Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) ở Việt Nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng Streptomyces cavourensis YBQ59

viÖn HÀN LÂM khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam

ViÖn c«ng nghÖ sinh häc

VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG
SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN
NỘI SINH TRÊN CÂY QUẾ (Cinnamomum
cassia Presl) Ở VIỆT NAM VÀ ĐẶC TÍNH
SINH HỌC CỦA HOẠT CHẤT TỪ CHỦNG
Streptomyces cavourensis YBQ59

LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc

Hà Nội, năm 2019
i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................... xi
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 4
1.1.

Tổng quan về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu ................... 4

1.1.1.

Giới thiệu về vi sinh vật và xạ khuẩn nội sinh ..................................................... 4

1.1.2.

Tương tác giữa xạ khuẩn nội sinh và thực vật ..................................................... 6

1.1.3.

Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trong công nghệ sinh học và y dược ............... 7

1.1.4.

Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu .................................................... 9

1.2.

Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu .............................................. 11

1.2.1.

Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trong các mô thực vật ............................................. 11

1.2.2.

Đa dạng di truyền của xạ khuẩn nội sinh ........................................................... 12

1.2.3.

Đánh giá đa dạng sinh học của xạ khuẩn theo sản phẩm trao đổi chất thứ
cấp ...................................................................................................................... 15

1.3.

Sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh và một số nghiên cứu
về loài Streptomyces cavourensis ..................................................................... 17

1.3.1.

Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu .................................. 17

1.3.2.

Các gen mã hóa enzyme tham gia quá trình tổng hợp kháng sinh của xạ
khuẩn .................................................................................................................. 19

1.3.3.

Nghiên cứu đặc tính và xác định cấu trúc kháng sinh ....................................... 24

1.3.4.

Một số cấu trúc kháng sinh sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn ................................... 26

1.3.5.

Lên men sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh ................................ 27

iii

1.3.6.

Một số nghiên cứu về xạ khuẩn Streptomyces cavourensis ............................... 30

1.4.

Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh tại Việt Nam và tiềm năng
khai thác xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) ...... 31

1.4.1.

Tình hình nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh ở Việt Nam ................................... 31

1.4.2.

Đặc điểm của cây quế (Cinnamomum sp.)......................................................... 33

1.4.3.

Tiềm năng phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum sp.) .......... 34

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 37
2.1.

Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 37

2.1.1.

Mẫu nghiên cứu, chủng giống vi sinh vật và các dòng tế bào ung thư .............. 37

2.1.2.

Hóa chất và thiết bị ............................................................................................ 37

2.1.3.

Môi trường nuôi cấy........................................................................................... 38

2.2.

Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 38

2.2.1.

Xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu quế ............................. 38

2.2.2.

Xác định khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh .............. 40

2.2.3.

Phân loại các chủng xạ khuẩn dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA ........ 42

2.2.4.

Xác định đặc điểm sinh học của xạ khuẩn ......................................................... 43

2.2.5.

Tách chiết, giải trình tự và phân tích hệ gen của chủng xạ khuẩn YBQ59 ....... 44

2.2.6.

Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men thích hợp cho xạ khuẩn................. 46

2.2.7.

Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các chất kháng khuẩn của chủng
xạ khuẩn ............................................................................................................. 47

2.2.8.

Xử lý thống kê.................................................................................................... 47

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................... 48
3.1.

Đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây
quế (C. cassia Presl) ......................................................................................... 48

3.2.

Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) ........................... 48
iv


3.2.1.

Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) .................. 49

3.2.2.

Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn nội sinh ............ 55

3.2.3.

Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh sinh kháng sinh......... 57

3.2.4.

Khuếch đại gen mã hóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và
nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng
sinh ..................................................................................................................... 61

3.2.5.

Khả năng sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline ................................ 62

3.3.

Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của
chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 ........................................................ 63

3.3.1.

Đặc điểm sinh học của chủng S. cavourensis YBQ59 ....................................... 64

3.3.2.

Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh
của chủng S. cavourensis YBQ59 ...................................................................... 67

3.3.3.

Lựa chọn môi trường thích hợp sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis
YBQ59 ............................................................................................................... 70

3.3.4.

Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng sinh kháng sinh ............. 71

3.3.5.

Ảnh hưởng điều kiện lên men đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S.
cavourensis YBQ59 ........................................................................................... 73

3.3.6.

Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S.
cavourensis YBQ59 ........................................................................................... 75

3.3.7.

Hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào ung thư của chủng S. cavourensis
YBQ59 ............................................................................................................... 76

3.4.

Tách chiết, tinh sạch và đặc tính của các hoạt chất thứ cấp từ chủng S.

cavourensis YBQ59 .......................................................................................... 78

3.3.1.

Tách chiết và tinh sạch các hoạt chất thứ cấp .................................................... 78

3.3.2.

Hoạt tính sinh học của các hợp chất tách được từ chủng S. cavourensis
YBQ59 ............................................................................................................... 83

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ ......................................................................... 86
v


4.1.

Đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây
quế (C. cassia Presl) ......................................................................................... 86

4.1.1.

Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) ................................. 86

4.1.2.

Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh ............................. 89

4.1.3.

Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh kháng sinh ................ 92

4.2.

Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của
chủng S. cavourensis YBQ59 ........................................................................... 93

4.2.1.

Đặc điểm sinh học của chủng S. cavourensis YBQ59 ....................................... 93

4.2.2.

Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh
của chủng S. cavourensis YBQ59 ...................................................................... 94

4.2.3.

Lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy sinh kháng sinh của chủng S.
cavourensis YBQ59 ........................................................................................... 96

4.3.

Tách chiết, tinh sạch và đặc tính của các hoạt chất thứ cấp từ chủng S.
cavourensis YBQ59 ........................................................................................ 102

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 114
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ ...................................... 116
LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ........................................................................................ 116
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 125

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về đa dạng sinh học của xạ
khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu ............................................... 13
Bảng 1.2. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược
liệu ................................................................................................................. 16
Bảng 1.3. Các chất chuyển hóa được sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn được sử dụng
trong y học với các cơ chế sinh tổng hợp ...................................................... 22
Bảng 3.1. Số liệu thống kê hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 297 chủng xạ
khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế ............................................................... 56
Bảng 3.2. Kết quả phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế Hòa Bình,
Lai Châu và Yên Bái dựa trên kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA ..... 58
Bảng 3.3. Sự phân bố của các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế ................ 60
Bảng 3.4. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59
với các chủng S. cavourensis với các chủng tham chiếu ............................... 65
Bảng 3.5. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của chủng S. cavourensis YBQ59 ............... 66
Bảng 3.6. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chủng S. cavourensis YBQ59 .... 76
Bảng 3.7. Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của từ dịch lên men của chủng
YBQ59 ........................................................................................................... 77
Bảng 3.8. Tổng hợp các hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng S. cavourensis YBQ59 ... 80
Bảng 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn các hợp chất tinh sạch từ chủng S. cavourensis
YBQ59 ........................................................................................................... 84
Bảng 3.10. Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của các chất tách được từ
chủng S. cavourensis YBQ59 (IC50, μM) ...................................................... 85

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Quá trình xâm nhập vào lỗ khí và gian bào của S. galbus MBR-5 trên lá
đỗ quyên sau 60 ngày quan sát ........................................................................ 6
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một số kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh (1-6) ............. 18
Hình 1.3. Sơ đồ mô tả hình thành chuỗn polyketide bởi synthase gồm bốn mô đun
riêng biệt. A. synthase bao gồm một protein đa mô đun đơn được mã hóa
bởi một gen duy nhất chứa bốn mô đun enzyme, đặc trưng của loại PKSI. B. Mỗi mô đun có mặt trên một protein của loại PKS-II. .......................... 21
Hình 1.4. Sơ đồ mô tả hình thành chuỗn peptide gồm 4 mô đun và được mã hóa bởi
hai gen khác nhau. Sản phẩm tạo ra là tetrapeptide....................................... 22
Hình 1.5. Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm anthracycline
DOX, DNR, EPI và IDA ............................................................................... 27
Hình 1.6. Một số bộ phận của cây quế đơn (C. cassia Presl)......................................... 33
Hình 3.1. Khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) tại
Hòa Bình (A), Lai Châu (B) và Yên Bái (C) phân lập trên một số môi
trường đặc hiệu sau 4-6 tuần nuôi cấy ........................................................... 49
Hình 3.2. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên các bộ phận của cây quế (C. cassia Presl): số
liệu tổng hợp tại ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy
mẫu (B) .......................................................................................................... 50
Hình 3.3. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên các môi trường phân lập khác nhau: số liệu
tổng hợp tại ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu
(B) .................................................................................................................. 51
Hình 3.4. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh theo nhóm mầu khuẩn ty: số liệu tổng hợp tại ba
vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) .......................... 53
Hình 3.5. Đa dạng di truyền của 16 chủng xạ khuẩn nội sinh dựa trên phân tích đa
hình sản phẩm phản ứng BOX-PCR. Giếng M: Thang DNA chuẩn (100
viii


bp); Giếng 1÷16 lần lượt là: HBQ7; HBQ8; HBQ9; HBQ10; HBQ11;

HBQ16; HBQ19; HBQ33; HBQ40; HBQ43; HBQ46; HBQ47; HBQ49;
HBQ55; HBQ56; HBQ62. ............................................................................. 54
Hình 3.6. Hoạt tính kháng C. albicans ATCC 10231 (A), P. vulgaris (B), P.
aeruginosa (C), S. epidermidis kháng methicillin (D) tại Hòa Bình; hoạt
tính kháng S. Typhimurium (E), S. epidermidis kháng methicillin (F) tại
Lai Châu. P. vulgaris (G), S. epidermidis kháng methicillin (H) tại Yên
Bái .................................................................................................................. 55
Hình 3.7. Số lượng xạ khuẩn kháng vi sinh vật kiểm định phân bố theo vị trí rễ,
thân, lá trên cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái................................... 57
Hình 3.8. Số liệu thống kê khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của 96
chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái ....... 62
Hình 3.9. Sự thay đổi màu sắc theo pH môi trường của các chủng xạ khuẩn. A: bổ
sung acid; B: bổ sung kiềm............................................................................ 63
Hình 3.10. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng tuyển chọn ở Hòa
Bình, Lai Châu và Yên Bái ............................................................................ 64
Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc (A) trên môi trường ISP2 và hình ảnh chuỗi bào tử
và bề mặt chuỗi bào tử của chủng YBQ59 được quan sát dưới kính kiển
vi điện tử quét (SEM) với độ phóng đại 3000 X (B) và 20.000 X (C) ......... 65
Hình 3.12. Cây phát sinh chủng loại dựa trên quan hệ di truyền giữa các trình tự
gen 16S rRNA của chủng S. cavourensis YBQ59 và các chủng xạ khuẩn
đại diện. Bootstrap = 1000 lần lặp; Bar = 0,02 đại diện cho sự thay thế
cho mỗi nucleotide. ........................................................................................ 67
Hình 3.13. Cấu trúc gen/nhóm gen tham gia quá trình sinh tổng hợp kháng ung thư
bleomycin (ctg328_1), jamaikamide (ctg328_1)

(A) và kháng sinh

macrotetrolide (ctg1114_1) (B) ..................................................................... 69

ix

Hình 3.14. Hoạt tính kháng S. Typhimurium ATCC 14028 và MRSE ATCC 35984
của chủng S. cavourensis YBQ59 trên các môi trường lên men khác nhau.. 71
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến hoạt tính kháng sinh của chủng S.
cavourensis YBQ59 ....................................................................................... 72
Hình 3.16. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh kháng sinh của chủng S.
cavourensis YBQ59 ....................................................................................... 72
Hình 3.17. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) đến khả năng sinh kháng sinh
của chủng S. cavourensis YBQ59 ................................................................. 73
Hình 3.18. Ảnh hưởng của độ thông khí bề mặt (A) và tỷ lệ tiếp giống (B) đến khả
năng sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 .............................. 74
Hình 3.19. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S.
cavourensis YBQ59. ...................................................................................... 75
Hình 3.20. Sơ đồ phân lập và tinh chế các chất sạch từ chủng S. cavourensis
YBQ59 ........................................................................................................... 78
Hình 4.1. Cấu trúc hợp chất M2B5.1: 1-monolinolein (1) (C21H38O4) ........................ 103
Hình 4.2. Cấu trúc và tương tác HMBC chính của hợp chất M2B5.0: bafilomycin D
(2) (C35H56O8) ............................................................................................. 105
Hình 4.3. Cấu trúc hợp chất M2B9.8: nonactic acid (3) (C10H18O4) ........................... 106
Hình 4.4. Cấu trúc hợp chất M2B8.3: 4’,7-dihydroxyisoflavone (daidzein (4))
(C15H10O4) .................................................................................................... 107
Hình 4.5. Cấu trúc hợp chất M2B7.5: 3'-hydroxydaidzein (5) (3',4',7trihydroxyisoflavone) (C15H10O5) ................................................................ 107
Hình 4. 6. Cấu trúc hợp chất M2B3.8: 5,11-Epoxy-10-cadinanol (6) (C15H26O2)....... 108
Hình 4.7. Cấu trúc hợp chất M2B4.3: prelactone B (7) (C9H16O3).............................. 109
Hình 4.8. Cấu trúc hợp chất M2B6.17: daucosterol (8) (C35H60O6) ............................ 110

x

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chú thích

26-L5

Ung thư ruột kết ở người

A

Vùng adenyl hóa

A549

Tế bào ung thư phổi ở người

ACP

Acyl carrier protein

AL

Acyl-CoA ligas

AntiSMASH

Antibiotics and secondary metabolite analysis shell

AT

Acyl transferase

BGC

Cụm gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp (biosynthetic
gene clusters)

C

Vùng ngưng tụ

13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon

C-NMR

CFU

Đơn vị hình thành khuẩn lạc

CKS

Chất kháng sinh

d

Đường kính lỗ thạch

D

Đường kính vòng vô khuẩn

DH

Dehydratase

DCW

Khối lượng tế bào khô

DEPT

Detortionless enhancement by polarization transfer (Phổ
DEPT)

DH

Dehydratase

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DNA

Deoxyribonucleic acid

xi

DO

Lượng oxy hòa tan

DOX

Doxorubicin

DNR

Daunorubicin

E

Vùng epime hóa

EPI

Epirubicin

ER

Enoulreductase

ESI-MS

Khối phổ lượng ion hóa phun mù điện tử

FT-IR

Phổ hồng ngoại Fourtier

GC-MS

Sắc ký khí-khối phổ

GISA

Glycopeptides intermediate và Staphylococcus aureus

GO

Dữ liệu gene ontology

1

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

H-NMR

HepG2

Tế bào ung thư gan ở người

Hep3B

Tế bào ung thư gan ở người

HGT

Chuyển gen ngang (Horizontal gene transfer )

HMBC

Heteronuclear multiple bond correlation (Phổ HMBC)

HMEC

Ung thư vú ở người

HSQC

Heteronuclear single quantum coherence (Phổ HMQC)

IAA

Indole-3-acetic acid

IC50

Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm

IDA

Idarubicin

IPH

Isatin-3-phenylhydrazone

IR

Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

ISC

Isatin-3-semicarbazone

xii


ISP

Chương trình xạ khuẩn quốc tế

ITC

Isatin-3-thiosemicarbazone

kb

Kilo base

KB

Ung thư cổ tử cung ở người

GEGG

Kyoto encyclopedia of genes and genomes

KR

Ketoreductase

KS

Ketosynthase

KTKS

Khuẩn ty khí sinh

KTCC

Khuẩn ty cơ chất

LC50

Liều gây chết 50%

LLC

Tế bào ung thư phổi Lewis

M

Methyl hóa

MCF7

Tế bào ung thư vú ở người

Mb

Mega base

MDA-MB-435

Tế bào ung thư tuyến vú ác tính ở người

ME-180

Tế bào ung thư cổ tử cung

MIC

Nồng độ ức chết tối thiểu (Minimum inhibitory concentration)

MS

Khối phổ

MRSA

Staphylococcus aureus kháng methicillin

MRSE

Staphylococcus epidermidis kháng methicillin

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

N50

Đánh giá chất lượng lắp ráp

NCBI

Ngân hàng cơ sở dữ liệu

NR

Cơ sở non-redundant

xiii


NRPS

Nonribosomal peptide synthetase

NRPs

nonribosomal peptide

OD

Mật độ quang

Ox

Oxy hóa

P388

Ung thư bạch cầu

PCP

Peptidyl carrier protein

PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction)

PGAP

Prokaryotic genome annotation pipeline

PK

Polyketide

PKS

Polyketide synthase

PKS-I

Polyketide synthase type I

PKS-II

Polyketide synthase type II

RNA

Ribonucleic acid

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

SEM

Kính hiển vi điện tử quét

SK-BR-3

Tế bào ung thư vú ở người

SK-LU-1

Tế bào ung thư phổi ở người

SKK

Sinh khối khô

TE

Thioesterase

TLC

Sắc ký lớp mỏng

XKNS

Xạ khuẩn nội sinh

VSV

Vi sinh vật

VVK

Vòng vô khuẩn

VRE

Enterococcus faecalis kháng vancomycin

xiv

1

MỞ ĐẦU
Một trong những thành tựu của y học hiện đại là phát triển các chất kháng sinh
và kháng vi sinh vật (VSV). Cho đến nay, sử dụng kháng sinh là phương thức quan
trọng trong điều trị các bệnh truyền nhiễm do VSV gây ra. Tuy nhiên việc lạm dụng
thuốc kháng sinh đã trở thành yếu tố chính dẫn tới xuất hiện các chủng VSV gây
bệnh kháng đa thuốc (Singh, 2012). Theo Demain và Sanchez (2009), VSV đã và
đang thay đổi tính kháng với các thuốc kháng sinh hiện đang sử dụng trong điều trị
nhờ xuất hiện các đột biến mới hoặc thay đổi thông tin di truyền. Vì vậy, hướng
nghiên cứu và phát triển các tác nhân kháng khuẩn mới là ưu tiên của nhiều nhà
khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới (Alekshun, 2007). Bên cạnh điều
trị các bệnh truyền nhiễm do VSV, việc tìm kiếm và phát hiện các hợp chất có hoạt
tính sinh học như có hoạt tính kháng tế bào ung thư, kháng viêm cũng là những vấn
đề mang tính toàn cầu.
Trong khoảng 20 năm gần đây, nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh (XKNS) trên
cây dược liệu đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học, công ty dược phẩm do
XKNS cho thấy tiềm năng lớn sinh tổng hợp các chất kháng sinh, kháng u, chất
kích thích tăng trưởng thực vật, các loại enzym và chính XKNS cũng có thể góp
phần tăng cường sức sống của cây chủ cũng như mang lại những tính chất dược lý
cho cây dược liệu. Theo Bérdy (2012), khoảng 70% chất kháng sinh có nguồn gốc
tự nhiên được sử dụng trong lâm sàng được sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn. Trong số
33.500 hợp chất hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ VSV, xạ khuẩn thuộc chi
Streptomyces đóng vai trò quan trọng và cho thấy đã sinh tổng hợp 10.400 hợp chất.
Vì vậy, sự đa dạng của xạ khuẩn trong tự nhiên nói chung và XKNS nói riêng rất
phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác và ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh
học sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Ngoài ra, nhiều
chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn được sinh tổng hợp bởi các
enzyme polyketide synthase (PKS) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) nên

việc nghiên cứu những gen pks, nrps liên quan đến quá trình trao đổi chất thứ cấp


2
rất hữu ích trong việc đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh (CKS) từ
xạ khuẩn (Ayuso và cs., 2005). Cho đến nay, rất ít nghiên cứu về tài nguyên XKNS
trên cây dược liệu Việt Nam được công bố và cần được nghiên cứu nhằm bảo tồn,
lưu giữ và khai thác nguồn gen VSV bản địa.
Trong y học cổ truyền Việt Nam tinh dầu của cây quế (Cinnamomum sp.) đã
được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm và chống
ung thư (Singh và cs., 1995; Tariq và cs., 2006) nhưng các nghiên cứu về XKNS
trên cây quế chưa được công bố nhiều. Trong nghiên cứu này, các XKNS được
phân lập trên các môi trường chọn lọc và đa dạng sinh học của XKNS được đánh
giá qua đặc điểm sinh học, phân bố, khả năng sinh kháng sinh và đặc điểm di
truyền. Các chủng XKNS có hoạt tính kháng VSV kiểm định, ức chế phát triển tế
bào ung thư phổi, mang các gen chức năng pks-I, pks-II, nrps được sàng lọc. Từ đó,
nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy phù hợp và tách chiết, tinh sạch các hợp
chất và giải trình tự, lắp ráp de novo, dự đoán và chú giải hệ gen của XKNS được
tuyển chọn để tìm kiếm thông tin về những gen liên quan đến quá trình tổng hợp
kháng sinh. Từ những lý do trên nghiên cứu sinh thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự
đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế
(Cinnamomum cassia Presl) ở Việt Nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ
chủng Streptomyces cavourensis YBQ59”
MỤC TIÊU
Đánh giá được sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh
trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) thu thập tại miền Bắc Việt Nam và tinh
sạch được một số cấu trúc hóa học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và các
gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis
YBQ59.

3
NỘI DUNG
1. Phân lập và nghiên cứu sự đa dạng sinh học của các chủng xạ khuẩn nội sinh
trên cây quế (C. cassia Presl) tại các điểm thuộc tỉnh Hòa Bình, Yên Bái và Lai
Châu.
2. Tuyển chọn xạ khuẩn sinh chất kháng sinh hoạt tính cao và xác định một số gen
liên quan đến tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn.
3. Nghiên cứu đặc điểm di truyền, lên men, tách chiết và xác định một số cấu trúc
kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ59.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CHO LUẬN ÁN
- Là nghiên cứu đầu tiên, có hệ thống về đa dạng, sinh tổng hợp chất kháng
sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) tại miền Bắc Việt Nam.
- Sàng lọc được chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 sinh kháng sinh phổ
rộng và phân lập được 8 hợp chất kháng sinh: 1-monolinolein (1), bafilomycin (2),
nonactic acid (3), daidzein (4), 3′-hydroxydaidzein (5), 5,11-epoxy-10-cadinanol
(6), prelactone B (7), daucosterol (8), trong đó các hợp chất 1, 3-8 được phát hiện
lần đầu từ loài S. cavourensis và hợp chất 1, 2 có hoạt tính kháng vi khuẩn kháng
kháng sinh cao (MIC50 8,5-30,3 µg/ml) và ức chế phát triển ba dòng tế bào ung thư
A549, MCF, Hep3B (IC50 3,6-24,7 µM).


4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu
1.1.1.

Giới thiệu về vi sinh vật và xạ khuẩn nội sinh

Thuật ngữ nội sinh “endophytic” lần đầu tiên được định nghĩa bởi de Bary
năm 1866, “VSV nội sinh là những VSV sống bên trong các mô thực vật và có sự
khác biệt đáng kể so với những loại VSV được tìm thấy trên bề mặt thực vật” (de
Bary, 1866). Khái niệm khác về XKNS được đưa ra khi Smith (1957) phân lập
thành công chủng xạ khuẩn Micromonospora sp. có khả năng ức chế nấm gây bệnh
Fusarium oxysporum trong mô cây cà chua không nhiễm bệnh. Tuy nhiên, định
nghĩa được các nhà VSV học thừa nhận rộng rãi nhất của Bacon và White (2000)
“VSV nội sinh là VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra những
hiệu ứng xấu tới cây chủ”; VSV nội sinh không những không gây ảnh hưởng mà
còn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, chống côn trùng,
miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất... (Staniek và
cs., 2008; Nalini và Prakash, 2017). Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ XKNS
được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như các chất
kiểm soát sinh học, chất kháng VSV gây bệnh, kháng nấm, ức chế phát triển tế bào
ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng...
(Bacon và White, 2000; Qin và cs., 2011; Kaishing và cs., 2018). Nấm, vi khuẩn và
XKNS đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh
học như alkaloid, steroid, terpenoid, peptide, polyketone, flavonoid, quinol, phenol
và thuốc trừ sâu tự nhiên azadirachtin cũng được sản xuất bởi VSV nội sinh hiện
đang được ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y dược (Li và cs., 2008;
Molina và cs., 2012; Golinska và cs., 2015; Ganapathy và Natesan, 2018; Singh và
Dubey, 2018).
Vi khuẩn: hơn 200 chi từ 16 ngành vi khuẩn đã được công bố là nội sinh
trong thực vật, phần lớn các loài thuộc ngành Actinobacteria, Proteobacteria và


5
Firmicutes (Golinska và cs., 2015). Vi khuẩn nội sinh thuộc nhóm vi khuẩn Gram
dương và Gram âm: Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus,

Brevibacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Xanthomonas, Enterobacter,
Gluconobacter… (Sun và cs., 2013). Saini và cs. (2016) đã phân lập được 166
chủng vi khuẩn nội sinh từ rễ của các loại cây lương thực như: đậu hồi (Cicer
arietinum), đậu (Pisum sativum), lúa mì (Triticum aestivum) và yến mạch (Avena
sativa). Vi khuẩn nội sinh đa dạng trong tự nhiên và có khả năng sinh các chất
chuyển hóa sinh học khác nhau có hoạt tính kháng khuẩn và chống tế bào ung thư.
Xạ khuẩn: Trong những năm gần đây, XKNS thu hút sự quan tâm của các
nhà khoa học, nhiều báo cáo khoa học về XKNS trên nhiều loại thực vật khác nhau
đã được công bố như các loại từ cây lương thực như lúa mì, ngũ cốc, gạo, cà chua,
cà rốt và khoai tây, cam quýt (Araújo và cs., 2000; Coombs và Franco, 2003) đến
các cây dược liệu (Taechowisan và cs., 2003; Golinska và cs., 2015; Nalini và
Prakash, 2017). XKNS phân lập được chủ yếu thuộc chi Streptomyces,
Microbispora, Micromonospora, Nocardioides, Nocardia và Streptosporangium.
XKNS được chứng minh mang lại nhiều lợi ích như cải thiện hoặc thúc đẩy quá
trình tăng trưởng thực vật, làm giảm các triệu chứng bệnh thực vật thông qua một
loạt các cơ chế như sinh tổng hợp các hoạt chất thứ cấp có khả năng tiêu diệt các
loại mầm bệnh do nấm hay côn trùng gây ra (Igarashi và cs., 2002). Nhiều chất
kháng sinh mới được tìm thấy do xạ khuẩn Streptomyces spp. sinh tổng hợp như
alnumycin, munumbicin A, D hay coronamycin (Castillo và cs., 2007; Nalini và
Prakash, 2017). Ngoài ra, nhiều công trình nghiên cứu về việc tìm kiếm XKNS mới
đã được công bố (Qin và cs., 2011; Golinska và cs., 2015; Nalini và Prakash, 2017).
Vì vậy, XKNS được kỳ vọng như một nguồn cung cấp tiềm năng trong việc phát
hiện ra các hợp chất có hoạt tính sinh học mới.
Nấm nội sinh: trong 10 năm qua, các nhà khoa học đã công bố khoảng 770
loại nấm nội sinh đã được phân lập. Các loài đã được định tên nhiều nhất là:
Altenaria spp.; Altenaria infectoria; Aspergillus spp.; Colletrotrichum spp.; C.
gloeosporioides; Guignardia spp.; Nigrospora oryzae; N. sphaerica; Penicillium


6

spp.; Phomopsis spp.; Rhizoctonia spp.; Xylaria spp. Gần đây, Daisy và cs. (2002)
đã phân lập được hai chủng nấm nội sinh mới là chủng Muscodor albus từ cây quế
(Cinnamomun zeylanicum) và Muscodor roseus từ hai cây trong rừng nhiệt đối tại
Úc. Hai chủng nấm sản sinh một số hợp chất trao đổi thứ cấp hoạt tính ức chế, tiêu
diệt nấm và vi khuẩn hại cây.
1.1.2.

Tương tác giữa xạ khuẩn nội sinh và thực vật

Nhiều nhà khoa học đã đưa ra các hình ảnh mô tả sự xâm nhập của các xạ
khuẩn trong thực vật, tuy nhiên phương thức xâm nhập và cơ chế nội sinh của VSV
nội sinh vẫn là một ẩn số (Sardi và cs., 1992).

Hình 1.1. Quá trình xâm nhập vào lỗ khí và gian bào của S. galbus MBR-5 trên lá
đỗ quyên sau 60 ngày quan sát
(Nguồn: Clark và Mattews, 1987)
Ghi chú: (a) quá trình xâm nhập vào lỗ khí. Khuẩn ty được gắn trên vật liệu electron (G: tế
bào bảo vệ). (b) các tế bào hệ sợi (mũi tên) trong khoang gian bào bên dưới lớp biểu bì (E: tế bào
biểu bì; IS: khoang gian bào; M: tế bào mesophyll).

Suzuki và cs. (2005) đã chứng minh quá trình xâm nhập vào mô lá và thân cây
đỗ quyên của chủng S. galbus MBR-5 bằng cách quan sát qua kính hiển vi điện tử,
cho hệ khuẩn ty của chủng S. galbus MBR-5 vào lá thông qua các lỗ khí nhưng
không thông qua lớp biểu bì, vì lớp biểu bì còn nguyên vẹn (Hình 1.1). Ngoài ra,
chủng MBR-5 được chứng minh là có khả năng sinh các enzyme thủy phân như
xylanase, cellulase và pectinase. VSV nội sinh đã tự thích nghi trong suốt thời gian
dài cùng với sự đồng tiến hóa của cây chủ qua gen điều hòa (Qin và cs., 2010). Một
giả thuyết được đưa ra rằng gen mã hóa cho các chất có hoạt tính sinh học được
sinh ra từ quá trình trao đổi giữa VSV và thực vật thông qua chuyển gen ngang
(HGT - horizontal gene transfer). VSV nội sinh sản sinh ra một số hợp chất để duy

7
trì mối quan hệ cộng sinh với cây chủ, thúc đẩy sự phát triển của cây chủ và giúp
chúng tồn tại được trong cây chủ (Golinska và cs., 2015).
1.1.3.

Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trong công nghệ sinh học và y dược

Trong thời gian gần đây, XKNS liên quan đến thực vật, đặc biệt là cây dược
liệu đã được chứng minh là tạo ra các hợp chất có giá trị trị liệu cao (Singh và
Dubey, 2018). Các nghiên cứu về XKNS đã xác định được nhiều sản phẩm tự nhiên
mới, đa dạng về cấu trúc và hoạt tính sinh học như: 9-hydroxybafilomycin D, 29hydroxybafilomycin D, bafilomycin D, bafilomycin E, bafilomycin A1, bafilomycin
B1, bafilomycin B2, bafilomycin C1, bafilomycin C2, bafilomycin C1 amide,
bafilomycin C2 amide; caryolane-1,7α-diol, 1,6,11-eudesmanetriol, 11-eudesmene1,6-diol, 7,4 dihydroxy-8-(hydroxymethyl)-1 methoxy-isoflavones, tripstretine…
(Qin và cs., 2011; Golinska và cs., 2015; Nalini và Prakash, 2017).
• Các chất kháng ung thư và chống viêm từ xạ khuẩn nội sinh
Hoạt chất paclitaxel từ Kitasatospora sp. được phân lập từ cây thanh tùng Ý
(Taxus baccata) (Caruso và cs., 2000; Janso và Carter, 2010) là báo cáo đầu tiên về
sản xuất taxol từ XKNS có hoạt tính kháng tế bào ung thư. Trong số các hợp chất có
hoạt tính chống ung thư, nhiều hợp chất có chứa khung cấu trúc hóa học đặc biệt,
chưa từng phát hiện từ các nguồn tự nhiên khác naphthomycin K (dẫn xuất của
kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) được phân lập đầu tiên từ
chủng Streptomyces sp. CS nội sinh trên cây mỹ đăng mộc (Maytenus hookeri) –
loại cây thuốc có tác dụng điều trị hung thư, hoạt huyết…. Kết quả kiểm tra hoạt
tính sinh học của naphthomycin K cho thấy, hoạt tính gây độc với hai dòng tế bào
ung thư: ung thư bạch cầu (P388) và ung thư phổi (A549) ở người với giá trị IC50
thấp là 0,07 và 3,17 μM, nhưng không có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus và
vi khuẩn lao (Lu và Shen, 2007). Năm hợp chất macrolide 16 thuộc họ bafilomycin
cũng được phân lập từ XKNS và cho thấy hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư vú

ở người (MDA-MB-435) bằng in vitro (Li và cs., 2010). Hai hợp chất
anthraquinone mới là lupinacidin A và B được chiết từ dịch lên men của chủng xạ


8
khuẩn Micromonospora lupine. Lupinacidin có khả năng ức chế sự phát triển của tế
bào ung thư biểu mô ruột kết ở người 26-L5 (Igarashi và cs., 2007). Kim và cs.
(2006) đã phân lập được hoạt chất 2 6-alkylsalicylic acid mới là salaceyin A và B từ
chủng S. laceyi MS53 nội sinh trên cây thầu dầu. Các kết quả khảo sát hoạt tính
chống ung thư cho thấy, salaceyin A và B thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư
vú ở người (SK-BR-3) với IC50 thấp lần lượt là 3,0 và 5,5 μg/ml. Mặt khác,
pterocidin được phân lập từ chủng S. hygroscopicus TP-A0451, cho thấy hoạt tính
gây độc với một số dòng tế bào ung thư ở người với giá trị IC50 trong khoảng 2,97,1 µM (Igarashi và cs., 2006).
Trước đây, hai hợp chất 5, 7-dimetoxy-4-phenylcoumarin và 5, 7-dimetoxy-4p-methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh, thường thu
nhận từ nhiều loài thực vật khác nhau. Nhưng gần đây, Chủng S. aureofciens
CMUAcl30 phân lập từ cây gừng (Zingiber officinale Rose) có khả năng sinh tổng
hợp các hợp chất kháng nấm và chống ung thư như 4-arylcoumarin (5, 7dimethoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin và 5, 7-dimethoxy-4-phenylcoumarin).
Hơn nữa, hoạt chất 4-acrylocoumarin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào
ung thư phổi Lewis (LLC) ở chuột BDF-1, bằng cách tiêm hoạt chất này vào ổ bụng
của chuột. Giá trị ức chế sự tăng trưởng của khối u (T/C treatment-to-control) của
5, 7 dimhoxy1-4-p methoxylphenylcoumarin là 80,8 và 50,0% ở liều 1 và 10 mg/kg,
trong đó 5, 7-dimethoxy-4-phenylcoumarin là 81,6 và 44,9% ở liều 1 và 10 mg/kg.
Hai hợp chất chống ung thư này có độc tính thấp trong đường ruột ở chuột và chỉ
gây độc với các dòng tế bào ác tính và không gây độc tế bào thường (Taechowisan
và cs., 2007).
• Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Ngày nay, nhiều loại thuốc kháng sinh mới được tổng hợp từ XKNS trên cây
dược liệu có khả năng kháng khuẩn, nấm và virus. Năm 2005, Guan và cs đã phân
lập được ba nhóm hoạt chất mới có khả năng kháng khuẩn là p-aminoacetophenic
của 7-(4-aminophenyl)-2,4-dimethyl-7-oxo-hept-5-enoic acid, (9-(4-aminophenyl)-

9
7-hydroxy-2,4,6-trimethyl-9-oxo-non-2-enoic

acid

và

12-(4-aminophenyl)-10-

hydroxy-6-(1-hydroxyethyl)-7,9-dimethyl-12-oxo-dodeca-2,4 dienoic acid từ chủng
S. griseus subsp., nội sinh trên cây ngập mặn (Kandelia candel) (Guan và cs.,
2005). Taechowisan và cs. (2005) đã công bố một số chất có hoạt tính kháng khuẩn
từ chủng S. aureofaciens CMUAc130 nội sinh trên cây gừng (Zinger officinale) như
5,7-dimethoxy-4-(p-methoxy)-phenylcoumarin, 5,7-dimethoxy-4- phenylcoumarin,
vanillin, 3-methoxy-4-hydroxytoluene và các chất kháng sinh kaempferol,
isoscutellarin, umbelliferone và cichorii từ chủng Streptomyces sp. Tc052 nội sinh
trên cây giềng nếp (Alpinia galangal).
1.1.4.

Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu

Năm 1886, chi xạ khuẩn Frankia đã được phân lập từ nốt sần của một cây
không thuộc họ đậu (Okazaki, 2003). Tiếp đó, Baker và cs. (1980) lần đầu tiên phân
lập được XKNS từ rễ cây Elaeagnus umbellate. Như vậy, số lượng XKNS phân lập
được phụ thuộc vào cây thực vật, độ tuổi, loại mô, phân bố địa lý, môi trường sống,
mùa lấy mẫu, cách khử trùng bề mặt, lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy
(Coombs và Franco, 2003; Hallmann và cs., 2006). Theo các công bố, quá trình
phân lập XKNS cần xử lý bề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề

mặt. Thông thường, việc xử lý bề mặt được thực hiện bằng cách xử lý các mô thực
vật với chất oxy hóa hoặc chất khử trùng nói chung trong một khoảng thời gian, sau
đó mô thực vật được rửa với nước cất khử trùng. Các chất khử trùng sử dụng phổ
biến là ethanol (70-95%), NaClO (3-10%) và H2O2. Một số chất hoạt động bề mặt
như tween 20, tween 80 và triton X-100 có thể được thêm vào để tăng hiệu quả khử
trùng bề mặt (Hallmann và cs., 2006). Việc phân lập bao gồm một quy trình ba
bước như được mô tả bởi Coombs và Franco (2003). Qin và cs. (2009) đề xuất quy
trình 5 bước và thêm dung dịch Na2S2O3 sau khi được xử lý bằng NaClO để trung
hòa NaClO dư trên bề mặt thực vật, giúp cho quá trình phân lập không bị ảnh
hưởng bởi chất khử trùng bề mặt. Sau khi xử lý, các mô thực vật có thể được ngâm
trong dung dịch NaHCO3 10% (Nimnoi và cs., 2010). Sau mỗi lần xử lý, phải kiểm
tra xác nhận khử trùng bề mặt để chứng minh rằng các VSV ký sinh trên bề mặt đã


10
được khử trùng hoàn toàn và VSV phân lập được là nội sinh, có thể được chứng
thực bằng cách trang nước rửa cuối cùng vào đĩa môi trường tương tự. Việc bổ sung
các kháng sinh như nalidixic acid và trimethoprim, nystatin hoặc cycloheximide là
cần thiết để ức chế vi khuẩn, nấm nội sinh và nâng cao khả năng phát triển chọn lọc
của xạ khuẩn, vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và nấm (Qin và cs.,
2009).
Li và cs. (2012) áp dụng cách xử lý nhiệt khô và xử lý mẫu thực vật với nitơ
lỏng, đã phân lập được 228 chủng xạ khuẩn từ cây thanh hao hoa vàng (Artemisia
annua L.) trong đó 31 chủng có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, 07 chủng có hoạt
tính amylase mạnh, 10 chủng sinh protease cao, 01 chủng sinh lipase cao và 19
chủng có hoạt tính ức chế sự phát triển của cây lồng vực (Echinochloa crusgalli).
Cùng trên đối tượng cây lồng vực (Echinochloa crusgalli) tại tỉnh Vân Nam, Trung
Quốc, nhóm nghiên cứu đã sử dụng các cách xử lý bề mặt khác và các loại môi
trường khác đã phân lập được 312 chủng XKNS (Qin và cs., 2012). Waheeda và
Shyam (2017) đã phân lập được 32 chủng XKNS trên 3 loại cây: cây húng quế

(Ocimum basillicum), sâm Ấn Độ (Withania somnifera) và cây ba gạc bốn lá
(Rauvolfa tetraphylla).
Các loại môi trường phân lập XKNS đã được mô tả bởi các tác giả về thành
phần môi trường như môi trường tinh bột casein (Küster và Williams, 1964), tinh
bột casein nitrat (SCNA), đậu tương (Williams và Davies, 1965), chitin-vitamin B
(Hayakawa và Nonomura, 1987), môi trường cao nấm men (TWYE) (Qin và cs.,
2009); humic acid vitamin B (HV), cao nấm men casamino acid (YECA), tổng hợp
(Mincer và cs., 2002), Gause cải tiến (Ivantiskaya và cs., 1978) và glycine-glycerol
(Küster, 1959). Machavariani và cs. (2014) đã cải tiến phương pháp phân lập là tiền
xử lý lá với dung dịch heteroauxin và zircon, giúp tăng số lượng XKNS hiếm từ cây
dược liệu. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sử dụng môi trường bổ sung humic acid và
vitamin để phân lập xạ khuẩn hiếm thường cho hiệu quả cao (Tiwari và Gupta,
2013). Bên cạnh đó, một số môi trường được bổ sung amino acid (arginine,
asparagine và proline) làm nguồn nitơ và cellulose, natri propionat, natri succinat và


11
xylan như các nguồn carbon, cũng cho hiệu quả phân lập cao đối với một số loại xạ
khuẩn hiếm (Qin và cs., 2009). Zhao và cs. (2011) đã nhấn mạnh sự cần thiết của
việc sử dụng các phương pháp và môi trường phân lập mới để phát hiện và nghiên
cứu về sự đa dạng của các loài XKNS trên cây dược liệu.
1.2. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu
Như đã đề cập ở trên, XKNS là một trong những nhóm VSV đa dạng và còn ít
được nghiên cứu, có khả năng sinh chất có ích cho cây chủ (Golinska và cs., 2015;
Nalini và Prakash, 2017). Theo quan niệm đó, XKNS có sự đa dạng về thành phần
loài, chi về các taxon và về sinh tổng hợp các hợp chất sinh học. Mức độ đa dạng
XKNS có thể thay đổi giữa các vùng lấy mẫu, các loài thực vật khác nhau và phụ
thuộc vào phương pháp, môi trường phân lập (Qin và cs., 2011; Nalini và Prakash,
2017).
1.2.1.

Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trong các mô thực vật

Dựa trên kết quả phân lập của một số nghiên cứu cho thấy, số lượng XKNS
được phân lập nhiều nhất từ rễ, tiếp theo là thân và ít nhất trong lá (Qin và cs.,
2009; Gangwar và Khushboo, 2014). Sự đa dạng của quần thể XKNS phụ thuộc vào
ba yếu tố chính gồm: loài thực vật, vị trí mô thực vật (rễ, thân, lá) và vị trí địa lý
(khí hậu, độ ẩm, dinh dưỡng) (Nimnoi và cs., 2010; Golinska và cs., 2015).
Taechowisan và cs. (2003) đã phân lập được 330 chủng xạ khuẩn từ 7 cây dược liệu
ở Chiang Mai, Thái Lan, thuộc 4 chi: Streptomyces, Microbispora, Nocardia và
Micromonospora. Verma và cs. (2009) đã phân lập 55 XKNS từ 20 mẫu cây
Azadirachta indica, trong đó chi Streptomyces thường gặp nhất (49,09%), sau đến
là chi Streptosporangium (14,5%), Microbispora (10,9%), Streptoverticillium
(55%), Saccharomonospora (5,5%) và Nocardia (3,6%). Hai mươi sáu cây dược
liệu từ tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc đã phân lập được 60 chủng XKNS, trong đó
thuộc chi Streptomyces chiếm 50% số chủng phân lập, các chủng còn lại thuộc các
chi

Micromonospora,

Oerskovia,

Nonomuraea,

Promicromonospora

và


12

Rhodococcus (Yuan và cs., 2008; Nalini và Prakash, 2017). So với thân và lá, tập
hợp các chủng xạ khuẩn phân loại từ rễ đa dạng hơn.
Các nghiên cứu về số lượng xạ khuẩn trên các bộ phận các loài dược liệu
thường mang lại kết quả trái ngược nhau. Taechowisan và cs. (2003) đã phân lập
được 212 chủng xạ khuẩn ở rễ, 97 chủng ở lá và 21 chủng ở thân, tương tự XKNS
từ cây Azadirachta indica cho số lượng XKNS ở rễ là cao nhất 54,6%, thân và lá
lần lượt là 23,6% và 21,8% Verma và cs. (2009). Nhưng một số nghiên cứu đưa ra
kết quả, XKNS phân lập từ lá là thấp nhất và trong một vài nghiên cứu khác cho
thấy, không có một chủng xạ khuẩn nào được phân lập từ lá (Zhao và cs., 2011;
Akshatha và cs., 2016). Mặt khác một số nghiên cứu phân lập XKNS nhiều nhất từ
thân, đặc biệt trên các mô lớn (Castillo và cs., 2002; Castillo và cs., 2003; BascomSlack và cs., 2009).
1.2.2.

Đa dạng di truyền của xạ khuẩn nội sinh
Sự đa dạng của XKNS trên thực vật rất phong phú được đánh giá từ các

nhóm nghiên cứu trên thế giới tại Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản, Mỹ,
Nga… (Bảng 1.1). Kaewkla và Franco (2013) đã đưa ra sự đa dạng XKNS trên thực
vật tại Úc cho thấy, đã phân lập được trên 500 chủng XKNS, thuộc 16 chi khác
nhau phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và phân tích trình tự gen mã hóa 16S
rRNA, trong đó chi Streptomyces phổ biến nhất (chiếm trên 50% tổng số XKNS
phân lập được). Tuy nhiên, rất nhiều loài mới, hiếm khác được phát hiện thêm như
Microbispora, Microbacterium, Micrococcus, Micromonospora, Rhodococcus,
Streptacidiphilus, Arthrobacter, Dietzia, Herbiconiux, Kitasatospora, Nocardia,
Rathayibacter,

Tsukamurella,

Streptosporangium,

Streptoverticillium,

Verrucosispora, Isoptericola và Kytococcus (Kaewkla và Franco, 2013; Golinska và
cs., 2015). Tại miền Nam Ấn Độ đã phân lập được 135 chủng XKNS từ bốn cây
dược liệu (Cajanus lineatus, Leucas ciliata Benth., Rauwolfia densiflora Benth. và
Gomphostemma heyneanum Wall.) thuộc các chi Streptomyces (68%), Arthrobacter
(15%), Patulibacter (3%), Rhodococcus (9%) và Promicromonospora (5%)