Phân lập gen mã hóa enzyme GDP d mannose 3’ 5’ epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin c từ cây quýt miền núi phía bắc việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ KIM CHI

PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA
ENZYME GDP-D-MANNOSE-3’.5’- EPIMERASE
LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C
TỪ CÂY QUÝT MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

\

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ KIM CHI

PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA
ENZYME GDP-D-MANNOSE-3’.5’- EPIMERASE
LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C
TỪ CÂY QUÝT MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM
Ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm

THÁI NGUYÊN - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sư
hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi
rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và
chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018
Tác giả

Nguyễn Thị Kim Chi

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã
tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công
trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Di truyền &
Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi
trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn các cán bộ Phòng DNA ứng dụng, Phòng thí nghiệm
Trọng điểm công nghê gen, Viện Công nghê sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghê Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi tiến hành các thí nghiệm
của đề tài.
Tôi xin cảm ơn sư động viên, khích lê của gia đình và bạn bè trong suốt

thời gian học tập và thực hiện đề tài luận văn.
Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh và cao học
của
Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm
- Đại học Thái Nguyên.

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018
Tác giả

Nguyễn Thị Kim Chi

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................ii
MỤC LỤC ..........................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...................................................iv
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3
1.1. Phân loại thực vật học và đặc điểm sinh học của cây quýt ..........................
3
1.1.1. Phân loại thực vật học cây quýt................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây quýt ................................................................

3
1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của quả quýt ....................................................... 4
1.2. Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid và một số gen, enzyme tham
gia tổng hợp ascorbic acid ở thực vật ..................................................................
6
1.2.1. Ascorbic acid ............................................................................................. 6
1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vitamin C ......................................................... 7
1.3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền
....... 11
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................
17
2.1. Vật liêu, hóa chất và thiết bị .......................................................................
17
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................. 17
3


2.1.2. Hóa chất và thiết bị ..................................................................................
17
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................
17
2.2.1. Phương pháp thu mẫu ..............................................................................
17

4


2.2.2. Phương pháp xác định trình tư gen.......................................................... 17
2.3. Phương pháp xử lý số liêu .......................................................................... 22
2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn ............................................ 22

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 23
3.1. Nhân bản và giải trình tư gen GDP-D từ DNA của giống quýt BS-LS ..... 23
3.1.1. Kết quả nhân bản gen GDP-D bằng kỹ thuật PCR ................................. 23
3.1.2. Kết quả tách dòng gen GDP-D................................................................ 24
3.1.3. Đặc điểm của trình tư gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS......... 25
3.2. Sư đa dạng về trình tư nucleotide và trình tư amino acid suy diễn của
gen GDP-D ........................................................................................................ 30
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 34
1. Kết luận.......................................................................................................... 34
2. Đề nghị........................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 35

iv


DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

bp

base pair

CIAA

24 Chloroform: 1 isoamylalcol

CTAB

Cetyl trimetyl amomnium bromide

DEPC

Diethyl Pyrocarbonate

DNA

Deoxyribonucleotide acid DNTPs

Deoxynucleotide triphosphate GDP-D
GDP-D-mannose-3’.5’-epimerase kb
kilo base
NCBI

National Center for Biotechology Information

PCR

Polymerase Chain Reaction

TAE

Tris - Acetate - EDTA

4


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1.

Thành phần phản ứng PCR nhân gen GDP-D ............................. 19

Bảng 2.2.

Chu kì nhiêt của phản ứng PCR nhân gen GDP-D ....................... 19

Bảng 2.3.
20

Thành phần phản ứng gắn gen GDP-D vào vector tách dòng pBT.....

Bảng 2.4.

Thành phần phản ứng colony - PCR ............................................. 21

Bảng 3.1.

Những vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tư nucleotide
của gen GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946................. 27

Bảng 3.2.

Những vị trí amino acid sai khác giữa hai trình tư protein suy
diễn của gen GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946........ 29

Bảng 3.3.
30

Trình tư gen mang mã số trên GenBank được sử dụng phân tích....

Bảng 3.4.

Hê số tương đồng và hê số phân ly của trình tư nucleotide của gen
GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS và các trình tư trên
GenBank ........................................................................................ 31

Bảng 3.5.

Hê số tương đồng và hê số phân ly của BS-LS và các trình tư
trên GenBank dựa trên trình tư amino acid suy diễn của gen
GDP-D........................................................................................... 32

5


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình1.1.

Các dạng Ascorbic acid trong tư nhiên .......................................... 7

Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp Ascorbic acid
............................................. 8
Hình 3.1.

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số của mẫu quýt
BS-LS với cặp mồi GDP-D-F và GDP-D-R................................. 23

Hình 3.2.

Hình ảnh điện di sản phẩm colony -PCR từ khuẩn lạc ................ 24

Hình 3.3.

Đặc điểm trình tư nucleotide của mẫu BS-LS thu được bằng
máy xác định trình tư nucleotide tư động ..................................... 25

Hình 3.4.

Kết quả so sánh trình tư nucleotide của gen GDP-D phân lập từ
giống quýt BS-LS với trình tư gen GDP-D trên GenBank mang
mã số HQ224946................................................................. 27

Hình 3.5. Kết quả phân tích sư tương đồng giữa trình tư nucleotide của
gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với một số trình tư
gen đã công bố trên GenBank ....................................................... 28
Hình 3.6.

Kết quả so sánh trình tư amino acid suy diễn từ gen GDP-D
phân lập từ giống quýt BS-LS và từ gen GDP-D mang mã số
HQ224946 trên GenBank.............................................................. 29

Hình 3.7.

Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hê của BS-LS với các trình tư đã
công bố trên GenBank dựa trên trình tư nucleotide của gen GDPD........................................................................................... 31

Hình 3.8.

Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hê của BS-LS với các trình tư
đã công bố trên GenBank dựa trên trình tư amino acid suy diễn
của gen GDP-D ............................................................................. 32

6


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây quýt (Citrus recutilata Blanco) là giống cây ăn quả được nhiều
người biết đến với vị ngọt thanh, mùi thơm đặc trưng, chứa nhiều vitamin,
khoáng chất và dinh dưỡng cần thiết cho con người. Quýt được khuyến khích
sử dụng hằng ngày bởi các chuyên gia dinh dưỡng.
Quýt không chỉ là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng mà còn đóng vai trò
tích cực trong phát triển kinh tế ở nhiều địa phương.Trồng quýt đem lại thu
nhập cao cho các hộ làm vườn so với các cây nông nghiệp khác, trung bình từ
80 - 100 triệu đồng/ha/năm.
Cây quýt được trồng lâu đời ở miền núi phía Bắc Việt Nam có sư thích
nghi sinh thái ở diện hẹp, do đó đòi hỏi khá kỹ tính về điều kiện canh tác, nông
hóa thổ nhưỡng hay tiểu vùng khí hậu. Điều này dễ nhận thấy mỗi loại quýt chỉ
trồng phù hợp trên một địa bàn đặc hữu với các giống thường gặp như quýt sen
(Phú Thọ), quýt hồng (Hà Giang), quýt đường (Lào Cai), quýt Quang
Thuận (Bắc Kạn), quýt Bắc Hà (Lào Cai), quýt giấy (Tuyên Quang), quýt Bắc
Sơn (Lạng Sơn) [4].
Quả quýt chứa hàm lượng vitamin C cao, khoảng 30mg- 36mg vitamin C
trong 100gram quả. Vitamin C tốt cho tóc, da, tiêu hóa, hê thống miễn dịch và
cân bằng trọng lượng cơ thể. Mỗi giống quýt lại có hàm lượng vitamin C khác
nhau, điều này ảnh hưởng đến mùi vị, độ chua ngọt của mỗi giống quýt.
Nghiên cứu đặc điểm trình tư các gen tham gia tổng hợp vitamin C, và
tìm hiểu sư đa dạng của trình tư các gen này ở các giống quýt địa phương là

cơ sở đề xuất sử dụng đa dạng hóa trong việc chọn giống cho vùng trồng chuyên
canh.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Phân lập gen
mã hóa enzyme GDP-D-mannose-3’.5’- epimerase liên quan đến tổng hợp
vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt Nam.”
1


2. Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá được đặc điểm trình tư gen liên quan đến tổng hợp vitamin C ở
mẫu quýt khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Khuếch đại, tách dòng và xác định trình tư gen liên quan đến tổng
hợp vitamin C ở mẫu quýt miền núi phía Bắc.
3.2. So sánh trình tư gen, trình tư amino acid suy diễn của enzyme liên
quan đến tổng hợp vitamin C ở mẫu quýt nghiên cứu với một số trình tư đã
công bố trên GenBank.


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phân loại thực vật học và đặc điểm sinh học của cây
quýt
1.1.1. Phân loại thực vật học cây
quýt
Cây quýt có tên khoa học là Citrus recutilata Blanco (tên khác: Citrus
suhuiensis Hort. ex Tanaka hoặc: Citrus deliciosa Tennre) [6], [11]. Quýt thuộc
chi Cam chanh (Citrus), họ Cam quýt (Rutaceae), bộ Cam quýt (Rutales).
Tập đoàn quýt trồng khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam được xác định
với nhiều giống quýt (Variele) trong loài Citrus recutilata Blanco với bộ nhiễm

sắc thể 2n = 18, quýt mang những đặc tính đặc trưng của chi quả có múi Citrus
ở đặc điểm có các túi chứa tuyến dầu và hoa lưỡng tính, thu phấn nhờ sâu bọ
[11].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây
quýt
Cây quýt có tuổi thọ trung bình từ 20 - 50 năm, trong đó thời kỳ cho thu
hoạch quả tập trung khoảng 15 - 25
năm.
Quýt là cây thân gỗ, thường xanh, thiết diện tròn, màu nẫu thâm, cao 23m, hình dạng ngoài của cây thường có hình chóp, thân cây có gai, phần trong
vỏ cây chứa nhiều túi tiết tinh dầu thơm. Cây trồng bằng hạt thường có một gốc
lớn, cây trồng bằng cành chiết thì có nhiều cành gốc.
Quýt có rễ cọc khỏe , lan rộng, rễ phát triển tối ưu ở nhiệt độ 10-37oC,
khi nhiệt độ cao hơn hay thấp hơn cộng với độ ẩm của đất là 1% thì sư phát
triển của rễ sẽ ngừng lại hoặc tỷ lê oxy trong đất từ 1,2 -1,5% thì rễ cũng ngừng
phát triển.
Lá quýt là đơn mọc cách, không có eo lá, trên lá chứa nhiều túi tiết dầu
thơm, dưới dạng điểm, có thể quan sát được bằng mắt thường khi soi qua ánh


sáng cường độ đủ lớn. Lá thay nhau rụng trong lúc lá mới xuất hiện nên cây lúc
nào cũng xanh lá.
Hoa quýt được hình thành ở nách lá, có cấu tạo là hoa cụm, lưỡng tính,
cánh hoa rời nhau, hoa mẫu bốn, trong hoa thường có đĩa mật, một đặc
điểm


thích nghi với thu phấn nhờ sâu bọ. Đài hoa gồm các mảnh dính nhau ở phía
dưới làm thành đài hợp hình đấu. Nhị hoa có số lượng gấp ba đến bốn lần cánh
hoa (do sư phân nhánh), chỉ nhị dính thành nhiều bó. Bộ nhụy đôi, một đầu vòi
và một đầu nhụy với nhiều lá noãn dính lại thành bầu trên, nhiều ô, mỗi ô

tương ứng với số lá noãn đính tru giữa. Kích thước hoa khi nở trung bình từ 0,2
- 0,25 cm. Cây quýt miền Bắc ra lộc đầu tiên vào tháng 2 hoặc tháng 3 hằng
năm, phần lớn sinh cành cho quả, đợt 2 vào tháng 5 và tháng 6 ra hoa, đợt 3 vào
tháng 7 và tháng 8 đợt lộc này sinh ra cành khỏe dài, lá to màu nhạt. Trong
các lứa ra hoa thì lứa hoa tháng 2 và tháng 3 là tốt nhất.
Quả quýt là quả mọng với ba lớp vỏ, lớp vỏ ngoài chứa các túi dầu, lớp
vỏ giữa trắng xốp (cùi), vỏ quả giữa mỏng dai, phía trong có nhiều lông đơn
bào chứa nhiều nước mà người ta thường gọi là “tép”.
Sư sinh trưởng của quả quýt trải qua các giai đoạn: Giai đoạn ra hoa hình
thành quả (từ tháng 12 đến giữa tháng 3 năm sau), rụng quả sinh lý đợt một
(cuối tháng 4), rụng quả sinh lý đợt hai (đầu tháng 6), quả chắc xanh (cuối
tháng 8) và cho thu hoạch (đầu tháng 10 đến tháng 1 năm sau).
Quả quýt có hình dẹt (trừ quýt chum), vỏ màu vàng và mỏng, trọng lượng
của quả đạt khoảng 35 gam đến 145 gam. Vị quả ngọt sắc, chua nhẹ đặc biệt có
hương thơm đậm, đặc trưng rất dễ phân biệt với bất kỳ quả trong nhóm cây ăn
quả có múi khác. Quả trung bình có từ 8 đến 16 múi, số hạt trung bình của quả
giao động từ 10 đến 40 hạt. Hạt quýt có 2 lá mầm, đa phôi hay đơn phôi, hạt có
2 lớp màng vỏ, màng ngoài cứng do thấm nhiều li gnin, màng trong mỏng.
Hạt thường chín cùng quả, nảy mầm ở nhiệt độ từ 10 -30oC, nhiệt độ tối ưu
là 25-30oC [14].
1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của quả
quýt
Trong quả quýt có nhiều chất dinh dưỡng, vitamin, khoáng chất cần thiết
cho con người, đặc biệt chứa vitamin C giúp chống lại một số bênh tật, tăng
cường sức đề kháng. Mỗi 100 gram quả quýt có thành phần dinh dưỡng gồm:


87,6 gram nước; 1,104 mg carotene - một loại vitamin chống oxy hóa, 30mg
vitamin C, 93mg kali, 26 mg canxi, 9mg magnesium, 0,3g chất xơ, 4,5 mg
natri, 7mg Chromium, 20mg phốt pho, 0,32 mg sắt và giá trị năng lượng là 48

kcal, protein chiếm 0,6 %, lipid chiếm 0,4 %, đường khoảng 8,6 %...Trong đó,
tinh dầu vỏ quýt (có tên thương phẩm là Mandarin oil), là chất lỏng màu vàng
đỏ có huỳnh quang xanh nhẹ. Thành phần chính tinh dầu vỏ quýt là limonen
(hơn 90 %), methylan - thranilat (1 %).
Trong quýt ngoài vitamin C, chất khoáng thì còn có một lượng chất xơ.
Chất xơ khi vào ống tiêu hóa sẽ trương lên do hút nước trong ruột, giúp cặn bã
của quá trình tiêu hóa dễ dàng thải ra ngoài. Chất xơ khi vào ruột kết hợp với
đường và acid tạo thể đông có tác dụng làm chậm quá trình hấp thu một số chất
dinh dưỡng từ đó làm lượng đường trong máu tăng vừa phải, duy trì ở mức cần
thiết, nhờ đó mà cơ thể không thừa đường, không chuyển hóa thành mỡ dư thừa
dư trữ ở các mô gây béo phì.
Quả quýt không chứa chất béo hay cholesterol nhưng chứa nhiều vitamin
C. Quả quýt được chứng minh có tác dụng chống viêm, chống khối u, ức chế
đông máu và chống oxy hóa mạnh. Trên thực tế, hàm lượng vitamin C chỉ
chiếm 15 - 20% tổng số các chất kháng oxy hóa trong quả, trong khi những hợp
chất khác có khả năng chống oxy hóa cao gấp 6 lần vitamin C đó là hesperidin
từ flavanoid có nhiều trong lớp vỏ xơ trắng, màng bao múi của quả và một
lượng nhỏ trong tép [14].
Ăn cam quýt còn giúp chữa lành các vết thương nhanh hơn bởi vitamin
C đảm nhiêm vai trò quan trọng trong cơ thể để sản xuất collagenprotein chịu
trách nhiêm tạo ra các mô liên kết, giúp vết thương, vết cắt hay xước da mau
lành, thiếu hụt collagen khiến các tế bào trong mạch máu thiếu sư gắn kết, cho
phép máu rò rỉ trong các mô, cơ quan dễ dẫn đến chảy máu nướu răng và xuất
hiện đốm màu đỏ đặc trưng của bệnh Scorbut [28].


Quả quýt có vị chua tính ấm. Người bị cao huyết áp, bệnh mạch vành,
đau dạ dày, suy dinh dưỡng, cơ thể suy nhược sau khi ốm ăn quýt rất tốt. Vỏ
quýt khô gọi là trần bì, có tính ấm, có tác dụng làm khỏe dạ dày, long đờm, trị
ho, trị phong, lợi tiểu, chữa ợ hơi, đau thượng vi. Y học đã chứng minh, tinh

dầu thơm trong vỏ quýt có tác dụng hưng phấn tim, ức chế vận động của cơ dạ
dày, phòng xuất huyết. Vỏ quýt còn dùng để điều trị cao huyết áp, nhồi máu cơ
tim, có tác dụng tốt đối với các chứng bệnh đầy bung, rối loạn tiêu hóa, kém ăn,
buồn nôn, ho nhiều đờm. Hạt quýt có vị đắng tính bình, vào hai kinh can và
thận, có tác dụng kiện tì, lý khí, táo thấp hóa đờm. Lá quýt vị đắng tính bình,
vào đường can kinh, có tác dụng trợ gan, hành khí, tiêu thủng, tan u cục, chữa
đau mạn sườn, sa nang, u cục ở vú [29].
1.2. Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid và một số gen, enzyme tham
gia tổng hợp ascorbic acid ở thực vật
1.2.1. Ascorbic acid
Ascorbic acid (vitamin C) có nhiều trong cây xanh, rau quả, đặc biệt
trong chanh, cam, bưởi, quýt, bắp cải và trong thịt, nhất là ở cây hồng gai và
một số giống ớt đỏ (có thể đạt tới 1% - 2 % khối lượng khô). Lần đầu tiên
vitamin C được tách chiết từ chanh, cam vào năm 1920. Đến năm 1933, vitamin
C được điều chế thành công bằng con đường tổng hợp hóa học không cần phải
tách chiết từ thực vật. Ngày nay, vitamin C được biết tồn tại trong tư nhiên
dưới dạng khử (L. ascorbic acid) và dạng oxy hoá (dehydroascorbic acid). Tuy
nhiên, dạng oxy hóa không phổ biến bằng dạng khử. Cả hai dạng đều tan trong
nước, dễ bị phân huỷ khi tiếp xúc với các chất oxy hoá hoặc bazơ. Cả hai dạng
khử và dạng oxy hoá đều có hoạt tính sinh học và đều tồn tại trong các dịch cơ
thể. Hoạt tính của vitamin C chủ yếu là do nhóm endiol của axit ascorbic, vì
nhóm này làm nhiêm vu tham gia vận chuyển hydro [25].


(- C ===== C -)
|

|

OH

OH

Dạng khử (L. ascorbic acid)

Dạng oxy hoá
(dehydroascorbic acid)

Hình1.1. Các dạng ascorbic acid trong tư nhiên [19]
So với các vitamin khác, vitamin C là chất duy nhất không có ở dạng
phức hợp với các nucleotide hoặc coenzym. Đặc tính cơ bản của ascorbic acid
là tác dụng khử.
Đặc tính này để định lượng vitamin C khi cho nó tác dụng với một chất
có màu, rồi xác định bằng phương pháp so màu.
Trong cơ thể người hoàn toàn không tư tổng hợp được vitamin C mà phải
lấy từ các nguồn thức ăn bên ngoài vào. Vitamin C dễ tìm, có nhiều ở rau quả.
Trong cơ thể, vitamin C có nồng độ khác nhau ở mô và thể dịch, nơi nào chuyển
hoá mạnh nhất thì nồng độ vitamin C ở đó cao nhất.
1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vitamin
C
Nghiên cứu về cơ chế tổng hợp vitamin C ở thực vật gần đây được công
bố năm 1998 bởi Steven Clarke tại phòng thí nghiệm UCLA (University of
California, Los Angeles, Hoa Kỳ). Theo ông, các nghiên cứu từ năm 1998 đến
nay đã xác minh được phần lớn cơ chế này, mặc dù gen thực hiện bước thứ
bảy(g) trong sơ đồ hình 1.2 trong tổng số 10 bước chuyển hóa glucose thành
vitamin C được đề xuất vẫn còn là một ẩn số và đang tiếp tục nghiên cứu.
Quá trình nghiên cứu bắt đầu từ việc tìm ra vai trò của một gen có trong
loài giun C. elegans, một loài giun nhỏ được nhà nghiên cứu Tara Gomez từ
phòng thí nghiệm UCLA của Clarke sử dụng làm mẫu vật để nghiên cứu quá

trình lão hóa. Trình tư sắp xếp của gen cho thấy nó có mối quan hê với một
họ gen bị biến đổi trong bệnh ung thư.
Sư cộng tác từ nhiều phòng thí nghiệm đã khám phá ra điểm tương đồng
trong gen của loài giun này với sản phẩm là gen GDP-L-galactose
phosphorylase (GGP hay VTC2) của một loài cải dại có tên Arabidopis
thaliana, một loại thực vật hoang dại mà bộ gen của chúng đã được biết rõ.
Trước đây, các nhà khoa học đã tìm thấy mối tương quan giữa những đột biến
trong gen của loài thực vật này với hàm lượng vitamin C thấp. Chính vì thế,
một số nghiên cứu hiện nay tập trung vào việc xác định cách mà sản phẩm của
gen này góp phần vào quá trình
tổng hợp vitamin C [26].

Mạng lưới nội chất
hạt, polysacarit và
glycoprotein thành tế
bào

Ty thể

Quan điểm hiện tại về Sinh học thực vạt


Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid, Nicholas Smirnoff (2000)
[21]


Steven Clarke tái hiện lại bước thứ 7(g) trong hình 1.2, một ẩn số trong
suốt một thời gian dài, trong quá trình tổng hợp vitamin C trong phòng thí
nghiệm, một phản ứng mà được miêu tả là bước khơi mào. Sau đó, so sánh 6

bước đầu tiên của quá trình tổng hợp vitamin C với một bản đồ gồm nhiều quá
trình chuyển hóa từ đường glucose đến các hợp chất tế bào mà có thể xảy ra.
Tuy nhiên, một khi sản phẩm của bước (f) là một hợp chất có tên GDP-Lgalactose có thể thoát ra ở nơi có mặt gen VTC2 thì các nguyên tử sẽ được hoàn
thiện cấu trúc để hướng đến việc tổng hợp vitamin C, đặc biệt là tạo ra một số
các loại vitamin khác. Enzyme VTC2 đã được biểu hiện và tinh chế từ vi khuẩn.
Tác giả và nhóm nghiên cứu đã chứng minh được rằng gen VTC2 chịu trách
nhiệm ở bước (g), bước mà các nhà nghiên cứu đã tìm kiếm rất lâu trong quá
trình tổng hợp vitamin C. Bởi vì, các enzyme xúc tác cho các bước thực hiện
khơi mào trong quá trình tổng hợp cho thấy các vị trí điều hòa sinh học nên các
nhà nghiên cứu hi vọng khám phá này có thể đưa đến những chiến lược mới khi
mong muốn của con người là tăng hàm lượng vitamin C trong cây trồng thực
vật [21].
Trên cây ăn quả có múi, khi so sánh hàm lượng vitamin C giữa cam và
quýt (Citrus unshiu Marc và Citrus sinensis Osb.) của Trung Quốc, Xiao Y.
Y. và cs (2011) đã chỉ ra hàm lượng vitamin C ở cam nhiều hơn so với quýt.
Đồng thời tìm ra 4 gen mã hóa cho 4 loại enzyme (GDP-D-mannose-3’.5’epimerase; GDP-L- galactose-pyrophosphatase; L-galactose dehydrogenase và
L- galactono - 1,4 - lactone dehydrogenase) liên quan đến con đường hình
thành ascorbic acid trong quả. Các tác giả đã giải mã thành công gen mã hóa
GDP-D-mannose-3’.5’- epimerase (mã số HQ224946) liên quan đến hoạt động
của enzyme ascorbate oxidase và ascorbate peroxidase. Khi quả chín, sư có mặt
của GDP-D-mannose3’.5’-epimerase đã góp phần nâng cao hàm lượng vitamin C của cam nhiều hơn
1,5 lần so với quýt [21].


Cũng theo Xiao – Y.Y. và cs (2011), gen mã hóa GDP-D-mannose-3’.5’epimerase tìm thấy trên Citrus unshiu (một loài cam ngọt), gen có tổng chiều
dài


1086 bp. Gen mã hóa quy định trình tư phân tử protein GDP - D - mannose 3’.5’- epimerase với 361 amino acid. GDP - D - mannose - 3’.5’- epimerase
điều phối vào quá trình hoạt hóa từ enzyme GDP - D – manose thành GDP - L galactose, bước chuyển hóa (e) trong hình 1.2 trên con đường sinh tổng hợp

ascorbic acid ở thực vật được công bố trên GenBank với mã số HQ224946
[22].
Nghiên cứu của Xiao – Y. Y. và cs (2011) cũng đã chỉ ra rằng, trên gen
hình thành 03 vùng để quy định bảo toàn chức năng protein gồm: (1) Vùng
được đặt tên “M1P -guanylylT_B_like_N”, từ vị trí amino acid thứ nhất đến
234, quy định enzyme pyrophosphorylase GDP – mannose một trong số các
enzyme tham gia trực tiếp trong chu trình hình thành ascorbic acid; (2) Vùng có
tên “LbetaH - LbH”, từ vị trí amino acid thứ 256 đến 335, mã hóa enzyme
acyltransfase liên quan đến sư chuyển hóa ion trong tế bào; và (3) Vùng “other”
từ vị trí amino acid thứ 303 đến 330, vị trí hình thành sư liên kết giữa các chuỗi
polypeptide [22], [21].
Cũng theo Junjie T. và cs (2018) ascorbic acid phổ biến đóng một vai trò
quan trọng trong sư phát triển của cây trồng và khả năng chịu stress phi sinh
học, nhưng nồng độ ascorbic acid rất khác nhau giữa các cây khác nhau.
GDP-D- mannose epimerase (GDP-D), xúc tác GDP-D-mannose đến GDP-galactose hoặc GDP-

L

L

-gulose, là một enzyme quan trọng trong con đường

sinh tổng hợp ascorbic acid thực vật. Các chức năng và mô hình biểu hiện
của GDP-D đã được nghiên cứu kỹ trong các công trình trước đó, tuy nhiên, ít
thông tin được biết về các mô hình tiến hóa của gen. Trong nghiên cứu này, cấu
trúc gen GDP- D , các mô hình protein được bảo tồn tương ứng và các mối
quan hê tiến hóa đã được phân tích một cách hê thống. Tổng số 111trình tư gen
GDP-D được lấy từ
59 bộ gen thực vật, đại diện cho hầu như tất cả các dòng chính của thực vật
xanh: dicotyledons, monocotyledon, thực vật hạt trần, pteridophytes, bryophytes

và chlorophytes. Kết quả cho thấy rằng homologs của GDP-D đã có mặt rộng


rãi trong thực vật xanh. Cấu trúc gen GDP-D được bảo thủ ở cây cao hơn, trong
khi


rất đa dạng trong các phân nhóm cơ bản của phylogeny bao gồm lycophytes,
bryophytes và chlorophytes, cho thấy cấu trúc gen GDP-D có thể đã trải qua
sư phân hóa sâu sắc ở thực vật thấp hơn và sau đó dần dần cố định như sư tiến
hóa của thực vật. Các trạng thái cơ bản của GDP-D được bảo tồn mạnh mẽ
trong thực vật xanh, cho thấy chức năng bảo tồn của protein. Một vài nhánh
và địa điểm được lựa chọn và hầu hết các nhánh nằm trong phân nhóm
chlorophyte, cho thấy sư lựa chọn đa dạng ở một số nhánh và địa điểm có thể
đóng vai trò trong sư phát triển của GDP-D và đa dạng hóa sư lựa chọn giai
đoạn đầu của thực vật xanh. Kết quả này cung cấp thông tin chi tiết mới về bảo
tồn chức năng và sư phát triển của GDP-D[23].
Nghiên cứu của Gilbert L. và cs (2009) đã sử dụng các dòng cà chua biến
đổi gen đã được RNAi-slienced cho GDP-D, qua đó xác nhận rằng GDP-D thực
sư đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa sinh tổng hợp ascorbate
trong thực vật. Ngoài ra, các dòng cà chua chuyển gen biểu hiện các khuyết tật
tăng trưởng ảnh hưởng đến sư phân chia tế bào và sư phát triển tế bào. Một tính
năng đáng chú ý hơn nữa của cây chuyển gen là sư mong manh và mất độ
săn chắc của trái cây. Phân tích thành phần thành tế bào của lá và phát triển quả
cho thấy hàm lượng monosaccharide thành tế bào được thay đổi trong các dòng
chuyển gen, đặc biệt là những liên kết trực tiếp với hoạt động của GDP-D như:
mannose và galactose. Khi được xem xét cùng nhau, những phát hiện này cho
thấy mối liên hê mật thiết giữa sinh tổng hợp polysaccharide của ascorbate
và tế bào không chứa cellulose trong thực vật, giúp giải thích các yếu tố phổ
biến trong các đặc điểm không liên quan như độ cứng trái cây và hàm lượng

ascorbate[24].
1.3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di
truyền
Nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền được các nhà nghiên cứu sử dụng
bằng nhiều phương pháp khác nhau, mỗi phương pháp cung cấp các loại
thông tin khác nhau. Việc lựa chọn phương pháp đánh giá phu thuộc vào mục