Xác định tỷ lệ nhiễm escherichia coli o157h7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại hà nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM ESCHERICHIA COLI O157:H7 TRONG THỊT
BÒ BÁN Ở MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM TẠI HÀ NỘI, NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT
KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG ĐẶC HIỆU

PHẠM THỊ TÂM

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC THÚ Y


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề
tài
Vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm ở Việt Nam đang được Chính phủ và
hầu hết các Ngành, các cấp và người tiêu dùng quan tâm. Gần đây báo chí
thường xuyên lên tiếng phản đối việc sử dụng hormone, kháng sinh, thuốc
bảo vệ thực vật không đúng mục đích và không phù hợp với các qui định, gây
ảnh hưởng nguy hiểm đến sức khoẻ con người. Việc phát hiện thấy chất sudan
trong lòng đỏ trứng gà, melamin trong sữa, kim loại nặng gấp nhiều lần so với
ngưỡng quy định là những hồi chuông cảnh báo cho sự mất an toàn của thực
phẩm đang lưu hành tại Việt Nam. Theo số liệu thống kê của Cục Vệ sinh An
toàn Thực phẩm – Bộ Y Tế, năm 2010 cả nước đã xảy ra 132 vụ ngộ độc thực
phẩm với 4.676 người mắc bệnh, 3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp
tử vong. Nguyên nhân chính là do vi khuẩn (Salmonella, Streptoccocus, E.
coli Staphylococcus); do độc tố tự nhiên và hóa chất) [2].
E.coli O15:H7 là một trong các chủng vi khuẩn nguy hiểm gây ngộ độc
thực phẩm ở nhiều quốc gia trên thế giới với các hội chứng: tiêu chảy, viêm

ruột xuất huyết, urê huyết (Haemolytic ureamic syndrome-HUS). Thịt bò và
các sản phẩm chế biến từ bò là những loại thực phẩm có nguy cơ cao nhiễm
vi khuẩn E.coli O15:H7. Theo báo cáo của Griffin P.M, (1995) [47], 3,7%
mẫu thịt bò ở vùng Nam Mỹ nhiễm vi khuẩn E.coli O15:H7. Ở Châu Á,
E.coli O157:H7 đã được phát hiện ở Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia
(Yamada, 1993) [144], (Son Radu, 1998) [133]. Ở Việt Nam, vi khuẩn này
được phát hiện thấy trong phân bò với tỷ lệ 2% (Norobu và cộng sự, 2005)
[90]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu của các tác giả trong nước đã phát hiện
thấy các gen độc tố điển hình của vi khuẩn E.coli O157:H7 trong thịt bò, thịt
lợn, phân bò, phân lợn với tỷ lệ mẫu nhiễm khá cao (Phạm Công Hoạt và
cộng sự, 2003) [3], (Trần Thanh Phong và cộng sự, 2007) [5].


Như vậy, với điều kiện chăn nuôi kém vệ sinh và đặc biệt là điều kiện
giết mổ mất vệ sinh, thiếu kiểm soát như hiện nay ở Việt Nam thì nguy cơ
nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 vào các loại thực phẩm và gây ngộ độc thực
phẩm cho người tiêu dùng là rất dễ xảy ra.
Với mục đích xác định sự có mặt của vi khuẩn này trong thịt bò để chủ
động trong công tác phòng, điều trị bệnh ngộ độc thực phẩm và sản xuất
kháng thể đơn dòng phục vụ chế tạo kit xác định nhanh vi khuẩn, chúng tôi
tiến hành thực hiện đề tài: “ Xác định tỷ lệ nhiễm Escherichia coli O157:H7
trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất
kháng thể đơn đòng đặc hiệu”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Xác định được tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số
địa điểm tại Hà Nội;
- Sản xuất được kháng thể đơn dòng đặc hiệu của vi khuẩn E.coli
O157:H7.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1 Ý nghĩa khoa học

- Việc xác định được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 và các đặc
tính sinh hóa cũng như độc lực của vi khuẩn này sẽ là cơ sở để xác định dịch
tễ học của hội chứng ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn này gây ra, từ đó tạo cơ
sở để xây dựng các biện pháp phòng ngừa quá trình ô nhiễm thực phẩm và
điều trị bệnh do vi khuẩn này gây nên.
- Đề tài đã đưa ra được quy trình chế tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu
với vi khuẩn E.coli O157:H7 có thể ứng dụng để sản xuất các kit chẩn đoán
huyết thanh học xác định vi khuẩn này.


3.2 Ý nghĩa thực tiễn
- Đề tài đã xác định được sự có mặt của vi khuẩn E.coli O157:H7 trong
thịt bò bán ở Hà Nội và một số vùng phụ cận, đồng thời chứng minh được
khả năng gây bệnh của các chủng này.
- Đề tài đã chế tạo được 2 kháng thể đơn dòng đặc hiệu 100% với vi
khuẩn E.coli O157:H7. Hai kháng thể này đã được sử dụng trong nghiên cứu
tạo phức hợp kháng thể và hạt nano silica để phát hiện số lượng vi khuẩn
E.coli O157:H7 do Viện Công nghệ sinh học chủ trì thực hiện.
- Việc xác định được vi khuẩn E.coli O157:H7 và sản xuất kháng thể
đơn dòng phục vụ chế tạo kit phát hiện vi khuẩn sẽ góp phần tích cực trong
công tác đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm.
4. Những đóng góp mới của đề tài
Kết quả của đề tài hoàn toàn mới ở Việt Nam, với các lý do:
- Đề tài được thực hiện với đối tượng là vi khuẩn E.coli O157:H7
nhiễm trong thịt bò và đặc tính gây điển hình. Kết quả của đề tài là minh
chứng đầu tiên cho sự có mặt của vi khuẩn này trong thịt bò ở Hà Nội và các
vùng phụ cận.
- Lần đầu tiên ở Việt Nam chế tạo được kháng thể đơn dòng đặc hiệu
của vi khuẩn E.coli O157:H7 để ứng dụng vào quy trình xác định vi khuẩn
trong thực phẩm và chẩn đoán cho bệnh nhân ngộ độc thực phẩm.

Ch−¬ng I. Tæng quan tµi liÖu
1.1 Vi khuÈn E.coli g©y bÖnh
Escherichia coli (E.coli) là vi khuẩn thường trú trong đường ruột của
người và động vật máu nóng. Hầu hết các chủng E.coli là vô hại. Tuy nhiên,
do sự suy giảm miễn dịch hoặc có sự tổn thương ở niêm mạc đường tiêu hoá
mà ngay cả các chủng E.coli thông thường cũng có thể gây bệnh. Với các
chủng gây bệnh, vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể thông qua bề mặt màng
nhày niêm mạc hoặc da và gây nên 3 hội chứng lâm sàng chủ yếu, bao gồm: i)
nhiễm khuẩn đường tiết niệu, ii) nhiễm trùng huyết hoặc viêm màng não, và
iii) viêm ruột, tiêu chảy.
Theo thống kê của James Nataro và cộng sự, (1998) [53], các chủng vi
khuẩn E.coli gây bệnh được chia thành 5 nhóm ( phụ lục bảng 1).
+ Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): gồm các chủng E.coli gây
viêm ruột, tiêu chảy ở trẻ em dưới 2 tuổi (Polotsky và cộng sự, 1977) [106].
+ Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): gồm các chủng E.coli tiết ra 2
độc tố ruột bền nhiệt (heat stable toxin- ST) và độc tố ruột không bền nhiệt
(heat-labile enterotoxin- LT). Trong ®ã, độc tố LT hoạt hóa men adenyl
cyclase trong tế bào ruột làm gia tăng yếu tố C.AMP (cyclic adenozin 5’
-

monophosphat). Yếu tố này sẽ kích thích ion Cl và bicarbonat tách ra khỏi tế
+

bào đồng thời ức chế Na bên trong tế bào, gây hiện tượng kéo nước từ tế bào,
mô vào lòng ống tiêu hóa và hậu quả là gây tiêu chảy mất nước. Còn độc tố
ST hoạt hóa men guanyl cyclase làm tăng yếu tố C.GMC (cyclic guanosin 5’
monophosphat) bên trong tế bào dẫn đến kích thích bài tiết muối và nước gây
ra tiêu chảy. Những chñng E.coli có cả 2 loại nội độc tố LT và ST sẽ gây

ra tiêu chảy trầm trọng và kéo dài (Levine và cộng sự, 1987) [70].


+ Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): những chñng E.coli này
bám lên niêm mạc và làm bong tróc gây loét niêm mạc do đó gây tiêu
chảy lẫn máu (giống triệu chứng bệnh lỵ do vi khuẩn Shigella) (DuPont và
cộng sự, 1971) [35].
+ Nhóm EAEC (Enteroaggregative E.coli): là nhóm E.coli gây tiêu
chảy nhưng không sản sinh độc tố (Cravioto và cộng sự, 1979) [29].
+ Nhóm EHEC: là nhóm E.coli gây tiêu chảy xuất huyết, đại diện là vi
khuẩn E.coli O157: H7. Vi khuẩn này gây bệnh ở người với các triệu chứng
cấp tính như: tiêu chảy cấp, xuất huyết đường tiêu hoá, phân có lẫn máu, gây
hội chứng ure huyết (HUS-Haemolytic Uraemic Syndrome), trường hợp
nghiêm trọng có thể gây tử vong. 85-95% các ca bệnh nhiễm E.coli O157:H7
là có biểu hiện hội chứng urê huyết (Riley và cộng sự, 1983) [119].
E.coli O157:H7 là vi khuẩn duy nhất thuộc loài E.coli duy nhất gây ngộ
độc thực phẩm ở người. Theo ước tính của CDC, (1999) [26], hàng năm số ca
nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 tại nước này chiếm khoảng 20.000 người,
trong đó, khoảng 250 trường hợp tử vong. Nguyên nhân của tình trạng ngộ
độc này là do E.coli O157:H7 nhiễm trong nước uống, rau xanh, thịt bò và
các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ bò.
Theo các tác giả Faith và cộng sự, (1996) [39], Hancock và cộng sự,
(1994) [48], tỷ lệ E. coli O157:H7 trên gia súc non lớn hơn ở gia súc trưởng
thành. Còn theo nghiên cứu của Doyle và cộng sự, (1997) [34] cho biết: E.
coli O157:H7 có mặt trong 3,7% mẫu thịt bò bán lẻ, 1,5% mẫu thịt lợn, 1,5%
mẫu thịt gà, 2% mẫu thịt cừu. Bên cạnh đó, các nghiên cứu khác của Le Saux
và cộng sự, (1993) [68], cũng chứng minh rằng vi khuẩn E. coli O157:H7
nhiễm trong thịt bò tái, sữa tươi và bánh humburger là nguyên nhân gây nhiều
vụ ngộ độc thực phẩm ở Mỹ và Canada. Ngoài ra, người ta cũng đã xác định
được sự có mặt của vi khuẩn này ở sốt mayonaire (Griffin, 1995) [47], nước

hoa quả chưa thanh trùng (Besser và cộng sự, 1993) [14], (Mc Carthy, 1996)
[78] và rau sống (Morgan, 1988) [83].
Ở Việt Nam, mặc dù chưa có báo cáo về số trường hợp ngộ độc thực
phẩm do E.coli O157:H7, tuy nhiên, theo báo cáo của Noboru và cộng sự,
(2005) [90], 2/100 mẫu phân bò nuôi tại Việt Nam có mặt vi khuẩn này. Theo
một số các nghiên cứu ở trong nước của tác giả như: Phạm Công Hoạt và
cộng sự, (2003) [3] đã xác định được 8/33 mẫu phân lợn tiêu chảy nhiễm độc
tố Stx của vi khuẩn E.coli O157:H7. Còn trong nghiên cứu của tác giả Trần
Thanh Phong và cộng sự, (2007) [5], các gen độc tố đặc trưng của vi khuẩn
E.coli O157:H7 như Stx1, Stx2, eae, hly, stb được phát hiện thấy trong thịt bò,
thịt lợn, phân bò, phân lợn bình thường và tiêu chảy với tỷ lệ tương đối cao,
cụ thể: có tới 50% mẫu phân bê tiêu chảy, 57,1% mẫu phân bò bình thường,
55,9% mẫu thịt bò mang 1 đến 8 gen độc lực đặc trưng của nhóm EHEC; còn
trên lợn thì có đến 33,3% mẫu phân lợn con tiêu chảy, 62,5% mẫu phân lợn
con cai sữa tiêu chảy, 20% mẫu phân lợn bình thường, 24,5% mẫu thịt lợn
mang 1 đến 8 gen độc lực đặc trưng của nhóm EHEC.
1.2 Các đặc tính của vi khuẩn E.coli O157:H7
1.2.1 Đặc tính sinh học
1.2.1.1 Đặc điểm hình thái
E.coli O157: H7 là trực khuẩn hình que ngắn, bắt màu gram âm, kích
thước tế bào khoảng 2x0,5µm, không hình thành nha bào, có lông và roi, có
khả năng di động. Khuẩn lạc vi khuẩn dạng S, tròn trơn, bóng, có lớp màng
bao bọc, gắn chặt trên bề mặt môi trường thạch, khuẩn lạc có màu nâu nhạt
trên môi trường thạch Sorbitol MacConkey(SMAC).
1.2.1.2 Đặc tính nuôi cấy


Khác với hầu hết các chủng E.coli khác, E.coli O157:H7 không lên

men đường D-sorbitol, do đó, môi trường thạch Sorbitol MacKonkey được sử
dụng làm môi trường đặc hiệu để phân biệt vi khuẩn này (March và cộng sự,
1986) [77]. Trên môi trường SMAC, vi khuẩn E.coli O157:H7 có màu vàng
nâu nhạt trong khi các chủng vi khuẩn E.coli khác có màu hồng cánh sen.
Theo Thompson, (1990) [139], E.coli O157:H7 không sinh enzyme glucuronidase, do

đó trên

môi

trường

có bổ sung cơ

chất 4-

methylumbelliferyl--D-glucuronide (MUG), vi khuẩn này không phát quang,
trong khi các vi khuẩn E.coli khác lại có khả năng đó. Vì vậy, người ta có thể
phân biệt được khuẩn lạc E.coli O157:H7 trên môi trường thạch MUG dưới
ánh sáng tử ngoại.
Ngoài ra, khuẩn lạc E.coli O157:H7 có thể phân biệt được trên môi
trường Rainbow Agar O157 (Biolog Inc., Mỹ) hoặc Fluorocult E.coli O157
(Merck, Đức). Trên môi trường thạch Fluorocult® khuẩn lạc của vi khuẩn này
có màu xanh nhạt trong khi các E.coli khác có màu vàng. Còn trên môi trường
thạch Rainbow, khuẩn lạc vi khuẩn E.coli O157 có phổ màu đen, xám, đỏ,
xanh, tím.
1.2.1.3 Sức đề kháng
+ Nhiệt độ: khả năng thích ứng với nhiệt độ của vi khuẩn E.coli nhóm
EHEC, bao gồm cả chủng E.coli O157:H7 tương tự với các nhóm khác. Theo
Doyle và cộng sự, (1984) [32], chủng vi khuẩn này bị ức chế ở điều kiện trên

0

44 C. Tuy nhiên, Palumbo và cộng sự, (1995) [99] lại cho biết, khả năng thích
ứng với nhiệt độ của E.coli O157:H7 phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy:
trong môi trường BHI (Brain Heart Infusion), vi khuẩn này vẫn phát triển tốt
0

ở nhiệt độ 45 C, còn với môi trường EC (E.coli) thì chúng lại bị ức chế ở
0

nhiệt độ 44 C. Theo Buchanan và cộng sự, (1994) [21], Rajkowski và cộng


sự, (1995) [108], nhiệt độ tối thiểu cho sự sinh trưởng của vi khuẩn E.coli
0

O157:H7 là khoảng 8-10 C.
+ Độ pH: theo Buchanan và cộng sự, (1992) [20], pH thích hợp cho vi
khuẩn E.coli O157:H7 là 5,5-7,5. Vi khuẩn này bị ức chế mạnh ở mức pH
4,0-4,5, tuy nhiên ảnh hưởng của pH tới sự phát triển của vi khuẩn còn phụ
thuộc vào các yếu tố có liên quan khác như: thời gian, nhiệt độ nuôi cấy, loại
axit, nồng độ axit sử dụng để chuẩn độ môi trường (Leyer và cộng sự, 1995)
[71]. Còn theo nghiên cứu của Benjamin và cộng sự, (1995) [13], Buchanan
và cộng sự, (1996) [22], các chủng vi khuẩn thuộc nhóm EHEC có khả năng
0

chịu được độ pH 2,5 trong 2-7 giờ ở 37 C. Trong các loại thực phẩm lên men
như nước ép trái cây, pho mát, E.coli O157:H7 có thể tồn tại sau vài tháng.
Tuy nhiên, khả năng sống sót của vi khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào thời gian
bảo quản, ví dụ: trong nước ép hoa quả vi khuẩn có thể tồn tại từ 2-3 ngày ở

0

0

25 C, nhưng ở 8 C, vi khuẩn chỉ tồn tại từ 10-30 ngày (Zhao và cộng sự,
1993) [148].
+ Khả năng chịu mặn: theo Buchanan và cộng sự, (1994) [22], vi
khuẩn E.coli O157:H7 có thể chịu được nồng độ muối từ 0,5-5%.
1.2.2 Đặc tính sinh hoá
Kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E.coli O157:H7 được thực hiện
sau bước nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu SMAC. Các khuẩn lạc
có màu vàng nâu nhạt được cấy chuyển lên môi trường thạch LB (Luria
0

Agar), sau 18 giờ nuôi cấy ở 42 C, thu nhận các khuẩn lạc đứng riêng rẽ để
làm các phản ứng sinh hóa như trong bảng 1.1.


Bảng 1.1 Các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn E.coli O157:H7 ( Samuel
và cộng sự, 1998) [122]
Phản ứng
β-Glucuronidase
Sorbitol
Salicin
Esculin
Arginine dihydrolase
Adonitol
Inositol
Cellobiose
Urease

Citrate
KCN
Sucrose
Glucose (acid)
Glucose (gas)
Indol
Arabinose
Trehalose
Mannitol
Lactose
Maltose
Rhamnose
Xylose
Lysine decarboxylase
Ornithine decarboxylase
Raffinose
Dulcitol

Kết quả phản ứng
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+

Ghi chú: (-): âm tính; (+): dương tính


10

Phản ứng không lên men đường D-sorbitol được thực hiện trên môi
trường SMAC. Trên môi trường này, vi khuẩn E.coli O157:H7 có màu vàng
nâu nhạt trong khi các chủng vi khuẩn E.coli khác có màu hồng cánh sen.
Phản ứng âm tính -glucuronidase của vi khuẩn E.coli O157:H7 được
thực hiện với môi trường có bổ sung cơ chất 4-methylumbelliferyl--Dglucuronide (MUG). Vi khuẩn này không sản sinh enzyme -glucuronidase
vì vậy không thủy phân 4-methylumbelliferyl--D-glucuronide thành 4methylumbelliferone và glucuronide vì vậy khi quan sát khuẩn lạc vi khuẩn
E.coli O157:H7 dưới ánh sáng đèn tử ngoại, ta không nhìn thấy hiện tượng
phát quang do 4-methylumbelliferone.
Các phản ứng lên men đường lactose, glucose, sinh H2S và sinh hơi
được thực hiện trên môi trường thạch KIA (Kligler Iron Agar). Trên môi
trường này, vi khuẩn E.coli O157:H7 gây hiện tượng lên men đường lactose
tạo nên màu vàng ở phần thạch nghiêng, lên men đường glucose tạo màu
vàng ở phần thạch đứng. Vi khuẩn này không sinh H2S nên không tạo màu
đen trong ống thạch.
Phản ứng sinh indol được thực hiện bằng thuốc thử Kovac. Vi khuẩn
E.coli O157:H7 được tăng sinh trong môi trường Tryptone Water Buffer ở
0

37 C trong 20 giờ rồi bổ sung 1ml xylen vào ống canh khuẩn, lắc đều để chiết
tách indol lên lớp dung môi hữa cơ, sau đó nhỏ 1-2 giọt Kovac có chứa pdimethylaminobenzaldehyde vào ống canh khuẩn. Vi khuẩn E.coli O157:H7

sản sinh enzyme tryptophanase vì vậy sẽ phân giải tryptophan có trong môi
trường Tryptone Water Buffer để tạo thành indol. Vì vậy, khi nhỏ thuốc thử
Kovac vào canh khuẩn, indol sẽ kết hợp với p-dimethylaminobenzaldehyde
để tạo thành phức hợp có màu đỏ hồng trên bề mặt ống nghiệm.


1.2.3 Đặc tính gây bệnh
Bệnh do vi khuẩn E.coli O157:H7 được coi là bệnh truyền lây giữa
người và gia súc. Vi khuẩn này ký sinh trong đường ruột của bò, hươu, cừu vì
vậy nó có thể nhiễm vào tất cả các loại thực phẩm, thức ăn, nước uống có tiếp
xúc với phân nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, E.coli O157:H7 không gây bệnh cho
các loài gia súc này.
Ở người, E.coli O157:H7 là một serotype thuộc loài E.coli có khả năng
gây ngộ độc thực phẩm, xuất huyết và phù thũng ở màng nhầy niêm mạc ruột
(Griffin, 1990) [46]. Các triệu chứng bệnh do vi khuẩn này thường xuất hiện
sau hai ngày nhiễm khuẩn (phụ lục hình 1). Biểu hiện ban đầu ở bệnh nhân
thường không tiêu chảy nhưng có cảm giác đau quặn bụng và sốt nhẹ. Sau
khoảng 24-48 giờ, bệnh nhân tiêu chảy mạnh, đau bụng và mất nước. Trong
một số trường hợp, bệnh nhân xuất hiện hội chứng urê huyết. Sau 1 tuần mắc
bệnh, bệnh nhân có biểu hiện da dẻ nhợt nhạt, xuất huyết các mạch máu ngoại
vi, giảm tiểu cầu, giảm đi tiểu, phù thũng, suy thận cấp (Moake, 1994) [82].
Theo Tarr, (1995) [138], 10% bệnh nhi dưới 10 tuổi có hội chứng urê huyết
(HUS) do vi khuẩn E.coli O157:H7, trong đó, tỷ lệ tử vong là 3 - 5%, khoảng
12- 30% số đó xuất hiện các di chứng suy thận, tăng huyết áp, thần kinh, tiểu
đường, đột quỵ.
1.2.4 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli O157:H7
1.2.4.1 Độc tố Shiga toxin- Stx
Stx được chia thành 2 loại chính, không gây miễn dịch chéo cho nhau,
đó là Stx1 và Stx2, mỗi chủng vi khuẩn E.coli O157:H7 mang một hoặc cả hai
loại độc tố này. Trong đó, Stx1 có tính ổn định cao, còn Stx2 được chia thành

nhiều nhóm phụ khác nhau như: Stx2c, Stx2v, Stx2vhb, Stx2e. Stx2e gây phù
thũng chủ yếu trên lợn.


Trên thực tế, Stx còn được phát hiện thấy ở các chủng gây bệnh đường
tiêu hoá như: V.cholerae, V.parahaemolyticus, Campylobacter jejuni, E.coli
K-12, và một số chủng E.coli khác (O’Brien và cộng sự, 1987) [91]. Ở dạng
nguyên mẫu, Stx có trọng lượng phân tử là 78 kDa, chứa 2 tiểu phần A và B,
trong đó, tiểu phần A là một phân tử protein có trọng lượng phân tử là 32 kDa
được phân ly thành 2 chuỗi peptide nhỏ là A1 có trọng lượng 28 kDa (mang
hoạt tính enzyme) và A2 có trọng lượng 4 kDa, hai mảnh peptide này liên kết
với nhau bởi các cầu nối disulfua. Phần B có trọng lượng phân tử là 7,7 kDa
chứa 5 liên kết đặc hiệu với điểm thụ cảm globotriaosylceramide (Gb) trên bề
mặt của tế bào vật chủ. Khi độc tố gắn lên màng tế bào, chúng được thẩm
thấu qua các hốc tế bào rồi đi vào hệ thống golgi và lưới nội chất (Sandvig và
cộng sự, 1994) [123], phần A gắn với tiểu phần 60S của ribosom và ức chế
quá trình tổng hợp protein của tế bào vật chủ (hình 1.1). Kết quả là gây gián
đoạn quá trình tổng hợp protein và gây chết các tế bào biểu mô đường tiết
niệu, đường tiêu hoá hoặc các tế bào có chứa Gb3, Gb4. Loài thỏ không có
yếu tố này trên bề mặt tế bào biểu mô ruột nên vi khuẩn E.coli O157:H7
không gây tiêu chảy và các triệu chứng liên quan tới ngộ độc thực phẩm.
Trong đường tiêu hoá, độc tố Stx có thể gây tổn thương hoặc làm chết
các tế bào lông nhung trên biểu mô ruột (Kandel và cộng sự, 1989) [55],
(Keenan và cộng sự, 1986) [61]. Để chứng minh khả năng gây bệnh đường
tiêu hoá của độc tố Stx, Sjogren và cộng sự, (1994) [130] đã sử dụng chủng vi
khuẩn E.coli RDEC-1 gây bệnh tự nhiên trên thỏ với triệu chứng tiêu chảy
không có máu lai với thực khuẩn thể mang gen Stx cho thỏ uống. Kết quả thí
nghiệm cho thấy, thỏ cho uống chủng vi khuẩn lai có biểu hiện bệnh tích nặng
hơn rất nhiều so với thỏ uống chủng tự nhiên E.coli RDEC-1 với các triệu
chứng như: thay đổi huyết áp, phù thũng, xuất hiện nhiều đám tổn thương trên

niêm mạc đường tiêu hóa.


Còn đối với hội chứng urê huyết, các chủng E.coli O157:H7 gây tiêu
chảy lẫn máu thường kèm theo hội chứng này hơn các chủng gây tiêu chảy
thông thường (Griffin, 1995) [47]. Bằng gây nhiễm thực nghiệm tiêm độc tố
Stx1 và Stx2 cho thỏ cho thấy: ở các mô, cơ quan có nhiều điểm thụ cảm Gb3
như ruột non, hệ thần kinh trung ương xuất hiện các đám tổn thương lớn
(Barrett và cộng sự, 1989) [12]. Còn ở thận, do thận thỏ không chứa các điểm
thụ cảm Gb3 nên không xuất hiện tổn thương (Boyd và cộng sự, 1989) [17].
Đối với con người, Gb3 có nhiều trên ống tiết niệu, vì vậy, dưới tác động của
độc tố Stx, các tế bào biểu mô cầu thận căng phồng, tổn thương, có hiện tượng
lắng đọng tiểu cầu, hình thành các sợi tơ trong các tế bào cầu thận (Boyd và
cộng sự, 1989) [17]. Sự tổn thương tế bào biểu mô cầu thận dẫn tới giảm khả
năng lọc của thận, đây chính là nguyên nhân của hội chứng suy thận cấp, biểu
hiện điển hình của HUS. Trên thực tế, Stx2 gây hội chứng urê huyết phổ biến
hơn Stx1 (Boyd và cộng sự, 1989) [17], theo Pickering, (1994) [105] các
chủng E.coli O157:H7 mang độc tố Stx2 thường gây tình trạng HUS mạnh
hơn các chủng chỉ mang độc tố Stx1 hoặc cả hai loại độc tố này.

Hình 1.1 Cấu trúc của độc tố Stx và cơ chế gây bệnh


1.2.4.2 Độc tố east1 (eaec)
Theo Savarino và cộng sự, (1996) [124], tất cả các chủng E.coli
O157:H7 đều mang gen eastA mã hoá nên độc tố east1 (phụ lục hình 2). Khả
năng gây bệnh của độc tố này chưa được xác định nhưng độc tố này đã được
tìm thấy trong phân của một số bệnh nhân tiêu chảy.
1.2.4.3 Enterohemolysin (hly)
Ở vi khuẩn E.coli O157:H7, độc tố hly được mã hoá bởi gen nằm trên

plasmid 60 mDa (phụ lục hình 2) (Schmidt và cộng sự, 1995) [127]. Theo
Beutin và cộng sự, (1994) [15], ở Đức, có khoảng 90% chủng E.coli O157:H7
sinh độc tố Stx có mang gen mã hoá độc tố hly. Vai trò của độc tố này vẫn
chưa được xác định rõ, tuy nhiên, khả năng dung giải hồng cầu và giải phóng
heme cùng sắc tố hemoglobin của độc tố này giúp cho E.coli O157:H7 phát
triển tốt hơn trên môi trường thạch máu.
1.2.4.4 Yếu tố bám dính
Yếu tố bám dính của E.coli O157:H7 là OPM intimin có trọng lượng
phân tử từ 94-97 kDa được mã hoá bởi gen eae. Trên lợn con, E. coli
O157:H7 gây tổn thương dạng A/E ở ruột già với đặc điểm bám dính điển
hình của vi khuẩn lên các tế bào biểu mô. Bên cạnh đó, các tác giả Ashkenazi,
(1992) [8], Fratamico, (1993) [43] cũng cho thấy E.coli O157:H7 còn sản sinh
yếu tố bám dính fimbriae, tuy nhiên các tác giả trên chưa xác định được gen
mã hoá yếu tố này.
1.2.4.5 pO157 plasmid
Theo Schmidt và cộng sự, (1994) [126], 1996 [128] hầu hết các chủng
E.coli O157:H7 đều chứa plasmid pO157 có kích thước từ 93.6-104 kb, trên
đó có các gen: gen mã hoá độc tố hly có trọng lượng 3.4 kb, gen mã hóa
enzyme catalase-peroxidase (KatP), enzyme protease phân hủy serine (EspP).


Trong đó, EspP là một protein ngoại bào có khối lượng phân tử 104 kDa, có
khả năng tách các nhân tố làm đông máu và gây độc đối với các tế bào thận.
Đây là một trong các tác nhân tác động bổ trợ gây nên hội chứng urê huyết
(Brunder, 1996) [20].
1.3 Nguồn tàng trữ vi khuẩn E.coli O157:H7
* Ở bò: Vi khuẩn E.coli O157:H7 có mặt trong thịt, sữa tươi, sữa chua,
phomat do sự tạp nhiễm của vi khuẩn này từ phân bò trong quá trình giết mổ,
bảo quản, chế biến. Theo Zhao và cộng sự, (1995) [149], tỷ lệ nhiễm E.coli
O157:H7 ở bê nhiều hơn bò trưởng thành, tuy vậy vi khuẩn này lại không gây

bệnh ở bò (Brown và cộng sự, 1997) [18]. Nhóm tác giả này đã tiến hành
kiểm tra phân của 965 con bò sữa và 11.881 con bò thịt ở Mỹ, kết quả cho
thấy tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong các mẫu phân của bò sữa là 3,2% và
2

5

bò thịt là 1,6%, với cường độ nhiễm dao động từ 10 -10 CFU/1g phân. Tại
Việt Nam, theo số liệu của Noboru và cộng sự, (2005) [90], 2/100 mẫu phân
bò nuôi tại khu vực Hà Nội có chứa vi khuẩn E.coli O157:H7. Theo báo cáo
của Faith và cộng sự, (1996) [39], Meng và cộng sự, (1995) [79], có nhiều
hơn 1 chủng E. coli O157:H7 trong phân của một cá thể hoặc các cá thể trong
một đàn.
* Ở hươu: Theo báo cáo của Keene và cộng sự, (1997) [62]; Rice và
cộng sự, (1995) [118]; Doyle và cộng sự, (1987) [33] khi nghiên cứu về tính
tương đồng giữa các chủng E.coli O157:H7 ở bệnh nhân nhiễm khuẩn do ăn
thịt bò tái nuôi tại khu vực có hươu và đã xác định được hươu tham gia vào
chuỗi truyền lây vi khuẩn với vai trò là nguồn tàng trữ. Trong báo cáo này,
các tác giả còn cho biết, E.coli O157:H7 đã được phát hiện thấy trong phân và
các mảnh cắt của sừng hươu.
* Ở cừu: Theo nghiên cứu của Kudva và cộng sự, (1996) [67], cừu là
nguồn mang vi khuẩn E.coli O157:H7 mặc dù chúng không bị bệnh do vi


khuẩn này. Khả năng bài thải E.coli O157:H7 qua phân cừu phụ thuộc theo
mùa, trong đó mùa hè có 31% mẫu phân dương tính, mùa thu là 5,7%, còn
mùa đông thì không phát hiện mẫu dương tính.
* Ở nước sinh hoạt: Theo Doyle và cộng sự, (1987) [33], nước là
nguồn tàng trữ vi khuẩn E.coli O157:H7 và là nguyên nhân trực tiếp gây bệnh
cho người. Theo báo cáo của Faith và cộng sự, (1996) [39] thì nước cũng

chính là nguồn gây nhiễm vi khuẩn này cho trâu bò.
1.4 Các phương pháp chẩn đoán, xác định vi khuẩn
E.coli O157:H7 là vi khuẩn gây bệnh cho con người nhưng có nguồn
gốc từ gia súc và các sản phẩm thực phẩm, vì vậy, phải có các hệ thống chẩn
đoán, xác định vi khuẩn riêng cho người và động vật (Banatvala và cộng sự,
1996) [10], (Baqui và cộng sự, 1992) [11]. Về nguyên tắc chung, việc chẩn
đoán, xác định vi khuẩn thường dựa trên 3 yếu tố: i) vi khuẩn trong mẫu bệnh
phẩm hoặc thực phẩm; ii) kháng thể kháng O157 hoặc H7; iii) độc tố hoặc các
gen độc tố.
1.4.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn
* Môi trường tăng sinh: thường sử dụng môi trường Peptone Water
Buffer có bổ sung kháng sinh vancomycin 8 mg/lít, cefuroxim 10 mg/lít và
cefixime 0.05 mg/lít để ức chế các vi khuẩn gram âm khác như: Aeromonas
spp., Proteus spp.; hoặc môi trường Modified Trypticase Soy Broth (mTSB)
bổ sung novobiocin 20 mg/lít và acriflavin 10 mg/lít; hoặc môi trường E.coli
Broth bổ sung novobiocin 20 mg/lít. Điều kiện tăng sinh là khác nhau với các
0

đối tượng mẫu khác nhau, cụ thể: mẫu phân bò tăng sinh ở 37 C/6 giờ, mẫu
0

0

thịt tăng sinh ở 41-42 C trong 6 giờ, mẫu sữa tăng sinh ở 41-42 C trong 24
giờ. Trong trường hợp mật độ vi khuẩn quá ít, người ta có thể sử dụng
phương pháp miễn dịch từ tính đồng thời với quá trình tăng sinh. Về nguyên
lý, phương pháp từ tính sử dụng các hạt nam châm được phủ kháng thể đặc


hiệu với kháng nguyên O157. Trong quá trình tăng sinh, nếu có mặt của vi

khuẩn E.coli O157 thì dưới tác dụng của từ trường, chúng sẽ bị thu hút và gắn
lên hạt nam châm.
* Môi trường phân lập đặc hiệu: khác với các chủng vi khuẩn E.coli
khác, E.coli O157:H7 không có khả năng lên men đường sorbitol và không có
enzyme beta-glucuronidase. Dựa và hai đặc điểm này, người ta sử dụng các
môi trường đặc hiệu cho vi khuẩn, bao gồm: i) thạch SMAC có bổ sung Dsorbitol 1%, rhamnose 0.5% hoặc potassium tellurite 0,25% và cefixime 0.05
mg/lít. Trên môi trường này, vi khuẩn E.coli O157:H7 có màu vàng nâu nhạt
do không lên men đường sorbitol; hoặc ii) môi trường thạch MUG có chứa 4methylumbelliferyl-beta-D-glucuronide. Trên môi trường này, vi khuẩn E.coli
O157:H7 không phát quang khi quan sát dưới tia tử ngoại.
Phương pháp phân lập vi khuẩn trong mẫu phân phụ thuộc vào thời
gian nhiễm khuẩn. Theo Tarr và cộng sự, (1990) [137], thời gian lấy mẫu
phân bệnh nhân nghi nhiễm E.coli O157:H7 là 2 ngày sau khi bắt đầu có triệu
chứng tiêu chảy, lúc này tỷ lệ phát hiện đạt 100%, còn nếu lấy mẫu sau 3-6
ngày hoặc sau 6 ngày thì tỷ lệ phát hiện chỉ còn 91.7 - 33.3%.
1.4.2 Phương pháp miễn dịch học
Các phương pháp này chủ yếu sử dụng để phát hiện kháng nguyên
O157 (kháng nguyên thân có bản chất lipopolysacharide) và H (kháng nguyên
lông có bản chất protein). Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại KIT chẩn
đoán hai loại kháng nguyên này. Tuy nhiên, CDC, (1999) [26] khuyến cáo
nên sử dụng các loại kit latex phát hiện kháng nguyên O157 của các hãng
Oxoid, Richmond Hill, Remel và kit latex phát hiện kháng nguyên H7 của
Remel. Bên cạnh đó, phương pháp ELISA cũng cho hiệu quả chẩn đoán cao,
theo Park và cộng sự, (1996) [101], phương pháp này cho độ nhạy lớn hơn
phương pháp nuôi cấy, phân lập. Tuy vậy, tác giả này cũng cho rằng, kết quả


dương tính ELISA chỉ là cơ sở để tiếp tục thực hiện các phản ứng khác như:
kiểm tra độc tố, PCR hoặc nuôi cấy để kết luận sự có mặt của vi khuẩn.
Ngoài ra, FDA cũng khuyến cáo sử dụng kit sandwich ELISA của hãng
Meridian Diagnostics, Inc. để phát hiện độc tố Stx1 và Stx2 của vi khuẩn

E.coli O157:H7. Phản ứng này sử dụng kháng thể đa dòng kháng Stx và các
kháng thể đơn dòng kháng Stx1, Stx2, vì vậy phản ứng cho phép phát hiện độc
tố trong mẫu vi khuẩn nuôi cấy, mẫu thực phẩm, mẫu phân (trích theo
Acheson và cộng sự, 1994) [7]. Theo Kehl và cộng sự, (1997) [63], kit ELISA
trên có độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng là 100% và 99,7%, trong khi đó,
các giá trị này của phương pháp nuôi cấy trên thạch SMAC chỉ đạt 60% và
100%.
1.4.3 Phương pháp phát hiện độc tố
Phản ứng này dùng để phát hiện độc tố Stx dựa trên khả năng gây bệnh
tích trên tế bào Vero (Karmali, 1987) [56], (Karmali, 1989) [57]. Vi khuẩn
nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu được tăng sinh tiếp trên môi trường CAYE
có thành phần: 2% casamino acid, 0.6% yeast extract, 0.25% NaCl, 0.87%
0

K2HPO4, 0.0005% MgSO4, 0.0005% FeCl3 ở 37 C trong 18 giờ để tách độc tố
(Mundell, 1976) [85]. Canh khuẩn E.coli O157:H7 được ly tâm, thu dịch nổi
rồi bổ sung vào các đĩa tế bào thận khỉ xanh châu Phi (VERO) và tiếp tục
0

nuôi ở điều kiện 37 C/ 3 ngày trong tủ ấm CO2. Kiểm tra bệnh tích tế bào sau
mỗi 24 giờ và so sánh mẫu với đối chứng dương và âm.
1.4.4 Phương pháp PCR-Mutiplex
Phương pháp này dùng để phát hiện các gen độc tố của vi khuẩn E.coli
O157:H7. Theo Paton và cộng sự, (1997) [100] các gen mã hóa độc tố của vi
khuẩn này là Stx1, Stx2, eae, hly được phát hiện bằng các cặp mồi trong bảng
1.2.


Bảng 1.2 Trình tự các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCRMultiflex phát hiện các gen độc tố của vi khuẩn E.coli O157:H7 (Paton và
cộng sự, 1997) [100]

Còn theo Blanco và cộng sự, (1997) [16], trật tự các cặp mồi để phát
hiện các gen mã hóa độc tố của vi khuẩn E.coli O157:H7 Stx2e, sta, stb, LT-I
như trong bảng 1.3.
Bảng 1.3 Trình tự các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR-Multiflex
phát hiện các gen độc tố của vi khuẩn E.coli O157:H7 (Blanco và cộng
sự) [16]

1.5. Cấu trúc kháng nguyên của E.coli sp. và E.coli O157:H7
Escherichia coli (E.coli) là vi khuẩn có trong đường ruột của con người
và động vật. Từ nhiều thập kỷ qua, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu
về vi khuẩn này trên tất cả các góc độ: khả năng gây bệnh, đặc điểm hình thái,


20

sinh hoá, cấu trúc kháng nguyên, cấu trúc gen, độc tố,... Trong đó, cấu trúc bề
mặt của vi khuẩn được xác định là yếu tố quan trọng đặc biệt đối với sinh lý
bệnh, dịch tễ bệnh và khả năng sinh đáp ứng trên vật chủ. Cấu trúc này không
chỉ có vai trò bảo vệ vi khuẩn mà nó chính là các yếu tố kháng nguyên. Theo
James và cộng sự, (1998) [52], cấu trúc kháng nguyên của E.coli gồm 4
nhóm: i) kháng nguyên O (thân), ii) kháng nguyên H (tiên mao, lông), K
(kháng nguyên giáp mô), F (kháng nguyên fimbrae). Ngoài ra, theo Orskov và
cộng sự, (1984) [97], một số chủng E.coli còn mang kháng nguyên

M

(mucus- kháng nguyên màng nhầy).
Hiểu biết về đặc điểm bề mặt của tế bào và các kháng nguyên của vi khuẩn
E.coli là cơ sở giúp các nhà khoa học có định hướng nghiên cứu các phương

pháp phòng bệnh, xác định cơ chế tác dụng của thuốc, chế tạo các loại KIT
chẩn đoán và các chế phẩm điều trị bệnh.
Năm 1984, Orskov và cộng sự [97] đã thống kê được 163 kiểu kháng
nguyên O, tương ứng với 56 kiểu kháng nguyên H và 101 kiểu kháng nguyên
K. (phụ lục bảng 2)
1.5.1 Kháng nguyên thân (O)
Là kháng nguyên có mặt ở tất cả các chủng vi khuẩn đường tiêu hoá có
cấu trúc khuẩn lạc dạng S. Kháng nguyên này nằm trên lớp lipopolysaccharide (LPS) của thành tế bào trực khuẩn gram âm, có bản chất là
0

polysaccharide, bền với nhiệt và không bị biến tính ở nhiệt độ 100 C. Đây là
kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch trên vật chủ, tạo phản ứng ngưng kết do
ngưng kết tố.
Lớp LPS của thành tế bào vi khuẩn gram âm được chia thành 3 vùng (hình
1.2), bao gồm: i) lipid A được cấu tạo bởi axit hydroxymyristic, glucosamine
và acid béo giúp LPS được neo giữ vào màng ngoài của vi khuẩn bằng các
liên kết đồng hoá trị. Đây là yếu tố đóng vai trò nội độc tố của vi khuẩn; ii)


nhân oligosaccharide có cấu tạo từ các loại đường hoặc các gốc đường và gắn
với vùng lipid A bởi acid 2-keto-3 deoxymannulosoctonic (KDO); iii) vùng
biến đổi, có bản chất polysaccharide đặc trưng cho từng chủng vi khuẩn,
mang tính đặc hiệu cho kháng nguyên O, vùng này bao gồm 10-30 phân tử
oligosaccharide kết hợp lặp lại và tạo nên 3-6 gốc đường (hình 1.2) (Luderitz
và cộng sự, 1973) [74]. Chính nhờ khả năng tái tổ hợp ngẫu nhiên của các
phân tử oligosaccharide và số lượng các các gốc đường trong cấu trúc kháng
nguyên O đã tạo nên tính đa dạng của loại kháng nguyên này, bên cạnh đó,
các gốc O-acetyl hoặc các acid amin là yếu tố làm kéo dài chuỗi polysaccharide (phụ lục bảng 3) (Reeves và cộng sự, 1994) [116].
Hình 1.2 Cấu trúc cơ bản của LPS

Năm 1944, Kauffmann [58], bằng phương pháp huyết thanh học đã
định type vi khuẩn E.coli theo các nhóm huyết thanh O. Một năm sau, năm
1945, chính tác giả này đã đưa ra hệ thống phân loại 20 nhóm E.coli dựa trên
huyết thanh O đầu tiên (Kauffmann, 1945) [59]. Năm 1945, Knipschildt [64]
đã bổ sung thêm 5 nhóm huyết thanh O của vi khuẩn E.coli. Năm 1984,
Orskov [97] và cộng sự đã thống kê được 164 kiểu kháng nguyên O. Và từ đó
đến nay, đã có 187 kiểu huyết thanh O của vi khuẩn này được đưa vào hệ
thống phân loại (trích theo CDC, 1999) [26].


Để phát hiện kháng nguyên O, người ta dùng phương pháp ngưng kết
huyết thanh với kháng thể đặc hiệu tương ứng, một số chủng vi khuẩn có giáp
mô bền nhiệt thì phản ứng ngưng kết chỉ xảy ra khi vi khuẩn được xử lý ở
0

nhiệt độ tiệt trùng (121 C/2 giờ). Tuy nhiên, giữa các kháng nguyên O của
E.coli với kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn đường tiêu hoá khác như
Salmonella, Shigella, Klebsiella, Vibrio cholera, thậm chí, giữa các nhóm
hoặc các kiểu kháng nguyên O trong cùng loài E.coli cũng thường xuất hiện
phản ứng chéo (Edwards và cộng sự, 1972) [36], (Frantzen và cộng sự, 1980)
[42], (Ida, 1977) [50], (Kauffmann, 1954) [60] (phụ lục bảng 4,5). Bên cạnh
đó, một số chủng E.coli lại có khả năng biến đổi từ dạng S sang dạng R do đột
biến của một hoặc vài gen quy định tổng hợp và trùng hợp kháng nguyên O,
vì vậy các chủng vi khuẩn này sẽ mất khả năng tổng hợp kháng nguyên thân
dẫn đến việc phát hiện kháng nguyên O bằng kháng thể đặc hiệu không cho
kết quả mong muốn (Ida, 1977) [50].
Hiện nay, kháng nguyên O của vi khuẩn E.coli có thể được phát hiện
bằng các phương pháp miễn dịch học như ELISA (M.Gleeson và cộng sự,
1998) [81], Western blot (Walter và cộng sự, 1995) [141], hoặc sinh học phân
tử như PCR (Chitrita và cộng sự, 2005) [28].

Gen mã hoá kháng nguyên O gồm có: i) gen wzx (orf4) mã hoá enzyme
gắn các tiểu phần kháng nguyên, và ii) wzy (orf2) mã hoá enzyme trùng hợp
kháng nguyên O. Hầu hết các kháng nguyên này đều được tổng hợp bởi hệ
thống gen phụ thuộc wzx, là các gen cho phép tổng hợp các tiểu phần O trên
màng trong của màng nguyên sinh chất tế bào vi khuẩn, sau đó các tiểu phần
này được chuyển qua màng bằng các emzyme phụ thuộc gen wzx để tham gia
quá trình trùng hợp tạo kháng nguyên O được quy định bởi gen wzy (Reeves,
1994) [116].


Đối với E.coli O157:H7, cấu trúc kháng nguyên O gồm có: N-acetyl-Dperosamine-L-fucose-D-glucose-N-acetyl-D-galactose (Leiwang và cộng sự,
1998) [69]. Gen mã hoá kháng nguyên O157 có chiều dài 14kb, chứa 12 gen
và một đoạn lặp H (hình 1.3), cụ thể: 4 gen mã hoá đường GDP-L-fucose là
manB, manC, gmd, fcl; 1 gen per mã hoá GDP-perosamine; 3 gen mã hoá
enzyme mang chức năng vận chuyển đường của các tiểu phần O; 1 gen mã
hoá enzyme vận chuyển acetyl; 1 gen gắn các tiểu phần O và 1 gen trùng hợp
kháng nguyên O.
Hình 1.3 Sơ đồ gen mã hoá kháng nguyên O157

Kháng nguyên O là thành phần gây đáp ứng miễn dịch đối với vật chủ.
Người ta có thể tách chiết kháng nguyên O của vi khuẩn E.coli bằng các loại
dung môi hữu cơ (Kiyoshi và cộng sự, 1971) [65] hoặc bằng phương pháp tái
tổ hợp gen (Lu Feng và cộng sự, 2004) [73] để sản xuất vắc xin phòng bệnh
hoặc gây miễn dịch để chế kháng huyết thanh chẩn đoán.
1.5.2. Kháng nguyên lông (H)
Khác với kháng nguyên thân có bản chất là polysaccharide và định vị
trên thành tế bào, kháng nguyên lông có bản chất protein và định vị trên lông
hoặc tiên mao của vi khuẩn, vì vậy, kháng nguyên này chỉ có ở các loài vi
khuẩn có cấu trúc lông hoặc tiên mao. Tiên mao của vi khuẩn có cấu tạo từ
protein roi, có cấu trúc là một ống rỗng xoắn hoặc uốn cong được gắn với

thành tế bào bằng các phân tử protein vòng. Ở vi khuẩn gram dương, protein
vòng hình thành hai cấu trúc vòng nhẫn, một gắn với màng peptidoglycan và
một gắn với màng nguyên sinh chất. Còn ở vi khuẩn gram âm, có tới 4 cấu


trúc vòng nhẫn để giúp tiên mao gắn chặt và tế bào, bao gồm: vòng L liên kết
với lớp lipopolysaccharide, vòng P liên kết với lớp peptidoglycan, vòng M
nằm trên màng nguyên sinh chất, vòng S gắn trực tiếp vào màng nguyên sinh
chất. Đầu tận cùng của tiên mao là một protein mũ.
Số lượng tiên mao phụ thuộc vào loài vi khuẩn: vi khuẩn tả Vibrio
cholera có một tiên mao, trong khi đó E.coli lại có rất nhiều và phân bố khắp
trên bề mặt tế bào. Cấu trúc tiên mao là cấu trúc đặc trưng cho các chủng vi
khuẩn, chính vì sự khác biệt trên cấu trúc bề mặt của tiên mao đã dẫn đến sự
khác biệt về cấu trúc kháng nguyên H, các chủng vi khuẩn có cấu trúc tiên
mao giống nhau thì có cấu trúc kháng nguyên H giống nhau. Đây chính là cơ
sở để lý giải khả năng gây phản ứng chéo giữa các kháng nguyên H. Theo
Macnab, (1996) [76], các tiểu phần protein cấu tạo nên kháng nguyên tiên
mao của vi khuẩn E.coli được mã hoá bởi gen fliC. Dựa trên hình thái, cấu
trúc của tiên mao, vi khuẩn E.coli được chia làm 6 nhóm, ký hiệu từ A-F (
hình 1.4), với các đặc điểm như sau:

Hình 1.4 Cấu trúc bề mặt tiên mao của vi khuẩn E.coli