TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ADENOSINE LY TRÍCH TỪ HỆ SỢI NẤM Cordyceps sinensis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ADENOSINE
LY TRÍCH TỪ HỆ SỢI NẤM Cordyceps sinensis

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TRẦN CÔNG SƠN

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 6/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ADENOSINE
LY TRÍCH TỪ HỆ SỢI NẤM Cordyceps sinensis

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. LÊ THỊ DIỆU TRANG

TRẦN CÔNG SƠN

ThS. PHÙNG VÕ CẨM HỒNG

Tháng 6/2013


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn
Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Toàn thể quý Thầy Cô của bộ môn Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình truyền đạt
kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học.
Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất và
trang thiết bị trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
TS. Lê Thị Diệu Trang, ThS. Phùng Võ Cẩm Hồng đã trực tiếp hướng dẫn, giúp
đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp.
ThS. Lê Văn Huy, ThS. Nguyễn Thanh Điền đã tận tình giúp đỡ để tôi vượt qua
những khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài.
Tập thể lớp DH09SH đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt 4 năm, đặc
biệt là các bạn Nguyễn Thị Ngọc Anh, Lê Phước Thọ, Nguyễn Thị Trường Giang đã
chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Con xin tỏ lòng biết ơn đến ba mẹ cùng người thân trong gia đình luôn là chỗ dựa
vững chắc, động viên, khuyến khích tạo điều kiện để con học tập tốt.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013
Sinh viên thực hiện
Trần Công Sơn

i


TÓM TẮT
Nấm C. sinensis (Đông Trùng Hạ Thảo) ngoài tự nhiên ngày càng khan hiếm do
sự khai thác quá mức của con người, do đó, việc nuôi cấy nấm này trong môi trường
nhân tạo là rất cần thiết nhằm đáp ứng nhu cầu dược liệu. Để đánh giá chất lượng nấm
C. sinensis nuôi cấy trong môi trường nhân tạo, người ta dựa vào hàm lượng các hoạt
chất sinh học quý hiếm như các nucleoside trong đó thường sử dụng nhất là adenosine,
chất có tác dụng dự trữ năng lượng, điều hòa hoạt động sinh lý của hệ thống thần kinh
trung ương và cải thiện tuần hoàn ngoại biên. Đề tài “Tối ưu hóa quy trình phân tích
adenosine ly trích từ hệ sợi nấm Cordyceps sinensis” được thực hiện nhằm xây dựng
quy trình chuẩn để phân tích hàm lượng adenosine trong các sản phẩm C. sinensis, có
thể ứng dụng để kiểm soát chất lượng nấm này trên thị trường dược liệu.
Mẫu C. sinensisđược thu nhận từ việc nuôi cấy sợi nấm trên môi trường lỏng bao
gồm các thành phần:glucose 40 g/l, yeast extract 10 g/l, pepton 5 g/l, KH2PO4 1 g/l,
MgSO4 0,5 g/l. Sau 26 ngày nuôi cấy, sinh khối sợi nấm được thu nhận và sấy khô ở
400C. Phương pháp phân tích adenosine sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
với đầu dò hấp thụ tử ngoại (High Performance Liquid Chromatography – Ultra Violet
– HPLC – UV), cột Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 150 x 4,6 mm 5µ. Thí nghiệm tối
ưu hóa quy trình phân tích khảo sát hiệu quả của việc ly trích adenosine bằng các dung
môi khác nhau kết hợp đánh sóng siêu âm ở các thời gian khác nhau. Song song với
quy trình ly trích, việc tối ưu hóa chương trình phân tích của hệ thống HPLC cũng
được thực hiện.

Kết quả nuôi cấy sợi nấm trong môi trường lỏng thu được sinh khối tươi là 35 g/l
môi trường. Đường chuẩn được xây dựng từ các nồng độ chuẩn có độ tuyến tính cao
(R2 = 0,9996). Hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích adenosine được ly trích bằng
các dung môi khác nhau trong thời gian đánh sóng siêu âm 5 phút trung bình từ
103,4% đến 110,4%, trong thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút là 90,7% - 111,1%,
điều này phù hợp với khoảng khuyến cáo của FDA nên có thể dùng để phân tích
adenosine. Kết quả phân tích, cho thấy thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút với dung
môi ethanol 50% cho hàm lượng adenosine cao nhất là 1643,88(µg/g) khác biệt rất có
ý nghĩa với các dung môi khác (P = 0,01).
ii


SUMMARY
The natural fungus C. sinensis (winter worm, summer grass) becomes exhausted
due to overexploitation by humans, so the cultured fungus in syntheticmedia is
necessary in order to meet the pharmaceutical needs. Quality assessment of cultured
C. sinensisfungus was based on the content of special bioactive substances such as
nucleosides including adenosine, that effects energy storage, regulates physiological
activity of the central nervous system and improves peripheral circulation ....
Thesis“Optimization of analysis process for adenosine extracted from C. sinensis
mycelia”was carried out to build a standard procedure for analyzing amount of
adenosine in C. sinensis products, that can be applied to control quality of this fungus
in the pharmaceutical material market.
C. sinensis samples were collected from the cultured mycelia in liquid
mediumconsisted of: glucose 40 g/l, yeast extract 10 g/l, peptone 5 g/l, KH2PO4 1 g/l,
MgSO4 0,5 g/l. After 26 days of incubation, mycelia were collected and dried at 400C.
Adenosine analysis was performed with thehigh performance liquid chromatography
system using ultraviolet absorbance detector (HPLC – UV), Phenomenex Luna 5μ C18
(2) 150 x 4.6 mm 5μ column. Optimization processexamined the effect of
adenosineextractedby different solvents combined with ultrasonication in different

time. In parallel with the extraction process, the optimization of analysis program of
the HPLC system was also implemented.
Results showed fresh biomass of mycelia cultured in liquid medium was 35 g/l
medium. Calibration curve was built from the standard concentrations had high
linearity (R2 = 0,9996). The recovery of adenosine extracted by different solvents with
5 minutes sonicationwas average from 103,4% to 110,4%, while that with 15minutes
sonication was 90,7% – 111,1%, this is in range of FDA recommendations and could
be used to analyze adenosine. The analysis results revealed thatthe ultrasonication time
of 15 minutes with 50% ethanol solvent obtained highest amount of adenosine1643,88
(µg/g), significant difference with other solvents (P = 0,01).
Keywords: HPLC, adenosine, Cordyceps sinensis, mycelia, optimization, solvent,
untrasound
iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ..................................................................................................................... i
Tóm tắt .......................................................................................................................... ii
Summary ...................................................................................................................... iii
Mục lục ........................................................................................................................ iv
Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... vii
Danh sách các bảng ................................................................................................... viii
Danh sách các hình ...................................................................................................... ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1
1.2 Yêu cầu ................................................................................................................... 2
1.3 Nội dung thực hiện ................................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3
2.1. Giới thiệu về Cordyceps sinensis .......................................................................... 3

2.1.1 Nguồn gốc Cordyceps sinensis ............................................................................ 3
2.1.2 Mô tả Cordyceps sinensis .................................................................................... 4
2.1.3 Thành phần hóa học của Cordyceps sinensis ...................................................... 5
2.1.4 Công dụng của Cordyceps sinensis ..................................................................... 5
2.2 Các nucleoside trong Cordyceps ............................................................................ 6
2.3. Giới thiệu về adenosine ......................................................................................... 7
2.3.1 Nguồn gốc hình thành adenosine ........................................................................ 7
2.3.2 Vai trò của adenosine .......................................................................................... 8
2.4. Phương pháp phân tích adenosine ......................................................................... 8
2.4.1. Giới thiệu về phương pháp sắc ký ...................................................................... 9
2.4.1.1 Lịch sử phương pháp sắc ký ............................................................................. 9
2.4.1.2 Nguyên tăc cơ bản của phương pháp sắc ký .................................................... 9
2.4.1.3 Phân loại các phương pháp sắc ký.................................................................. 10
2.4.2. Sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography – HPLC)..... 11
2.4.2.1 Nguyên tắc của sắc ký lỏng cao áp ................................................................. 11
2.4.2.2 Các bộ phận của HPLC .................................................................................. 12
iv


2.4.2.3 Pha tĩnh trong HPLC ...................................................................................... 13
2.4.2.4 Pha động trong HPLC .................................................................................... 14
2.4.2.5 Tối ưu hóa quy trình ....................................................................................... 15
2.5 Các nghiên cứu về adenosine trong và ngoài nước .............................................. 15
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 17
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 17
3.2. Vật liệu thí nghiệm .............................................................................................. 17
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................ 17
3.2.2 Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................ 17
3.2.3 Hóa chất ............................................................................................................. 17
3.3. Phương pháp tiến hành ........................................................................................ 18

3.3.1. Tăng sinh khối nấm Cordyceps sinensis trong môi trường lỏng ...................... 18
3.3.1.1 Nuôi cấy nấm Cordyceps sinensis trên môi trường PGA............................... 18
3.3.1.2 Nuôi cấy nấm Cordyceps sinensistrong môi trường lỏng .............................. 18
3.3.2 Quy trình chạy máy HPLC ................................................................................ 19
3.3.3 Xây dựng đường chuẩn adenosine .................................................................... 19
3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi, thời gian ly trích adenosine ...................... 20
3.3.5. Phân tích dữ liệu và tính toán kết quả .............................................................. 22
3.3.5.1 Nồng độ adenosine từ đường chuẩn ............................................................... 22
3.3.5.2 Nồng độ adenosine thực tế trong mẫu ............................................................ 22
3.3.5.3 Hiệu suất thu hồi ............................................................................................. 23
3.4 Phân tích số liệu và xử lý kết quả ......................................................................... 23
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 24
4.1. Nuôi cấy nấm Cordyceps sinensis trong môi trường lỏng .................................. 24
4.1.1 Nuôi cấy nấm Cordyceps sinensis trên môi trường PGA.................................. 24
4.1.2 Tăng sinh nấm Cordyceps sinensis trong môi trường lỏng ............................... 25
4.2 Xây dựng đường chuẩn adenosine ....................................................................... 26
4.3 Xác định hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích mẫu ...................................... 28
4.4. Ảnh hưởng của dung môi và thời gian đánh sóng siêu âm ................................. 29
4.4.1 Định tính adenosine trong mẫu phân tích .......................................................... 29
4.4.2 Định lượng adenosine trong mẫu phân tích....................................................... 33
4.5 Quy trình tối ưu phân tích adenosine ly trích từ hệ sợi nấm ................................ 35
v


Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 37
5.1 Kết luận................................................................................................................. 37
5.2 Đề nghị ................................................................................................................. 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 38
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN:

Acetonitrile

ADP:

Adenosine Diphosphate

AMP:

Adenosine Monophosphate

API:

Active Pharmaceutical Ingredient

ATP:

Adenosine Triphosphate

CE :

Capillary Electrophoresis

CNS:

Central Nervous System

ĐTHT:

Đông Trùng Hạ THảo

FDA:

Food and Drug Administration

GC:

Gas Chromatography

HEAA:

Hydroxy – Etyl – Adenosine – Analogs

HPLC – DAD:

High Performance Liquid Chromatography – Photodiode Array
Spectrophotometer

HPLC – UV:

High Performance Liquid Chromatography – Untra Violet

LC/ESI–MS:

Liquid Chromatography Electrospray Ionization - Mass Spectrometry

LOD:

Limits Of Detection

LOQ:

Limits Of Quantitation

PC:

Paper Chromatography

PGA:

Potato Glucose Agar

TLC:

Thin Layer Chromatography

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1Các loại pha động và pha tĩnh sử dụng trong kỹ thuật sắc ký ................. 10
Bảng 2.2 Tóm tắt các cấu hình sắc ký khác nhau .................................................. 11
Bảng 2.3 Các loại cột HPLC dùng trong kỹ thuật sắc ký khác nhau ..................... 14

Bảng 3.1 Xây dựng các nồng độ adenosine từ dung dịch gốc1138,5 ppm ............ 19
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của dung môi và thời gian ly trích adenosine ...................... 20
Bảng 4.1 Tốc độ lan tơ của nấm C. sinensis trên môi trường PGA ................................... 24
Bảng 4.2Phương trình đường chuẩn theo nồng độ và diện tích peak adenosine ... 27
Bảng 4.3Hiệu suất thu hồi của quy trình ly trích adenosine .................................. 28
Bảng 4.4Hiệu suất thu hồi các nghiên cứu phân tích adenosine ............................ 28
Bảng 4.5Ảnh hưởng của thời gian đánh sóng siêu âm và dung môi ..................... 33
Bảng 4.6 Nồng độ adenosine trong các nghiên cứu về nấm C.sinensis................. 34

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1Cordyceps sinensis ........................................................................................ 3
Hình 2.2 Môi trường sống của Cordyceps ở Trung Quốc .......................................... 4
Hình 2.3 Hình dạng một số loài Cordyceps ................................................................ 5
Hình 2.4 Con đường hình thành adenosine ................................................................ 7
Hình 2.5 Sơ đồ hệ thống HPLC .................................................................................. 12
Hình 3.1 Sơ đồ chuẩn bị mẫu phân tích adenosine .................................................... 21
Hình 4.1Nấm C. sinensis trên môi trường PGA vào ngày thứ 18, nhiệt độ 200C ...... 25
Hình 4.2Sợi nấm C. sinensis trên môi trường lỏng .................................................... 25
Hình 4.3Đồ thị đường chuẩn của adenosine ............................................................... 27
Hình 4.4Sắc ký đồ của mẫu nấm C. sinensis, ly trích mẫu bằng nước cất và thời gian
đánh sóng siêu âm 5 phút ............................................................................................ 30
Hình 4.5Sắc ký đồcủa mẫu nấm C. sinensis,ly trích mẫu bằng nước cất ................... 30
Hình 4.6Sắc ký đồ của mẫu nấm C. sinensis, ly trích mẫu bằng ethanol 30%........... 31
Hình 4.7Sắc ký đồ của mẫu nấm C. sinensis, ly trích mẫu bằng ethanol 50%........... 31
Hình 4.8Sắc ký đồcủa mẫu nấm C. sinensis,ly trích mẫu bằng methanol 60% ......... 32
Hình 4.9Sắc ký đồ của mẫu nấm C. sinensis,ly trích mẫu bằng methanol 90% ........ 32

Hình 4.10Quy trình tối ưu phân tích adenosine ly trích từ sợi nấm C. sinensis ......... 36

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cordyceps sinensis hay Đông Trùng Hạ Thảo là một loại dược liệu quý hiếm
được phát hiện và sử dụng từ rất lâu trong Y học cổ truyền Trung Quốc. Trong sinh
khối của Đông Trùng Hạ Thảo có chứa 17 acid amin thiết yếu cùng các yếu tố vi
lượng, đường, lipid. Đặc biệt, những thành phần có hoạt tính sinh học quan trọng nhất
của C. sinensis được xác định là các nucleoside tan như: adenosine, cordycepin,
guanosine, inosine và nhóm HEAA (Hydroxy – Etyl – Adenosine – Analogs).C.
sinensis có tác dụng trong việc điều trị các bệnh như: ung thư, tăng đường huyết, bệnh
đường hô hấp, bệnh gan, rối loạn chức năng thận, suy thận và đặc tính chống oxy
hóa… khiến cho C. sienensis ngày càng được ưa chuộng.
Trong tự nhiên C. sinensis chỉ sinh sống và phát triển được ở những vùng núi cao
từ 3500 – 5000m so với mực nước biển và khí hậu lạnh. Sản phẩm tự nhiên rất ít và
năng suất hằng năm ngày càng giảm do sự khai thác quá mức của con người. Chính vì
vậy mà sản phẩmC. sinensis giả hoặc kém chất lượng xuất hiện ngày càng nhiều. Vì
thế, việc phân tích xác định nucleoside trong C. sinensis là rất quan trọng cho việc
kiểm soát chất lượng của nó.
Hiện nay, có nhiều kỹ thuật phân tích nucleoside chính trong C. sinensis, chẳng
hạn như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), LC/ESI–MS và
điện di mao quản. Là kỹ thuật thuận tiện, phổ biến cho phân tích các thành phần không
bay hơi, HPLC với đầu dò UV ngày được sử dụng rộng rãi để xác định những thành
phần trong thuốc y học cổ truyền.
Đề tài: “Tối ưu hóa quy trình phân tích adenosine ly trích từ hệ sợi nấm
Cordyceps sinensis” bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được thực
hiện nhằm tìm ra phương pháp thu nhận hiệu quả nhất đối với adenosine ly trích từ C.

sinensis, đồng thời có thể ứng dụng để kiểm soát chất lượng sản phẩm C. sinensis trên
thị trường.

1


1.2 Yêu cầu
Thu được sinh khối sợi nấm C. sinensis đồng nhất về chất lượng để làm mẫu cho
thí nghiệm tối ưu hóa.
Chọn các nồng độ dung môi khác nhau và thời gian đánh sóng siêu âm thích hợp
cho việc ly trích adenosine.
Xây dựng phương pháp tối ưu cho việc phân tích adenosine.
Đánh giá độ chính xác của quy trình phân tích adenosine.
1.3 Nội dung thực hiện
Tăng sinhkhối sợi nấm C.sinensis trong môi trường nuôi cấy lỏng từ sợi nấm đã
được phục hồi trên môi trường PGA.
Xây dựng đường chuẩn adenosine từ các nồng độ chuẩn khác nhauvà xây dựng
chương trình phân tích của hệ thống HPLC.
Khảo sát ảnh hưởng của dung môi và thời gian đánh sóng siêu âm đến hiệu quả ly
trích adenosine (3 hệ dung môi với 2 thời gian đánh sóng siêu âm khác nhau).

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về Cordyceps sinensis
Cordyceps sinensis hay Đông Trùng Hạ
Thảo (ĐTHT) thuộc: (Trịnh Tam Kiệt, 2011)
Giới (regnum): Fungi
Phân giới (subregnum): Dikarya

Ngành (phylum): Ascomycota
Phân ngành (subphylum):Pezizomycotina
Lớp (class): Sordariomycetes
Phân lớp (subclass): Hypocreomycetidae
Bộ (ordo): Hypocreales
Họ (familia): Clavicipitaceae
Chi (genus):Cordyceps
Hình 2.1Cordyceps sinensis.

Loài (species):C. sinensis

()

2.1.1 Nguồn gốc Cordyceps sinensis
Đông Trùng Hạ Thảo là một dạng ký sinh giữa một loài nấm túi có tên khoa học
là Cordyceps sinensis với sâu non của một loài côn trùng thuộc chi Thitarodes.
Thườnggặp nhất là sâu non của loài Thitarodes baimaensis hoặc Thitarodes
armoricanus. Ngoài ra còn 46 loài khác thuộc chi Thitarodes cũng có thể bị C.
sinensis ký sinh. Các loài nấm này phân bố rộng ở châu Á và châu Úc với trung tâm đa
dạng là vùng Đông Á, đó là các cao nguyên cao hơn mặt biển từ 3500 đến 5000 m
như: Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc, Vân Nam…
Cơ chế xâm nhiễm của loài nấm này vào cơ thể sâu non hiện giờ vẫn chưa rõ.
Vào mùa đông, nấm bắt đầu ký sinh vào sâu non và làm chết sâu non sau khi sử dụng
hết chất dinh dưỡng của chúng. Những con sâu này có thể đã ăn phải bào tử nấm hoặc
bị nấm ký sinh xâm nhập qua các lỗ thở. Đến khi sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm
nhiễm vào các mô vật chủ, sử dụng hoàn toàn các chất dinh dưỡng trong cơ thể sâu.
Đến một giai đoạn nhất định thường là vào mùa hè ấm áp, nấm bắt đầu mọc ra khỏi
sâu như một ngọn cỏ và vươn lên khỏi mặt đất phát triển thành dạng cây (hình dạng
giống thực vật) và phát tán bào tử.
3

Hình 2.2 Môi trường sống của Cordyceps ở Trung Quốc.(A) một
đồng cỏ ở độ cao 3500 - 5000 m, chủ yếu ở các tỉnh Thanh Hải, Tây
Tạng, Tứ Xuyên, Vân Nam và Cam Túc; (B và C) hệ ký sinh của nấm và
sâu bướm được tìm thấy trong đất; (D) Cordyceps mới được thu thập,
đầu mũi tên trong (B và C) cho biết Cordyceps (Li và ctv, 2006).

2.1.2 Mô tả Cordyceps sinensis
Đông Trùng Hạ Thảo ngoài tự nhiên, có thể nhìn rõ hình con sâu, với phần quả
thể nấm mọc ra từ đầu ấu trùng. Khi sấy khô, nó có mùi tanh như cá, đốt lên có mùi
thơm. Phần quả thể hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 – 11 cm. Phần sâu non dài
chừng 3 – 5 cm, đường kính khoảng 0,3–0,8cm. Bên ngoài có màu vàng sẫm hoặc nâu
vàng với khoảng 20–30vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn, có tất cả 8 cặp chân,
nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất. Quả thể nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài
hơn sâu non một chút. Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi
vàng,quả thể nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà.

4


Hình 2.3 Hình dạng một số loài Cordyceps.(A) Cordyceps
sinensis;(B) Cordyceps gunnii; (C) Cordyceps barnesii; (D)
Cordyceps gracilis; (E) Cordyceps liangshanensis; (F) Cordyceps
militaris(Liu và ctv, 2011).

2.1.3 Thành phần hóa học của Cordyceps sinensis
Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối của đông trùng hạ thảo có 17 acid
amin khác nhau, D–mannitol, lipid, và nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na). Quan
trọng hơn là trong sinh khối Đông Trùng Hạ Thảo có nhiều hoạt chất sinh học mà các

nhà khoa học đang phát hiện dần dần ra nhờ các tiến bộ của ngành hoá học các hợp
chất tự nhiên. Nhiều hoạt chất này có giá trị dược liệu cao. Trong đó phải kể đến acid
cordycepic,cordycepin, adenosine, hydroxyethyl–adenosine. Đáng chú ý hơn cả là
nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy–Etyl–Adenosine –Analogs).Đông Trùng Hạ Thảo
còn có chứa nhiều loại vitamin (trong 100 g Đông Trùng Hạ Thảo có 0,12 g vitamin
B12; 29,19 mg vitamin A; 116,03 mg vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B2
(riboflavin), vitamin E, vitamin K) (Đái Duy Ban và Lưu Tham Mưu, 2009).
2.1.4 Công dụng của Cordyceps sinensis
Trong các nghiên cứu về y học và dược học đã chứng minh được nấmC. sinensis
có tác dụng chống lại tác dụng xấu của các tân dược đối với thận, thí dụ đối với độc
tính của Cephaloporin A, bảo vệ thận trong trường hợp tổn thương do thiếu máu,
chống lại sự suy thoái của thận, xúc tiến việc tái sinh và phục hồi các tế bào tiểu quản
ở thận. Bên cạnh đó, C. sinensis còn có tác dụng làm hạ huyết áp ở người cao huyết
5


áp, chống lại hiện tượng thiếu máu ở cơ tim, giữ ổn định nhịp đập của tim. Đối với hệ
thống miễn dịch, nó có tác dụng tăng cường tính miễn dịch không đặc hiệu, điều tiết
tính miễn dịch đặc hiệu, tăng cường năng lực thực bào của các tế bào miễn dịch. Hơn
nữa, C. sinensis còn tăng cường tác dụng của nội tiết tố tuyến thượng thận và làm
trương nở các nhánh khí quản, tăng cường dịch tiết trong khí quản và trừ đờm, làm
chậm quá trình lão hóa của cơ thể, hạn chế bệnh tật của tuổi già, nâng cao năng lực
chống ung thư của cơ thể, chống lại tình trạng thiếu oxy trong cơ thể, tăng cường tác
dụng lưu thông máu trong cơ thể, hạn chế tác hại của tia gamma đối với cơ thể, an
thần, trấn tĩnh thần kinh, điều tiết nồng độ đường trong máu. Ngoài ra, C. sinensis giúp
làm giảm cholesterol trong máu và chống xơ vữa động mạch, xúc tiến tác dụng của các
nội tiết tố, tăng cường chức năng tiêu hóa và hấp thu các chất dinh dưỡng, ức chế vi
sinh vật có hại, kể cả vi khuẩn lao, kháng viêm tiêu viêm, đặc biệt có tác dụng cường
dương, chống liệt dương (Nguyễn Lân Dũng, 2005).
2.2Các nucleoside trong Cordyceps

Các nucleoside là một trong những hoạt chấtquan trọng trong Cordyceps. Vào
năm 1964, hợp chất 3’ – deoxyadenosine hay cordycepin, đã được phân lập từ việc
nuôi cấy C. militaris–mộtloài có quan hệ với C. sinensis. Hợp chất cordycepin cho
thấy khả năng kháng ung thư, nên từ đó các nucleoside trong Cordyceps đã được quan
tâm hơn. Dù vậy, sự tồn tại của cordycepin trong C. sinensis tự nhiên đã gây tranh cãi
từ nhiều thập kỷ qua. Tuy nhiên, gần đây cordycepin đã được xác định trong C.
sinensis tự nhiên với nồng độ rất thấp. Nhiều hơn 10 nucleoside và các hợp chất có
liên quan của nó đã được phân lập từ Cordyceps bao gồm: adenine, adenosine, uracil,
uridine,

guanidine,

guanosine,

hypoxanthine,

inosine,

thymine,

thymidine,

deoxyuridine. Ngoài ra, hoạt chất N6–(2–hydroxyethyl)–adenosine hoạt động như một
chất đối kháng Ca2+ và tác nhân iontropic, đã được phân lập từ việc nuôi cấy sợi nấm
Cordyceps. Đến nay, các nucleoside cho thấy là thành phần hoạt chất sinh học quan
trọng trong Cordyceps, trong đó adenosine đã được sử dụng như chỉ thị cho việc kiểm
soát chất lượng của C. sinensis. Các nucleoside có liên quan đến sự điều hòa của
những quá trình sinh lý khác nhau trong hệ thống thần kinh trung ương (Central
Nervous System). Adenosine có chức năng làm giảm tính dễ bị kích thích của những
tế bào thần kinh trong hệ thống thần kinh trung ương và ức chế việc phóng thích

những dẫn truyền thần kinh tiền synapse. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho rằng
6


adenosine có hoạt tính chống co giật bằng những thử nghiệm trên mô hình động vật bị
rối loạn co giật. Độ ẩm và nhiệt độ làm gia tăng đáng kể hàm lượng các nucleoside
trong Cordyceps ngoài tự nhiên. Bảo quản Cordyceps ở độ ẩm 75% và nhiệt độ 400C
trong khoảng 10 ngày, nồng độ các nucleoside trong Cordyceps ngoài tự nhiên tăng
lên rõ rệt đến khoảng 4 lần. Tuy nhiên, ảnh hưởng của độ ẩm và nhiệt độ trong việc
thay đổi nồng độ các nucleoside không liên quan đến sợi nấm Cordyceps được nuôi
cấy. Inosine, chất chuyển hóa sinh hóa chính của adenosine do quá trình oxy hóa và
khử amin, có thể kích thích sự tăng trưởng của sợi thần kinh trong ống nghiệm và hệ
thống thần kinh trung ương trưởng thành (Central Nervous System). Cordyceps ngoài
tự nhiên chứa nồng độ inosine cao hơn so với Cordyceps được nuôi cấy, bao gồm C.
sinensis và C. militaris. Mặc dù hiệu quả của Cordyceps có thể không được xuất phát
chủ yếu từ các nucleoside nhưng adenosine, inosine, cordycepin, có thể được sử dụng
để phân biệt C. sinensis và C. militaris ngoài tự nhiên và được nuôi cấy, rất hữu ích để
kiểm soát chất lượng Cordyceps (Li và ctv, 2006).
2.3. Giới thiệu về adenosine
2.3.1 Nguồn gốc hình thành adenosine

Hình 2.4 Con đường hình thành adenosine

7


Adenosine là một nucleoside purine tự nhiên và được hình thành bởi sự phân hủy
của adenosine triphosphate (ATP). ATP là nguồn năng lượng chính trong tế bào cho
các hệ thống vận chuyển và hoạt động của nhiều enzym. Hầu hết ATP bị thủy phân
thành adenosine diphosphate (ADP), mà ADP có thể tiếp tục được khử nhóm

phosphate để tạo thành AMP. Sau đó AMP sẽ được tiếp tục khử nhóm phosphate để
tạo thành adenosine bởi sự liên kết của enzyme 5’–nucleotidase với màng tế bào (Enzo
và ctv, 2001).
2.3.2 Vai trò của adenosine
Adenosine giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim mạch, giảm sinh trưởng của
các tế bào thoái hóa, tăng lượng oxy trong máu. Hơn nữa, adenosine có tác dụng dự
trữ năng lượng giúp cho con người luôn dồi dào năng lượng để lao động hiệu quả, là
cơ chất cho các enzyme và là một chất điều biến ngoại bào trong hoạt động tế
bào(Alam và ctv, 1999).Việc phóng thích adenosine nội sinh có ảnh hưởng mạnh mẽ
trong một loạt các hệ thống cơ quan (Olah và ctv, 1992). Ví dụ, adenosine có tác dụng
chủ yếu làm tăng sự phân cực trên điện thế màng tế bào dễ bị kích thích, ức chế tế bào
cơ trơn mạch máu của động mạch vành và các tế bào thần kinh trong não (Basheer và
ctv, 2004). Là một nucleoside nội sinh, adenosine được sử dụng như chất chỉ thị để
khảo sát chất lượng các sản phẩm khác nhau.Ví dụ, adenosine là một chỉ số quan trọng
để đánh giá chất lượng của Linh Chi (Ganoderma lucidum) và Cordyceps (Gong và
ctv, 2004; Gao và ctv, 2007).
2.4. Phương pháp phân tích adenosine
Điện di mao quản (Capillary electrophoresis – CE) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
là những kỹ thuật phân tách adenosine thường được sử dụng nhất kết hợp với việc phát
hiện bằng tia cực tím (Gong và ctv, 2004; Kieszling và ctv, 2004; Tzeng và ctv,
2006).Bên cạnh đó, người ta còn sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin Layer
Chromatography – TLC) để phân tích các nucleoside trong Cordyceps sinensis và
Cordyceps nuôi cấy (Guo và ctv, 2006). Tuy nhiên, HPLC là hệ thống dùng để phân
tích phổ biến, được sử dụng như thiết bị tiêu chuẩn trong nhiều phòng thí nghiệm, đơn
giản, nhạy, và phù hợp cho việc phân tích adenosine (Xue và ctv, 2009).

8


2.4.1. Giới thiệu về phương pháp sắc ký

2.4.1.1 Lịch sử phương pháp sắc ký
Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát
minh ra kỹ thuật sắc ký vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll. Từ
ngữ “chromatography” xuất phát từ chữ “chroma” trong tiếng Latinh có nghĩa là chất
màu, nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga, vừa là màu của sắc tố thực vật ông
phân tích vào lúc bấy giờ. Tên này vẫn tiếp tục được dùng dù các phương pháp hiện
đại không còn liên quan đến màu sắc (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Năm 1938, Izmailov và Schraiber đã xây dựng và sau đó năm 1958 Stahl đã hoàn
thiện phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Sắc ký tiếp tục phát triển không ngừng nhờ vào những kết quả nghiên cứu của
Martin và Synge trong suốt những năm thập niên 40 và 50 của thế kỷ 20. Hai ông đã
đưa ra những nguyên tắc và kỹ thuật cơ bản của sắc ký phân bố làm động lực cho sự
phát triển của nhiều phương pháp sắc ký khác nhau như sắc ký giấy (PC), sắc ký khí
(GC) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Sắc ký khí đã được biết đến từ năm 1906 nhưng
mãi đến năm 1952, kỹ thuật này mới được phát triển mạnh mẽ, nhất là trong thập niên
1960. Năm 1967, Horvath là tác giả đầu tiên đã tạo máy HPLC để nghiên cứu về
nucleotide, tạo một bước ngoặt mới trong lịch sử sắc ký (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
2.4.1.2 Nguyên tắc cơ bản của phương pháp sắc ký
Sắc ký là một phương pháp dùng để phân tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp
chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại
hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha
tĩnh) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Về căn bản, khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha
tĩnh và pha động tương ứng với tính chất của chúng (tính hấp phụ, tính tan). Trong các
hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các
chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha tĩnh và pha động. Trong quá trình pha
động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến pha tĩnh khác, sẽ lặp đi
lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ
chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha
này. Nhờ vậy, mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký (Martin, 1952).

9


Hầu hết các phương pháp sắc ký đều được dựa theo nguyên lý trên, và hiệu quả
của từng phương pháp phụ thuộc vào sự lựa chọn giữa pha động và pha tĩnh.
2.4.1.3 Phân loại các phương pháp sắc ký
Tùy thuộc vào bản chất của pha tĩnh và pha động, người ta phân biệt một số kỹ
thuật sắc ký khác nhau
Bảng 2.1 Các loại pha động và pha tĩnh sử dụng trong kỹ thuật sắc ký
Pha động

Pha tĩnh

Chất lỏng

Chất rắn

Sắc ký lỏng – rắn (sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng)

Chất khí

Chất rắn

Sắc ký khí – rắn (gọi chung là sắc khí)

Chất lỏng

Chất lỏng

Sắc ký lỏng – lỏng (Sắc ký HPLC với cột nhồi pha

Tên gọi của kỹ thuật sắc ký

đảo C – 18)
Chất khí

Chất lỏng

Sắc ký khí – lỏng (gọi chung là sắc khí)
(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Dựa vào bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình tách chất, phương pháp
sắc ký được phân thành sắc ký phân chia (Partition chromatography),sắc ký hấp thu
(Adsorption chromatography),sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography) và
sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography; gel filtration chromatography) (Nguyễn
Kim Phi Phụng, 2007).
Các kỹ thuật sắc ký cũng được phân biệt dựa vào cấu hình, nghĩa là cho biết pha
tĩnh được chứa đựng trong các thiết bị ra sao và với thiết bị như thế, pha động đi ngang
qua pha tĩnh như thế nào, xét theo trạng thái vật lý (khí hoặc lỏng) hoặc cho biết làm sao
pha động có thể di chuyển được (nhờ vào trọng lực, lực mao dẫn hoặc các lực khác).
Về tổng quát, có hai loại cấu hình: phương pháp phẳng (planar method) và
phương pháp cột (column method).
Trong những loại phương pháp phẳng: pha tĩnh được tráng thành một lớp thật
mỏng lên trên một tấm phẳng. Khi sắc ký, tấm này được dựng đứng và pha động di
chuyển ngang qua bề mặt của tấm này, có thể theo chiều từ trên xuống dưới hoặc từ
dưới đi lên.
Trong những loại phương pháp cột: pha tĩnh được nén trong một trụ hình tròn và
pha động di chuyển xuyên ngang qua trụ đó, có thể nhờ trọng lực hoặc nhờ một bơm
có áp suất lớn hoặc nhờ áp lực của chất khí.

10


Bảng 2.2 Tóm tắt các cấu hình sắc ký khác nhau
Hình
học
Phẳng

Cấu hình sắc ký
Giấy

Chiều di chuyển của pha động
Đi lên, đi xuống, từ tâm lan tỏa

Loại sắc ký
Phân chia

tròn
Phẳng
Cột

Lớp mỏng
Cột hở

Đi lên, đi xuống, từ tâm lan tỏa

Hấp thu, phân chia,

tròn

trao đổi ion, lọc gel

Đi xuống

Hấp thu, phân chia,
trao đổi ion, lọc gel

Cột
Cột

Sắc ký khí (GC) Nhờ vào ngoại lực
HPLC

Nhờ vào ngoại lực

Hấp thu, phân chia
Hấp thu, phân chia,
trao đổi ion, lọc gel
(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

2.4.2. Sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography – HPLC)
2.4.2.1 Nguyên tắc của sắc ký lỏng cao áp
HPLC được ra đời vào đầu năm 1970 là một trong những công cụ quan trọng của
các nhà phân tích. HPLC là phương pháp sắc ký được phát triển dựa trên phương pháp
ghi sắc ký cột, các chất phân tích khi qua cột sắc ký do có ái lực khác nhau với pha
động (dung môi) và pha tĩnh (các hạt nhồi trong cột) mà chúng ra khỏi cột với thời
gian khác nhau, chất nào có ái lực với pha tĩnh lớn hơn sẽ giữ trong cột lâu hơn, còn
chất có ái lực nhỏ với pha tĩnh sẽ ra khỏi cột cùng với pha động sớm hơn.
Phương pháp HPLC có một số ưu điểm như áp suất cao, độ phân giải cao, nhạy,

vận tốc sắc ký nhanh nên được áp dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu như phân
tích dược phẩm, các dung dịch sinh lý, polymer thiên nhiên hoặc tổng hợp, phân tách
các acid nucleic và các acid amin(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Hiện nay, HPLC được sử dụng nhiều để phân tích các hoạt chất sinh học, đặc biệt
là các nucleoside có trong Cordyceps sinensis. HPLC với cột (250 × 4,6mm i.d.,
5µm), đầu dò mạng diod (HPLC – DAD) được sử dụng để phân tích ergosterol, các
nucleoside có trong Cordyceps tự nhiên và nuôi cấy (Li và ctv, 2004). Trong các
nghiên cứu khác, HPLC với đầu dò UV (HPLC – UV), cột C18 (250 mm x 4,6 mm
i.d., 5 µm) cũng đã được sử dụng để xác định adenosine trong sữa ong chúa
11


(Xue và ctv, 2009). Việc sử dụng HPLC với đầu dò khối khổ được sử dụng để phân
tích các nucleoside có trong Cordyceps sinensis (Guo và ctv, 2005).
2.4.2.2Các bộ phận của HPLC

Hình 2.5 Sơ đồ hệ thống HPLC.
( />
Hệ thống HPLC, bao gồm các bộ phận chính như:
- Bình chứa dung môi giải ly cột: bình được làm bằng chất liệu trơ, thường bằng
thủy tinh. Bình luôn luôn có một cái nắp bảo vệ để không cho bụi rơi vào trong bình,
nắp có lỗ hở để bình luôn thông với khí trời. Trong bình, có một ống dẫn dung môi từ
bình vào ống sắc ký, ở đầu này có gắn một nút lọc bằng kim loại với mục đích lọc
dung môi và cũng để giữ ống luôn ở dưới mặt thoáng của chất lỏng.
- Máy bơm: loại bơm của máy HPLC là loại bơm đặc biệt với áp suất rất cao lên
đến 7000 psi (48,3 MPa) để bơm một dung môi (pha động) đi xuyên ngang qua một
pha tĩnh với một vận tốc không đổi, thường vào khoảng 0,5 – 4,0 ml/phút. Bơm được
cấu tạo bằng chất liệu để chịu đựng được dung môi hữu cơ và các dung dịch đệm.
- Cột sắc ký (và cột bảo vệ): cột HPLC được làm bằng thép không gỉ, thường dài
10 – 25 cm và có đường kính bên trong 2,1 – 4,6 mm. Cột sắc ký được nhồi thật chặt

bởi những hạt nhỏ đường kính ≤ 5 µm. Trước khi pha động đi vào cột phân tích, nó
phải được cho đi ngang một cột bảo vệ (guard column), sử dụng để lọc bỏ những chất
tạp bẩn còn sót lại.
12


- Đầu dò: có nhiều loại đầu dò được sử dụng trong hệ thống HPLC, trong đó phổ
biến nhất là đầu dò đo hấp thu tia tử ngoại (Ultraviolet detector) và đầu dò mạng diod
quang (photodiode array spectrophotometer).
Đầu dò hấp thụ tử ngoại (ultraviolet detector): sử dụng cho các hợp chất có khả
năng hấp thụ trong bước sóng cần nghiên cứu nhưng đầu dò hấp thụ tử ngoại vẫn được
sử dụng rộng rãi vì nó dễ vận hành,không nhạy với nhiệt độ và tốc độ dòng, đáp ứng
tuyến tính giữa sự hấp thu UV với lượng mẫu. Nhưng nó có nhược điểm khá kén chọn
loại hợp chất phân tích vì một số loại hợp chất hấp thu UV rất kém.
Đầu dò mạng diod quang (photodiode array spectrophotometer): cho phép quét
một cách liên tục quang phổ hấp thu của một chất phân tích đang hiện diện trong dòng
chảy của dung môi ly giải, nên không cần phải làm ngưng dòng chảy. Máy quang phổ
mạng diod quang có cách bố trí sắp đặt các bộ phận của hệ thống ở vị trí ngược lại với
đầu dò đo hấp thu tia tử ngoại, trong đó tất cả ánh sáng đến từ nguồn sáng đều được
tập trung chiếu vào ống chứa dung dịch mẫu phân tích. Toàn phổ ánh sáng, sau khi đi
xuyên ngang qua ống chứa mẫu, được một máy nhiễu xạ ánh sáng toàn phổ tán xạ
thành những bước sóng đơn, các bước sóng đơn này được tập trung vào một mạng
diod quang. Mạng diod quang là một dãy đầu dò, lên đến 1056 cái, gắn trên những
chip điện tử, mỗi diod nhận được một bước sóng khác nhau với độ phân giải của phổ
khoảng 1,2 nm. Ngoài ra, hệ thống HPLC còn có bộ phận khử khí và hệ thống xử lý
dữ liệu (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
2.4.2.3 Pha tĩnh trong HPLC
Có nhiều loại pha tĩnh để nhồi cột HPLC, tùy thuộc vào tính chất của hợp chất
phân tích mà lựa chọn cột pha tĩnh khác nhau, bao gồm: cột pha thường (normal phase
column), cột pha tạo nối (bonded phase), cột pha đảo (reverse phase), cột trao đổi ion

(ion exchange column), cột sắc ký lọc gel (size exclusion column).
Các loại nguyên liệu dùng để nhồi cột sắc ký HPLC là những hạt có lỗ rỗng siêu
nhỏ (microporous particle) với kích thước, dạng và độ rỗng khác nhau. Phần lớn các
nguyên liệu là silica, là những hạt có kích thước nhỏ, có diện tích bề mặt lớn (200 –
300 m2/g) và chịu được áp suất tương đối cao. Các loại nguyên liệu khác có thể là
alumin, zirconium, nguyên liệu trao đổi ion.

13


Bảng 2.3 Các loại cột HPLC dùng trong kỹ thuật sắc ký khác nhau
Loại cột

Tính chất của hợp chất có thể phân tích

Cột pha thường, pha Có trọng lượng phân tử nhỏ (< 2000). Không có mang điện
đảo, pha tạo nối

tích. Có thể có tính phân cực hoặc không. Có thể hòa tan trong
dung môi hữu cơ hoặc nước.

Cột trao đổi ion

Có trọng lượng phân tử nhỏ (< 2000). Phân tử có mang điện
tích. Loại hợp chất hòa tan trong nước.

Cột sắc ký gel

Có trọng lượng phân tử nhỏ hoặc lớn. Không có mang điện tích.
Có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ hoặc nước.

(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

2.4.2.4 Pha động trong HPLC
Trong phương pháp sắc ký, quá trình phân tách dựa trên sự tương tác giữa chất
cần phân tích trong mẫu, pha tĩnh, pha động. Do đó, việc điều chỉnh pha động được
xem là vấn đề quan trọng.
Dung môi dùng cho HPLC có thể là nước, các loại dung dịch đệm (pha trong
nước), methanol, acetonitrile hoặc hỗn hợp của các loại trên. Nếu máy sử dụng đầu dò
UV, dung môi sử dụng phải trong suốt đối với bước sóng mà đầu dò UV đang hoạt
động để phát hiện mẫu chất.
Tất cả dung môi phải có độ tinh khiết cao, đạt tiêu chuẩn HPLC (HPLC grade
solvent), không có lẫn bụi bẩn, trước khi gắn vào máy HPLC, dung môi phải được khử
không khí. Có thể khử khí bằng cách cho một luồng khí helium xục mạnh vào bình với
vận tốc 300 ml/phút trong vài phút, bong bóng khí helium sẽ đuổi bọt khí ra khỏi bình.
Dung môi bão hòa khí helium không làm ảnh hưởng gì đến quá trình sắc ký. Cũng có
thể khử khí bằng cách đặt bình, đã được mở nắp, vào một bồn siêu âm và cho máy
hoạt động trong 5 – 10 phút (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Việc sử dụng pha động là hỗn hợp methanol và nước cho việc phân tích
cordycepin và adenosine trong các sản phẩm của Cordyceps (Huang và ctv, 2009).
Trong một nghiên cứu khác, Li và ctv (2004) đã sử dụng dung môi pha động gồm:
acetonitrile, 10 mmol/l ammonium acetate trong nước để xác định đồng thời ergosterol
và các nucleoside có trong Cordyceps tự nhiên và nuôi cấy. Cũng theo

14