Nghiên cứu nhân giống lan Bạch Cập (Bletilla striata) từ hạt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRẦN THỊ THANH TÂM
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN BẠCH CẬP (Bletilla striata)
TỪ HẠT BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Lớp

: K46 - CNSH

Khóa học

: 2014 – 2018

Thái Nguyên - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRẦN THỊ THANH TÂM
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN BẠCH CẬP (Bletilla striata)
TỪ HẠT BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: K46-CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2014– 2018

Giảng viên hướng dẫn

: 1. TS. Nguyễn Tiến Dũng
2. GS.TS Ngô Xuân Bình

Thái Nguyên – 2018


i

LỜI CAM KẾT
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là hoàn toàn trung thực và
chưa được công bố trong bất kì công trình nào khác.
Thái nguyên, tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Trần Thị Thanh Tâm


ii

LỜI CẢM ƠN
Được sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm
khoa Công nghệ Sinh học và công nghệ thực phẩm, trong thời gian thực tập
em đã tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu nhân giống lan Bạch Cập (Bletilla striata) từ hạt bằng
kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào”.
Trong quá trình thực tập để hoàn thành khóa luận ngoài sự nỗ lực của
bản thân em còn nhận được nhiều sự giúp đỡ của nhà trường cùng với sự chỉ
dạy tận tình của các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ sinh học và công
nghệ thực phẩm.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Tiến Dũng, GS.TS.
Ngô Xuân Bình và cô giáo Nguyễn Thị Tình đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và
hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất tốt nhất có
thể và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình thực tập; cảm ơn bạn
bè đã giúp đỡ em trong thời gian vừa qua.
Mặc dù bản thân đã cố gắng hết sức nhưng do thời gian thực hiện đề tài
có hạn nên bản khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong
nhận được ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tài
được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2018
Sinh viên
Trần Thị Thanh Tâm


3

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.2. Thiết bị và Dụng cụ ..................................................................... 23
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 đến khả năng tạo vật
liệu vô trùng ................................................................................................. 31
Bảng 4.2. Kết quả nghiện cứu khả năng nảy mầm của hạt trên một số môi

trường........................................................................................................... 33
Bảng 4.3. Kết quả nghiên ảnh hưởng của nồng độ nước dừa tới khả năng
nhân nhanh chồi ........................................................................................... 35
Bảng 4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP khả năng nhân nhanh
chồi. ............................................................................................................. 37
Bảng 4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin tới khả năng khả năng
nhân nhanh chồi. .......................................................................................... 39
Bảng 4.5. kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ .......... 40


4

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.5. Sơ đồ thí nghiệm.......................................................................... 26
Hình 4.2. Ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt sau .... 34
Hình 4.3. Ảnh hưởng của nước dừa tới khả năng nhân nhanh chồi ............... 36
Hình 4.4.1. Ảnh hưởng của BAP tới khả năng nhân nhanh chồi .................. 38
Hình 4.5. Ảnh hưởng của các nồng độ IBA khác nhau đến khả năng tạo rễ.. 41


5

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
BAP

: 6-Benzylaminopurine

GA3

: Gibberellic Acid

IBA

: Indole butyric acid

MS

: Murashige & Skoog (1962)

CS

: Cộng sự

CT

: Công thức

CV

: Coeficient of Variation

Đ/c

: Đối chứng

LSD

: Least Singnificant Difference Test

MS

: Murashige & Skoog (1962)

MT

: Môi trường

NAA

: α-Naphthalene acetic acid

WHO

: World Health Organization

BAP

: 6-benzylaminopurine

IAA

: Indole-3-acetic acid

Kinetin

: Furfurylaminopurine


6

MỤC LỤC
LỜI CAM KẾT ............................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................... iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................. iv
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ............................................... v
PHẦN 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................... 2
1.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................. 3
1.4.1. Ý nghĩa khoa học.................................................................................. 3
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................. 3
PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ...................................................... 4
2.1. Nguồn gốc và phân loại phong lan........................................................... 4
2.2. Đặc điểm sinh vật học của cây hoa phong lan......................................... 5
2.3. Một số kết quả nghiên cứu về nhân giống của hoa phong lan bằng
phương pháp nuôi cấy mô. ............................................................................. 7
2.4. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào ................................................... 9
2.4.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào.......................................................... 9
2.4.2. Tính toàn năng của tế bào ..................................................................... 9
2.4.3. Sự phân hóa tế bào và phản phân hóa ................................................. 10
2.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật...... 11
2.5.1. Vật liệu nuôi cấy................................................................................. 11
2.5.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................... 11
2.6. Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro ........................................ 19


vii

2.6.1. Giai đoạn chuẩn bị.............................................................................. 19
2.6.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy......................................................................... 19
2.6.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi ................................................................. 20
2.6.4. Tạo cây hoàn chỉnh............................................................................. 20
2.6.5. Giai đoạn đưa cây ra đất ..................................................................... 20
2.7. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào lan Bạch Cập trên thế giới và
trong nước .................................................................................................... 21
2.7.1. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Bạch Cập trên thế giới. ...... 21
2.7.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô lan Bạch Cập trong nước.............. 22
PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 23
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.......................................................... 23
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 23
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................ 23
3.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng .................................................................. 23
3.2.1. Hóa chất sử dụng ................................................................................ 23
3.3. Địa điểm và thời gian tiến hành ............................................................. 24
3.4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 24
3.4.1.Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 tới khả năng tạo vật liệu
vô trùng ........................................................................................................ 24
3.4.2.Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả
năng này mầm của hạt. ................................................................................. 24
3.4.3.Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân
nhanh chồi .................................................................................................... 25
3.4.4.Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng tới
khả năng nhân nhanh chồi ............................................................................ 25
3.4.5.Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ ......... 26
3.5. Phương pháp nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi .................................. 26

viii

3.6. Phương pháp xử lí số liệu ...................................................................... 30
PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 31
4.1. Ảnh hưởng của HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng. .................... 31
4.2.Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới khả năng nảy mầm của hạt lan
Bạch Cập...................................................................................................... 33
4.3. Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa tới khả năng nhân nhanh chồi .......... 34
4.4. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng tới khả năng nhân
nhanh chồi. ................................................................................................... 37
4.5. Kết quả nghiên cứu ánh hưởng của IBA tới khả năng ra rể.................... 40
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................... 42
5.1. Kết luận ................................................................................................. 42
5.2. Kiến nghị............................................................................................... 42


1


2

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hoa lan được con người biết đến rất sớm từ 2.800 năm TCN, nó được
coi một trong những đỉnh cao tiến hóa của các loài hoa. Hiện nay trên thế giới
với 800 chi và 25.000 – 30.000 loài, họ Lan (Orchidaceae) chiếm vị trí thứ hai
sau họ Cúc (Asteraceae) trong ngành thực vật hạt kín . Vì vậy hình thái, cấu
tạo cũng như hệ thống phân loại của họ này rất đa đa dạng và phức tạp.
Việt Nam là quốc gia được đánh giá có sự đa dạng sinh học phong phú,

phong lan Việt Nam đa dạng về số loài, màu sắc và chủng loại với trên 140
loại phong lan chia ra thành 1000 giống nguyên thủy. Chúng thường phân bố
ở các vùng rừng núi Cao Bằng, Sa Pa, Lào Cai, Huế, Hải Vân, Quy Nhơn,
Kontum, Pleiku, Ban Mê Thuật, Phan Rang, Đà Lạt, Di Linh, v.v.... Trong số
các loài lan của Việt Nam có rất nhiều cây quý hiếm điển hình là giống lan
Bạch Cập (Bletilla striata)
Lan Bạch Cập (Bletilla striata) thuộc họ lan Orchidaceae là một trong
những họ lớn nhất và cũng mang nhiều giá trị kinh tế, khoa học. Lan Bạch
Cập (Bletilla striata) có phạm vi phân bố hẹp chỉ có ở một số tỉnh miền núi
phía bắc Việt Nam như Cao Bằng, Lạng sơn, Lào Cai.
Hoa lan không với tác dụng làm đẹp, đồng thời cũng là một dược liệu
thiên nhiên để hỗ trợ cho nhiều căn bệnh. Trong thời gian gần đây, các nhà
khoa học đã nghiên cứu nhằm tạo ra được giống lan có chất lượng cao, cho
năng suất và phẩm chất tốt mà giá thành hợp lý để triển khai vào sản xuất ở
quy mô thương mại. Vì thế ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật vào sản xuất là cần
thiết.
Đặc thù riêng của lan Bạch Cập là cây sinh trưởng chậm, tỷ lệ nảy mầm
của hạt trong tự nhiên thấp ,vì vậy việc nghiên cứu nhân giống Bạch Cập rất
được chú trọng nhằm mục đích thương mại và bảo tồn nguồn gen thực vật


quý hiếm. Trước đây các nhà nghiên cứu đã tiến hành nhân giống các loài lan
Bạch Cập bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng
những phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như chất lượng cây thấp,
không đồng đều và số lượng cây ít. Để khắc phục được điều này, phương
pháp nhân giống in vitro đã ra đời nhằm khắc phục những hạn chế trên.
Phương pháp này cho số lượng cây lớn, chất lượng cao, đồng đều và sạch
bệnh, đây là điều mà phương pháp truyền thống không thực hiện được. Hiện
nay nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đang phát triển mạnh mẽ có
thể tạo ra số lượng cây con lớn, sạch bệnh, ổn định về mặt di truyền trong một

thời gian ngắn và đáp ứng được giá cả phải chăng của thị trường được coi là
một giải pháp lý tưởng mà không thể thay thế được
Xuất phát từ thực tiễn đó mà chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu
nhân giống lan Bạch Cập (Bletilla striata) từ hạt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô
tế bào”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
- Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh lan
Bạch Câp từ hạt như: HgCl2 , BAP, kinetin, IBA, nước dừa.
1.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng HgCl2 tới khả năng tạo vật liệu vô trùng
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng nảy mầm
của hạt lan Bạch Cập.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa tới khả năng nhân
nhanh chồi
- Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP va kinetin đến khả năng nhân nhanh
chồi
- Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ


1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu xác định được môi trường thích hợp cho nhân
giống lan Bạch Cập bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, đánh giá
được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng, thành phần môi trường
nuôi cấy, bổ sung thêm dữ liệu cho việc nghiên cứu các loại cây lan khác.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu sẽ cố gắng cung cấp được số lượng cây giống có
chất lượng cao, đồng đều cho sản xuất.

PHẦN 2
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
2.1. Nguồn gốc và phân loại phong lan
Trên khắp trái đất, hầu như nơi nào có thực vật là có phong lan. Tuy
nhiên số lượng nhiều ít khác nhau. Ở Columbie có trên 3000 loài, khoảng 100
loài ở Mỹ và Alasca chỉ có 14 đến 15 loài. Mỗi loài có một cách phân bố và
phát triển rất riêng biệt cho kiểu dáng và kích cỡ của cây lan khác nhau rất
nhiều, sự khác biệt đó không chỉ vì xuất xứ từ các lục địa khác nhau mà còn
có khi ở ngay trong một vùng địa lý vài kilomet vuông.
Hoa phong lan là một họ rất lớn thuộc lớp đơn tử diệp, phân bố khắp
nơi trên thế giới, nhưng phong phú nhất ở các rừng ẩm nhiệt đới, các vùng
Đông Nam Á và Trung Mỹ. Họ lan phân bố từ 68 độ bắc tới 56 độ vĩ nam..
Ở vùng ôn đới, ta gặp nhiều loài sống ở đất như địa lan, một số loài
hoại sinh không diệp lục và sống vào chất mục nát trong đất. Có loài ở châu
Úc có thể sống ngầm dưới đất như nấm.
Ở vùng nhiệt đới ta sẽ gặp nhiều loại phụ sinh sống trên cây khác như
cattleya, oncidium, laelia tập trung nhiều ở vùng Trung Mỹ, ở Đông Nam Á
đặc sắc nhất là Denbrodium và còn có Cypripedium, Phalaenopsis,
Cymbidium có nguồn gốc ở Inđônêsia.
Cây lan có thể chia thành hai nhóm: Nhóm đơn thân và nhóm đa thân
* Nhóm đơn phân chia làm hai nhóm phụ:
- Nhóm phụ lá mọc đối (Sarcanthinae): Nhóm này lá được xếp thành
hai hàng mọc đối nhau.
Gồm các giống như: Vanda, Aerides, Phalaenopsis...
- Nhóm phụ lá dẹp thẳng hay tròn (Campylocentrinae): Papilionanthe,
Luisia...


* Nhóm đa thân: Gồm những cây tăng trưởng liên tục. Căn cứ vào cách
ra hoa nhóm này chia thành hai nhóm phụ:

- Nhóm ra hoa phía trên như: lan Kiếm (Cymbidium), lan Hoàng Thảo
(Dedrobium), lan Vũ Nữ (Oncidium)...
- Nhóm ra hoa ở đỉnh: Cát Lan (Cattleya),chi Trúc Lan (Epidendrum)...
Cây hoa Phong Lan có tên khoa học là Orchidaceae. Theo hệ thống học
thực vật mới nhất, cây hoa Lan được phân loại như sau:
Giới : plaltae
Nghành: Magnolyophyta
Lớp: Liliospida
Bộ: Asperagales
Phân họ: Orchidaceae
Phong lan là họ sống phụ ( bì sinh) bám , treo lơ lửng trên các thân gỗ
khác, lan có hai loại thân : đa thân và đơn thân. Đa số củ giả đều có màu xanh
bóng nên cùng với lá nó làm nhiệm vụ quang hợp. Lá rất đa dạng, từ loại lá
mỏng tới loại lá phiến mỏng.
2.2. Đặc điểm sinh vật học của cây hoa phong lan
- Thân [6];[8];[11]: lan có hai loại thân: Đa thân và đơn thân.
Đa thân đại diện các chi lan Kiếm (Cymbideam), chi lan Hài
(paphiopeclilum), chi Cát Lan (Cattleya),...
Đơn thân các chi lan Vanda, Hồ Điệp (Phaleanopsis), Phượng vĩ
(Renanthera), Giáng hương (Aerides)
Củ giả: có hình cầu hoặc hình thuôn dài xếp sát nhau hoặc rải rác đều
hoặc hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành một thân giả. Củ giả gồm nhiều
mô mềm chứa nhiều dịch nhầy, phía ngoài là lớp biểu bì với vách tế bào dày ,
nhẵn bóng bảo vệ tránh sự mất nước do ánh sáng mặt trời. Đa số củ giả đều có
màu xanh bóng nên cùng với nó là làm nhiệm vụ quang hợp [8];[11]


- Căn hành ( thân, rễ): chỉ gặp ở lan đa thân, căn hành là nơi cấu tạo các
cơ quan dinh dưỡng mới, trên căn hành có nhiều mắt sống, chết. Mắt lá nơi
hình thành cũng mang rất nhiều rễ để nuôi sống cây lan [8];[11]

- Rễ: đa số rễ của các loài lan có lớp mô xốp màu trắng ngà với nhiều
công dụng khác nhau như: bảo vệ nguồn dẫn nước bên trong của rễ, hút nước
và các muối khoáng bám trên bề mặt rễ và hấp thụ cả hơi nước trong không
khí ẩm, chúng có khả năng bám chạt vào các vật mà chugn1 tiếp xúc. Ruột
của rễ các loại lan là một sợi dây rất chắc và khá dài như sợi cước, chính vì
vậy rễ lan đảm bảo cho cây lan có thể bám chắc chăn trên ngọn cây cao hay
trên vách núi mà không sợ bị gió cuốn đi. Miền chóp rễ có chứa các chất diệp
lục nên rễ cũng làm phần chức năng quang hợp của lá [1];[8];[11].
- Lá : đa số các loài phong lan lá cây tự dưỡng, nó phát triễn đầy đủ hệ
thống lá. Hình dạng cảu lá thay đổi rất nhiều từ loại lá mọng nước đến lá
phiến mỏng, phiến lá trải rộng khắp hay gấp lại theo gân vòng cung hay chỉ
gấp lại theo gân hình chữ V. Màu sắc lá thường xanh bóng nhưng có trường
hợp hai mặt lá màu khác nhau, thường màu lá dưới có màu xanh đậm hay tía,
mặt trên lại khảm nhiểu màu sắc sặc sỡ [5];[8];[11].
- Hoa: đối xứng qua một mặt phẳng, bên ngoài có 6 cánh, trong có 3
cánh dài ở ngoài cùng, thường có màu sắc và kích thước giống nhau. Một
cánh dài nằm phía trên hay phía sau của hoa gọi là cánh đài lý, 2 cánh dài
nằm 2 bên gọi là cánh đài cạnh. Nằm kề bên trong và xen kẽ với 3 cánh đài là
3 cánh hoa. Chúng giồng nhau về hình dáng, kích thước , màu sắc. Cánh còn
lại nằm phái trên hay phái dưới có màu sắc và hình dạng khác hẳn với các
cánh còn lại gọi là cánh môi, cánh môi quyết định giá trị thầm mĩ của lan. Ở
giữa hoa có một trụ nổi lên bộ phận sinh dục của cây, giúp cây duy trì nòi
giống. Trụ gồm nhiều nhụy và nhị, sau khi thụ phấn các cánh hoa héo, cuống
hoa hình thành quả lan [4];[8];[11].


- Quả và hạt: quả lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-4 đường nứt dọc,
quả có dạng cài dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa. Khi chín quả nở ra và
mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía dỉnh và phái gốc[8];[11].
Hạt lan rất nhiều, hạt nhỏ li ti. Hạt chỉ cấu tạo bởi một lớp chưa phân

hóa, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí. Hạt trưởng thành sau
2-18 tháng. Hạt phong lan không có nội nhũ nên khó phát triển thành cây. Các
loài lan rừng chủ yếu nhờ nấm để phát triển thành cây[8];[11].
2.3. Một số kết quả nghiên cứu về nhân giống của hoa phong lan bằng
phương pháp nuôi cấy mô.
Các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước đã đưa ra một số môi trường
nuôi cấy phong lan phổ biến là Vanci and went, Knudson C, Murashige &
Skoog (1962)
-

Năm 2009 Lê Minh Nguyệt và cộng sự [13] đã nghiên cứu ảnh hưởng

của môi trường và chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh và nhân
nhanh giống hoàng lan thuộc chi lan Kiếm (Cymbidium). Các tác giả đã khẳng
định : môi trường nhân nhanh bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thuộc
nhóm auxin và cytokinin có tác dụng tốt tăng hệ số nhân và chất lượng chồi
đối với hai giống lan CD5 và CD9. Môi trường cho hệ số nhân và chất lượng
chồi cao nhất với giống CD5 là môi trường cơ bản MS bổ sung 1mg/l BAP và
0,3mg/l NAA. Môi trường tốt nhất cho giống CD9 là môi trường cơ bản MS
bổ sung 1mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA.
+ Môi trường tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất cho CD5 và CD9 là môi
trường MS + 1g/l than hoạt tính + 0,5mg/l NAA, tạo ra số lượng rễ nhiều nhất
và chất lượng rễ tốt nhất.
+ Giá thể tốt nhất để ra cây con sau giai đoạn in vitro là dớn đối với cả
hai giống, tuy nhiên có thể dùng hỗn hợp dong biển và xơ dừa với tỉ lệ 1:1
nhằm giảm chi phí giá thể trong nhân giống.


- Năm 2016 Trịnh Thị Tuyết [13] thực hiện đề tài nghiên cứu nhân
nhanh lan Hài Giáp (Paphiopedilum malipoens) bằng phương pháp in vitro.

Kết quả:
+ Khử trùng quả lan Hài trong cồn 70º kết hợp với HgCl2 0,1% cho
hiệu quả khử trùng cao nhất với tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 71,78%.
+ Công thức môi trường MS cho tỷ lệ nảy mầm của hạt cao nhất đạt
84,7%.
+ Công thức tốt nhất để nhân nhanh chồi lan Hài Giáp: MS cơ bản +
BA 2 mg/l + NAA 0,3 mg/l cho hệ số nhân đạt 3,16 lần. Khi bổ sung 100 g/l
dịch chiết chuối vào môi trường cho hệ số nhân cao nhất so với các công thức
còn lại.
+ Môi trường thích hợp cho sự tạo rễ của chồi lan Hài Giáp trong ống
nghiệm là: MS cơ bản + NAA 0,4 mg/l + than hoạt tính 1 g/l.
+ Giá thể thích hợp cho cây con sau in vitro là dớn + trấu hun (2:1) cho
tỷ lệ sống đạt 90,44%.
- Năm 2010 Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng
Thắm, Đỗ Thu Hà [7]. Viện sinh học nông nghiệp (Trường Đại học Nông
Nghiệp Hà Nội) đã nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan hài
quý P.hanggianum Perner Gurss (Hài Hằng) thu thập ở Việt Nam. Kết quả
hạt lấy từ quả 6 tháng tuổi đem khử trùng bằng cồn 700 và HgCl2 trong 5 phút
rồi gieo vào môi trường MS, ½ MS, RE, V1 trong đó môi trường RE thích
hợp cho hạt nảy mầm 58-67%. Môi trường nhân nhanh protocom là RE có bổ
sung 150ml/l nước dừa và 100g/l chuối cho hệ số nhân chồi cao nhất là 4,3
lần. Môi tường này cũng rất có hiệu quả để tạo chồi. Môi trường ra rễ tốt nhất
khi bổ sung NAA nồng độ 0,4-0,6ml/l, khi cây cao 3-4cm, có 3-4 lá và 4-5 rễ
thì đưa ra vườn ươm trồng trên giá thể dớn, chế độ dinh dưỡng NPK là
(30:10:10) với lượng bón 1g/l và chế độ phun 2 lần/ tuần.


- Năm 2010 Võ Hà Giang, Ngô Xuân Bình [8] nghiên cứu nhân giống
phong lan đuôi chồn (Rhynchotylis retunsa [L] Blume) bằng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào. Các tác giả đã nghiên cứu môi trường gieo hạt và nhân

chồi cho kết quả như sau: bổ sung BAP 0,3 mg/l và kinetin 0,1mg/l cho tỷ lệ
hạt nảy mầm cao nhất đạt 86,7%, bổ sung 0,5mg/l kinetin và 0,3mg/l BAP
cho hệ số nhân chồi đạt 5-6 cụm chồi và 5-7 chồi/cụm.
2.4. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào
2.4.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình
nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô
trùng.
Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho
việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các
bộ phận khác nhau của thực vật với kích thước nhỏ.
Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy
mô và nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các
phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích
khác nhau.
2.4.2. Tính toàn năng của tế bào
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là
tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Haberlandt
lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa
bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi
tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết
và đủ của cơ thể sinh vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có
thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào.


10

2.4.3. Sự phân hóa tế bào và phản phân hóa
Sự phân chia và giãn của tế bào là hai giai đoạn sinh trưởng của tế

bào thực vật, trong giai đoạn này tế bào chưa có những đặc trưng riêng rẽ
về cấu trúc và chức năng của các tế bào gần như giống nhau.
Sau đó các tế bào bắt đầu phân hóa thành các mô chuyên hóa đảm
nhiệm các chức năng khác nhau. Các tế bào trong giai đoạn này đã có các
đặc trưng khác nhau về cấu trúc và chức năng; ví dụ tế bào mô bì có ngấn
cuti hay bần, sáp… làm nhiệm vụ che chở, mô dậu có chứa lục lạp và diệp
lục làm nhiệm vụ quang hợp một số tế bào mất chất nguyên sinh va hóa gỗ
dể làm nhiệm vụ dẫn truyền nước và chống đỡ… thực vật có khoảng 15 mô
chuyên hóa khác nhau nhưng chúng đều có chung nguồn gốc từ một tế bào
ban đầu phân hóa thành. Có thể nói rằng sự phân hóa tế bào là sự chuyễn
hóa tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hóa.
Sự phản phân hóa tế bào diễn ra ngược lại với sự phân háo tế bào.
Các tế bào đã được phân hóa trong các mô chức năng không mất đi khả
năng phân chia cảu mình mà trong các điều kiện nhất định chúng có thể
quay trở lại đóng vai trò như mô phân sinh và có khả năng phân chia để tạo
ra tế bào mới. Chẳng hạn có thể lấy một mẫu tế bào nào đó của cây (đã
phân hóa) cho vào nuôi cấy trong môi trường thích hợp chúng lại phân chia
để cho ra các tế bào mới hình thành mô sẹo rồi từ đó phân hóa thành các cơ
quan như rễ chồi. Lúc giâm cành, chiết cành từ các mô đã chuyên hóa khi
được kích thích bằng cách cắt rời khỏi cơ thể mẹ, bằng khoanh vỏ, bằng xử
lý hóa chất hay bó bầu… các tế bào đó quay trở lại phân chia mạnh mẽ để
cho ra các tế bào mới là cơ sở của rễ mới.


11

2.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.5.1. Vật liệu nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế
bào thực vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là hầu

hết các cơ quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá,…), các
cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thân
rễ…).
Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác
nhau trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình
nuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái
sinh lý và tuổi của mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu,
mục đích và khả năng nuôi cấy.
Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp
phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khả
năng tiêu diệt vi sinh vật. Hóa chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm
bảo 2 điều kiện: Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối
với mẫu. Hiệu quả vô trùng tùy thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm
nhập để tiêu diệt vi sinh vật của hóa chất. Một số hóa chất thường được sử
dụng hiện nay để vô trùng mẫu là: Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaOClhypoclorit natri, oxy già, HgCl2-thủy ngân clorua, chất kháng sinh
(gentamicin, ampixilin…)
2.5.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định
cho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy
2.5.2.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
a) Điều kiện vô trùng


12

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm
bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị
nhiễm. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy
mô in vitro.
Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các

chất hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn.
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa
quyết định. Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất
khử trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao.
Thông thường hay sử dụng một số hoá chất như: cồn 700, NaOCl, Ca(OCl)2,
HgCl2 0,1% … để khử trùng.
b) Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH
- Ánh sáng
Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố
như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời
gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời
gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày.
Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy.
Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh
trưởng của mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo
chồi. Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 7000 lux, ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh
hình thái của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân
chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì
sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô
sẹo. Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn
ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnh
quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 – 40 cm.


13

- Nhiệt độ
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng
ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ
thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp.

Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây
là 25±20C.
- PH
pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định của pH môi
trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. pH của đa số môi trường
được điều chỉnh giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng. pH dưới 5,5 làm agar
khó chuyển sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng.
2.5.2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, phát
triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi
trường nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ
theo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Mặc dù có sự đa
dạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường
nuôi cấy mô đều gồm các thành phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng
vi lượng, đường làm nguồn cacbon, cac vitamin, các chất điều hoà sinh
trưởng. Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần
xác định (amino acid, EDTA,..) và một số chất có thành phần không xác
định như nước dừa, dịch trích nấm men…
a) Nước
Cần đặc biệt chú ý đến thành phần này vì nước chiếm đến 95% môi
trường dinh dưỡng. Nên sử dụng nước cất khi tiến hành các thí nghiệm
nghiên cứu. Nếu môi trường chuẩn bị nuôi cấy protoplast, tế bào hay
meristem thì nên dùng nước cất 2 lần. Hoàn toàn không nên sử dụng nước


14

máy trong nuôi cấy mô. Trong trường hợp không có sẵn cũng chỉ nên sử
dụng nước khử ion, mặc dù nước này vẫn có thể chứa nguồn lây nhiễm hữu
cơ và các loài vi khuẩn .

b) Dinh dưỡng vô cơ
Dinh dưỡng vô cơ được chia ra làm 2 loại: các nguyên tố dinh dưỡng
đa lượng và nguyên tố dinh dưỡng vi lượng. Theo thống nhất của Hội sinh
lí học thực vật quốc tế (IAPP), nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nồng
độ lớn hơn 0,5 mmol/l gọi là nguyên tố đa lượng, nguyên tố khoáng mà
thực vật cần có nồng độ nhỏ hơn 0,5 mmol được gọi là nguyên tố vi lượng.
Nguyên tố khoáng là nhu cầu rất cần thiết đối với nuôi cấy mô thực vật.
Giống như cây trồng ngoài tự nhiên các mô và cơ thể thực vật khi nuôi cấy
trong ống nghiệm trên môi trường nhân tạo chúng cần được cung cấp đầy
đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển. Trong tự nhiên cây
trồng muốn sinh trưởng và phát triển mạnh thì cần phải lấy từ đất các
nguyên tố sau:
- Các nguyên tố đa lượng: các ion của nitơ (N), photpho (P), kali (K),
canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S).
- Các nguyên tố vi lượng: sắt (Fe), niken (Ni), clo (Cl), mangan
(Mn), kẽm (Zn), bo (B), đồng (Cu), và molipden (Mo).
Mười bốn nguyên tố trên cùng với cacbon, oxy, hidro được xem là
các nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu của thực vật.
Nhu cầu của mô thực vật nuôi cấy đối với nguyên tố dinh dưỡng
khoáng khác nhau so với thực vật ngoài đồng ruộng. Hệ rễ thực vật lấy
dinh dưỡng từ đất chủ yếu theo phương thức hấp thu chủ động, còn mô
nuôi cấy dinh dưỡng khoáng từ môi trường theo phương thức hấp thu bị
động là chính. Theo nguyên tắc thành phần môi trường nuôi cấy sẽ được
xây dựng trên thành phần các nguyên tố dinh dưỡng có mặt trong mô. Môi