Phân tích đa hình di truyền các gene CSN1S1 và β-LG của dê Nản Định Hóa bằng kỹ thuật PCR-RFLP

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THANH SƠN
Tên đề tài:

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN CÁC GENE CSN1S1, β-LG CỦA
DÊ NẢN ĐỊNH HÓA BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Hệ đào tạo

: Chính quy

Ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2014 – 2018

THÁI NGUYÊN, NĂM 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THANH SƠN
Tên đề tài:

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN CÁC GENE CSN1S1, β-LG CỦA
DÊ NẢN ĐỊNH HÓA BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Hệ đào tạo

: Chính quy

Ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2014 – 2018

Người hướng dẫn : 1. PGS. TS. Dương Văn Cường
2. TS. Nguyễn Xuân Vũ

THÁI NGUYÊN, NĂM 2018

i

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khoá luận tốt nghiệp,
ngoài sự nỗ lực và cố gắng của bản thân mình, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng
dẫn tận tình, chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình trong suốt thời
gian thực tập và hoàn chỉnh khoá luận tốt nghiệp.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất với 2 thầy giáo PGS. TS.
Dương Văn Cường, TS. Nguyễn Xuân Vũ thuộc Khoa Công nghệ sinh học &
Công nghệ thực phẩm – Đại học Nông lâm Thái Nguyên và ThS. Ma Thị Trang
cùng toàn thể cán bộ công tác tại Bộ môn Sinh học Phân tử - Viện Khoa học Sự
sống – Đại học Thái Nguyên, những người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn chỉnh khoá luận tốt nghiệp.
Tôi cũng xin được cảm ơn ban lãnh đạo, cán bộ viên chức tại Viện Khoa học
Sự Sống – Đại học Thái Nguyên cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên
đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi học tập và nghiên cứu thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh,
ủng hộ và động viên tôi, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học
tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày…tháng 6 năm 2018
Sinh viên
Nguyễn Thanh Sơn


ii

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
Bp

: Base paire

Kb

: Kilo base

DNA

: Deoxyribonucleic acid

dNTP

: Deoxyribonucleotide triphosphate

PCR

: Polymerase chain Reaction

RFLP

: Reaction Fragment Length Polymorphism DNA

TE

: Tris – EDTA

SNP

: Single Nucleotide Polymorphism

Taq

: Thermus aquaticus

EtBr

: Ethidium Bromide

Rpm

: Revolutions Per Minute

Kg

: Kilogram

O

C

: Độ Celsius

kDa

: Kilodalton

µl

: Microlit


3

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR................................ 22
Bảng 3.2:Thành phần của một phản ứng PCR........................................................ 23
Bảng 3.3: Thành phẩn phản ứng cắt gene CSN1S1 bằng enzyme XmnI.................. 24
Bảng 3.4: Thành phẩn phản ứng cắt gene β-LG bằng enzyme SacII....................... 24
Bảng 3.5: Vị trí cắt của enzyme giới hạn ............................................................... 24
Bảng 3.6: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài. ........................................... 26
Bảng 3.7: Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài. ......................................... 27
Bảng 4.1: Tỷ lệ kiểu gene CSN1S1 ở dê Nản ......................................................... 30
Bảng 4.2: Tần số allele gene CSN1S1 trong các quần thể dê khác nhau ................. 32
Bảng 4.3: Tỷ lệ kiểu gene β-LG ở dê Nản .............................................................. 34
Bảng 4.4: Tần số allele gene β-LG trong các quần thể dê khác nhau ...................... 36


4

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Sơ đồ mô phỏng các allele của gene CSN1S1 ...........................................
9
Hình 2.2: Sơ đồ mô phỏng các kiểu gene của gene CSN1S1 .................................. 11
Hình 2.3: Vị trí cắt của enzyme giới hạn XmnI trên đoạn gene CSN1S1................. 12
Hình 2.4: Sơ đồ mô phỏng các allele của gene β-LG.............................................. 14
Hình 2.5: Sơ đồ mô phỏng các kiểu gene của gene β-LG .......................................
15

Hình 2.6: Vị trí cắt của enzyme giới hạn SacII trên đoạn gene β-LG...................... 16
Hình 3.1: Chu kì nhiệt độ của phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gene β-LG...........
23
Hình 3.2: Chu kì nhiệt độ của phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gene CSN1S1 ......
23
Hình 4.1: Kết quả tách chiết DNA tổng số 10 mẫu mô tai dê Nản.......................... 28
Hình 4.2: Sản phẩm PCR khuyếch đại từ cặp mồi CSN1S1.................................... 29
Hình 4.3: Kết quả phân tích đa hình đoạn gene CSN1S1 bằng enzyme XmnI .........
29
Hình 4.4: Tỷ lệ kiểu gene và tần số allele gene CSN1S1 trong quần thể dê Nản .....
30
Hình 4.5: So sánh tần số allele gene CSN1S1 trong quần thể dê Nản
với các quần dê khác trên thế giới.......................................................................... 32
Hình 4.6: Sản phẩm PCR khuyếch đại từ cặp mồi β-LG ............................................
Hình 4.7: Kết quả phân tích đa hình đoạn gene β-LG bằng enzyme SacII ..................
Hình 4.8: Tỷ lệ kiểu gene và tần số allele gene β-LG trong quần thể dê Nản.......... 35
Hình 4.9: So sánh tần số allele gene β-LG trong quần thể dê
Nản với các quần thể dê khác trên thế giới............................................................. 36


5

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..........................................................................................................i
DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ....................................................ii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. iii
DANH MỤC HÌNH ...............................................................................................iv
MỤC LỤC .............................................................................................................. v
Phần 1.MỞ ĐẦU .....................................................................................................
1

1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu của đề tài............................................................................................ 2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát .........................................................................................
2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể .............................................................................................. 2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn........................................................................... 2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ........................................................................... 2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài............................................................................ 2
Phần 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 4
2.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu.................................................................. 4
2.1.1. Tổng quan về dê Nản .....................................................................................
4
2.1.2. Tổng quan về sữa........................................................................................... 5
2.1.3. Gene CSN1S1 - Alpha-S1 Casein ...................................................................
6
2.1.4. Gene β-lg - Beta-lactoglobulin .....................................................................
12
2.2. Cơ sở khoa học của đề tài ............................................................................... 16
2.2.1. Khái niệm đa hình gene ............................................................................... 16
2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số .......................................................... 17
2.2.3. Phương pháp điện di kiểm tra ...................................................................... 18
2.2.4. Kỹ thuật PCR............................................................................................... 18
2.2.5. Kỹ thuật RFLP............................................................................................. 19
2.2.6. Kỹ thuật PCR-RFLP .................................................................................... 19


6

Phần 3.ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 21
3.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 21

3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu .................................................... 21
3.3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 21
3.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 21
3.4.1. Phương pháp lấy mẫu .................................................................................. 21
3.4.2. Phương pháp tách chiết DNA ...................................................................... 22
3.4.3. Phương pháp PCR ....................................................................................... 22
3.4.4. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn ....................................................... 24
3.4.5. Phân tích đa hình các gene ........................................................................... 25
3.4.6. Các phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 25
3.5. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất nghiên cứu ........................................................ 25
3.5.1. Dụng cụ nghiên cứu ..................................................................................... 25
3.5.2. Thiết bị nghiên cứu ...................................................................................... 26
3.5.3. Hóa chất nghiên cứu .................................................................................... 27
Phần 4.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................................... 28
4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô tai dê Nản ................................... 28
4.2. Kết quả phân tích đa hình chiều dài đoạn gene CSN1S1.................................. 28
4.2.1. Kết quả PCR khuyếch đại gene CSN1S1 bằng cặp mồi đặc hiệu .................. 28
4.2.2. Kết quả phân tích đa hình đoạn gene CSN1S1 bằng enzyme XmnI ............... 29
4.3. Kết quả phân tích đa hình chiều dài gene β-LG ............................................... 33
4.3.1. Kết quả PCR khuyếch đại gene β-LG bằng cặp mồi đặc hiệu ...................... 33
4.3.2. Kết quả phân tích đa hình đoạn gene β-LG bằng enzyme SacII .................... 33
Phần 5.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................... 37
5.1. Kết Luận......................................................................................................... 37
5.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 38
PHỤ LỤC I ........................................................................................................... 42
PHỤ LỤC II .......................................................................................................... 44


1

PHẦN 1

MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Dê là loài gia súc nhai lại nhỏ đã được thuần dưỡng từ rất lâu đời và đã đem
lại nhiều lợi ích thiết thực cho đời sống con người. Ở nhiều nước trên thế giới, dê là
một loài vật nuôi có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp chăn nuôi. Dê cung
cấp nhiều loại sản phẩm phục vụ đời sống con người như: thịt, sữa, da, lông, sừng,
móng,… và cung cấp một nguồn phụ phẩm để làm phân bón phục vụ cho sản xuất
nông nghiệp.
Chăn nuôi dê ở Việt Nam đã có từ lâu nhưng chủ yếu theo phương thức
quảng canh, tự cung tự cấp. Theo số liệu của Tổng Cục thống kê năm 2000: Tổng
đàn dê của cả nước là 525.000 con, trong đó chủ yếu là giống dê Cỏ (dê địa
phương) nuôi lấy thịt, phân bố chủ yếu ở các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc.
Trên thực tế, giống dê Cỏ có tầm vóc nhỏ và màu sắc lông da tương đối khác nhau.
Bên cạnh đó, do độ pha tạp nhiều nên có hiệu suất chuyển hóa thức ăn thấp, tỉ lệ suy
thoái cận huyết cao, khả năng nuôi dưỡng kém dẫn đến bệnh tật phát sinh nhiều [4].
Chính vì vậy, từ năm 1993 Nhà nước đã bắt đầu giao nhiệm vụ nghiên cứu
và phát triển chăn nuôi dê trong cả nước cho Trung tâm nghiên cứu Dê và Thỏ Sơn
Tây thuộc Viện Chăn Nuôi - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Cho đến nay
thì các giống dê Cỏ địa phương hầu hết đều được lai tạo với các giống dê cho năng
suất sữa và thịt cao trên thế giới như dê sữa Ấn Độ, dê Boer chuyên thịt và dê
Saanen, Alpine chuyên sữa (Mỹ) để tạo ra các giống dê cho năng suất sữa và thịt
cao hơn trước. Tuy nhiên, vẫn còn 1 số giống dê thuần ở Việt Nam mang các đặc
điểm tốt như là dê Nản ở vùng núi Định Hóa. Về giá trị thương phẩm, chất lượng
thịt dê Nản tốt, thơm ngon, tỷ lệ nạc cao, giá trị dinh dưỡng cao, hàm lượng
Cholesterol thấp, tốt cho sức khỏe của con người. Vấn đề ở đây là số lượng dê Nản
thuần chủng hiện đang giảm mạnh xuống mức đáng lo ngại, do vậy cần có những
biện pháp để cải thiện khả năng sinh trưởng, sinh sản và phát triển của loài dê này

2

nhằm mục đích bảo tồn cũng như phát triển quy mô chăn nuôi để đáp ứng nhu cầu
tiêu thụ của thị trường [4].
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về việc chọn lọc giống vật nuôi
bằng chỉ thị phân tử. trong đó có các nghiên cứu về 2 gene CSN1S1 và β-LG đã chỉ
ra tính tương quan mật thiết giữa các gene này với mức độ sinh trưởng và phát triển
của loài Dê cũng như các loài động vật có vú khác. Cụ thể, gene CSN1S1 mã hóa
protein tối quan trọng bậc nhất trong các loại protein sữa. Gene β-LG mã hóa 1 loại
protein có nhiều trong sữa động vật là β-lactoglobulin có liên quan tới sản lượng và
chất lượng sữa.
Để bảo tồn và phát triển dê Nản Đinh Hoá, tỉnh Thái Nguyên đã phê duyệt
thực hiện đề tài quỹ gene cấp tỉnh: “Bảo tồn và lưu giữ nguồn gene dê Cỏ (dê
Nản) Định Hoá tại tỉnh Thái Nguyên”.
Trong đó, thực hiện nghiên cứu về mối tương quan giữa đa hình di truyền
với các tính trạng sinh trưởng, sinh sản cũng là 1 chỉ tiêu quan trọng trong việc chọn
lựa các cá thể tốt nhất để làm giống. Từ các cơ sở khoa học như trên, tôi lựa chọn đề
tài: “Phân tích đa hình di truyền các gene CSN1S1 và β-LG của dê Nản Định
Hóa bằng kỹ thuật PCR-RFLP”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
Phân tích được đa hình di truyền các gene CSN1S1 và β-LG của dê Nản Định
Hóa.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Phân tích đa hình chiều dài đoạn gene CSN1S1 trên dê Nản.
- Phân tích đa hình chiều dài đoạn gene β-LG trên dê Nản.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài

Xác định được đa hình chiều dài của các đoạn gene CSN1S1 và β-LG. Làm
cơ sở cho các nghiên cứu về mối tương quan giữa các gene này với tính trạng sinh
trưởng của dê Nản.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo tồn và chọn ra các giống dê thuần
chủng có nhiều tính trạng quý bằng các chỉ thị phân tử.


3

Kết quả phân tích đa hình di truyền sẽ tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp
theo sau đó nhằm ứng dụng các kĩ thuật – công nghệ hiện đại, tiên tiến vào công tác
chọn lọc giống vật nuôi có khả năng đem lại giá trị lợi nhuận kinh tế cao, duy trì
giống thuần chủng, phục vụ nhu cầu thị trường và phát triển kinh tế của khu vực
cũng như trên toàn quốc.


4

PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Tổng quan về dê Nản
- Phân loại học:
Dê là loài động vật nhai lại, chân có móng thuộc họ Bovidae. Chúng là loài
gia súc, có sau chó và có lẽ cùng thời với cừu, được nuôi để lấy thịt, sữa và da. Dê
sinh sống ở khắp nơi, từ những vùng nóng như châu Phi đến những vùng lạnh như
châu Âu, từ vùng đồng bằng cho đến vùng đồi núi.
- Ngoài ra dê còn được phân làm hai nhóm là dê hoang và dê nhà:

+ Dê hoang (Capra aegagrus) hay dê núi, dê rừng sống thành bầy đàn và
sống ở những môi trường như rừng, đồi núi...
+ Dê nhà (Capra aegagrus hircus) cũng sống thành bầy đàn nhưng được con
người chăn nuôi và sống ở chuồng, hoặc một vùng đất của chủ đàn dê được chăn
nuôi ở vùng đất đó... Dê nhà nuôi để khai thác những giá trị kinh tế có từ dê.
+ Danh pháp ba phần: Capra aegagrus hircus (Linnaeus, 1758).
+ Phân loại khoa học của Dê như sau:
Giới Động vật

: Animalia

Ngành Động vật có xương sống

: Chordata

Lớp Thú

: Mammalia

Bộ Guốc chẵn

: Artiodactyla

Họ Trâu bò

: Bovidae

Phân họ Dê cừu

: Caprinae

Chi Đv có vú họ Bovidae

: Capra

Loài dê hoang dã

: C. aegagrus

Phân loài

: C. a. hircus

- Đặc điểm ngoại hình:
Theo khảo sát ban đầu, dê Nản có thân hình thấp nhỏ so với các giống dê
ngoại nhập khác. Trọng lượng cơ thể của dê sơ sinh vào khoảng 1,7 - 1,9 Kg. Khi
trưởng thành trọng lượng dê Nản đạt khoảng 25 – 30 Kg/con. Trung bình thì dê
đực


5

nặng khoảng 25 Kg và dê cái nặng khoảng 20 Kg. Dê Nản có đầu to, đôi tai hơi nhỏ,
ngắn và dựng dứng lên, cặp sừng cũng ngắn, lông màu trắng hoặc đen, có con khoang
đen trắng hoặc có màu cánh gián, cổ có bờm ngắn và có râu ở phía dưới cằm.
- Chế độ dinh dưỡng:
Trải qua quá trình quan sát ban đầu, dê Nản ăn nhiều loại cỏ, lá và cành non
của nhiều loại cây, đặc biệt là cây họ Đậu, các loại củ quả và ngũ cốc, ngoài ra còn
có các phụ phẩm công nghiệp. Dê Nản được người dân nuôi theo phương thức chăn
thả trên núi cao vào ban ngày, đến chiều tối lại lùa về nhốt vào chuồng. Sau khi

được nhốt vào chuồng, mỗi con dê sẽ được ăn thêm 1 – 2 Kg cỏ non và lá cây họ
Đậu, 200 - 300g thức ăn tổng hợp (cám gạo, bột ngô, bột sắn trộn với một chút
muối). Đối với dê cái đang mang thai thì khẩu phần này sẽ tăng gấp 1,5 lần, dê cái
đang nuôi con sẽ tăng gấp 2 – 3 lần lượng thức ăn thêm, Riêng dê đực giống mỗi
ngày sẽ được cho ăn khoảng 3 – 4 kg cỏ tươi, 1 – 1,5kg lá ngô hoặc lá cây họ Đậu
giàu chất đạm và 0,3 – 0,4kg thức ăn tổng hợp.
- Tập tính sinh sản:
Dê Nản thành thục sớm, tuổi phối giống lần đầu 6 – 7 tháng, đẻ 1,4 lứa/năm
và 1,3 con/lứa, tức là khoảng 2 năm đẻ 3 lứa và mỗi lứa đẻ 1 – 2 con. Dê cái mang
thai trung bình từ 144 – 155 ngày là đẻ. Dê con từ lúc đẻ đến khi cai sữa mất
khoảng 3 tháng. Dê cái non phải đạt 7 tháng tuổi và trọng lượng xấp xỉ 24 Kg mới
được cho phối giống lần đầu.
2.1.2. Tổng quan về sữa
Sữa được đặc trưng như một loại thực phẩm có khả năng tiếp cận đơn giản
và giàu chất dinh dưỡng, chẳng hạn như carbohydrate, protein, khoáng chất và
vitamin. Việc sử dụng sữa không phải là sữa bò như một nguồn protein thay thế đã
tăng lên gần đây, do có sự quá mẫn cảm với protein sữa bò nên đây vẫn là một trong
những nguyên nhân chính gây dị ứng thực phẩm. Vì vậy, thành phần thô của phần
protein của sữa từ các loài động vật có vú khác nhau đã được nghiên cứu đặc trưng,
và trong số đó, sữa dê nổi bật do sự có mặt của các hợp chất có tính chất trao đổi
chất quan trọng đối với dinh dưỡng của con người [24].


6

Sự quan tâm đến hàm lượng protein trong sữa đã phát triển với tốc độ đáng
kinh ngạc, đặc biệt là trong vài năm qua vì lý do dinh dưỡng, công nghệ kỹ thuật và
kinh tế nó mang lại cho con người. Mặc dù cả chất lượng lẫn số lượng protein sữa là
khác nhau giữa các loài và trong các chủng giống cũng sẽ có sự khác nhau giữa các
cá thể, nhưng nhìn chung protein trong sữa được chia thành 2 loại là Casein và

protein Whey. Casein chiếm khoảng 80% lượng protein trong sữa và tồn tại dưới 4
dạng là α-S1, α-S2, β và κ Casein. Protein Whey chiếm 20% còn lại, bao gồm βlactoglobulin, α-lactalbumin, albumin huyết thanh và globulin miễn dịch. Trong
trường hợp ở loài dê cho thấy sự biến đổi định tính và định lượng phức tạp, đặc
trưng bởi 1 số đa hình di truyền và nhiều điểm sửa đổi sau dịch mã. Cơ chế điều
khiển phiên mã và sau phiên mã khác nhau dẫn đến sự biểu hiện gene Casein là
khác nhau, ảnh hưởng đáng kể tới tính chất công nghệ của sữa (Martin và cộng sự,
1999) [23].
2.1.3. Gene CSN1S1 - Alpha-S1 Casein
2.1.3.1. Nguồn gốc, cấu tạo và chức năng của gene CSN1S1
Gene Casein là 1 cụm tổ chức hình thành theo thứ tự S1-Casein (CSN1S1),
casein (CSN2), S2-Casein (CSN1S2) và к-Casein (CSN3). (Ferretti và cộng sự,
1990; Threadgill và Womack, 1990). Toàn bộ khu vực cụm gene Casein ở dê kéo
dài khoảng 250kb trên NST số 6 (Hayes và cộng sự, 1993). Trong đó 2 đoạn gene
CSN1S1 và CSN2 chỉ cách nhau 12 kb (Leroux và Martin, 1996) [23].
Trong số các Casein, α-S1 Casein chiếm khoảng 40% trong sữa bò (Farrel và
cộng sự, 2004), ở trong sữa dê nó dao động từ 5 – 25% do sự xuất hiện của đa hình
trong gene CSN1S1 (Boulanger và cộng sự, 1984). Moioli và cộng sự (2007) cũng
cho rằng hàm lượng protein trong sữa dê bị ảnh hưởng bởi sự đa hình gene CSN1S1.
Theo Céline Carillier-Jacquin (2016) thì các kiểu gene CSN1S1 có ảnh
hưởng đáng kể đến sản lượng sữa, hàm lượng chất béo và hàm lượng protein. Ngoài
ra, một số nghiên cứu chỉ ra rằng gene CSN1S1 có vai trò trong việc tăng cường và
điều hoà khả năng miễn dịch ở cá thể sơ sinh vượt quá giá trị dinh dưỡng của nó
trong sữa [11].


7

2.1.3.2. Các dạng allele của gene CSN1S1
Groscaude và cộng sự (1987) đã phát hiện 7 allele của gene CSN1S1 trên 2
giống dê Alpine và Saanen. Sau đó, trải qua quá trình nghiên cứu lâu dài trên nhiều

chủng loại dê khác nhau trên thế giới, Groscaude và Martun (1997) đưa ra con số 17
allele của CSN1S1 được xác định là có liên kết với các nồng độ khác nhau của α-S1
Casein trong sữa. Đó là các allele A, B1, B2, B3, B4, C, H, L, M, E, I, F, D, G, O1, O2
và N. Sau đó, vào năm 2002 Neveu và cộng sự đã thông báo rằng có sự hiện diện
của 1 allele khác kí hiệu là O3 trên locus gene CSN1S1.
Các allele được biểu hiện mạnh và mong muốn xuất hiện trong các giống dê
chuyên sữa để sản xuất pho-mat là A, B1, B2, B3, B4, C, H, L và M tạo ra 3,5g/L αS1 Casein (Brigon và cộng sự, 1989; Chianese và cộng sự, 1997; Martin và cộng sự,
1999; Bevilacqua và cộng sự, 2002). Các allele E và I có mức biểu hiện trung bình
và tạo ra 1,1g/L α-S1 Casein (Martin và cộng sự, 1999). Các allele biểu hiện yếu và
không được mong muốn xuất hiện là F, D và G chỉ tạo ra 0,45g/L α-S1 Casein
(Martin và cộng sự, 1999). Các allele O1, O2 và N là allele không được biểu hiện và
không sản xuất α-S1 Casein (Cosenza và cộng sự, 2003). Các allele H, I, L và M
được xác định là allele hiếm chỉ được xác định đã xuất hiện trên các giống dê địa
phương ở miền nam nước Ý (Chianese và cộng sự, 1997) [23].
2.1.3.3. Đa hình đoạn cắt gene CSN1S1 bằng enzyme giới hạn XmnI
Trong đề tài này, tôi kí hiệu các allele của gene CSN1S1 thành 4 nhóm N
gồm (CSN1S1 O1, O2 và N), F gồm (CSN1S1 D, F và G), A (CSN1S1 A, G, H, L và
M) và B gồm (CSN1S1 B1, B2. B3, B4, C, và E) [14]. Trong đó allele A và B là các
allele có mức biểu hiện mạnh, allele F thể hiện cho các allele có mức biểu hiện
trung bình yếu và allele N là các allele không được biểu hiện.
Sau khi điện di sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gene CSN1S1 với cặp mồi
do Ramunno thiết kế năm 2000 sẽ thu được 2 băng sản phẩm PCR kích thước
213bp và 223bp. Phân tích đa hình đoạn gene CSN1S1 bằng enzyme XmnI ta thu
được các dạng allele tương ứng sau:


8

- Allele F: 223bp
- Allele N: 212bp

- Allele B: 161bp - 62bp
- Allele A: 149bp - 64bp
Từ đó ta có thể suy ra các kiểu gene tương ứng sau:
- Kiểu gene AA: cá thể có chứ kiểu gene AA là cá thể đồng hợp tử đoạn cắt
gene CSN1S1. Sau khi điện di ta sẽ thu được 1 băng duy nhất có kích thước 149bp.
Đoạn gene kích thước 64bp quá nhỏ nên không thể nhìn thấy sau khi điện di.
- Kiểu gene BB: cá thể có chứ kiểu gene BB là cá thể đồng hợp tử đoạn cắt
gene CSN1S1. Sau khi điện di ta sẽ thu được 1 băng duy nhất có kích thước 161bp,
đoạn gene kích thước 62bp quá nhỏ nên không thể nhìn thấy sau khi điện di.
- Kiểu gene NN: cá thể có chứ kiểu gene NN là cá thể đồng hợp tử đoạn cắt
gene CSN1S1. Sau khi điện di ta sẽ thu được 1 băng duy nhất có kích thước 213bp
do trên kiểu allele này không có vị trí cắt của enzyme giới hạn XmnI.
- Kiểu gene FF: cá thể có chứ kiểu gene FF là cá thể đồng hợp tử đoạn cắt
gene CSN1S1. Sau khi điện di ta sẽ thu được 1 băng duy nhất có kích thước 224bp
do trên kiểu allele này không có vị trí cắt của enzyme giới hạn XmnI.
- Ngoài ra ta còn có thể thu được 6 kiểu gene khác là: AB, AN, AF, BN, BF
và FN. Các cá thể mang các kiểu gene này là các cá thể dị hợp tử đoạn cắt gene
CSN1S1. Sau khi điện di ta sẽ thu được 2 băng tương ứng với kích thước của đoạn
cắt lớn hơn 100bp, các đoạn gene có kích thước nhỏ không thể nhìn thấy sau khi
điện di.


9

- Sơ đồ mô phỏng 4 allele A, B, F và N tương ứng được thể hiện ở hình 2.1
dưới đây:

Hình 2.1: Sơ đồ mô phỏng các allele của gene CSN1S1
- Sơ đồ mô phỏng các kiểu gene AA, BB, NN, FF, AB, AN, AF, BN, BF, FN
tương ứng được thể hiện ở hình 2.2 dưới đây:

10


11

Hình 2.2: Sơ đồ mô phỏng các kiểu gene của gene CSN1S1


12

2.1.3.4. Vị trí cắt đa hình của enzyme giới hạn XmnI trên đoạn gene CSN1S1:

Hình 2.3: Vị trí cắt của enzyme giới hạn XmnI trên đoạn gene CSN1S1
Trong hình 2.3 ta có thể quan sát thấy sự khác nhau giữa 3 dạng allele của
đoạn gene CSN1S1. Allele A ở vị trí nucleotide 68 bị đột biến thêm 1 nucleotide C
hình thành vị trí nhận biết điểm cắt của enzyme giới hạn XmnI, điều này lý giải cho
việc allele A sau khi cắt sẽ tạo thành 2 đoạn có kích thước 149bp và 64bp. Allele N
nguyên bản không có vị trí cắt của XmnI nên sau phản ứng cắt vẫn chỉ có 1 đoạn
kích thước 212bp. Đặc biệt là ở allele F xảy ra hiện tượng đột biến thêm vào 1 đoạn
11bp bắt đầu từ nucleotide 152, điều này lý giải cho việc tại sao sử dụng 1 cặp mồi
PCR trên cùng 1 đoạn gene nhưng kích thước của sản phẩm PCR lại xuất hiện 2
đoạn khác nhau lần lượt là 223bp và 112bp. Ở allele này cũng xuất hiện 2 điểm
SNP ở nucleotide 97 (A > G) và nucleotide 108 (C > T) nhưng không hình thành vị
trí nhận biết của enzyme XmnI. Về phần allele B, theo ý kiến của tôi, có thể là ở vị
trí nucleotide 68 trên allele F cũng có thể xuất hiện đột biến thêm 1 nucleotide C để
hình thành điểm nhận biết của enzyme XmnI giống như ở allele A. Do đó hình
thành nên dạng allele B có kích thước sản phẩm PCR là 224bp và khi cắt bằng
enzyme XmnI sẽ tạo thành 2 đoạn 161bp và 62bp. Tất nhiên điều này còn cần được

kiểm chứng bằng các thí nghiệm chuyên sâu hơn.
2.1.4. Gene β-lg - Beta-lactoglobulin
2.1.4.1. Nguồn gốc, cấu tạo và chức năng của gene β-lg
Gene β-LG dài 8088bp (Genbank accession: Z33881.1) gồm 7 exon và 6
intron xen kẽ nhau. Nằm trên NST 11 của các loài động vật nhai lại. Sản phẩm của
gene β-LG sau khi mã hóa là protein β –lactoglobulin, 1 loại protein Whey có rất


13

nhiều trong sữa của các loài động vật nhai lại nhưng không hề xuất hiện trong sữa
của các loài động vật thuộc bộ Gặm nhấm, bộ Thỏ và của Người. Trong sữa của
động vật nhai lại, protein β –lactoglobulin tự nhiên được tìm thấy như là một dimer
với trọng lượng phân tử là 36,4 kDa tương ứng với 162 axit amin [18].
Chức năng của β -lactoglobulin chưa được xác định 1 cách chính xác nhưng
có thể nói protein này có liên quan mật thiết tới sản lượng và chất lượng sữa. βlactoglobulin được chứng minh là một protein thuộc họ lipocalin. Đây là 1 nhóm
protein thú vị và đa dạng, tuy nhiên lại chưa được hiểu rõ dưới góc nhìn của khoa
học. Thông qua quá trình nghiên cứu, người ta thấy được các protein thuộc họ
lipocalin có tính đặc hiệu liên kết ngoại bào cao đối với các phân tử kị nước nhỏ như
steroid, bilins, retinoids và lipid. β-lactoglobulin có thể liên kết với nhiều phân tử kị
nước cùng lúc [7], [8], [9]. Qua đó cho thấy vai trò vận chuyển quan trọng. Bên
cạnh đó, β-lactoglobulin còn được chứng minh là có khả năng liên kết với ion Fe3+
thông qua Siderophore, thể hiện vai trò trong việc chống lại các tác nhân gây bệnh.
2.1.4.2. Các dạng allele của gene β-lg
Theo nghiên cứu trên thế giới, Gene β-LG có 2 allele là A và B tạo ra 3 kiểu
gene AA, AB và BB. 1 trong 2 allele này được tạo ra bởi một sự thay thế nucleotide
đơn tại vị trí +4601 (Pena và cộng sự, 2000). Phân tích thống kê cho thấy xu hướng
chung là kiểu gene AA cho năng suất sữa cao hơn 2 kiểu gene AB và BB. Các biến
thể khác nhau đã được xác định cho gene β-lg ở dê ở mức độ phân tử đã phát hiện
sự có mặt của quá trình chuyển đổi cơ sở G > A tạo nên vị trí nhận biết điểm cắt của

enzyme giới hạn SacII. Sau đó, Kumar và cộng sự năm 2006 đã nghiên cứu đa hình
gen β-LG trong tám giống dê địa phương khác nhau ở Ấn Độ và xác định được ba
kiểu gen khác nhau của gene β-lg. Rout và cộng sự năm 2010 cũng quan sát thấy
hai biến thể A và B này trong cùng một giống dê.
2.1.4.3. Đa hình đoạn cắt gene β-LG bằng enzyme giới hạn SacII
Sử dụng cặp mồi cụ thể do Pena và cộng sự thiết kế năm 2000 để khuyếch
đại thành công một đoạn gen β-LG có kích thước 427bp. Sau đó cắt bằng enzyme
giới hạn SacII sẽ thu được các dạng allele sau:


14

- allele A: 427bp
- allele B: 346bp - 81bp
Từ 2 allele trên ta có các kiểu gene tương ứng như sau:
- Kiểu gene AA: các cá thể mang kiểu gene AA là cá thể đồng hợp tử về
đoạn cắt gene β-LG. khi điện di sẽ thu được 1 băng duy nhất với kích thước 427bp.
- Kiểu gene AB: các cá thể mang kiểu gene AB là cá thể dị hợp tử về đoạn
cắt gene β-LG. khi điện di sẽ thu được 2 băng có kích thước 427bp và 346bp, đoạn
gene kích thước 81bp quá nhỏ nên không thể nhìn thấy sau khi điện di.
- Kiểu gene BB: các cá thể mang kiểu gene BB là cá thể đồng hợp tử về đoạn
cắt gene β-LG. khi điện di sẽ thu được 1 băng duy nhất có kích thước 346bp, đoạn
gene kích thước 81bp quá nhỏ nên không thể nhìn thấy sau khi điện di.
- sơ đồ mô phỏng 2 allele A và B được thể hiện ở hình 2.4 dưới đây:

Hình 2.4: Sơ đồ mô phỏng các allele của gene β-LG


15

- Sơ đồ mô phỏng 3 kiểu gene AA, AB và BB tương ứng được thể hiện ở
hình 2.5 dưới đây:

Hình 2.5: Sơ đồ mô phỏng các kiểu gene của gene β-LG


16

2.1.4.4. Vị trí cắt đa hình của enzyme giới hạn SacII trên đoạn gene β-LG:

Hình 2.6: Vị trí cắt của enzyme giới hạn SacII trên đoạn gene β-LG
Quan sát ở hình 2.6 rất dễ dàng có thể nhận ra giữa 2 allele A và B của đoạn
gene β-LG xuất hiện 2 điểm SNP ở vị trí nucleotide 79 và nucleotide 390. Ở vị trí
nucleotide 79 xuất hiện đột biến thay thế 1 nucleotide A > G dẫn đến việc hình
thành vị trí nhận biết của enzyme giới hạn SacII. Điều này cũng lí giải cho việc khi
xử lý sản phẩm PCR đoạn gene β-LG với enzyme SacII thì allele B sẽ bị cắt thành 2
đoạn có kích thước 346bp và 81bp còn allele A thì vẫn giữ nguyên kích thước
427bp. Ở vị trí nucleotide 390 cũng xuất hiện đột biến thay thế 1 nucleotide A > C
nhưng không hình thành vị trí nhận biết của enzyme SacII.
2.2. Cơ sở khoa học của đề tài
2.2.1. Khái niệm đa hình gen
Tính đa hình gene do allele quyết định, gene có nhiều allele thì tính đa
hình càng cao. Gregor Mendel (1856) định nghĩa allele như sau: “Alen là các
dạng khác nhau của một gene cùng quy định một tính trạng”. Từ sau năm 1925, sau
khi Mogan thành công trong việc lập bản đồ di truyền của ruồi giấm, thì allele được
định nghĩa lại như sau: “Alen là các dạng khác nhau của cùng một gene định vị trên
một locus của cùng một nhiễm sắc thể cùng quy định cùng một tính trạng nào đó ở cơ
thể sinh vật”.

17

Sự đa hình DNA là những biến đổi trong trình tự DNA của một cá thể, sự
biến đổi đó có thể hoặc không thể ảnh hưởng lên kiểu hình. Sự biến đổi này thường
được phát hiện qua nhiều phương pháp sinh học phân tử khác nhau. Những biến đổi
được phát hiện có ảnh hưởng lên kiểu hình được xem như một marker đặc hiệu cho
biến đổi đó. Điều đó có nghĩa là nếu một cá thể có cùng sự đa hình đó, có thể sẽ
biểu hiện một vài đặc điểm tương tự khác.
2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Ở động vật, DNA được tách chiết từ da, cơ vân, mô mỡ và từ máu. Quy trình
gồm 4 bước cơ bản sau:
Bước 1: Phá vỡ màng tế bào màng nhân ( tế bào Eukaryote). Thông thường
tế bào, mô được nghiền trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, Sarosyl) và proteinase K.
khi đó màng tế bào, màng nhân sẽ bị phá vỡ và giải phóng DNA ra môi trường và
phân huỷ các protein liên kết với DNA.
Bước 2: Loại bỏ các phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein, mẫu được lắc mạnh trong một dung dịch phenol va chloroform, dung dịch
này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hoà tan DNA, sau khi ly tâm
sẽ tủa thành lớp nằm giữa pha nước và pha phenol/chloroform. Pha nước có chứa
DNA được thu nhận lại.
Bước 3: Tủa DNA, mục đích của việc kết tủa là nhằm thu nhận DNA dưới
dạng cô đặc, một phần nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân huỷ của các enzyme, mặt
khác có thể hoà tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Có thể tủa
DNA trong ethanol (2,5 dung tích ethanol/1 dung tích mẫu), môi trường có nồng độ
muối cao, nhiệt độ thấp, tuy nhiên cũng có thể tủa trong isopropanol ( 1 thể tích
isopropanol/l thể tích mẫu), không cần muối. Sau khi thu nhận DNA, cặn tủa cần
phải rửa trong ethanol 70% để loại bỏ muối hoặc isopropanol dính vào.
Bước 4: Hoà tan DNA, DNA sau khi kết tủa được rửa bằng cồn và để khô tự
nhiên. Sau đó được hoà tan trong TE hoặc nước cất để bảo quản DNA phục vụ cho
các nghiên cứu tiếp theo.