PHÁT HIỆN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE (APP) VÀ XÁC ĐỊNH TÝP 1, 2, 5, 8 BẰNG KỸ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y
****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE
(APP) VÀ XÁC ĐỊNH TÝP 1, 2, 5, 8 BẰNG KỸ THUẬT PCR

Sinh viên thực hiện: PHẠM NGỌC NHƯ Ý
Lớp: DH08DY
Ngành: Dược Thú Y
Niên khóa: 2008 – 2013

Tháng 08/2013


BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y
****************

PHẠM NGỌC NHƯ Ý

PHÁT HIỆN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE
(APP) VÀ XÁC ĐỊNH TÝP 1, 2, 5, 8 BẰNG KỸ THUẬT PCR

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ thú y

Giáo viên hướng dẫn

TS. NGUYỄN ĐÌNH QUÁT

Tháng 08/2013

i


XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên thực tập: Phạm Ngọc Như Ý.
Tên luận văn: “Phát hiện Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) và xác
định týp 1, 2, 5, 8 bằng kỹ thuật PCR”.
Đã hoàn thành khóa luận theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các
ý kiến nhận xét, đóng góp của Hội đồng chấm báo cáo tốt nghiệp ngày …/…/2013.
Ngày

tháng

năm 2013

Giáo viên hướng dẫn

TS. Nguyễn Đình Quát

ii


LỜI CẢM TẠ
Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến công ơn sinh thành, dưỡng dục và hy
sinh của Ba Mẹ đã tận tụy lo cho con đến ngày hôm nay, cùng những người thân

luôn yêu thương, giúp đỡ và động viên con trong những năm qua.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Đình Quát đã hết lòng giảng
dạy, hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo tôi suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn
tốt nghiệp.
Luôn ghi nhớ và cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP.
Hồ Chí Minh và Ban chủ nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y cùng toàn thể quý thầy cô
đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập vừa
qua.
Xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc và các anh chị Bệnh Xá Thú Y Trường
Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.
Cảm ơn tập thể lớp DH08DY đã cùng chung sức và giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp.

iii


TÓM TẮT
Đề tài “Phát hiện Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) và xác định týp 1,
2, 5, 8 bằng kỹ thuật PCR”đã được tiến hành tại phòng Phân Tử và Nuôi Cấy Tế
Bào thuộc Bệnh Xá Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh từ ngày
02/02/2013 đến 15/06/2013.
Mục đích: xây dựng quy trình PCR phát hiện APP và các týp 1, 2, 5, 8 trên
mẫu phổi heo.
Kết quả thu được như sau:
Đã bước đầu xây dựng thành công qui trình PCR phát hiện APP trên mẫu
phổi heovới đoạn mồi xuôi: 5’-TAGAACCTTGTAAGCCTCGTCCATA-3’, đoạn
mồi ngược: 5’-CGTTTGTTAAGTGGTGTTGAGC-3’ và chương trình chạy trên
máy luân nhiệt là: 95 oC trong 3 phút (biến tính); 35 chu kỳ gồm 95 oC trong 1 phút
(biến tính), 56 oC trong 45 giây (bắt cặp), 72 oC trong 45 giây (kéo dài); và 72 oC

trong 10 phút (kéo dài cuối).
Tỉ lệ mẫu dương tính với APP bằng kỹ thuật PCR là 32 %.
Không xác định được các týp 1, 2, 5, 8 trên các mẫu dương tính với APP.

iv


MỤC LỤC
TRANG
TRANG TỰA ................................................................................................ i
PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN .............................. ii
LỜI CẢM TẠ ..............................................................................................iii
TÓM TẮT ................................................................................................... iv
MỤC LỤC .................................................................................................... v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ......................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH ........................................................................... x
Chương 1 MỞ ĐẦU .................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
1.2 Mục đích và yêu cầu ...................................................................................... 2
1.2.1 Mục đích ................................................................................................. 2
1.2.2 Yêu cầu ................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN ............................................................................ 3
2.1 Đặc điểm sinh lí hô hấp của heo..................................................................... 3
2.1.1 Các đường dẫn khí .................................................................................. 3
2.1.2 Cấu tạo phổi ............................................................................................ 3
2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến bệnh đường hô hấp ........................................ 4
2.1.3.1 Yếu tố không truyền nhiễm .............................................................. 4
2.1.3.2 Yếu tố truyền nhiễm ......................................................................... 4
2.2 Bệnh do Actinobacillus pleuropneumoniae .................................................... 6

2.2.1 Khái niệm ................................................................................................... 6
2.2.2 Lịch sử .................................................................................................... 6
2.2.3 Căn bệnh học .......................................................................................... 7
2.2.4 Độc lực ................................................................................................... 8
2.2.5 Dịch tễ .................................................................................................... 9

v


2.2.6 Cách sinh bệnh ...................................................................................... 10
2.2.7 Triệu chứng........................................................................................... 11
2.2.8 Bệnh tích............................................................................................... 12
2.2.8.1 Bệnh tích đại thể ............................................................................ 12
2.2.8.2 Bệnh tích vi thể .............................................................................. 13
2.2.9 Chẩn đoán ............................................................................................. 13
2.2.10 Điều trị................................................................................................ 13
2.2.11 Phòng bệnh ......................................................................................... 14
2.2.11.1 Vệ sinh phòng bệnh ...................................................................... 14
2.2.11.2 Phòng bệnh bằng vaccine ............................................................. 15
2.3 Giới thiệu kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................ 17
2.3.1 Kỹ thuật PCR ........................................................................................ 17
2.3.2 Phương pháp ly trích DNA.................................................................... 17
2.3.3 Định tính và định lượng DNA ............................................................... 18
2.3.4 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR .................................................. 19
2.3.5 Primer ................................................................................................... 19
2.3.6 Nguyên tắc của phương pháp PCR ........................................................ 20
2.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR ............................................. 20
2.3.8 Các hạn chế của PCR ............................................................................ 22
2.3.9 Giá trị sử dụng của PCR ........................................................................ 23
2.3.10 Đọc kết quả ......................................................................................... 23

2.4 Những công trình nghiên cứu có liên quan ................................................... 24
Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 26
3.1 Thời gian và địa điểm .................................................................................. 26
3.1.1 Thời gian............................................................................................... 26
3.1.2 Địa điểm thực hiện ................................................................................ 26
3.2 Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 26
3.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 26
3.4 Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 26

vi


3.4.1 Thiết bị, dụng cụ và vật liệu thí nghiệm ................................................ 26
3.4.2 Thu thập mẫu phổi có bệnh tích viêm màng phổi .................................. 27
3.4.3 Qui trình xét nghiệm APP bằng kỹ thuật PCR ....................................... 28
3.4.3.1 Đoạn mồi ....................................................................................... 28
3.4.3.2 Qui trình tách chiết DNA ............................................................... 28
3.4.3.3 Qui trình thực hiện PCR ................................................................. 29
3.4.3.4 Phương pháp chạy điện di .............................................................. 29
3.4.4 Qui trình định týp 1, 2, 5, 8 của APP trên các mẫu dương tính bằng kỹ
thuật PCR ...................................................................................................... 30
3.4.4.1 Đoạn mồi ....................................................................................... 30
3.4.4.2 Qui trình thực hiện PCR ................................................................. 30
3.4.4.3 Phương pháp chạy điện di .............................................................. 31
3.5 Công thức tính ............................................................................................. 31
Chương 4KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 32
4.1. Xây dựng qui trình xét nghiệm APP bằng kỹ thuật PCR ............................. 32
4.2 Xác định tỉ lệ dương tính với APP trên mẫu phổi thu thập tại cơ sở giết mổ
Nam Phong ........................................................................................................ 35
4.3 Xác định týp 1, 2, 5, 8 của APP trên các mẫu dương tính ............................. 37

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................... 39
5.1 Kết luận ....................................................................................................... 39
5.2 Đề nghị ........................................................................................................ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 40

vii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APP

: Actinobacillus pleuropneumoniae

CAMP

: Christae Ackins And Much Petersen

dATP

: deoxyadenosine triphosphate

dCTP

: deoxycytosine triphosphate

dGTP

: deoxyguanosine triphosphate

dTTP

: deoxythimine triphosphate

dNTPs

: deoxynucleoside triphosphate

ELISA

: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

LPS

: Lipopolysaccharide

NAD

: Nicotinamide Adenin Dinucleotide

OD

: Optical Density

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RTX

: Repeats-in-toxin

SDS

: Sodium Dodecyl Sulphate

SPF

: Specific Pathogen Free

Tm

: Melting temperature

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi cho phản ứng PCR xét nghiệm APP
Bảng 3.2 Trình tự đoạn mồi cho phản ứng PCR định týp 1, 2, 5, 8 của APP
Bảng 3.3Chương trình chạy PCR định týp 1, 2, 5, 8 của APP
Bảng 4.1 Tỉ lệ dương tính với APP bằng kỹ thuật PCR

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 3.1Bệnh tích viêm màng phổi nghi ngờ do APP
Hình 4.1 Kết quả PCR xét nghiệm APP với nhiệt độ ủ bắt cặp 60 oC
Hình 4.2 Kết quả PCR xét nghiệm APP với nhiệt độ ủ bắt cặp 56 oC
Hình 4.3Kết quả PCR xét nghiệm APP trên một số mẫu đại diện

Hình 4.4 Kết quả PCR đại diện cho xét nghiệm APP định týp 1, 2, 5, 8 âm
tính

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, nền kinh tế Việt Nam ngày càng phát triển, mức sống của người
dân ngày càng được cải thiện và nâng cao. Nhằm đáp ứng với xu thế phát triển
chung, ngành chăn nuôi nói chung và ngành chăn nuôi heo nói riêng đã và đang
không ngừng chuyển mình, phát triển theo hướng công nghiệp. Với quy mô chăn
nuôi tập trung, các trại chăn nuôi không những có thể đáp ứng ra thị trường số
lượng lớn những sản phẩm chăn nuôi chất lượng mà còn có thể tiết kiệm được nhiều
chi phí, tăng lợi nhuận. Tuy nhiên, bên cạnh đó những rủi ro và thiệt hại kinh tế
cũng rất nặng nề nếu xảy ra bệnh truyền nhiễm trong đàn. Trong các bệnh truyền
nhiễm ảnh hưởng đến ngành chăn nuôi, các bệnh trên đường hô hấp chiếm một vị
trí khá quan trọng. Theo Christensen và Mousing (1992), đến khi giết mổ thì hầu
như không có heo nào không bị bệnh đường hô hấp. Các bệnh đường hô hấp thường
không gây tỉ lệ chết cao nhưng chúng gây tổn thất nặng nề về mặt kinh tế vì heo
bệnh bị còi cọc, chậm lớn, tiêu tốn thức ăn nhiều nhưng chậm tăng trọng và chi phí
điều trị lớn. Trong đó, bệnh viêm phổi – màng phổi do vi khuẩn Actinobacillus
pleuropneumoniae (APP) gây ra trên heo lây lan mạnh ở mọi lứa tuổi với tỉ lệ bệnh
có thể lên đến 40% và tỉ lệ chết lên đến 24% (Biberstein và ctv, 1999) là một trong
những bệnh đường hô hấp gây nhiều thiệt hại kinh tế đáng kể cho các nhà chăn
nuôi. Theo Nicolet (1992), ở nước ta bệnh xảy ra phổ biến, xuất hiện trong mọi hình
thức chăn nuôi, đặc biệt nghiêm trọng ở các trại chăn nuôi tập trung quy mô lớn có
điều kiện vệ sinh không đảm bảo, heo không được tiêm phòng. Do đó, nhu cầu phát
hiện heo nhiễm APP bằng phương pháp chẩn đoán nhanh, có độ chính xác cao và ít

tốn kém để kịp thời đề ra các biện pháp can thiệp và xử lý ngày càng bức thiết.

1


Xuất phát từ tình hình trên và được sự cho phép của Khoa Chăn nuôi Thú Y
Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn
Đình Quát, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Phát hiện Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) và xác định týp 1, 2,
5, 8 bằng kỹ thuật PCR”.
1.2 Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Xây dựng quy trình phát hiện APP trên mẫu phổi heo giết thịt và xác định
týp 1, 2, 5, 8 trên các mẫu dương tính với APP bằng kỹ thuật PCR.
1.2.2 Yêu cầu
Thu thập mẫu phổi nghi nhiễm APP tại cơ sở giết mổ Nam Phong.
Thử nghiệm quy trình PCR để phát hiện APP.
Thử nghiệm quy trình PCR để xác định týp 1, 2, 5, 8 trên các mẫu dương
tính với APP.

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Đặc điểm sinh lí hô hấp của heo
Theo Lâm Thị Thu Hương (2005), hô hấp là sự trao đổi khí liên tục giữa cơ
thể sống và môi trường xung quanh.Trong cơ thể luôn có sự oxy hóa chất dinh
dưỡng để sản xuất nhiệt độ, công, các sản phẩm chế tiết,… nhờ oxy lấy từ môi
trường.

2.1.1 Các đường dẫn khí
Các đường dẫn khí gồm có xoang mũi, thanh quản, khí quản, phế quản, tiểu
phế quản. Đường hô hấp được lót bằng biểu mô có nhung mao nhằm thải ra ngoài
các vật lạ đồng thời tiết chất nhầy và sưởi ấm không khí.
2.1.2 Cấu tạo phổi
Phổi gồm hai lá phổi: phải và trái. Thông thường, dung tích của lá phổi phải
lớn hơn lá phổi trái. Phổi trái có ba thùy: thùy đỉnh, thùy tim và thùy hoành cách
mô. Phổi phải tương tự như phổi trái nhưng có thêm thùy Azygot hay thùy giữa
(Phan Quang Bá, 2007).
Phổi được bao bọc bởi màng phổi có cấu tạo bởi mô liên kết, mô đàn hồi và
sợi cơ trơn. Màng phổi được duy trì trong tình trạng căng rất cần cho cử động co
giãn của hai lá phổi. Lớp màng phổi được nối tiếp với mô gian bào. Mô gian bào
này chia các tiểu thùy càng lúc càng nhỏ. Mỗi tiểu thùy có tiểu phế quản tận cùng
chia làm 2 - 4 vi phế quản. Các vi phế quản dẫn không khí đến phế nang bằng các
ống phế nang. Phế nang được xếp kế tiếp nhau, ngăn cách nhau bởi những vách
mỏng và thông thương với nhau nhờ ống phế nang. Đường kính phế nang khoảng
0,15 - 0,5 µm, thành phế nang là những tế bào biểu mô lát đơn với nhiều nơi dầy lên
từ 0,1 - 0,5 µm, gọi là “tâm vô hạch”. Phế nang có hệ thống ti thể dồi dào tham gia

3


vào việc thực bào bảo vệ cơ thể. Biểu mô phế nang tựa lên sườn collagen và sợi đàn
hồi để liên hệ trực tiếp với lớp nội ngoại mạc của mạng lưới mao quản phổi. Mạch
máu, mạch bạch huyết, dây thần kinh đều nằm trong gian bào. Máu đến phổi có 2
đường: hệ tuần hoàn cơ năng và hệ tuần hoàn nuôi dưỡng phổi. Thần kinh đến phổi
gồm sợi giao cảm và sợi phó giao cảm (Ngô Phương Nghi, 2003).
2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến bệnh đường hô hấp
Theo Trần Thanh phong (1996), bộ máy hô hấp trên heo là cơ quan thường
xuyên tiếp xúc với môi trường bên ngoài. Do đó nếu hàng rào bảo vệ (niêm mạc,

dịch tiết, lông rung) đường hô hấp bị suy yếu hoặc không còn hiệu lực thì các tác
nhân gây bệnh sẽ dễ dàng xâm nhập và gây bệnh. Bệnh đường hô hấp xảy ra do
nhiều yếu tố khác nhau:
2.1.3.1 Yếu tố không truyền nhiễm
Dinh dưỡng: mức độ cảm nhiễm với thú bệnh tăng lên khi khẩu phần không
cung cấp đủ vitamin và khoáng. Ngoài ra sức đề kháng còn phụ thuộc vào thành
phần thức ăn. Tính chất thức ăn cũng ảnh hưởng đến đường hô hấp, thức ăn dạng
bột có bụi cao làm cho heo dễ bị hắt hơi, viêm phổi.
Môi trường: nhiệt độ, ẩm độ, chuồng trại, tiểu khí hậu chuồng nuôi ảnh
hưởng trực tiếp đến sức tăng trưởng và sức đề kháng của heo. Ngoài ra, còn tạo điều
kiện cho mầm bệnh xâm nhập và phát triển. Chuồng trại không thông thoáng kết
hợp với chiếu sáng không thích hợp gây kích ứng niêm mạc dẫn đến tình trạng mất
bão hòa hệ hô hấp.
Di truyền: cũng liên quan đến rối loạn hô hấp.
Chăm sóc quản lý: có ảnh hưởng trực tiếp đến sức đề kháng của cơ thể đối
với mầm bệnh.
2.1.3.2 Yếu tố gây bệnh
Trong môi trường có rất nhiều mầm bệnh ảnh hưởng đến đường hô hấp. Khi
gặp điều kiện thuận lợi (sức đề kháng của thú giảm) chúng sẽ xâm nhập, phát triển
và gây bệnh. Những mầm bệnh gây bệnh hô hấp có thể là vi khuẩn, virus hay ký
sinh trùng.

4


 Bệnh do vi khuẩn:
-

Bệnh viêm phổi do Mycoplasma hyopneumoniae gây viêm phổi mãn tính với

những vùng gan hóa (đỏ, xám) có tính đối xứng.
-

Bệnh tụ huyết trùng do Pasteurella multocida với đặc điểm gây viêm phổi

thùy lớn, phổi có nhiều vùng gan hóa, viêm phổi – màng phổi, viêm màng phổi dính
lồng ngực, phổi có abscess.
-

Bệnh do Haemophilus parasuis với đặc điểm là viêm đa khớp, viêm màng

phổi sợi huyết, viêm màng não.
-

Bệnh viêm phổi – màng phổi do Actinobacillus pleuropneumonia.

-

Bệnh viêm teo xoang mũi truyền nhiễm do Bordetella bronchiseptica.

-

Bệnh do Streptococcus spp gây bệnh tích viêm phúc mạc có sợi huyết, sung

huyết gan và phổi.
-

Bệnh do Staphylococcus spp.

-

Bệnh phó thương hàn do Salmonella cholerae suis.

 Bệnh do virus:
-

Bệnh dịch tả heo do virus thuộc họ Flaviviridae.

-

Bệnh cúm heo do virus thuộc họ Orthomyxoviridae.

-

Bệnh giả dại do virus thuộc họ Herpesviridae suisHerpesvirus.

-

Bệnh cảm nhiễm đường hô hấp ở heo thuộc họ Coronaviridae.

 Bệnh do kí sinh trùng:
Giun phổi Metastronggylus spp tác động lên bộ máy hô hấp bằng cách phá
hủy niêm mạc, tiết độc tố làm suy giảm hệ thống tạo kháng thể, và hầu hết đều gây
chứng ho, viêm phế quản, viêm phổi.
Một số loài khác không định vị trên đường hô hấp nhưng trong chu trình phát
triển chúng di hành qua bộ máy hô hấp và các cơ quan gây nên tổn thương các cơ
quan chúng đi qua (Lương Văn Huấn và Lê Hữu Khương, 1997). Theo Alfonso
(1995), trong suốt quá trình di hành ngang qua phổi heo, ấu trùng của Ascaris suum
có thể gây phù thũng, hình thành những ổ xuất huyết dưới màng phổi và gây viêm
phổi kẽ.

5


2.2 Bệnh do Actinobacillus pleuropneumoniae
2.2.1 Khái niệm

APP là tác nhân gây viêm phổi – màng phổi trên heo. APP phân bố trên khắp
thế giới và gây nhiều thiệt hại kinh tế đối với các nhà chăn nuôi. Tại Việt Nam, vi
khuẩn này cũng đã được phân lập và được đánh giá là một bệnh quan trọng ở các
trại heo (Yoshikazu và ctv, 2005). Heo là ký chủ duy nhất của bệnh này, với đặc
điểm gây bại huyết, viêm nội tâm mạc, viêm khớp trên heo 1 - 6 tuần tuổi. Trên heo
lớn gây bệnh tích ngoài da, viêm màng phổi, có mức độ truyền lây rất cao từ đàn
này sang đàn khác qua các phương tiện vận chuyển (Macinnes và Rosendal, 1988).
Triệu chứng bệnh do APP rất thay đổi, có thể gây chết, gây mãn tính hoặc không có
triệu chứng (Taylor, 1999). Hầu hết những nỗ lực để kiểm soát và ngăn ngừa bệnh
tỏ ra chưa có hiệu quả (trích dẫn của Lo, 1997).
2.2.2 Lịch sử
Vào năm 1902, Ligniere và Spritz đã mô tả căn bệnh nhưng chưa hề đề cập ở
nước ta. Theo Pattinson và ctv quan sát ca bệnh đầu tiên vào năm 1957, kế đến là
Matthews và Pattinson (1961), Olander (1963) và Shope (1964) phát hiện tại một
nông trại ở Argentina, Anh Quốc và Mỹ. Vào thời điểm đầu tiên phân lập có thể là
một trong 3 loài: Haemophilus liticus, H. parafluenza, H. pleuropneumoniae. Vào
năm 1983, Pohl và các cộng sự đã phân biệt H. influenza và H. pleuropneumoniae
và chứng minh mối liên hệ giữa H. pleuropneumoniae và Actinobacillus lignieresi
từ đó vi khuẩn này được đặt tên là A. pleuropneumoniae (APP). Theo Bertschinger
và Seifert (1978) mô tả các vi khuẩn trông giống như Pasteurella haemolytica, được
xem là nguyên nhân gây viêm màng phổi hoại tử, chúng có liên quan đến NAD
(Nicotinamide Adenin Dinucleotide) không phụ thuộc vào biovar của APP(Pohl và
ctv, 1983) và bây giờ là APP biovar 2 (Taylor, 1999).
Hiện nay, APP đã xuất hiện ở Việt Nam và trong nền chăn nuôi công nghiệp

Úc, APP được xem là căn bệnh chính gây viêm màng phổi trên heo (Mireya, 2004).

6


2.2.3 Căn bệnh học
APP gây bệnh viêm phổi – màng phổi heo là vi khuẩn Gram âm, trực khuẩn
có capsule, không di động, không lông rung, không nha bào, kỵ khí tùy nghi. Kích
thước khuẩn lạc khoảng 0,5 - 1 mm, khuẩn lạc mọc tốt ở 37 0C trên môi trường có
thêm 5 - 10 % CO2. Sau 24 giờ nuôi cấy trên thạch máu khuẩn lạc dung huyết kiểu
β. Theo Phillips (1990), có 2 loại khuẩn lạc được tìm thấy, một loại tròn màu xám
và một loại mềm, dẹt, bóng, cả hai đều gây dung huyết và cho phản ứng CAMP (+)
với đường dung huyết của vi khuẩn Staphylococcus. Vi khuẩn không phát triển
trong môi trường thạch máu khi chưa được bổ sung NAD. Ngày nay người ta đã
chứng minh biovar 1 phụ thuộc NAD, biovar 2 không phụ thuộc NAD nhưng đòi
hỏi các nucleotid của pyridin hoặc tiền chất pyrindin nucleotid để tổng hợp NAD
(Niven và Levesque, 1988). Có thể phân biệt Haemophilus parasuis với
Actinobacillus pleuropneumoniae bằng vòng dung huyết quanh khuẩn lạc trên môi
trường thạch máu (Taylor, 1999).
APP biovar 1 chia làm 12 serovar. Serovar 5 chia thành 2 type 5A và 5B.
Tính đặc hiệu của huyết thanh được xác định bởi lớp vỏ polysaccharide và
lypopolysaccharide của màng tế bào. Tuy nhiên vài serovar có cấu trúc tương tự
hoặc chuỗi lipopolysaccharide O giống nhau. Điều này nhằm giải thích phản ứng
chéo giữa serovar 1, 9 và 11; serovar 3, 6 và 8; serovar 4 và 7 (Perry và ctv, 1990).
Biovar 2 có 3 serovar được xác định (Taylor, 1999).
Lớp vỏ bao quanh thành tế bào vi khuẩn đã được nghiên cứu và xác định các
serovar. Dạng vi khuẩn không vỏ bọc cũng được nghiên cứu. Có 3 loại protein tiết
ra bên ngoài (ngoại độc tố) thuộc họ RTX (Repeats-in-toxin) là: ApxI, ApxII,
ApxIII. Độc tố ApxI gây dung huyết mạnh, có khối lượng phân tử là 105 - 110 KDa
hiện diện trong các serovar 1, 5, 9, 10. Độc tố ApxII gây dung huyết có khối lượng

phân tử là 103 - 105 KDa, hiện diện trong tất cả các dòng trừ serovar 10. Độc tố
ApxIII không gây dung huyết có khối lượng phân tử 120 KDa, hiện diện trong
serovar 2, 3, 4, 6 và 8 (Taylor, 1999).

7


Độc tố ApxIV được phát hiện bởi Alain Schaller và cs (1999) trên heo ở thực
địa. Độc tố này được sản sinh ở tất cả các serotype, nhưng về độc lực của chúng gây
ra thì đến nay vẫn chưa được làm sáng tỏ (Nguyễn Thị Thu Hằng và ctv, 2009).
2.2.4 Độc lực
Ngày càng có nhiều bằng chứng cho rằng số lượng độc tố đóng một vai trò
quan trọng trong độc lực vi khuẩn (Macinnes và Smart, 1993). Với APP, ngoại độc
tố, lipopolysaccharide (LPS) và capsule là những yếu tố quan trọng tạo nên độc lực
của vi khuẩn. Chúng đóng vai trò mấu chốt quyết định sự bảo vệ và nhận diện
kháng nguyên APP. Các yếu tố độc lực được tóm tắt như sau:
 Ngoại độc tố
Ngoại độc tố APP liên quan đến các dấu hiệu lâm sàng (Rosendal và
Mitchell, 1980), dịch huyền phù từ APP có thể gây hoại tử và xuất huyết kết hợp
với viêm màng phổi. Ở nồng độ cao, độc tố APP là cytolysin có khả năng phân giải
hồng cầu và giết chết tế bào lympho, tế bào biểu mô, lympho T và đại thực bào
(Macinnes và Smart, 1993). Đặc tính thủy phân hồng cầu và gây độc tế bào của
APP do sự phối hợp ít nhất của 3 loại protein: ApxI, ApxII và ApxIII. Mỗi loại độc
tố sẽ thủy phân hồng cầu và gây độc tế bào theo những cách khác nhau tùy theo
chủng (Frey, 1995).
Độc lực của các serotype APP thay đổi từ mạnh đến yếu. Sự thay đổi này do
các loại độc tố của mỗi serotype tạo ra. Serotype 5 bị đột biến sẽ không tiết ApxI
hay ApxII không gây bệnh cho heo và chuột. Điều này cho thấy ngoại độc tố là yếu
tố độc lực quan trọng của APP serotype 5 (Inzana, 1991).
 Lipopolysaccharide

Lipopolysaccharide (LPS) là thành phần chủ yếu cấu tạo nên màng bên ngoài
của APP và có khả năng gây hư hại mô. LPS tinh khiết có khả năng gây gây hư hại
phổi khác với những tổn thương xuất huyết và hoại tử do nhiễm APP (Udeze và cs,
1987). Sự tương tác giữa LPS và ngoại độc tố làm tăng độc lực của APP (Izana,
1991). Theo Belanger và ctv (1990) báo cáo rằng 83 % serotype có LPS ít trơn, gây
dính ít và ở những chủng có vỏ capsule nhỏ, LPS là chất bám vào màng niêm của

8


hệ hô hấp. Điều này đã gợi ý rằng LPS là yếu tố cần thiết trong sự xâm lấn của APP
trong đường hô hấp (Taylor, 1999).
 Capsule
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng vỏ capsule của APP đóng vai trò quan trọng
trong việc phòng thủ chống lại hệ thống miễn dịch của vật chủ (Macinnes và Smart,
1993). Tất cả 12 serotype của APP được phân biệt bởi polysaccharide của capsule
với thành phần cấu trúc đặc trưng tạo ra miễn dịch đơn độc (Perry và ctv, 1990).
Capsule APP có tính kháng nguyên yếu (Fenwick và Osburn, 1986; Izana và
Mathison, 1987). Capsule tinh khiết không thể kích hoạt dòng thác bổ thể và không
thể hiện độc lực (Warol và Izana, 1994; Fenwick và Osburn, 1986). Không có biểu
hiện lâm sàng nào cũng như tổn thương ở phổi được tìm thấy khi đưa capsule tinh
khiết vào trong phế quản (Fenwick và Osburn, 1986). Vai trò chính là để bảo vệ vi
khuẩn không bị tiêu diệt bởi bổ thể trong trường hợp có và không có kháng thể
chống capsule đặc hiệu (Izana và ctv, 1988). Tuy nhiên, serotype 5 đột biến không
capsule trở nên nhạy cảm với sự tiêu diệt của bổ thể trong trường hợp không có
kháng thể đặc hiệu (Ward và Izana, 1994). Điều này cho thấy capsule góp phần
quan trọng trong việc kháng lại tác động gián tiếp của bổ thể. Ngoài ra các serotype
khác nhau có mức độ độc lực khác nhau. Các serovar có capsule lớn và dính hơn thì
có độc lực cao hơn (Jensen và Bertram, 1986). Điều này cho thấy capsule có thể là
một trong các yếu tố ảnh hưởng đến độc lực của các serotype.

2.2.5 Dịch tễ
APP không tồn tại lâu trong môi trường xung quanh, đặc biệt trong môi
trường khô ráo. APP có thể truyền trực tiếp từ heo bệnh sang heo nhạy cảm
(Wilson và ctv, 1987) hay truyền qua các dụng cụ chăn nuôi và phương tiện vận
chuyển đã bị nhiễm chất tiết của heo bệnh (Nicolet, 1992). Thời gian ủ bệnh rất thay
đổi, trong thực nghiệm thời gian từ lúc biểu hiện bệnh đến khi chết khoảng vài giờ
đến vài ngày. Mặc dù mọi lứa tuổi đều nhạy cảm với bệnh nhưng heo choai là nhạy
cảm nhất. Các yếu tố như vận chuyển, dồn chuồng, điều kiện khí hậu bất lợi có ảnh

9


hưởng đến khả năng chống bệnh của con vật (Nicolet, 1992). Trong heo nhiễm bệnh
APP trú ẩn ở hạch hạnh nhân, xoang mũi và những vùng phổi bị tổn thương.
APP phân bố khắp nơi trên thế giới, vài serotype được xem là có độc lực
thấp và không có ý nghĩa ở nước này nhưng lại là tác nhân gây bệnh ở một số nước
khác. APP chủng A2 và An5 từng được phân lập ở một số tỉnh ở miền Bắc Việt
Nam (Nicolet, 1992; trích dẫn bởi Yoshikazu Iritani, 2005). Theo Robert (2003),
hiếm có sự bảo hộ chéo giữa các chủng. Miễn dịch mẹ truyền kéo dài khoảng 6
tuần. Trong ổ dịch APP, tỉ lệ bệnh là 50 % và tỉ lệ chết có thể lên đến 10 % (Fewick
và Henry, 1994).
2.2.6 Cách sinh bệnh
Cách sinh bệnh của bệnh viêm màng phổi đã được nghiên cứu rất nhiều, cả
về sự phát triển bệnh tích lẫn mối quan hệ giữa vi khuẩn với các mô ở mức phân tử.
Gây bệnh thực nghiệm đã chỉ rõ rằng vi khuẩn sinh sống ở hạch hạnh nhân và định
cư ở biểu mô phế nang. Trong tự nhiên vi khuẩn kết bám nhờ fibrin. Trong phổi,
APP bị thực bào nhanh chóng bởi các đại thực bào phế nang và sản sinh độc tố
ApxI, ApxII và ApxIII. Tất cả các loại độc tố đó có chất độc tiềm tàng cho đại thực
bào, tế bào nội mô, tế bào biểu mô của phế nang và tế bào nội bì của mao mạch ở
thành phế nang. ApxII kháng một cách đặc hiệu với đại thực bào ở phế nang. Vi

khuẩn dường như được bảo vệ bởi hiện tượng đại thực bào nhờ lớp vỏ bọc của
chúng và dường như cũng đề kháng với hoạt động của bổ thể. Cảm nhiễm đi cùng
với các cytokine chẳng hạn như interleukin – 1β và IL – 8 trong dịch phế nang,
cũng xuất hiện trong mô bệnh tích rất sớm (Baarsch và ctv, 1995). Mô hư hỏng do
độc tố và cytokine cùng với cảm nhiễm làm cho bệnh tích phát triển. Thể cấp tính
và quá cấp thú có đáp ứng tương tự như trường hợp sốc nhiễm trùng trên người. Sự
khác nhau về độc lực của serovar hoặc ngay cả trong những serovar giống nhau, sự
khác nhau này do cấu trúc của lớp vỏ, thành phần LPS hoặc kiểu dung huyết. Nhìn
chung các serovar 1, 5, 9, 10 và 11 độc lực cao hơn các serovar khác (Taylor, 1999).
Bệnh tích phổi là kết quả của các độc tố xảy ra 3 giờ sau khi gây bệnh thực
nghiệm và ngày càng trở nên rõ ràng hơn. Thành phế nang tích dịch và mao mạch tụ

10


huyết. Dãn mạch bạch huyết với sự hiện diện của tế bào viêm, sợi huyết và dịch
chất. Tụ tập nhiều tiểu cầu và bạch cầu trung tính trong thành phế nang bị hư hại,
huyết khối hiện diện trong các tiểu động mạch lẫn thành mạch hoại tử rồi phát triển
thành nhồi huyết (infarct). Vi khuẩn tụ tập trong phế nang bệnh và nhiễm trùng
huyết có thể xảy ra. Bờ của vùng bệnh tích chứa đầy đại thực bào chết hay hư hỏng
hoặc nhiều mảnh tế bào và có thể dễ thấy phần ranh giới với mô phổi chung quanh
sau 4 ngày cảm nhiễm. Dịch chứa vi khuẩn trong các tiểu phế quản, cho nên vùng
trung tâm trở nên hoại tử và mô lành được hóa thớ.
Kháng thể hình thành sau 14 ngày cảm nhiễm, hàm lượng kháng thể đạt tối
đa trong vòng 4 - 6 tuần cảm nhiễm và tồn tại ở mức thấp trong nhiều tháng. Nái
truyền kháng thể qua sữa đầu cho heo con sơ sinh và tồn tại trong 4 - 5 tuần và
trong vài trường hợp bảo hộ này đạt tối đa trong 3 tuần. Kháng thể này chống lại
được tất cả các phần kháng nguyên của vi khuẩn bao gồm vỏ bọc, kháng nguyên
LPS, toxin, protein màng ngoài, Superoxide dismutase và protein liên kết với sắt.
Cả kháng thể IgA và IgG đều hình thành (Taylor, 1999).

2.2.7 Triệu chứng
Bệnh có thể chia thành 3 dạng: quá cấp, cấp tính và mãn tính. Triệu chứng
thay đổi tùy theo sức khỏe và khả năng miễn nhiễm của thú, điều kiện môi trường
và mức độ bộc phát của yếu tố gây bệnh.
Ở thể quá cấp, một hay nhiều heo trong bầy hoặc khác bầy đột nhiên yếu ớt
và sốt với thân nhiệt cao 41,5 0C, thờ ơ và bỏ ăn, có thời kỳ ngắn ói mửa, tiêu chảy;
chảy máu mũi, miệng. Thú bệnh nằm bẹp không có triệu chứng hô hấp nhưng tim
và tuần hoàn yếu. Thú chết trong vòng 24 - 36 giờ, trước khi chết trong miệng thú
luôn có nhiều dịch tiết lẫn bọt máu. Hiếm có trường hợp thú chết đột ngột mà không
có biểu hiện triệu chứng của bệnh (Taylor, 1999).
Trong thể cấp tính, thân nhiệt của thú tăng từ 40,5 - 41 0C, thú khó chịu và
hôn mê, thú giảm tính thèm ăn và uống ít nước, triệu chứng hô hấp là thở khó, tuần
hoàn và tim yếu, tụ máu ở các phần thấp. Ở dạng cấp tính có thể chết hoặc hồi phục,
khi bệnh nổ ra qua 4 ngày mà heo còn sống sót thì cũng có khả năng hồi phục.

11


Thể mãn tính phát triển sau khi triệu chứng cấp tính biến mất, thú sốt hoặc
không sốt, ho liên tục hoặc cắt quãng với cường độ khác nhau, thú ăn ít và giảm
tăng trọng, thể mãn tính thường chỉ phát hiện lúc giết mổ với bệnh tích đặc trưng
của phổi. Bệnh mãn tính là nguyên nhân lây lan mầm bệnh giữa các đàn.
Phát hiện thú bệnh bằng cách quan sát vận động miễn cưỡng của chúng. Khi
thú di chuyển, chúng tụt lại phía sau của bầy và vùng vẫy yếu ớt khi bị cầm cột.
Trong đàn thú bệnh mãn tính thường có nhiều thú không triệu chứng. Các triệu
chứng đó có thể do các cảm nhiễm khác ở đường hô hấp. Bệnh nguyên phát có thể
quan sát sẩy thai trên đàn nái bệnh, nhất là SPF (Specific Pathogen Free). Các triệu
chứng khác như viêm nội tâm mạc, viêm khớp và abscess xuất hiện ở các vị trí khác
trên cơ thể heo là do serovar 3, mặc dù các serovar khác hiện nay cũng ghi nhận
bệnh tích tương tự. Gần đây viêm tai giữa kết hợp với APP được ghi nhận (Taylor,

1999).
2.2.8 Bệnh tích
2.2.8.1 Bệnh tích đại thể
Bệnh tích định vị chủ yếu ở đường hô hấp, có nhiều loại bệnh tích khác
nhau, tùy theo triệu chứng của bệnh.
Ở thể cấp tính thú chết nhanh, khí quản và phế quản chứa đầy chất nhầy lẫn
máu và nhiều bọt, viêm màng phổi sợi huyết rất rõ, viêm dính xảy ra giữa phổi,
thành ngực, cơ hoành và màng ngoài tim. Xoang ngực chứa dịch chất thấm máu.
Dạng cấp tính của bệnh được xác định bằng vùng phủ fibrin và xuất huyết trên phổi
(Macinnes và Smart, 1993).
Trong giai đoạn sau của thể cấp tính, vùng phổi viêm sậm và rắn chắc với ít
hoặc nhiều viêm màng phổi sợi huyết, mặt cắt bở (dễ vỡ). Viêm màng phổi sợi
huyết rõ rệt với thú bệnh chết trong giai đoạn cấp tính, ít nhất 24 giờ sau khi nhiễm
và xoang ngực chứa dịch chất thấm máu, viêm phổi dính sườn xảy ra được quan sát
sau khi hạ thịt. Bệnh tích ban đầu màu đỏ nâu hay đen trở nên sáng và rắn chắc hơn.
Bệnh tích co rút lại xem như sự phân giải đang tiến triển, cho đến khi bệnh tích kinh
niên thì các cục bướu kích thước khác nhau vẫn còn, hầu hết ở các thùy hoành cách

12


mô. Các cục bướu trông giống như abscess không giới hạn bởi lớp vỏ mô liên kết
dày và vùng viêm dính sườn (Taylor, 1999).
2.2.8.2 Bệnh tích vi thể
Trong trường hợp đầu của bệnh, thay đổi mô học với đặc điểm hoại tử, xuất
huyết, bạch cầu trung tính xâm nhập, đại thực bào và tiểu cầu hoạt động, huyết khối
ở mao quản, thũy thũng phân tán và dịch chất có fibrin. Nếu đáp ứng cấp tính, đại
thực bào xâm nhập, chung quanh vùng hoại tử hóa sợi đáng kể và viêm màng phổi
hóa sợi (Taylor, 1999).
2.2.9 Chẩn đoán

Có thể chẩn đoán APP dựa trên những triệu chứng lâm sàng và bệnh tích trên
phổi. Nuôi cấy trong phòng thí nghiệm là một phương pháp cũng thường được áp
dụng.
Các phương pháp huyết thanh học như: phản ứng kết hợp bổ thể, ELISA
cũng khá phổ biến. Tuy nhiên, các phương pháp này chỉ có thể phát hiện được
những chủng APP đã được mô tả nên đưa đến một số trường hợp âm tính giả
(Jacobsen và Nielsen, 1995).
Phương pháp PCR đã được một số nhà khoa học đề xuất. Lo (1997) đã phát
hiện và định danh APP serotype 5 bằng kỹ thuật multiplex PCR. Chiers và ctv
(2001) cho biết kỹ thuật PCR phát hiện đoạn gen omlA mã hóa protein màng của
APP. Tuy nhiên, tiến hành PCR từ mẫu là toàn bộ hạch hạnh nhân sẽ cho độ nhạy
cao hơn mẫu sinh thiết hạch hạnh nhân (Fittipaldi và ctv, 2003).
2.2.10 Điều trị
APP thì nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh nhưng sự đề kháng cũng rất
nhanh khi sử dụng kháng sinh thường xuyên (Macinnes và ctv, 1990). Serotype 5
được phân lập ở Ontario thì kháng với tetracyline, serotype 7 thường xuyên kháng
với nhóm betalactam.
Sự đề kháng rất nhanh đối với penicillin, streptomycin, sulfonamide,
tetracyline và chloramphenicol là điều hết sức quan tâm. Điều này thường thấy đối
với các serovar 1, 3, 5 và 7 nhưng hiếm đối với các serovar khác đặc biệt là serovar

13


2, kháng thuốc qua trung gian plasmid, vì vậy làm kháng sinh đồ trong điều trị là rất
cần thiết.
Liệu pháp kháng sinh chỉ hiệu quả trên thú bệnh ở giai đoạn đầu, thuốc có
tác dụng làm giảm tỉ lệ chết. Để đảm bảo tác dụng và nồng độ kháng sinh cao trong
máu, tiêm nhắc lại là cần thiết, điều này phụ thuộc vào tính chất động dược học của
thuốc sử dụng. Sự thành công phụ thuộc vào sự phát hiện bệnh, cấp nước đầy đủ,

trộn kháng sinh vào nước uống cho hiệu quả tốt. Tuy nhiên, liệu pháp kháng sinh
không loại trừ hết căn bệnh mà chỉ làm giảm biểu hiện lâm sàng của bệnh.
Abscess ở phổi hoặc hạch hạnh nhân của thú bệnh mãn tính là nguồn chứa
mầm bệnh quan trọng cho các đợt cảm nhiễm trong đàn. Chữa trị nên chữa ngay
giai đoạn đầu của bệnh bằng cách chia nhóm nuôi trong môi trường không khí tốt
và duy trì mãi cho đến khi hạ thịt, nơi nào không có điều kiện thì kiểm soát các yếu
tố môi trường như nhiệt độ, độ thông thoáng và dùng vách ngăn thú bệnh trong ô
chuồng để giảm tối đa sự phát triển và lây lan bệnh. Tiếp tục sử dụng thuốc và nâng
liều sử dụng, không sử dụng một loại thuốc trong thời gian dài, liên tục giám sát sự
kháng thuốc của vi khuẩn. Chiến lược sử dụng thuốc đặt mục tiêu vào những thời
điểm nguy cơ, điều này có thể được khẳng định bằng cách theo dõi triệu chứng,
kiểm tra phủ tạng sau khi hạ thịt và phát hiện kháng thể trong đàn. Phải hủy bỏ toàn
bộ phổi và hạch lâm ba phổi, thịt được phép sử dụng (Taylor, 1999).
2.2.11 Phòng bệnh
2.2.11.1 Vệ sinh phòng bệnh
Ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn bằng cách nhập heo ở những cơ sở
giống an toàn dịch bệnh, có nguồn gốc lý lịch rõ ràng. Cần phải thực hiện các bước
kiểm dịch và xét nghiệm kỹ lưỡng, tiêm phòng vaccine và nuôi cách ly theo dõi 2
tháng trước khi nhập đàn.
Quản lý chặt chẽ các khâu xuất, nhập tuân thủ phương pháp “cùng vào –
cùng ra” (“all in – all out”).

14