KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM Cordyceps sinensis TRONG CÁC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY KHÁC NHAU

 
H  và tên: Đ NG TR

NG NGUY N 

L p: DH06SH 
MSSV: 06126096 
Ngày sinh: 29/11/1986 
 


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
 
 
 
 
 
 
 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
 
 

KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN
CỦA NẤM Cordyceps sinensis
TRONG CÁC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY KHÁC NHAU

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

ĐẶNG TRƯỜNG NGUYỄN

Niên khóa:

2006 - 2010

Tháng 09 / 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN
CỦA NẤM Cordyceps sinensis
TRONG CÁC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY KHÁC NHAU

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. LÊ THỊ DIỆU TRANG

ĐẶNG TRƯỜNG NGUYỄN

Tháng 09 / 2010


LỜI CÁM ƠN
Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ cùng gia đình đã không quản bao khó khăn
cực khổ để tạo điều kiện cho con được ăn học.
Để có điều kiện học tập trao dồi kiến thức và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp
này tôi xin chân thành cám ơn:
Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn
Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền dạy kiến thức cho tôi trong
suốt quá trình học tập tai trường.
Tiến sĩ: LÊ THỊ DIỆU TRANG đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho
tôi hoàn thành khóa luận này.
Ban lãnh đạo cùng toàn thể quý Thầy Cô và Anh Chị trong Viện Công Nghệ
Sinh Học Và Môi Trường, Ban Giám Đốc Trung Tâm Công Nghệ Quản Lý Môi
Trường và Tài Nguyên, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã giúp đỡ và tạo điều
kiện trong suốt thời gian thực tập tại viện.

i

 


TÓM TẮT
Cordyceps sinensis hay đông trùng hạ thảo (ĐTHT) là một trong những loại
dược liệu quý được biết đến từ rất lâu trong lịch sử đông y. Cordyceps sinensis được
sử dụng chữa các bệnh về phổi, thận từ hàng trăm năm nay trong y học cổ truyền
Trung Quốc. Gần đây nhiều công trình nghiên cứu cho thấy Cordyceps còn có hoạt
tính tăng cường miễn dịch, kháng ung thư và chống oxy hóa. Do sản phẩm tự nhiên

thường có rất ít và năng suất ngày càng giảm trong khi nhu cầu sử dụng tăng cao,
người ta nghiên cứu tìm mọi cách thay thế các sản phẩm Cordyceps tự nhiên bằng các
sản phẩm Cordyceps được sản xuất trong môi trường nhân tạo. Nhằm góp phần tìm
kiếm các điều kiện môi trường tối ưu cho việc nuôi cấy nhân tạo sợi nấm đông trùng
hạ thảo, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển
của nấm Cordyceps sinensis trong các môi trường nuôi cấy khác nhau”.
Kết quả: Ghi nhận được các đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm, tốc độ
sinh trưởng của C. sinensis nuôi cấy trên đĩa petri. Trong 4 nguồn cacbon và 4 nguồn
nitrogen được sử dụng trong thành phần môi trường nuôi cấy lỏng, dextrin và yeast
extract cho hiệu quả cao nhất trong quá trình phát triển sinh khối của nấm C. sinensis.
Kết luận: dextrin và yeast extract có thể là lựa chọn tối ưu trong thành phần
môi trường nuôi cấy C. sinensis để đạt được sinh khối cao nhất. Tuy nhiên cần xac
định tỉ lệ sử dụng dextrin: yeast extract và khảo sát ảnh hưởng của các thành phần
khác như vitamin, khoáng… để thiết kế công thức môi trường nuôi cấy thích hợp
nhất.

ii

 


SUMMARY

The thesis title: Investigation growth and development of Cordyceps sinensis
in different culture media
Cordyceps sinensis or winter worm summer grass is a valuable traditional
medicine for long time ago. It was used to treat diseases related to kidney and lung for
hundreds of years in China. Recently, many studies indicated that extracts of C.
sinensis can help improving immune response, anti-tumor and anti-oxidation. Since
natural product of C. sinensis is limited and yield has been declining through years

while the demand for health foods and medicine is increasing, the search for
substitutes of the natural products cultured in a submerged fermentation is considered.
To contribute to finding proper components for submerged fermentation, the research
“Investigation growth and development of Cordyceps sinensis in different culture
media” was done.
Results: Morphological characters were observed and growth speed was
recorded. For 4 carbon sources and 4 nitrogen sources, dextrin and yeast extract
showed high effect in producing high biomass of the fungus.
Conclusion and suggestion: dextrin and yeast extract can be considered as the
best components of carbon source and nitrogen source for fermentation media to
obtaine highest fungal biomass. However, ratio of dextrin/yeast extract should be
confirmed. Furthermore, other component sources such as vitamins, minerals… need
to be investigated.

iii

 


MỤC LỤC
Trang
Lời cám ơn ...................................................................................................................... i
Tóm tắt ........................................................................................................................... ii
Summary .......................................................................................................................iii
Mục lục.......................................................................................................................... iv
Danh sách các bảng và danh sách các hình.................................................................. vi
Chương 1: Mở đầu........................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Mục đích và yêu cầu ................................................................................................. 2
1.2.1. Mục đích ................................................................................................................ 2

1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................................. 2
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................... 2
Chương 2: Tổng quan tài liệu ........................................................................................ 3
2.1. Phân loại khoa học .................................................................................................. 3
2.2. Tổng quan về Cordyceps ........................................................................................ 3
2.3. Thành phần hóa học ................................................................................................ 6
2.4. Ứng dụng của Cordyceps sinensis .......................................................................... 6
2.5. Nguồn giống.......................................................................................................... 10
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ......................................................... 11
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 11
3.1.1. Thời gian ............................................................................................................ 11
3.1.2. Địa điểm ............................................................................................................. 11
3.2. Vật liệu thí nghiệm................................................................................................ 11
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................ 11
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu.......................................................................... 11
3.2.2.1. Thiết bị ............................................................................................................ 11
3.2.2.2. Dụng cụ ........................................................................................................... 11
3.2.3. Hóa chất ............................................................................................................. 11
3.3. Phương pháp tiến hành.......................................................................................... 11
iv

 


3.3.1. Chuẩn bị môi trường .......................................................................................... 11
3.3.2. Phục hồi nguồn nấm........................................................................................... 12
3.3.3. Khảo sát hình thái .............................................................................................. 12
3.3.4. Khảo sát tốc độ sinh trưởng ............................................................................... 12
3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng phát triển của ....... 13
3.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sự sinh trưởng phát triển ............ 14

Chương 4: Kết quả và thảo luận .................................................................................. 16
4.1. Kết quả .................................................................................................................. 16
4.1.1. Đặt điểm hình thái sinh trưởng và phát triển của Cordyceps sinensis ............... 16
4.1.1.1. Hình thái.......................................................................................................... 16
4.1.1.2 Tốc độ phát triển .............................................................................................. 18
4.1.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng phát triển của ...................... 19
4.1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sự sinh trưởng phát triển của .................... 21
4.2. Thảo luận............................................................................................................... 22
Chương 5: Kết luận và đề nghị .................................................................................... 24
5.1. Kết luận ................................................................................................................. 24
5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 24
Tài liệu tham khảo........................................................................................................ 25
Phụ lục..............................................................................................................................

 

 

 

 

v

 


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1. Tốc độ phát triển của sợi nấm Cordyceps sinensis trên .............................. 18
Bảng 4.2. Sinh khối sợi nấm thu được trong môi trường thay đổi nguồn cacbon ....... 20

Bảng 4.3. Sinh khối sợi nấm thu được trong môi trường thay đổi nguồn nitrogen ..... 21

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Một số loài nấm Cordyceps ........................................................................... 4
Hình 2.2 Nấm cordyceps sinensis mọc thành cây.......................................................... 5
Hình 2.3 Mô tả nấm mọc thành cây giông sâu khi sấy khô ........................................... 6
Hình 4.1 Sợi nấm xem dưới kính hiển vi ..................................................................... 16
Hình 4.2 Sợi nấm cordyceps sinensis phát triển trên môi trường PGA ....................... 17
Hình 4.3 Nấm mọc lên thành cây bên trên bề mặt thạch sợi nấm ............................... 17
Hình 4.4 Sợi nấm cordyceps sinensis phát triển trên môi trường thạch ...................... 19
Biểu đồ 4.1 Tốc độ phát triển của sợi nấm Cordyceps sinensis trên môi ................... 18
Biểu đồ 4.2 Biểu đồ cột so sánh sinh khối nấm thu được qua ba đợt nuôi .................. 20
Biểu đồ 4.3 Biểu đồ cột so sánh sinh khối nấm thu được qua ba đợt nuôi .................. 22

vi

 


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, do chất lượng cuộc sống con người ngày càng được nâng cao nên nhu
cầu sức khỏe là vấn đề rất được quan tâm của cộng đồng toàn xã hội.
Các nhà khoa học đã không ngừng tìm kiếm phát triển nguồn dược liệu quí để đáp
ứng nhu cầu sức khỏe của xã hội hiện đại. Cordyceps sinensis hay đông trùng hạ thảo
(ĐTHT) là một trong những loại dược liệu quý được biết đến từ rất lâu trong lịch sử

đông y. Cordyceps sinensis ký sinh trên ấu trùng của một số loài côn trùng cánh vảy, sau
khi sử dụng hết dinh dưỡng trong cơ thể ấu trùng sẽ hình thành quả thể nhằm phát tán
bào tử cho giai đoạn sinh sản.

Là loại dược liệu quý hiếm Cordyceps sinensis được sử dụng chữa các bệnh về
phổi, thận từ hàng trăm năm nay trong y học cổ truyền Trung Quốc. Gần đây nhiều công
trình nghiên cứu cho thấy Cordyceps còn có hoạt tính tăng cường miễn dịch, kháng ung
thư và chống oxy hóa. Việc sử dụng các sản phẩm Cordyceps trong thực phẩm chức năng
và chữa bệnh trở nên thông dụng ở nhiều quốc gia và giá cả tăng vọt trong những năm
gần đây, đặc biệt từ khi dịch SARS bùng phát ở Trung Quốc năm 2003.

Trong tự nhiên, Cordyceps sinensis chỉ sinh sống và phát triển được ở những
vùng núi cao từ 3500 – 5000 m so với mực nước biển và khí hậu lạnh. Do vậy, sản
phẩm tự nhiên thường có rất ít và năng suất hàng năm ngày càng giảm. Vào năm
2000, Cordyceps sinensis được liệt kê trong danh sách các loài có nguy cơ tiệt chủng
và cần được bảo vệ ở Trung Quốc. Đứng trước trình trạng nhu cầu tăng cao trong khi
khả năng cung cấp giảm, người ta nghiên cứu tìm mọi cách thay thế các sản phẩm
Cordyceps tự nhiên bằng các sản phẩm Cordyceps được sản xuất trong môi trường
nhân tạo. Bởi vì việc nuôi cấy để tạo ra quả thể Cordyceps rất khó khăn và tỉ lệ thành
công rất thấp, trong khi đó nhiều công trình cho thấy các hoạt chất quý hiếm trong sản
phẩm sợi nấm Cordyceps có hàm lượng cao và hiệu quả dược lý không thua kém so
với sản phẩm Cordyceps tự nhiên, sự sản xuất sợi nấm Cordyceps trong môi trường
lên men nhân tạo là cơ hội đầy hứa hẹn cho việc thay thế Cordyceps tự nhiên.
Nhằm góp phần tìm kiếm một điều kiện môi trường tối ưu cho việc nuôi cấy
nhân tạo sợi nấm đông trùng hạ thảo, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát

1

 


sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cordyceps sinensis trong các môi trường nuôi
cấy khác nhau” được thực hiện dưới sự hướng dẫn của Ts. Lê Thị Diệu Trang.
1.2. Mục đích và yêu cầu

1.2.1. Mục đích
Tìm kiếm các thành phần môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của
Cordyceps sinensis. Từ đó thiết kế môi trường lên men phù hợp để có thể ứng dụng
sản xuất Cordyceps ở quy mô công nghiệp.
1.2.2. Yêu cầu
Tìm kiếm được các thành phần môi trường cho phép Cordyceps sinensis cho
sinh khối lớn nhất.
1.3. Nội dung thực hiện
1. Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh trưởng phát triển của Cordyceps sinensis.
2. Khảo sát hiệu quả của các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh trưởng phát
triển của Cordyceps sinensis.
3. Khảo sát hiệu quả của các nguồn đạm (Nitrogen) khác nhau đến sự sinh
trưởng phát triển của Cordyceps sinensis.
 

2

 


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Phân loại khoa học
Giới (regnum): Fungi.
Phân giới (subregnum): Dikarya.
Ngành (phylum): Ascomycota.
Phân ngành (subphylum): Pezizomycota.
Lớp (class): Ascomycetes.
Phân lớp (subclass): Hypocreomycetes.
Bộ (order): Hypocreales.
Họ (family): Clavicipataceae.

Giống (genus): Cordyceps.
Loài (species): Cordyceps sinensis.
2.2. Tổng quan về Cordyceps
Hiện nay hơn 680 loài Cordyceps được đưa ra tài liệu. Tìm thấy ở cả sáu lục
địa, trong nhiều tầng khí hậu và môi trường sống khác nhau.

3

 


Hình 2.1 Một số loại nấm Cordyceps. (a) Cordyceps militaris (Nhộng trùng thảo). (b)
Cordyceps capitata. (c) Cordyceps ditmarii. (d) Cordyceps gracilis. (e) Cordyceps
sphecocephala. ( và )

4

 


Cordyceps sinensis là một loại nấm túi sống ký sinh trên sâu non (ấu trùng) của
một loại côn trùng thuộc chi Hepialus thường gặp nhất là sâu non của loài Hepialus
armoricanus. Ngoài ra còn 40 loài khác thuộc chi Hepialus cũng có thể bị Cordyceps
sinensis ký sinh. Vào mùa đông nấm bắt đầu ký sinh vào sâu non và làm chết sâu non
vì ăn hết chất dinh dưỡng của chúng. Mùa hè ấm áp nấm bắt đầu mọc ra khỏi sâu như
một ngọn cỏ và vương lên khỏi mặt đất.

Hình 2.2 Nấm Cordyceps sinensis mọc thành cây. ( và
)

Loài nấm này bắt đầu nảy mầm trong các cơ thể sống của một số loài ấu trùng,
tiêu diệt các loài ấu trùng này làm thức ăn của nấm, khiến cho các ấu trùng trở thành
một xác ướp khô tự nhiên. Loài nấm này sống âm ỉ trong lòng đất hơn 5 năm trước
khi trồi lên khỏi mặt đất. Phần "trái nấm" hay tai nấm thường trồi lên mặt đất vào mùa
xuân hoặc đầu mùa hè, luôn luôn lộ ra đầu của nấm. Tai nấm cao từ 5 - 15 cm bên
trên bề mặt đất và phóng ra các bào tử nấm. Đầu của ngọn nấm là một thể đệm
(stroma) hình trụ thuôn nhọn, chỉ phát hiện được Cordyceps sinensis vào mùa hè ở
một số cao nguyên cao hơn mặt nước biển từ 3500 đến 5000 m. Đó là vùng Tây
Trạng, Tứ Xuyên, Thanh Hy, Cam Túc, … ở Trung Quốc.
Cơ chế xâm nhiễm: cơ chế xâm nhiễm của nấm này vào cơ thể sâu hiện giờ
chưa rõ. Nhưng con sâu này có thể ăn phải bào tử nấm hoặc chúng mắc bệnh ký sinh
từ các lỗ thở. Đến khi sợi nấm phát triển mạnh chúng xâm nhiễm vào các mô vật chủ,
sử dụng hoàn toàn các chất dinh dưỡng trong cơ thể sâu. Đến giai đoạn nhất định nấm
phát triển thành cây (hình dạng giống thực vật) và phát tán bào tử.
5

 


Mô tả: Cordyceps sinensis khi còn sống người ta trông rõ hình con sâu với đuôi
là một cành nhỏ mọc lá. Khi sấy khô nó có mùi tanh như cá, đốt lên có mùi thơm.
Phần lá hình dạng giống ngón tay dài khoảng 4 - 11 cm do sợi nấm mọc dính liền vào
sâu non mà thành. Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3 - 5 cm, khoảng 20 30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn. Phần đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống như
đuôi con tằm, có tất cả 8 cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất. Thể đệm nấm hình
que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút. Sâu non dễ bẻ gãy ruột bên
trong căng đầy, màu trắng hơi vàng; chất đệm nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có
màu trắng ngà.

Hình 2.3 Mô tả nấm mọc thành cây giống sâu khi sấy khô. ()
2.3. Thành phần hóa học

Các phân tích hóa học cho thấy trong sinh khối của Cordyceps sinensis có 17
loại amino acid khác nhau, có D-manitol, lipid, nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, Na,
K,…). Quan trọng hơn cả là trong sinh khối của Cordyceps sinensis có nhiều hoạt
chất sinh học mà các nhà khoa học đang phát hiện dần ra nhờ các tiến bộ của ngành
hóa học các hợp chất tự nhiên, nhiều hoạt chất này có giá trị thần kỳ trong y học.
Trong đó phải kể đến cordyceps polysaccharide (cordyceptic acid, cordycepin),
adenosine, hyroxyethyl - adenosine. Đáng chú ý hơn cả là nhóm hoạt chất HEAA
(hyroxyethyl – adenosine - analogs). Cordyceps sinensis có chứa nhiều loại vitamin
(trong 100 g Cordyceps sinensis có 0,12 g vitamin B12; 29,19 mg vitamin A; 116,03
mg vitamin C. Ngoài ra còn có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitamin K,…)
2.4. Ứng dụng của Cordyceps sinensis: là nguồn dược liệu quý

6

 


Sách y học cổ truyền của Trung Quốc từ xa xưa đã coi Cordyceps sinensis là vị
thuốc có tác dụng “bổ phế ích can, bổ tinh điều tủy, chủ huyết hóa đàm”, “bổ phế ích
thận, hộ dưỡng tạng phủ”, “tư âm tráng dương, khư bệnh kiện thân”; là loại thuốc “tư
bổ dược thiện”, “có thể chữa được bách hư bách tổn”.
Cordyceps polysaccharide: các polysaccharide thúc đẩy quá trình sinh trưởng và
phát triển của tế bào lympho, kích hoạt tế bào lympho T và lympho B, hoạt hóa miễn
dịch tế bào nhằm nâng cao hệ miễn dịch, kháng virus, ngăn ngừa bệnh thiếu oxy, làm
giảm đau, giảm chứng sơ hóa gan, trị viêm gan và bảo vệ gan. Chống viêm, chống
oxy hóa, chống khối u, chống di căn.
Cordycepin: chống ung thư, côn trùng và chống vi khuẩn hoạt động.

Cordycepin
Manitol: thành phần diosmol trong manitol có thể tìm thấy ở nhiều thực vật

nhưng chỉ ở Cordyceps sinensis mới có hàm lượng diosmol cao nhất. Ngoài công
dụng làm giãm mỡ máu, đường máu và cholesterol còn giúp mạch máu giãn nở,
phòng chóng bệnh tim mạch hữu hiệu.
Adenosin: có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của cơ
thể. Adenosin giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim mạch, cải thiện năng lực cơ
bắp, giảm sự sinh trưởng của tế bào xấu, tăng lượng oxy trong máu. Vì vậy việc bổ
sung hàm lượng adenosine hàm lượng cao cho cơ thể là vô cùng cần thiết giúp cơ thể
luôn luôn dồi dào năng lượng để hoạt động hiệu quả.

Adenosin
Các nghiên cứu cổ truyền cũng như các thực nghiệm hiện đại đều xác định
Cordyceps sinensis hầu như không có tác dụng phụ đối với cơ thể người và động vật.
7

 


Các nghiên cứu y học và dược học đã chứng minh được các tác dụng sau đây của
Cordyceps sinensis:
1-chống lại tác dụng xấu của các tân dược đối với thận, thí dụ như độc tính của
cephalosporin A.
2- Bảo vệ thận trong trường hợp gặp tổn thương do thiếu máu.
3- Chống lại sự suy thoái của thận, xúc tiến việc tái sinh và phục hồi các tế bào tiểu
quản ở thận.
4- Làm hạ huyết áp ở người cao huyết áp.
5- Chống lại sự thiếu máu ở cơ tim.
6- Giữ ổn định nhịp đập của tim.
7- Tăng cường tính miễn dịch không đặc hiệu.
8- Điều tiết tính miễn dịch đặc hiệu.
9- Tăng cường năng lực thực bào của các tế bào miễn dịch.

10- Tăng cường tác dụng của nội tiết tố tuyến thượng thận và làm trương nở các
nhánh khí quản.
11- Tăng cường dịch tiết trong khí quản và trừ đờm.
12- Làm chậm quá trình lão quá của cơ thể.
13- Hạn chế bệnh tật của tuổi già.
14- Nâng cao năng lực chống ung thư của cơ thể.
15- Chống lại trình trạng thiếu oxygen của cơ thể.
16- Tăng cường tác dụng lưu thông máu trong cơ thể.
17- Hạn chế tác dụng của tia gamma đối với cơ thể.
18- Tăng cường tác dụng an thần, trấn tĩnh thần kinh.
19- Tăng cường việc điều tiết nồng độ đường trong máu.
20- Làm giảm cholesterol trong máu và chống xơ vữa động mạch.
21- Xúc tiến tác dụng của các nội tiết tố (hormone).
22- Tăng cường chức năng tiêu hóa và hấp thụ các chất ding dưỡng.
23- Ức chế vi sinh vật có hại, kể cả vi khuẩn lao.
24- Kháng viêm và tiêu viêm.
25- Có tác dụng cường dương và chống liệt dương.
Một số tác dụng đối với các hệ chức năng của cơ thể:

8

 


Đối với hệ thống miễn dịch: Những nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh
ĐTHT có khả năng tăng cường hoạt động miễn dịch tế bào cũng như miễn dịch dịch
thể. Cụ thể là có tác dụng nâng cao hoạt tính của đại thực bào và tế bào NK, điều tiết
phản ứng đáp ứng của tế bào lympho B, tăng cường một cách có chọn lọc hoạt tính
của tế bào T ức chế, làm tăng nồng độ các kháng thể IgG, IgM trong huyết thanh. Mặt
khác, ĐTHT còn là một vị thuốc ức chế miễn dịch có tác dụng chống sự bào loại tổ

chức cấy ghép khá tốt.
Đối với hệ thống tuần hoàn tim, não: ĐTHT có tác dụng làm giãn những mạch
máu, làm tăng lưu lượng tuần hoàn não và tim thông qua cơ chế hưng phấn thực thể
M ở cơ trơn thành mạch. Mặt khác, ĐTHT còn có khả năng điều chỉnh lipit máu, làm
giảm cholesterol và lipoprotein, hạn chế quá trình tiến triển của tình trạng xơ vữa
động mạch.
Đối với hệ hô hấp: ĐTHT có tác dụng bình suyễn, trừ đàm và phòng chống khí
phế thũng. Điều này làm sáng tỏ quan điểm của cổ nhân cho rằng, ĐTHT có khả năng
“bảo phế, ích thận” và “dĩ lao khái”.
Đối với hệ thống nội tiết: Trên động vật thực nghiệm ĐTHT có tác dụng làm
tăng trọng lượng tuyến vỏ thượng thận và tăng tổng hợp các hormon tuyến này, đồng
thời cũng có tác dụng tương tự như hormon nam tính và làm tăng trọng lượng của tinh
hoàn cũng như các cơ quan sinh dục phụ trên động vật thực nghiệm. Ngoài ra, ĐTHT
còn có tác dụng chống ung thư, chống viêm nhiễm, chống quá trình lão hóa và trấn
tĩnh chống co giật.
Dưới góc nhìn Tây y:
Tăng sức bền: Liều 3 g ĐTHT mỗi ngày cho kết quả tốt trong việc gia tăng năng
lượng cơ thể cho người cao tuổi bị các bệnh mạn tính. Một thí nghiệm thực hiện năm
2004 tại Mỹ cho thấy những người ở độ tuổi 40 – 70 có sức khỏe tốt nếu được dùng
trích tinh ĐTHT trong 12 tuần đã có sự gia tăng sức bền thể lực so với nhóm chỉ dùng
giả dược.
Cải thiện chức năng gan: Kết quả một nghiên cứu thực hiện trên 70 bệnh nhân
viêm gan B hoặc xơ gan cho thấy, ĐTHT giúp cải thiện chức năng gan. Một thí
nghiệm khác thực hiện trên 33 bệnh nhân viêm gan B cũng cho kết quả tương tự.
Giải độc cho thận: Thử nghiệm mù đôi được thực hiện trên 21 bệnh nhân cao
tuổi theo liệu trình điều trị với amikacine (một kháng sinh rất độc cho thận), người ta
9

 

quan sát thấy bệnh nhân có sử dụng ĐTHT thì thận được bảo vệ tốt hơn, giảm tác
dụng gây độc của kháng sinh so với nhóm đối chiếu dùng giả dược. Kết quả một
nghiên cứu khác trên 51 bệnh nhân bị suy thận chỉ dùng ĐTHT thì thấy có cải thiện
chức năng thận và hệ miễn dịch. Một thử nghiệm khác cũng được thực hiện trên 69
bệnh nhân ghép thận, kết quả là ĐTHT đã làm giảm độc tính của cyclosporine trên
thận.
Nâng cao khả năng miễn dịch: Một thí nghiệm kéo dài 5 năm trên 61 bệnh nhân
bị bệnh lupus cho thấy, việc dùng ĐTHT với liều 3 – 4 g/ngày và artermisinine (0,6
g/ngày) đã làm giảm sự tái diễn căn bệnh tự miễn này. Trong một thí nghiệm khác với
các bệnh nhân bị ung thư giai đoạn tiến triển, người ta kết luận rằng các bệnh nhân
được điều trị bằng ĐTHT đã được cải thiện chức năng miễn dịch và nâng cao chất
lượng cuộc sống.
Kích thích chức năng tình dục: 5 nghiên cứu tại Trung Quốc với trên 1.000
người tham gia ở cả 2 phái với liều lượng 3 g/ngày cho thấy, ĐTHT có hiệu quả trong
việc kích thích chức năng tình dục ở những người bị giảm sút.
Làm dịu triệu chứng bệnh hô hấp: Nhiều nghiên cứu tại Trung Quốc cho thấy,
ĐTHT tỏ ra hữu hiệu trong việc làm dịu các triệu chứng của nhiều bệnh hô hấp, cụ
thể là viêm phế quản mạn tính
Làm giảm LDL-cholesterol trong máu: Nghiên cứu trên 273 người tại Trung
Quốc bị cao lipid máu với liều 3 g/ngày đã làm giảm lượng cholesterol toàn thể và
giúp gia tăng cholesterol tốt.
2.5. Nguồn giống
Trong tự nhiên: Thu thập từ tự nhiên như Tibet, Nepal, Trung Quốc (Tây
Trạng, Tứ Xuyên, Thanh Hy, Cam Túc, Vân Nam,…).
Nuôi cấy nhân tạo: nuôi trong môi trường nhân tạo và thành công của nó trong
việc nuôi cấy ở quy mô công nghiệp (với nồi lên men) hoặc ở quy mô thủ công
nghiệp (nuôi trên nhiều vật chủ: cây, côn trùng, họ nhện và nhiều loại nấm khác. Nuôi
trên môi trường xốp trong các lọ miệng rộng có nút bông ). Nhiều công ty ngày nay
sản xuất sản phẩm Cordyceps nuôi trồng nhân tạo từ hệ sợi nấm và thân quả nấm.

Tuy nhiên qui mô nuôi công nghiệp để gia tăng nhanh chóng nguồn cung cấp gặp
phải nhiều vấn đề về chất lượng sản phẩm như suy giảm độ tinh khiết, hoặc mất đi
các hoạt chất sinh học quý so với sản phẩm thu thập trong tự nhiên.
10

 


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1. Thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2010 đến tháng 06/2010.
3.1.2. Địa điểm
Trung Tâm Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường Đại Học
Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu thí nghiệm
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm Cordyceps sinensis được cung cấp từ phòng thí nghiệm côn trùng,
khoa nông nghiệp, trường đại học Kobe Nhật Bản.
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
3.2.2.1. Thiết bị
Bếp điện, nồi hấp khử trùng (Autoclave), tủ cấy vô trùng, máy lắc (Vortex), tủ
sấy, tủ ủ (Incubator), máy ly tâm lạnh, kính hiển vi, kính soi nổi,cân 4 số (Balance) .
3.2.2.2. Dụng cụ
Nồi nấu môi trường, bình tam giác (250 ml và 500 ml), becher, pipette 10 ml,
micropipette 1 ml, ống nghiệm, giấy bạc, bông gòn, đèn cồn, que cấy thẳng.
3.2.2.3. Hóa chất
Khoai tây, glucose, peptone, yeast extract, sucrose, dextrin, acid citric, agar,
KH2PO4, MgSO4, KNO3, NaNO3.
3.3. Phương pháp tiến hành

3.3.1. Chuẩn bị môi trường
Chuẩn bị thành phần các hóa chất, các dụng cụ và thiết bị để tiến hành pha môi
trường:
Cách nấu môi trường PGA: khoai tây gọt sạch vỏ, rửa sạch, thái mỏng rồi nấu
trong một lít nước cất. Sau đó lọc lấy phần nước khoai tây, cho glucose và agar đã cân
vào và khuấy đều thêm nước cất cho đủ một lít. Môi trường được hấp khử trùng bằng
autoclave ở 1210C trong 20 phút. Sau đó đổ vào các đĩa petri sạch đã được sấy khử
trùng khoảng 15 – 20 ml mỗi đĩa.
11

 


Thành phần môi trường PGA gồm:
¾ Khoai tây: 200 g
¾ Glucose: 20 g
¾ Agar: 20 g
¾ Nước cất: 1 lít
Cách nấu một lít môi trường lỏng cơ bản: cân các thành phần môi trường rồi pha
vào một lít nước cất trong bình tam giác. Môi trường được hấp khử trùng bằng
autoclave ở 1210C trong 20 phút. Cho nấm đã phục hồi vào môi trường rồi ủ ở 220C
trong một tuần rồi cho vào môi trường tăng sinh khối.
Thành phần môi trường lỏng cơ bản gồm:
¾ Glucose: 30 g
¾ Pepton: 8 g
¾ KH2PO4: 1 g
¾ MgSO4: 0,5 g
Cách nấu một lít môi trường thay đổi nguồn cacbon và nitrogen: cân các thành
phần môi trường rồi pha vào một lít nước cất trong bình tam giác. Cho môi trường đã
pha vào ống nghiệm mỗi ống nghiệm 10 ml. Môi trường được hấp khử trùng bằng

autoclave ở 1210C trong 20 phút. Cho vào mỗi ống nghiệm 2 ml môi trường có nguồn
nấm nuôi sau một tuần ở môi trường lỏng cơ bản. Sau đó ủ ở 220C trong bốn tuần
3.3.2. Phục hồi nguồn nấm
Các dòng nấm được giữ trong môi trường ống nghiệm ở nhiệt độ thấp lâu ngày
có thể bị yếu đi hoặc bị nhiễm vi khuẩn và các nấm lạ. Do đó trước khi nhân sinh khối
chúng tôi phải cấy chuyển từ môi trường ống nghiệm ra môi trường phục hồi trong
các đĩa petri rồi từ đó cấy chuyển liên tiếp nhiều lần để cuối cùng thu được dòng
thuần khiết. Môi trường phục hồi là môi trường PGA (potato-glucose-agar).
3.3.3. Khảo sát hình thái
Quan sát bằng mắt thường, dưới kính soi nổi, kính hiển vi.
3.3.4. Khảo sát tốc độ sinh trưởng
Sử dụng môi trường PGA.
Từ đĩa nấm đã phục hồi, đục mẫu nấm hình tròn đường kính 0,2 cm, cấy lên tâm
điểm của đĩa môi trường mới. Nuôi cấy trong tủ ủ ở 21 – 220C, định kỳ khoảng 3 - 4
12

 


ngày/lần đo đường kính phát triển của nấm trên đĩa (dùng thước đo mặc dưới của đĩa
nấm), liên tục từ ngày 1 sau nuôi cấy đến khi nấm mọc gần hết đĩa.
3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng phát triển nấm
a) Môi trường đối chứng: Thành phần một lít môi trường
¾ Pepton: 8 g
¾ KH2PO4: 1 g
¾ MgSO4: 0,5 g
b) Môi trường glucose: Thành phần một lít môi trường
¾ Pepton: 8 g
¾ KH2PO4: 1 g
¾ MgSO4: 0,5 g

¾ Glucose: 30 g
c) Môi trường sucrose: Thành phần một lít môi trường
¾ Pepton: 8 g
¾ KH2PO4: 1 g
¾ MgSO4: 0,5 g
¾ Sucrose: 28,5 g
d) Môi trường dextrin: Thành phần một lít môi trường
¾ Pepton: 8 g
¾ KH2PO4: 1 g
¾ MgSO4: 0,5 g
¾ Dextrin: 27 g
e) Môi trường acid citric: Thành phần một lít môi trường
¾ Pepton: 8 g
¾ KH2PO4: 1 g
¾ MgSO4: 0,5 g
¾ Acid citric: 32 g
Đây là thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Gồm
5 nghiệm thức:
A: Môi trường đối chứng.
A1: Môi trường Glucose.
A2: Môi trường Sucrose.
13

 


A3: Môi trường Dextrin.
A4: Môi trường Acid citric.
Sau 4 tuần nuôi cấy đem ly tâm ở 40C để thu sinh khối, sinh khối được sấy khô đến
khi trọng lượng không đổi và cân trọng lượng. Trọng lượng sinh khối sau khi tính toán

được qui đổi ra hệ đơn vị g/l. Số liệu thu được được sử lý thống kê bằng phần mềm
portable_statgraphics_centurion_15.2.11.0.

3.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn đạm (nitrogen) đến sự sinh trưởng phát
triển nấm
a) Môi trường đối chứng: Thành phần một lít môi trường
¾ KH2PO4: 1 g
¾ MgSO4: 0,5 g
¾ Glucose: 30 g
b) Môi trường pepton: Thành phần một lít môi trường
¾ KH2PO4: 1 g
¾ MgSO4: 0,5 g
¾ Glucose: 30 g
¾ Pepton: 8 g
c) Môi trường KNO3: Thành phần một lít môi trường
¾ KH2PO4: 1 g
¾ MgSO4: 0,5 g
¾ Glucose: 30 g
¾ KNO3: 7 g
d) Môi trường NaNO3: Thành phần một lít môi trường
¾ KH2PO4: 1 g
¾ MgSO4: 0,5 g
¾ Glucose: 30 g
¾ NaNO3: 6 g
e) Môi trường yeast extract: Thành phần một lít môi trường
¾ KH2PO4: 1 g
¾ MgSO4: 0,5 g
¾ Glucose: 30 g
¾ Yeast extract: 10 g
14

 


Đây là thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên.
Gồm 5 nghiệm thức:
B: Môi trường đối chứng không có nguồn Nitrogen.
B1: Môi trường Pepton.
B2: Môi trường KNO3.
B3: Môi trường NaNO3.
B4: Môi trường Yeast extract.
Sau 4 tuần nuôi cấy đem ly tâm ở 40C để thu sinh khối, sinh khối được sấy khô đến
khi trọng lượng không đổi và cân trọng lượng. Trọng lượng sinh khối sau khi tính toán
được qui đổi ra hệ đơn vị g/l. Số liệu thu được được sử lý thống kê bằng phần mềm
portable_statgraphics_centurion_15.2.11.0.

15

 


Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả
4.1.1. Đặc điểm hình thái sinh trưởng và phát triển của Cordyceps sinensis
4.1.1.1. Hình thái
a) Cấu trúc sợi nấm
Hình thái sợi nấm Cordyceps sinensis khi quan sát dưới kính hiển vi thấy có
màu trắng, có vách ngăn đó là từng chấm trắng ngăn thành từng đoạn trong sợi nấm
(hình 4.1a), sợi nấm phân nhánh (hình 4.1b), đỉnh sinh trưởng của sợi nấm Cordyceps
sinensis hơi phình to (hình 4.1c).

Hình 4.1 Sợi nấm xem dưới kính hiển vi.
Sợi nấm Cordyceps sinensis có màu trắng khi được nuôi cấy trong điều kiện tối
hoàn toàn (đĩa petri được che phủ bằng giấy bạc), chuyển sang màu vàng khi có ánh
sáng yếu (ánh sáng ngày và đêm chiếu vào qua kính của tủ ủ), chuyển màu da cam
16