Đề cương ôn tập công nghệ lên men

Đề cương ôn tập công nghệ lên men
I. Giới thiệu các quá trình lên men
1. Khái niệm về quá trình lên men
Lên men là quá trình chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm mới dưới tác dụng của
enzyme do vi sinh vật sinh ra.
2. Khái niệm về enzyme. Các tính chất của enzyme
Khái niệm
Enzyme là những chất xúc tác sinh học có bản chất là protein tự nhiên do các tế bào vi
sinh vật sống sản sinh ra, nhưng hoạt động của enzyme không phụ thuộc vào tế bào.
Các tính chất của enzyme
Phản ứng của enzyme là phản ứng thuận nghịch – phân giải tổng hợp:
enzyme có thể làm gia tăng phản ứng theo chiều thuận cũng như chiều ngược lại.
- Enzyme có tính đặc hiệu – 1 loại liên kết, 1 loại cơ chất nhất định: mỗi enzyme
có tính đặc hiệu chuyên biệt, nó chỉ tác dụng đến một chất hoàn toàn xác định
hoặc trên một khối liên kết hóa học nhất định trong phân tử.
- Năng lượng tiêu tốn thấp – năng lượng hoạt hóa thấp
- Phản ứng bên trong hoặc bên ngoài tế bảo
- Điều kiện phản ứng ôn hòa ở pH, nhiệt độ vừa phải.
3. Các loại sản phẩm lên men
-

Sản phẩm

Ứng dụng

Sinh khối

-

Nấm men
Vi khuẩn

Men bánh mì, men bia
Men Probiotic

Sản phẩm cuối của qt
trao đổi năng lượng

-

Ethanol
CO2
Lactic acid

Bánh mì, rượu, bia
Kefir
Sữa chua, phomat

Sản phẩm trao đổi bậc 1

-

Citric aicd
Acetic acid

Citric acid
Acetic acid (giấm)

Sản phẩm trao đổi bậc 2

-

Kháng sinh

Kháng sinh

4. Các con đường pân giải glucose chủ yếu trong quá trình lên men
Glucose
 Chu trình đường phân


Kỵ khí

Kỵ khí

Pyruvat
Hiếu

Ethanol + CO2

khí

Lactate

+ O2
Acetate CO2 + H2O
II. Động học tăng trưởng của vi sinh vật
5. Phân biệt 4 pha sinh trưởng của vsv
 Pha tiềm phát (pha lag): chưa tăng số lượng, có thể tăng thể tích và khối lượng
- Vi sinh vật thích nghi với môi trường
- Bào tử thấm nước, trương nở và nảy mầm

- Vsv tham gia tổng hợp, hoạt hóa enzyme
- Tích lũy năng lượng chuẩn bị cho giai đoạn sinh sản
- Thời gian tiềm phát tùy vào loài vsv, tuổi giống, lượng và tỷ lệ cấy giống, thành
phần môi trường.
 Pha log (chỉ số): số lượng tăng theo lũy thừa.
 Pha cân bằng: số lượng tế bào mới sinh ra bằng số lượng tế bào chết đi trong cùng
thời gian.
- Tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có tính độc
- Chất dinh dưỡng giảm dần
 Pha suy vong: số lượng tế bào chết đi nhiều hơn số lượng tế bào sinh ra.
- Tích lũy nhiều chất có tính độc
- Cạn kiệt chất dinh dưỡng
6. Phân biệt lên men từng mẻ, liên tục, bán liên tục. Ưu và khuyết điểm của từng pp.
Ứng dụng
 Lên men từng mẻ
- Khái niệm:
Là phương pháp nuôi cấy không liên tục, trong suốt quá trình nuôi cấy không bổ sung
thêm mt dinh dưỡng cũng như không thu hồi sản phẩm trao đổi chất.
 Sing trưởng của vsv diễn ra theo đúng bốn pha: Pha tiềm phát (pha lag), pha chỉ số
(pha log), pha cân bằng, pha suy vong.
-

Ưu điểm:

+ Dễ sử dụng, thời gian ngắn.
+ Thiết bị dễ vận hành, ít xảy ra sự cố.


+ Tạo được các sản phẩm trao đổi bậc 2.
+ Ít khả năng nhiễm khuẩn.

+ Dễ truy xuất nguồn gốc.
-

Khuyết điểm

+ Tuổi giống vsv tăng, có khả năng biệt hóa.
+ Tích lũy các chất có khả năng kìm hãm sinh trưởng và kìm hãm sự tạo thành sản
phẩm.
+ Nồng độ cơ chất ban đầu có thể hạn chế.
+ Sự sai khác giữa các mẻ.
+ Có thể xảy ra sự tự phân.
+ Khó phát hiện do quá trình sinh lý phức tạp.
-

Ứng dụng

Được ứng dụng ở quy mô phòng thí nghiệm để nghiên cứu hoặc ở quy mô lớn để sản
xuất ethanol hay các sản phẩm trao đổi bậc 1 và bậc 2.
 Lên men liên tục
- Khái niệm:
Lên men liên tục là trong quá trình nuôi cấy ngta thu hồi các sản phẩm trao đổi chất
và bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng trong suốt quá trình lên men.
 Sinh trưởng của vsv duy trì ở pha log.
Phương pháp nuôi cấy liên tục:
+ PP đơn cấp: Mt dinh dưỡng mới được thêm vào và mt đã lên men rút ra khỏi nồi lên
men 1 cách liên tục với cùng 1 tốc độ.
+PP nhiều cấp: vsv được nuôi trong nồi lên men nhiều cấp, mt dinh dưỡng mới được
bổ sung vào nồi thứ nhất và từ đó lần lượt chảy vào nồi tiếp theo.
-

Ưu điểm

+ Hiệu suất và tốc độ sinh trưởng cóa thể đạt tối ưu hóa bằng cách điều chỉnh tốc độ
dòng chảy.
+ Có thể sử dụng công nghệ ổn định tế bào.


+ Ảnh hưởng của cá yếu tố đến quá trình sinh lý dễ kiểm soát.
+ Sự tiến hóa cuer giống vsv dễ được nghiên cứu.
-

Khuyết điểm

+ Khó truy xuất nguồn gốc
+ Một số sản có thể không được tối ưu.
+ Khả năng nhiễm khuẩn lớn.
+ Không tại được sản phẩm bậc 2.
+ Có thể xảy ra đột biến hoặc mất tính chất tái tổ hợp.
-

Ứng dụng

Sản xuất sinh khối và một số sản phẩm bậc 1 của quá trình lên men.
 Lên men bán liên tục
- Khái niệm
Bổ sung 1 hoặc nhiều chất dinh dưỡng vào thời điểm nhất định trong quá trình lên
men và thu hồi hoặc không thu hồi sản phẩm.
-

Ưu điểm

+ Ngăn sự kìm hãm do nồng độ cơ chất.
+ Kiểm soát được tốc độ sinh trưởng của vsv và lượng oxy cần thiết.
+ Tăng sản xuất các sản phẩm không liên quan đến giai đoạn sinh trưởng.
+ Giảm độ nhới môi trường.
-

Khuyết điểm

+ Cần hiểu rõ sinh trưởng của vsv và sự tạo sản phẩm.
+ Phụ thuộc tính chính xác của các sensor đo lượng cơ chất.
+ Hệ thống khó vận hành.
7. Các công thức tính toán động học đối với lên men từng mẻ
- Thời gian thế hệ
g=
t: thời gian tính đến thời điểm hiện tại

=>


n: số lần phân chia đến thời điểm hiện tại
-

Số tế bào

N0: số tế bào ban đầu
N: số tế bào bào ở thời điểm hiện tại


-

Sinh khối tế bào

Pha log : X = X0.e.t
Pha cân bằng: X = Y.S0
X0: sinh khối ban đầu
X: sinh khối tế bào ở thời điểm hiện tại
Y: hằng số hiệu suất K (kl chất khô/kl chất dinh dưỡng)
S0:nồng độ chất ban đầu của chất dinh dưỡng hạn chế
=
Sinh trưởng phụ thuộc vào chất dinh dưỡng hạn chế
  = max.

max: hằng số tốc độ sinh trưởng
Ks: hằng số bão hòa (nồng độ cơ chất mà tại đó  = tốc độ sinh trưởng cực đại max)
S >> Ks   = max
S << Ks   = max . S.Ks-1
S: nồng độ chất dinh dưỡng hạn chế (chất dinh dưỡng hạn chế là nồng độ cơ chất
không cho thừa so với nhu cầu của vsv).
Khi  = max, bỏ qua số vsv chết và xem X/X0 = N/N0  max = = 0,693.C
Các nhóm sản phẩm: sinh khối, sp cuối quá trình trao đổi năng lượng, sp bậc 1, sp bậc
2.


+ Phụ thuộc vào quá trình sinh trưởng: rp = .rx
+ Không phụ thuộc vào quá trình sinh trưởng: rp = .X
rp: tốc độ tạo sản phẩm (kg sản phẩm.m-3.h-1)
8. Các yếu tố ảnh hưởng đến đời sống vsv
-

Nhiệt độ:

-

pH

-

Các chất độc

-

Yếu tố sinh học

III. Các loại mt lên men trong công nghiệp
9. Những yêu cầu chung đối với mt lên men
-

Hiệu suất tạo sinh khối/sản phẩm tối đa

-

Tối thiểu sản phẩm không mong muốn

-

Chất lượng đều đặn và sẵn có cả năm

-

Tiết kiệm chi phí

-

Không gây ra các vấn đề cho quá trình thu hồi sản phẩm.

10. Các loại mt cung cấp nguồn C
-

Rỉ đường

-

Dịch kiềm sulfid

-

Tinh bột và cellulose

-

Dầu thực vật

-

Hydrocarbon

11. Các loại mt cung cấp nguồn N
-

Bột đậu tương

-

Nước chiết ngô và cao ngô


-

Nước chiết nấm men và cao nấm men

-

Dịch thủy phân các loại khô dầu

-

Peptone

12. Vai trò của nguồn O2. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ hòa tan của O2 trong mt
-

Vai trò của O2: cung cấp O2 cho các quá trình lên men hiếu khí và cho sự sinh
trưởng và phát triển của vsv hiếu khí.

13. Vai trò của chất phá bọt. Yêu cầu đối với chất phá bọt. Vd chất phá bọt phổ biến
-

Vai trò của chất phá bọt: ngăn ngừa và chống tạo bọt cho dịch lên men.

-

Yêu cầu đối với chất phá bọt:

+ Sức căng bề mặt kém
+ Độ hòa tan thấp trong môi trường có bọt
+ Khả năng khuếch tán trong môi trường lỏng cao
-

Một số chất phá bọt thường được dùng trong công nghiệp lên men như: chất béo
tự nhiên, cồn có mạch carbon cao, các dẫn xuất của sorbitan,....

IV. + VII. Vi sinh vật và quá trình cấy, bảo quản giống vi sinh vật
14. Tiêu chuẩn giống vsv dùng trong lên men
-

Chủng vsv phải thuần, không tạp nhiễm, không dễ bị nhiễm.

-

Dễ nuôi bằng nhiều loại cơ chất.

-

Phải đảm bảo năng suất sản phẩm cao.

-

Không tạo ra các chất không mong muốn.

-

Sản phẩm sinh khối có thể tách dễ dàng ra khỏi môi trường.

-

Bảo đảm đặc tính sinh hóa theo thời gian.

-

Dễ cải thiện để tăng năng suất.


15. Quy trình nhân giống vi khuẩn. Tên các loài vi khuẩn phổ biến trong lên men
Môi trường vô trùng
sử dụng ngay
Thu nhận  hoạt hóa  nuôi cấy
Thu hoạch, cô đặc  bảo quản
Các loài vi khuẩn phổ biến trong lên men:
-

Lactobacillus casei ( kefir, probiotic, acid hữu cơ)
Lb. bulgaricus (acid hữu cơ, sữa chua,…)
Lb. plantarum (dưa ngâm, probiotic, nước mắm)
Leuconostoc cremoris (phomat, bơ)
Sreptococcus thermophilus (Sữa chua, phomat, kefir)

16. Quy trình nhân giống nấm men. Tên các loài nấm men phổ biến trong lên men
Môi trường vô trùng

Thu nhận  hoạt hóa  nuôi cấy  ly tâm, rửa  nấm men dạng lỏng

Ép, định hình

Sấy
Bảo quản
Bao gói
Các loài nấm men phổ biến trong lên men
-

Saccharomyces cerevisiae (sản xuất bánh mì, bia, rượu)


17. Quy trình nhân giống nấm mốc. Tên các loài nấm mốc phổ biến trong lên men
Môi trường 1

Thu nhận  hoạt hóa  nuôi cấy

Hòa bào tử vói nước

nhân giống

sấy

MT2

Cấy truyền

Nhân giống cấp 1
MT3

Nhân giống cấp 2
Các loài nấm mốc phổ biến trong lên men
-

Aspergillus oryzae (sản xuất enzyme, nước chấm)
Rhizopus oligosporus (làm tempeh)
Mucor, Actionomucor (nước chấm, chao)
Peniccilium (tạo vị cho phomat, sản xuất các chất kháng sinh)

18. Lên men lactic đồng hình và dị hình
 Lên men lactic đồng hình
Glucose

Bao gói


Glucose-6-P
Fructose-6-P
Fructose-1,6-bis P
Aldolase

Dihydroxyacetone

Glyceraldehyde
1,3- diphosphoglycerate
3-phosphoglycerate
2-phosphoglycerate
Phosphoenolpyruvate
Pyruvate

Lactate dehydrogenase

Lactate
Acid pyruvic được tạo thành theo chu trình EMP (đường phân) sau đó tạo
thành acid lactic dưới tác dụng của enzyme lactaldehydrogenase, 1 lượng nhỏ
pyruvate bị khử carbon để tạo thành acid acetic, ethanol, CO 2 và acetone. Lượng
nhiều hay ít phụ thuộc vào sự có mặt của O2.

 Lên men lactic dị hình
Glucose
Glucose-6-P


6-phosphogluconate
Ribulose-5-P
Xylulose-5-P
Phosphoketolase

Acetyl phosphate

Glyceraldehyde-3-P

Acetyl-CoA
Acetaldehyde
Acetate

Ethanol

Pyruvate
acetoin

Lactate

Diacetyl
Xảy ra trong trường hợp vi khuẩn lactic không có các enzyme cơ bản của chu trình
EMP (Aldolase và triozophosphatizomerase), vì vậy Xilulose-5-P sẽ được tạo thành
theo con đường pento phosphate (PP). Trong trường hợp này chỉ có 50% lượng đường
tạo thành acid lactic, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác như: acid acetic, ethanol,
CO2. Các sản phẩm phụ tương tác với nhau thành ester có mùi thơm.
19. Các phương pháp bảo quản giống
- Bảo quản trên thạch nghiêng: các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt
độ 3 - 5C. Cấy truyền định kỳ. Người ta thường phủ lên môi trường đã được cấy

-

-

giống một lớp dầu khoáng như Paraffin lỏng để kéo dài thời gian bảo quản và
tránh tạp nhiễm.
Bảo quản trong silicagel, cát hoặc đất vô trùng: cát và đất được xử lý sạch và sàn
lọc qua rây, điều chỉnh pH đạt trung tính, sấy khô và khử trùng. Sau đó trộn bào tử
và cơ chất hoặc đất trong các ống nghiệm. Dùng paraffin quấn quah nắp ống
nghiệm để giúp cho ống giông không bị ẩm trở lại. Cuối cùng bảo quản ống giống
ở -18C.
Bảo quản đông sâu: Trộn huyền phù tế bào vsv với dung dịch nhũ hóa như
Glycerin 10% hoặc DMSO 5%. Sau đó làm lạnh đông đến -40C 1C/phút. Tiếp

-

tục đông đến -90C 10C/phút. Cuối cùng đưa vào bình chứa N2 lỏng để bảo quản.

Bảo quản đông khô: Trộn huyền phù tế bào với Skim milk 20% hoặc trehalose 5%
+ dextran 5%, sau đó làm đông đến -70C trong 1 giờ, tiếp tục đông đến -130C
trong 15’. Cuối cùng đông khô ở -30C trong chân không để bảo quản.

V. Một số sản phẩm lên men truyền thống và hiện đại (Giáo trình)


VI. + VIII. Vấn đề khử trùng, kỹ thuật lên men và thu hồi sản phẩm lên men
20. Các phương pháp khử trùng
Phương pháp

Cách tiến hành

Ứng dụng

Nhiệt

Autoclave 121C

Thiết bị, các loại môi trường
bền nhiệt, các chất phá bọt

Tia cực tím

UV 256nm

Tủ cấy, phòng thí nghiệm

Lọc

Màng lọc 0,22m, bông mỡ, Các loại môi trường không bền
bông thủy tinh, vải lọc, các vật nhiệt, không khí.
liệu đặc biệt.

Hóa chất (ít phổ Phenol và các hợp chất phenol, Các loại môi trường không bền
biến)
alcohol, các halogen, các chất nhiệt.
tẩy
thuốc
nhuộm,
các
ammonium bậc 4, các acid,
kiềm, ethylene oxide,  probilactone formadehyde.
21. Nguyên lý của các phương pháp khu nhận sinh khối
- Phương pháp ly tâm: dựa vào khối lượng riêng.
- Phương pháp lọc: dựa vào kích thước.
- Phương pháp lắng: dựa vào khối lượng riêng và kích thước.

22. Nguyên lý của các PP thu nhận các sản phẩm trao đổi chất. Vật liệu hay tác nhân
được sd trong các PP này
- Sản phẩm được tiết ra môi trường: thu dịch lên men và kết tủa sau đó tinh sạch
Phương
pháp

Trao đổi ion

Lọc gel

Nguyên
lý

Dựa vào phản ứng trao đổi Dựa
vào
ion.
thước.

Vật liệu

Cation resin

Anion resin

Sắc ký ái lực
kích Dựa vào ái lực giữa
hai chất.

Phức
dextran Agarose, Cellulose,
và Dextrose
và
Sulfonic acid, Amine bậc (Sephadex
Carboxylic
2, bậc 4, Sephacryl), phức Polyacrylamide.
agarose


acid,
Phosphonic
acid.
Tách các hợp

chất
mang
Ứng dụng
điện
tích
dương.
-

Amonium
bậc 4.

(Sepharose).

Tách
các Tinh sạch vacine.
hợp
chất
mang điện
tích âm.

Tinh sạch enzyme,
kháng thể và các
protein.

Phá vỡ tế bào
Vật lý

Hóa học

Sinh học

Đồng hóa áp suất Acid, kiềm, các Enzyme (lysozyme)
cao 1200 bar
chất tẩy (SDS,
Lạnh đông_tan giá triton X-100…)
Tác nhân

Nghiền
3mm)

bi

(0,1- Amonium bậc 4

Tạo áp suất thẩm
thấu cao
Ứng dụng

Tinh sạch enzyme và một số protein