.1 Quá trình phân lập mẫu .................................................................................... 31
Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái các chủng nấm phân lập được trên môi trường PGA ........32
Bảng 4.3 Tốc độ lan tơ trung bình của các chủng trên môi trường lignin và CMC ....... 38
Bảng 4.4 Tốc độ lan tơ trung bình của các chủng 5; 10; 11;14; 29; 35; P201 .................39
Bảng 4.5 Tốc độ phát triển sợi tơ trung bình......................................................................39
Bảng 4.6 Sư lan tơ của các chủng: 5; 10; 11;14; 29; 35; P201 trên môi trường lignin ... 40
Bảng 4.7 Sư lan tơ của các chủng: 5; 10; 11;14; 29; 35; P201 trên môi trường CMC ... 40
Bảng 4.8 Vòng lan tơ trung bình của chủng PC.36201 và Trichoderma reesis .......... 41
Bảng 4.9 Vòng phân giải của 25 chủng nấm trên môi trường lignin và CMC… ...... 43
Bảng 4.10 Hoạt tính enzyme của bốn chủng: 5; 10; 14 và P201 sau 4 ngày nuôi lắc ........... 47
Bảng 4.11 Hoạt tính LiP trong thí nghiệm khảo sát thời gian và môi trường tối ưu ............ 48
Bảng 4.12 Hoạt tính MnP trong thí nghiệm khảo sát thời gian và môi trường tối ưu ........... 50
Bảng 4.13 Hoạt tính cellulase trong thí nghiệm khảo sát thời gian và môi trường tối ưu51
Bảng 4.14 Hoạt tính CMCase của các loài nấm mốc theo thời gian ............................ 51

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Một số hình ảnh đại diện cho các chủng nấm thu nhận tại các khu vực ........ 3
Hình 2.2 Thành phần cơ bản của Lignocellulose ........................................................... 5
Hình 2.3 Cấu tạo phân tử β-D-glucose ........................................................................... 8

Hình 2.4 Phương thức cách mạch của enzyme Exoglucanase........................................ 9
Hình 2.5 Phương thức cách mạch của enzyme Endoglucanase...................................... 9
Hình 2.6 Phương thức cách mạch của enzyme β-glucosidase ...................................... 10
Hình 2.7 Cấu trúc của Lignin và tiền chất .................................................................... 11
Hình 2.8 Các đơn vị cơ bản của lignin ......................................................................... 12
Hình 2.9 Hình ảnh một số chủng nấm ......................................................................... 19
Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu ................................................................ 22
Hình 3.2 Sơ đồ quy trình phân lập đối với mẫu gỗ....................................................... 23
Hình 4.1 Các chủng nấm phân lập được lưu trữ trong môi trường PGA ..................... 33
Hình 4.2 Hình thái bốn chủng nấm khi được xác định có hoạt tính cao ...................... 36
Hình 4.3 Hình thái 21 chủng nấm khi nuôi cấy trong đĩa petri trên môi trường PGA . 37
Hình 4.4 Kích thước đường kính vòng phân giải của bốn chủng 5; 10; 14 và P201.... 44
Hình 4.5 Hình ảnh đường kính vòng phân giải của bốn chủng 10, 5, 14 và P201. ...... 44
Hình 4.6 Hình thái các chủng nấm được quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 10X . 45
Hình 4.7 Sự khác biệt về màu sắc của các giai đoạn xác định hoạt tính enzyme ......... 46

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Dân số tăng nhanh, nguồn nhiên liệu đáp ứng cho sử dụng và sản xuất ngày càng
cạn kiệt. Nhu cầu tìm ra một nguồn nhiên liệu sạch, bền vững đang là một vấn đề cấp
thiết. Trong khi đó, lignocellulose là nguồn nhiên liệu có trữ lượng lớn trong tự nhiên
có chứa rất nhiều trong phế thải nông nghiệp như rơm rạ, bã mía, mùn cưa, mạt dừa.
Chúng có tiền năng rất lớn cho sản xuất nhiên liệu sinh học nhưng hiện nay vẫn chưa
được sử dụng triệt để. Chuyển hóa và sử dụng được nguồn nguyên liệu lignocelluloses
này là một vấn đề mà công nghệ sinh học đang tập trung nghiên cứu và nếu thành công
sẽ có thể giải quyết được các vấn đề về nguồn nhiên liệu.
Để thực hiện được điều nói trên, trước hết cần phải loại bỏ những thành phần

không cần thiết nhưng gây cản trở lớn cho công nghệ xử lý, một trong các thành phần
đó là lignin. Lignin là một hợp chất tự nhiên, có rất nhiều trong tất cả thành phần của
các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật, với vai trò chính tạo ra độ bền vững của cấu
trúc gỗ đặc biệt là bảo vệ cellulose và hemicellulose khỏi sự phân hủy của enzyme.
Đây là thành phần có cấu trúc phức tạp, đa dạng và rất khó bị phân hủy.
“Làm sao tách lignin ra khỏi nguồn phế thải để sử dụng được tối đa nguồn
cellulose?” vẫn đang là một câu hỏi khó. Nhiều con đường xử lý bằng biện pháp hóa
học cũng như kết hợp cơ, lí hóa học đã được tiến hành xong hiệu quả vẫn còn giới hạn,
chi phí cao và thường gây ra những tác hại xấu về mặt môi trường. Chính vì vậy, con
đường xử lý bằng biện pháp sinh học được mở ra theo hướng tìm kiếm các vi sinh vật
có sở hữu hệ enzyme phân hủy được lignin và cellulose là rất có ý nghĩa.
Từ những lí do trên, đề tài: “Khảo sát khả năng phân hủy lignin và cellulose từ
một số chủng nấm được phân lập từ tự nhiên” đã được tiến hành nhằm mục đích phát
hiện các chủng nấm có hoạt tính phân hủy lignin và cellulose tốt, tiến tới việc xây
dựng phương pháp tách lignin ra khỏi nguồn phế thải dựa trên các biện pháp sinh học
nhằm tận dụng được nguồn phế thải nông nghiệp và tối ưu quy trình tiền xử lý nguyên
liệu trong quá trình sản xuất nhiên liệu sinh học.

1


1.2 Yêu cầu của đề tài
Tuyển chọn được chủng nấm có hoạt tính phân giải lignin và cellulose cao trong
các chủng đã phân lập được. Ghi nhận được thời gian và loại môi trường tối ưu cho sự
sinh tổng hợp enzyme phân giải lignin và cellulose của chủng nấm đã được tuyển chọn.
1.3 Nội dung thực hiện
Bước đầu tiên trong quá trình tiến hành khóa luận là thu nhận và phân lập các
chủng nấm trong tự nhiên.
Các chủng nấm sau khi được phân lập, làm thuần và giữ giống sẽ dựa vào tốc độ lan
tơ và đường kính vòng phân giải trên môi trường cơ chất lignin và CMC để lựa chọn các

chủng nấm có hoạt tính ligninase và cellulase. Dựa vào chỉ tiêu này, một số chủng có hoạt
tính vượt trội hơn sẽ được tuyển chọn và các chủng có hoạt tính yếu sẽ bị loại bỏ.
Sau đó, các chủng vừa được tuyển chọn tiếp tục với thí nghiệm xác định hoạt tính
enzyme của hệ ligninase và cellulase. Từ kết quả thu được, chủng có hoạt tính vượt
trội nhất sẽ được tuyển chọn và đi đến bước cuối cùng là khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme phân giải lignin và cellulose.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về giới nấm
Lúc đầu, nấm được xếp vào giới thực vật. Nhưng sau này, nấm được công nhận
là một giới riêng biệt, khác hẳn với thực vật hay động vật. Nấm phân bố trên toàn thế
giới và phát triển ở nhiều dạng môi trường khác nhau, kể cả sa mạc. Chúng phần lớn
sống trên cạn, nhưng một số loài chỉ tìm thấy ở môi trường nước.
Theo Hawksworth thì tổng số loài nấm được công nhận là khoảng 64.000 cho đến
năm 1983. Từ năm 1983 đến 1985, có gần 800 loài được công bố và ghi vào danh sách
mỗi năm nhưng một số trong số này đã được mô tả lại một cách tình cờ và được công
bố bởi các nhà nấm học. Theo thống kê của Hawksworth vào năm 1991 thì tỉ lệ giữa
loài mới và loài đã biết trong tổng số 800 loài được đưa vào danh sách mỗi năm là
2,5:1. Do đó chỉ có khoảng 6800 loài nấm thật sự được thêm vào từ năm 1983 đến
1995. Điều đó có nghĩa là tổng số loài thực sự của nấm là xấp xỉ 71000 loài cho đến
năm 1995 ( />
a)

b)

c)

d)
e)
f)
Hình 2.1 Một số hình ảnh đại diện của các chủng nấm thu nhận tại các khu vực lấy
mẫu khác nhau. (a); (b); (c;) (d) Mẫu nấm được thu nhận tại Tiền Giang; (e); (f) Mẫu
nấm được thu nhận trong khuôn viên trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.

Nấm được chia thành 6 lớp, gồm có: Lớp Nấm cổ, Lớp Nấm noãn, Lớp Nấm tiếp
hợp, Lớp Nấm túi, Lớp Nấm đảm và Lớp Nấm bất toàn. Các lớp Nấm phân biệt với
nhau bởi mức độ phát triển của thể sợi, cấu tạo sợi nấm, hình thức sinh sản và bào tử
sinh sản.

3


2.1.1. Đặc điểm chung của giới Nấm
2.1.1.1 Đặc điểm chung về cấu tạo
Nấm thuộc phát triển dưới dạng đơn bào hoặc đa bào, nhân chuẩn tự dưỡng,
chúng có thành tế bào cấu tạo bằng kitin (một số cấu tạo bằng cenllulose) không có lục
lạp, có đầy đủ các bào quan.
2.1.1.2 Phương thức dinh dưỡng
Nấm có ba phương thức dinh dưỡng, đó là dinh dưỡng hoại sinh, dinh dưỡng
cộng sinh và dinh dưỡng kí sinh. Trong phương thức dinh dưỡng hoại sinh, chúng lấy
chất hữu cơ từ đất giàu xác động vật, thực vật. Đối với phương thức cộng sinh, nấm lại
có mối quan hệ cộng sinh với hầu hết tất cả các giới, quan hệ của chúng có thể hỗ trợ
hoặc đối nghịch nhau, hay với những nấm hội sinh thì không đem lại bất cứ lợi ích hay
tác hại rõ ràng nào đối với vật chủ. Còn đối với phương thức kí sinh thì chúng lại sống
bám trên cơ thể động vật, thực vật và trên cả con người.
2.1.1.3 Phương thức sinh sản
Nấm có đủ 3 hình thức sinh sản (sinh dưỡng, vô tính và hữu tính) với nhiều cách

khác nhau. Ở các Nấm bậc cao (Nấm túi, Nấm đảm), quá trình sinh sản hữu tính khá
phức tạp: nhân của 2 tế bào sinh sản không kết hợp ngay mà qua 1 giai đoạn phát triển
trung gian tạo thành những tế bào 2 nhân đơn bội, cho đến khi hình thành tế bào mẹ bào
tử (túi và đảm) nhân mới kết hợp và phân chia giảm nhiễm cho ra các bào tử (bào tử túi
hay bào tử đảm). Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô tính) của nấm thường qua bào tử,
được tạo ra trên những cấu trúc đặc biệt hay thể quả. Một số loài lại mất khả năng tạo
nên những cấu trúc sinh sản đặc biêt và nhân lên qua hình thức sinh sản sinh dưỡng.
2.1.2 Vai trò của nấm
Nấm được ứng dụng rất rộng rãi trong đời sống lẫn sản xuất, nhiều loài được sử
dụng trong công nghệ thực phẩm, sử dụng làm thức ăn hoặc trong quá trình lên men.
Nấm còn được dùng để sản xuất chất kháng sinh, hoóc môn trong y học và nhiều loại
enzyme. Tuy vậy, nhiều loại nấm lại có chứa các chất hoạt động sinh học được gọi là
mycotoxin như ancaloit và polyketit, là những chất độc đối với động vật lẫn con
người. Vài loại nấm có thể gây ra các chứng bệnh cho con người và động vật, cũng
như bệnh dịch cho cây trồng, mùa màng và có thể gây tác động lớn lên an ninh lương
thực và kinh tế.

4


2.2 Tổng quan về lignocellulose
Khoảng 95% sinh khối thực vật trên trái đất được cấu tạo bởi lignocellulose.
Theo báo cáo của cơ quan năng lượng Hoa Kỳ, hàng năm nước này tạo ra 1,3 tỷ tấn
sinh khối lignocellulose. Lignocellulose được cấu tạo bởi 3 loại polymer chủ yếu là
cellulose (30 - 50%), hemicellulose (20 - 40%) và lignin (15 - 25%), ngoài ra còn chứa
một số hợp chất có hàm lượng thấp như protein, acid, muối, khoáng chất (5 - 35%). Ba
loại polymer này được liên kết chặt chẽ với nhau bằng liên kết hóa trị không phân cực
(Singh and Shulin, 2008).

Hình 2.2 Thành phần cơ bản của lignocellulose

(nguồn: />
Lignocellulose có trong phế thải nông nghiệp tồn động chủ yếu ở dạng các tồn dư
của cây trồng, trong phụ phẩm của công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, trong rác
thải rắn. Chúng là một nguồn nguyên liệu to lớn cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học.
Sinh khối lignincellulose là vật liệu hữu cơ thừa thải nhất trên thế giới và nó có thể
là biện pháp thích hợp để ít tốn chi phí trong việc sản xuất ethanol nhiên liệu và các hóa
chất khác trong tương lai. Gỗ mềm là nguồn vật liệu thô tiềm ẩn ở các quốc gia phía
5


Bắc, mà ở đó chúng được xem như là chất thải từ các ngành công nghiệp gỗ. Thật không
may, gỗ mềm, mà được thải ra là những vật liệu khó cho việc thủy phân bằng enzyme
nhất. Việc hiểu cơ chế cơ bản của quá trình thủy phân ligniocellulose bởi enzyme có tầm
quan trọng lớn để tăng cường tốc độ thủy phân (Paloman và ctv, 2004).
Bảng 2.1 Thành phần lignocellulose trong rác thải và trong phế phụ nông nghiệp
Nguồn lingocellulose

Cellulose (%)

Hemicelluloses (%)

Lignin (%)

Thân gỗ cứng

40 – 50

24 – 40

18 – 25

Thân gỗ mềm

45 – 50

25 – 35

25 – 35

Vỏ lạc

25 – 30

25 – 30

30 – 40

Lõi ngô

45

35

15

85 – 99

0

0 – 15

32,1

24

18

Vỏ trấu của lúa mì

30

50

15

Rác đã phân loại

60

20

20

Lá cây

15 – 20

80 – 85

0

Hạt bong

80 – 95

2 -20

0

Giấy báo

40 – 55

25 – 40

18 – 30

Giấy thải từ bột giấy hóa học

60 – 70

10 – 20

5 – 10

Chất rắn nước thải ban đầu

8 – 15

-

24 – 29

Chất thải từ lợn

6

28

-

Phân bón gia súc

1,6 – 4,7

1,4 – 3,3

2,7 – 5,7

Cỏ ở bờ biển Bermuda

25

35,7

6,4

Cỏ mềm

45

31,4

12,0

25 – 40

25 – 50

10 – 30

33,4

30

18,9

Giấy
Vỏ trấu

Các loại cỏ (trị số trung bình
của các loại)
Bã thô

(Howard và ctv, 2003)

Theo Quách Thị Tuyết Vân (2004), có một điểm cần lưu ý là trong tự nhiên
không tồn tại một loại vi sinh vật nào có đầy đủ tất cả các hệ enzyme mà chúng ta đã
nói ở phần trên, mà mỗi loại có một loại enzyme ưu việt. Để chuyển hóa triệt để các
hợp chất lignocellulose đòi hỏi nhiều loài vi sinh vật khác phải tham gia. Như vậy, cơ

chế của quá trình chuyển hóa này trở nên hết sức phức tạp. Phản ứng chuyển hóa được
6


nối tiếp nhau, sản phẩm đầu là cơ chất cho phản ứng enzyme kế tiếp. Cứ như vậy,
lignocellulose lần lượt được phân giải rất chậm trong tự nhiên. Việc chuyển hóa này có
ý nghĩa rất lớn, không chỉ đối với việc tái tuần hoàn vật chất trong tự nhiên mà còn có
ý nghĩa rất lớn trong việc tái hối chất dinh dưỡng cho cây.
2.3 Tổng quan về hemicellulose
Hemicellulose là polysaccharide có phân tử lượng nhỏ hơn phân tử lượng của
cellulose rất nhiều. Chúng thường được cấu tạo từ 150 gốc đường. Các gốc đường này
được nói với nhau bằng các liên kết -1,4; -1,3; -1,6 glucoside, thường là những
mạch ngắn, phân nhánh. Cấu trúc của hemicellulose không bền, chúng không hòa tan
trong nước nhưng dễ dàng bị phân giải bởi acid loãng hoặc kiềm.
Hemicellulose cũng là thành phần tế bào thực vật và tồn tại chủ yếu ở các phần
như: vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu. Khi thủy phân hemicellulose sẽ thu được các
monosaccharide thuộc nhóm hexose như mannose, galactose, nhóm pentose như
arabinose, xilose. Tùy theo trong thành phần của hemicelluloses có chứa
monosaccharide nào mà nó sẽ có những tên tương ứng như mangan, galactan và
penzotan. Các polysaccharide như mangan, galactan araban và xilan đều là các chất
phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ quan
khác nhau như rơm rạ, gỗ.v.v…
2.4. Cellulose và quá trình phân hủy cellulose
2.4.1 Tổng quan về cellulose
Cellulose là một trong những hợp chất tự nhiên rất bền vững và có chứa khá
nhiều trong tự nhiên và là thành phần đặc trưng của vách tế bào thực vật.
Cellulose có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n , là polymer, gồm nhiều đơn vị β-Dglucose nối với nhau bởi liên kết β-1,4-glucosid. Liên kết này không bền với acid.
Mức độ polymer hóa của phân tử cellulose thay đổi từ vài trăm đến 15000 đơn vị
glucose (trung bình là khoảng 3000 đơn vị). Do đó trọng lượng phân tử của cellulose
cũng dao động từ 50000 đến 2500000 Dalton tùy thuộc nguồn gốc loài thực vật.

Một số đặc tính của cellulose: là chất màu trắng, không màu, không mùi, không vị,
không tan trong nước nhưng có thể trương lên do hấp thụ nước, bị thủy phân ở nhiệt độ
thường hoặc ở nhiệt độ 40 – 500C nhờ các enzyme phân hủy cellulose được gọi chung là
cellulase, bị phân hủy khi đun nóng với acid hoặc với kiềm ở nồng độ cao.

7


Hình 2.3 Cấu trúc phân tử β-D-glucose
(nguồn: />
2.4.2. Hệ enzyme phân hủy cellulose – cellulase
Chính nhờ cấu trúc bền chắc và không tan trong nước mà cellulose rất khó bị phân
hủy. Các loài nấm, vi khuẩn hay protozoa như Trichoderma reei, Penicilium notatum,
Pseudomonas flourescens.v.v… có khả năng phân hủy được cellulose là do chúng tiết ra
enzyme cellulase. Cellulase không phải là một enzyme, nhưng là tên gọi chung của một
nhóm enzyme cùng tham gia thủy phân cellulose. Các hiểu biết về cellulase chủ yếu
được nghiên cứu trên đối tượng Trichoderma reesei (GADD, 2001).
Nhiều giả thuyết được đề xuất về sự hoạt động của hệ cellulase. Mandels và
Reese (1964) đã đề nghị một mô hình sự phân giải cellulase xảy ra theo cơ chế 2 bước
(Leatherwood, 1965). Bước đầu tiên được gọi là tiền – thủy giải (pre–hydrolytic),
trong đó các chuỗi anhydroglucose bị phân tách ra làm cho cellulose dễ dàng bị hòa
tan trong nước (cellulose lúc này tạm gọi là cellulose bị hòa tan–solubilized-cellulose).
Bước tiếp theo là thủy giải (hydrolytic) các phân tử cellulose đã bị làm yếu ở bước (1),
tức là sự phá hủy mối liên kết β-1,4-glucoside.
Như thế Mandels và Reese phân chia hệ phức hợp cellulase của nấm thành các phần
tử hòa tan cellulose, gọi là C-1 ở bước (1) và phần tự thủy giải cellulose, gọi là Cx (ở bước
(2), ngoài ra còn có sự tham gia của enzyme thứ 3 là β-glucosidase (cellobiase).
Cơ chế hoạt động của hệ enzyme cellulase có thể tóm tắt như sau:
C-1
Cellulose

Cx
cellulose hòa tan

Cellobiase
Cellobiose

8

β-D-glucose


2.4.2.1 Enzyme exoglucanase
Enzyme exoglucanase (EC.3.2.1.91) này còn có tên gọi khác như: exo-β-1,4glucanase, cellulose C1, cellobiohydrolase, CBH1, cellbiosidase, avicelase,…

Hình 2.4 Phương thức cắt mạch của enzyme exoglucanase
(nguồn: />
Enzyme này thủy phân liên kết β-1,4-glucosid từ đầu không khử của chuỗi
cellulose để tạo thành cellobiose, không thủy phân cellulose ở dạng kết tinh và dạng
hòa tan mà chỉ làm thay đổi tính chất vật lý của chúng. Nhưng có thể thủy phân được
cellulose đã được cắt ngắn mạch. Vai trò của enzyme này có thể là giúp cho
endoglucanase tác động lên cellulose kết tinh.
2.4.2.2 Enzyme endoglucanase
Enzyme endoglucanase (EC.3.2.1.4) ngoài ra còn có nhiều tên khác như: endoβ-1,4-glucanase, endocellulase, CMCase, Cx,…

Hình 2.5 Phương thức cách mạch của enzyme Endoglucanase
(nguồn: />
Enzyme nội bào endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase là
enzyme thủy phân nội bào liên kết 1,4-β-D-glucosidic trong phân tử cellulose bởi tác
dụng ngẫu nhiên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi khử tự do và các chuỗi

oligosaccharide ngắn. Các endoglucanase không thể thủy phân cellulose tinh thể hiệu
quả nhưng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình tương đối dễ tiếp cận
( />
9


2.4.2.3 Enzyme β-glucosidase
Enzyme β-glucosidase (EC.3.2.1.21) ngoài ra còn có một số tên khác như:
cellobiase β-D-glucosidase,β-1,6-glucosidase,… Enzyme này thủy phân cellobiose và
các cello-oligosaccharid mạch ngắn tạo thành glucose, β-glucosidase không tấn công
cellulose hoặc các cellodextrin khác.

Hình 2.6 Phương thức cách mạch của enzyme β-glucosidase
(nguồn: />
2.4.3 Ứng dụng của hệ enzyme cellulase
Hệ enzyme cellulase đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy các hợp chất
có chứa cellulose trong tự nhiên do đó chúng được ứng dụng một cách rộng rãi trong
đời sống như dùng phá vỡ thành tế bào của tế bào thực vật; thủy phân các loại phế liệu
gỗ, giấy báo cũ để nuôi cấy tạo sinh khối. Trong chăn nuôi, hệ enzyme này phân giải
các nguyên liệu giàu cellulose để sản xuất nấm men bổ sung vào khẩu phần thức ăn gia
súc nhằm tăng năng suất chăn nuôi. Ngoài ra còn làm biến đổi đặc tính của các loại
thức ăn cho người và động vật. Trong nông nghiệp, chúng được sử dụng để phân hủy
xác thực vật còn lại trên đồng ruộng để làm màu mỡ cho đất, phân hủy các chất thải
rắn, nước chứa cellulose để làm sach môi trường.
2.5. Lignin và quá trình phân hủy lignin
2.5.1 Sơ lược về lignin
Lignin là vật liệu hữu cơ phong phú thứ 2 trên trái đất sau cellulose được thực vật
tổng hợp và chiếm phần lớn hàm lượng chất vòng thơm trên trái đất. Lignin là một
polyphenol có cấu trúc mở, rất phức tạp, được hình thành một cách tự nhiên ở tế bào
thực vật thông qua quá trình lignin hóa với việc màng cellulose của gỗ được lấp đầy

bằng lignin. Quá trình này làm cho tế bào thực vật cứng cáp hơn từ đó làm cho thực vật
có độ cứng cần thiết. Hợp chất này còn có chức năng điều hòa quá trình trao đổi chất
lỏng trong cây xanh, đồng thời bảo vệ thực vật tránh khỏi sự xâm nhiễm của các vi sinh
vật, giúp cho cây xanh cứng cáp, sinh trưởng mạnh cạnh tranh thu nhận ánh sáng mặt
trời (Dashtban và ctv, 2009).

10


Hình 2.7 Cấu trúc của Lignin và tiền chất
(nguồn: />
Lignin có cấu tạo vô định hình, không tan trong nước và tan trong acid vô cơ (David
and Steven, 1994). Dưới tác dụng của kiềm bisulfitnatri và acid sulfuric thì lignin mới bị
phân giải một phần và chuyển sang dạng hòa tan (Nguyễn Lân Dũng, 1975).
Lignin được tìm thấy ở tế bào thực vật bậc cao (hạt trần và hạt kín), Dương sỉ và
cây Thạch tùng. Đặc biệt lignin chiếm ti lệ cao ở những mô mạch được chuyển hóa để
vận chuyển chất lỏng. Lignin không tìm thấy ở rêu, địa y và tảo – là các loại thực vật
không có quản bào.
Lignin được mô tả ở các dạng như lignin gỗ cứng, lignin gỗ mềm và lignin cỏ.
Lignin gỗ mềm (thực vật hạt trần) bao gồm những cấu trúc chủ yếu bắt nguồn từ rượu
coniferyl, một ít từ p–coumaryl, không có sinapyl. Lignin gỗ cứng (thực vật hạt kín)
chứa số lượng cân bằng coniferyl và sinapyl (46%) và một lượng nhỏ (8%) coniferyl
p–hydroxylferulpropan (có nguồn gốc từ rượu coumaryl). Lignin cỏ là hợp chất
coniferyl, sinapyl và p–hydroxyphenylpropan với coumaric acid (5 – 10%), chủ yếu là
ester với nhóm hydroxyl tận cùng của rượu p–coumaryl.
11


2.5.2 Thành phần cấu trúc của lignin
Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu

trúc điển hình đã được xác định là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S),
trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol.

Hình 2.8 Các đơn vị cơ bản của lignin
(nguồn: />
Các nhóm chức ảnh hưởng đến hoạt tính của lignin bao gồm nhóm phenolic
hydroxyl tự do, methoxyl, benzylic hydroxyl, ether của benzylic với các rượu mạch thẳng
và nhóm carbonyl. Guaicyl lignin chứa nhiều nhóm phenolic hydroxyl hơn syringyl.
Lignin tạo liên kết hóa học với hemicellulose và ngay cả với cellulose (nhưng không
nhiều). Độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết, cấu trúc
hóa học của lignin và các gốc đường tham gia liên kết (Nguyễn Đức Lượng, 2011). Carbon
alpha (Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất với khối
hemicellulose. Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid
4-O-methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin. Các liên kết có thể là ether,
ester (liên kết với xylan qua acid 4-O-methyl-D-glucuronic), hay glycoside (phản ứng giữa
nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin).
Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH
thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước.Ở nhiệt độ phản ứng cao
hơn 200oC, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose.
Những nghiên cứu trước đây cho thấy đối với gỗ cứng, nhóm ether β-O-4 aryl bị phá
hủy trong quá trình nổ hơi. Đồng thời, đối với gỗ mềm, quá trình nổ hơi làm bất hoạt
các nhóm hoạt động của lignin ở vị trí α như nhóm hydroxyl hay ether, các nhóm này
bị oxy hóa thành carbonyl hoặc tạo cation benzylic, cation này sẽ tiếp tục tạo liên kết
C-C (Paloman và ctv, 2004).
12


Trong dinh dưỡng động vật, lignin rất đáng quan tâm vì nó không bị tiêu hóa bởi
enzyme của cơ thể vật chủ. Lignin còn liên kết với nhiều polysaccharide và protein
màng tế bào ngăn trở quá trình tiêu hóa các hợp chất gỗ. Gỗ, cỏ khô và rơm rất giàu

lignin nên tỷ lệ tiêu hóa thấp trừ khi được xử lý hóa học làm cho các liên kết giữa
lignin với các carbohydrate khác bị bẻ gãy.
2.5.3 Các phương pháp xử lý loại bỏ lignin trong sản xuất cồn sinh học
Giai đoạn tiền xử lý nguyên liệu trong quá trình sản xuất cồn nhằm phóng thích
thành phần cellulose từ cấu trúc chặt chẽ lignocellulose, giai đoạn này chiếm 18-20%
giá trị của sản phẩm cồn sinh học từ nguyên liệu lignocellulose. Muốn giảm giá thành
cồn thì cần tối ưu hóa phương pháp và điều kiện cho quá trình tiền xử lý, bởi nó ảnh
hưởng tới các giai đoạn sau. Có nhiều phương pháp khác nhau đã được thử nghiệm
đưa vào sử dụng, được phân ra các nhóm như sau.
Phương pháp vật lý: có nhiều cách xử lý nguyên liệu như nghiền, sử dụng tia
gamma, tia electron, tia bước sóng ngắn.v.v…Phương pháp này dùng nhiều năng
lượng, trong hầu hết các trường hợp năng lượng sử dụng cao hơn năng lượng vốn có
trong cơ chất, do vậy ít được sử dụng vì đắt đỏ (Saumita và ctv, 2010).
Phương pháp hóa lý, sử dụng kết hợp cả 2 yếu tố hóa học và vật lý trong quá
trình xử lý cơ chất. Các phương pháp sử dụng như nổ hơi, nổ hơi SO2 hay CO2, xử lý
hóa học kết hợp sóng ngắn.v.v…Các phương pháp này có ưu điểm là loại bỏ
hemicellulose, giá thành hợp lý, không ảnh hưởng nhiều tới môi trường, tuy nhiên
không loại bỏ được cơ chất có hàm lượng lignin cao, nên chỉ sử dụng trên các đối
tượng có hàm lượng lignin thấp.
Phương pháp hóa học, sử dụng các loại hóa chất như acid vô cơ đậm đặc, dung
dịch kiềm, acid hữu cơ.v.v…Các phương pháp này được sử dụng nhiều trong công nghệ
giấy, đối với công nghệ sản xuất cồn sinh học từ lignocellulose phương pháp này ít được
sử dụng do tạo ra các chất độc ảnh hưởng tới giai đoạn thủy phân và lên men. Ngoài ra
các phương pháp hóa học nguy hiểm, gây ăn mòn và ảnh hưởng tới môi trường.
Phương pháp sinh học, sử dụng các vi sinh vật trong nhóm nấm mục trắng, nấm
mục nâu, nấm mục mềm, vi khuẩn hay các enzyme từ các loài đó có khả năng chuyển
hóa thành phần lignin và hemicellulose trong cơ chất. Đặc biệt là các loài nấm mục
trắng có khả năng phân giải lignin chọn lọc, không ảnh hưởng tới thành phần cellulose.

13

Phương pháp sinh học có nhiều ưu điểm bao gồm: không sử dụng hóa chất, năng
lượng sử dụng thấp, thân thiện với môi trường và người thực hiện.
2.5.4. Hệ enzyme tham gia phân hủy lignin (Ligninase)
Những vi sinh vật phân giải Lignin có hệ thống enzyme ngoại bào mang tính oxy
hóa để có thể phá hủy liên kết giữa các monolignol hoặc mở vòng các đơn phân của
lignin. Đó là các protein phổ biến, xúc tác sự oxi hóa cơ chất với một enzyme phụ
thuộc vào H2O2 gọi là peroxidase. Chúng có protein có chứa nhân heme với trạng thái
tự nhiên có nhân Fe3+. Có nhiều enzyme tham gia vào quá trình này nhưng giữ vai trò
quan trọng hơn hết là ba hệ thống enzyme có tính oxi hóa là Lignin peroxidase,
Mangan peroxidase và Laccase.
2.5.4.1 Lignin peroxidase (LiP)
LiP (EC.1.11.1.14) có tên hệ thống là 1,2-bis (3,4-dimethoxyphenyl) propane1,3-diol: hydrogen-peroxide oxidoreductase thuộc lớp enzyme oxido-reductase, phân
lớp peroxidase và xúc tác cho phản ứng (Antje, 2006):
1,2-bis (3,4-dimethoxyphenyl) propane-1,3-diol + H2O2
H2O + veratrylaldehyde + 1-(3,4-dimethoxyphenyl)ethane-1,2-diol
LiP là glycoprotein được Glenn và Tien phát hiện, công bố năm 1983. Enzyme
này tham gia vào giai đoạn đầu của sự phân hủy lignin được phát hiện trong môi
trường nuôi cấy Phanerchaete chrysosporium.
LiP có kích thước 41kDa, chứa 1 mol protoporphyrin sắt IX trong mỗi protein. Tùy
theo điều kiện nuôi cấy, LiP biểu hiện dưới dạng các isozyme khác nhau. LiP có khoảng 6
isozyme với pI biến thiên từ 3,3 (LiP6) đến 4,7 (LiP3) (Roberta và ctv, 1989).
LiP có thể xúc tác các phản ứng oxy hóa các hợp chất phenol dẫn đến mở vòng
do có thế oxy hóa cao. Thế oxy hóa khử cao được giải thích do các hợp chất trung gian
được tạo ra trong chu trình xúc tác của LiP là các hợp chất LiPI và LiPII.
Đầu tiên LiP bị oxy hóa thành LiPI nhờ H2O2, tiếp theo LiPI oxy hóa cơ chất và
trở thành LiPII. LiPII tiếp tục oxy hóa một phân tử cơ chất khác và trở về dạng ban
đầu rồi tiếp tục một chu trình xúc tác khác.
Các phản ứng hoạt động của LiP

LiP + H2O2

H2O + LiPI

LiPI + R

R+. +LiPII

LiPII + R + 2H+

R+. + H2O + LiPI
14