Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của quả các cây gội nước (anphanamixis polystachya), xà cừ (khaya senegalensis) và xoan (melia azedarach) thuộc họ xoan (meliaceae) ở việt namtt

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

VŨ THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA QUẢ CÁC
CÂY GỘI NƯỚC (Anphanamixis polystachya),
XÀ CỪ (Khaya senegalensis) VÀ XOAN (Melia
azedarach) THUỘC HỌ XOAN (MELIACEAE)
Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ
Mã số: 9. 44. 27. 01

TÓM T T LU N N TI N S HÓA HỌC

N

An-2018


2

C
P

N

C
T

ớ

ềH

ơ, Trung tâm TH-TN,
ọ V

ọ
1. PGS. TS. Vũ
H
2. PGS. TS. H
Vă Lự

P

PGS. TS Trị

P

PGS. TS. ỗ Quang Huy

P

PGS. TS. L

L
P

, ầ
,

T ịT ủ

ứ G

Hộ
6, N

T
C

T
ă

t

ọ
ọ V

019

C
1. T
.T
ọ Vinh

Q ố

T

V

N
T

N

T

H

–T


1

MỞ ẦU
. Lý

ọ ề
Những năm gần đây có nhiều cây thuốc y học cổ truyền của y học là đối
tƣợng nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng điều trị ung thƣ, qua đó đã và đang
phát hiện ra hàng loạt chất mới, nhiều chất rất có triển vọng trở thành những
chất dẫn đƣờng.
Họ Xoan đƣợc quan tâm nghiên cứu trên thế giới với thành phần hóa học
của họ Xoan rất đa dạng và phong phú gồm các lớp chất limonoid, mono-, di-,
sesqui-, và triterpenoid, coumarin, chromone, lignan, flavonoid.... đặc biệt lớp
chất limonoid gần 2000 hợp chất có cấu trúc thú vị, với các hoạt tính kháng

nấm, kháng khuẩn, ngán ăn côn trùng. Nhiều hợp chất limonoid thể hiện hoạt
tính kháng khuẩn, gây độc hại tế bào, chống khối u và chống HIV.
Cây gội nƣớc (Anphanamixis polystachya), xà cừ (Khaya senegalensis)
và xoan (Melia azedarach) thuộc loại cây thuốc dân gian Việt Nam. Cây đƣợc
trồng và mọc hoang dại nhiều nơi ở Việt Nam, nhƣng cũng đƣợc trồng nhiều ở
trạm xá đông y, y tế xã và trong nhà dân. Tuy nhiên cho đến nay hầu nhƣ chƣa
có công trình nghiên cứu nào về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của
các cây này của Việt Nam đƣợc công bố. Với mong muốn làm sáng tỏ kinh
nghiệm sử dụng trong dân gian, nâng cao tính hiệu quả, an toàn của dƣợc liệu,
đƣa dƣợc liệu vào sử dụng một cách khoa học hơn và có thể đẩy mạnh khai
thác sử dụng cây thuốc này vào việc phòng và chữa bệnh cho nhân dân trong
cộng đồng các dân tộc Việt Nam. Do vậy, việc nghiên cứu về họ xoan ở Việt
Nam là một yêu cầu bức thiết, có ý nghĩa lý luận và thực tiễn quan trọng, góp
phần quan trọng trong việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, về giá trị
kinh tế và tầm quan trọng của nguồn dƣợc liệu thiên nhiên của nƣớc ta. Vì lý
do đó chúng tôi đã chọn đề tài: “N
ứ
ầ
ọ
s
ọ ủ q các cây ộ
ớ (Anphanamixis polystachya), x ừ
(Khaya senegalensis) và xoan (Melia azedarach)
ộ ọX
(Me e e)
ở V N ”.
. ố
ứu
Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là dịch chiết từ quả các cây quả các
cây gội nƣớc (Anphanamixis polystachya), xà cừ (Khaya senegalensis) và xoan

(Melia azedarach) ở Việt Nam.
.N
ụ
ứ
- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp các hợp
chất từ quả gội nƣớc (Anphanamixis polystachya), quả xà cừ
(Khaya senegalensis) và quả xoan (Melia azedarach).
- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất.
- Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập đƣợc.


2
4. P

ơ
ứ
- Phƣơng pháp lấy mẫu: mẫu quả cây thu hái, định danh, sấy khô bằng
thiết bị sấy bơm nhiệ. Chiết với thiết bị siêu âm, cất quay chân không thu cao
chiết cho nghiên cứu đƣợc nêu ở phần thực nghiệm.
- Phƣơng pháp tách và phân lập: đã sử dụng các phƣơng pháp sắc ký
(CC), sắc ký lớp mỏng (TLC) với pha tĩnh khác nhau nhƣ silica gel, sephadex
LH-20, RP-18, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với cột ODS.
- Phƣơng pháp xác định cấu trúc: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại
(IR), phổ khối lƣợng va chạm electron (EI-MS), phổ khối lƣợng phun mù
electron (ESI-MS), phổ khối lƣợng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hƣởng từ
hạt nhân một chiều (1D NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác
nhau nhƣ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC đã
đƣợc sử dụng.
- Thăm dò các hoạt tính sinh học kháng viêm và hoạt tính kháng khuẩn,
kháng nấm bảo vệ thực vật.

5. N
ớ ủ
Lần đầu tiên nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của quả
các cây gội nƣớc (Anphanamixis polystachya), xà cừ (Khaya senegalensis) và
xoan (Melia azedarach) ở Việt Nam, chúng tôi đã thu đƣợc một số kết quả nhƣ
sau:
1. Từ dịch chiết quả gội nƣớc (Anphanamixis polystachya) đã phân lập
và xác định cấu trúc 6 hợp chất:
- 04 hợp chất limonoid: dysobinin (AP1), chisocheton compound G
(AP2), chisocheton compound E (AP3) và 6α - acetoxyepoxyazadiradione VI
(AP4);
- 02 hợp chất sterol: β-sitosterol, -sitosterol-3-O--D-glucopyranoside.
Các hợp chất (AP1, AP2, AP3, AP4) lần đầu tiên phân lập từ cây này.
2. Từ dịch chiết quả xà cừ (Khaya senegalensis) phân lập đƣợc 6 hợp
chất:
- 04 hợp chất limonoid: seneganolide, khayanone, khayanolide B, 6acetoxy-methyl angolensate;
- 02 hợp chất flavonoid: (-)-epicatechin và quercitrin.
3. Từ dịch chiết quả xoan (Melia azedarach) phân lập đƣợc 8 hợp chất:
- 01
limonoid ớ : 3α,12α-diacetoxy-7α-benzoyloxy-1αhydroxytrichilinin đƣợc gọi tên là trichilinin F.
- 02 hợp chất flavonoid: apigenin và quercetin 3-O-[-Lrhamnopyranosyl-(1→6)]--D-glucopyranoside).
- 01 hợp chất triterpenoid: taraxerol;
- 02 hợp chất phenolic: scopoletin và acid vanillic;
- 02 hợp chất sterol: β-sitosterol, -sitosterol-3-O--D-glucopyranoside.


3
4. Lần đầu tiên đánh giá hoạt tính kháng nấm của các hợp chất phân lập:
AP2, AP3, KS2, KS3, KS4 với Fusarium oxysporum. Kết quả cho thấy KS3
có hoạt tính kháng nấm mạnh với hiệu quả ức chế trên 80% ở nồng độ 500ppm

và không suy giảm sau 7 ngày nuôi cấy.
6. C

ủ
Luận án bao gồm 112 trang với 21 bảng số liệu, 19 hình và 3 sơ đồ với
109 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan
(25 trang), phƣơng pháp và thực nghiệm (20 trang), kết quả và thảo luận (69
trang), kết luận (1 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham
khảo (8 trang). Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 130 phổ của một số hợp chất
chọn lọc.

CHƯ NG

T NG QUAN

Luận án đã tiến hành tổng quan tài liệu các nội dung:
1. Họ Xoan (Meliaceae)
- Giới thiệu về đặc điểm chung thực vật của các loài thuộc họ Xoan, thành
phần hóa học chính của các cây họ Xoan nhƣ các lớp chất limonoid, mono-, di, sesqui-, và triterpenoid, coumarin, chromone, lignan, flavonoid và các
phenolic khác. Bên cạnh đó tổng quan cũng đề cập đến hoạt tính sinh học và
ứng dụng của các cây họ Xoan trong nông nghiệp, dƣợc phẩm…
2. Cây gội nƣớc (Aphanamixis polystachya)
- Giới thiệu về đặc điểm thực vật của cây gội nƣớc (Aphanamixis
polystachya)
- Thành phần hóa học của cây gội nƣớc (Aphanamixis polystachya)
- Hoạt tính sinh học của cây gội nƣớc (Aphanamixis polystachya)
3. Cây xà cừ (Khaya senegalensis)
- Giới thiệu về đặc điểm thực vật của cây xà cừ (Khaya senegalensis)
- Thành phần hóa học của cây xà cừ (Khaya senegalensis)
- Hoạt tính sinh học của cây xà cừ (Khaya senegalensis)

4. Cây xoan (Melia azedarach)
- Giới thiệu về đặc điểm thực vật của cây xoan (Melia azedarach)
- Thành phần hóa học của cây xoan (Melia azedarach)
- Hoạt tính sinh học của cây xoan (Melia azedarach)

CHƯ NG
. .P ơ
. . .P ơ

PHƯ NG PH P VÀ TH C NGHIỆM
ứ
:


4
Mẫu quả cây thu hái, định danh, sấy khô bằng thiết bị sấy bơm nhiệt.
Chiết với thiết bị siêu âm, cất quay chân không thu cao chiết cho nghiên cứu
đƣợc nêu ở phần thực nghiệm.
. . .P ơ
ế x ,
,x
ị
:
Để phân tích và phân tách cũng nhƣ phân lập các hợp chất, sử dụng các
phƣơng pháp sắc ký nhƣ: phƣơng pháp sắc ký (CC), sắc ký lớp mỏng (TLC)
với pha tĩnh khác nhau nhƣ silica gel, sephadex LH-20, RP-18, sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) với cột ODS.
. . .P ơ
s
:

Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lƣợng (ESI-MS),
(HR-ESI-MS); phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt
nhân 13C-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC, COSY,
NOESY; cấu trúc lập thể tƣơng của các hợp chất này đƣợc xác định các
phƣơng pháp phổ NMR.
. .4. P ơ
ử
s
ọ
Thử hoạt tính sinh học kháng viêm và thử nghiệm sinh học trực tiếp cho
hoạt tính chống nấm gây bệnh thực vật. Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các
hợp chất phân lập với C. acutatum, C. fragariae, C. gloeosporioides, F.
oxysporum, B. cinerea và P. obscurans.
. .H
ế ị
2.2.1. H
: Các dung môi ngâm chiết mẫu thực vật thuộc thuộc loại
tinh khiết (pure). Các dung môi sử dụng cho các loại sắc ký lớp mỏng và sắc
ký cột thuộc loại tinh khiết phân tích (PA). Các dung môi đƣợc sử dụng là:
hexan, metanol, butanol, etyl axetat, axeton, nƣớc cất.
. . . T ế ị: Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Yanaco MP-S3; Độ quay cực
đƣợc đo trên máy phân cực kế Jasco DIP -370; Phổ tử ngoại UV đƣợc ghi trên
máy quang phổ Hitachi UV-3210, phổ hồng ngoại IR đo trên máy quang phổ
Shimadzu FTIR-8501 và Bruker, viên nén KBr; Phổ khối lƣợng (ESI-MS, HRESI-MS) đƣợc đo trên máy Bruker Dailtonics APEX II 30eV spectrometer
Trƣờng Đại học Y Trung Quốc (Đài Loan) và máy micrOTOF-QII 10187
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh; Phổ cộng
hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR đƣợc đo trên máy Bruker 500MHz, phổ 13CNMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY và NOESY đƣợc đo trên máy Bruker
125 MHz (Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) với
chất chuẩn là TMS; Sắc ký cột sử dụng silicagen cỡ hạt 60,70-230 Kieselgel và
230-240 (Merck). Bản mỏng đƣợc tráng kieselgel 60 và các chất hiển thị bằng

dung dịch H2SO4 10% ở 1100 C trong thời gian 10 phút, bằng đèn tử ngoại ở
hai bƣớc sóng 254 nm và 368 nm; dùng hơi Iot (I2) hiện màu.
2.3. N
ứ
ừq
ộ
ớ (Aphanamixis polystachya)
2.3.1. Ph ơ


5
Quả cây gội nƣớc (Anphanamixis polystachya) đƣợc thu hái ở khu bảo
tồn Vũ Quang-Hà Tĩnh vào tháng 08/2013 và đƣợc PGS. TS Trần Huy Thái
(Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam) xác định tên khoa học và tiêu bản (DHV-2013) đƣợc lƣu giữ tại
khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Vinh.
2.3.2. P
Lấy 4,0 kg mẫu khô của quả cây gội nƣớc, sấy ở 40oC, sau đó xay nhỏ
rồi đƣợc chiết với metanol ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 tuần. Dịch chiết
đƣợc cất thu hồi dung môi, thu đƣợc 290g cao. Sau đó chiết lần lƣợt với
cloroform và butanol, cất thu hồi dung môi thu đƣợc 106g và 35g cao, tƣơng
ứng. Cao cloroform đƣợc tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi
hexan-axeton (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1) và hệ dung môi CHCl 3:CH3OH
(100:0, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1) thu đƣợc 7 phân đoạn chính (kí hiệu từ F 1 đến F7) (sơ
đồ 2.1)
Phân đoạn F1 (8,6 g) đƣợc tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x
5 cm) rửa giải bằng hệ dung môi hexan:axeton (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 4:1),
mỗi hệ dung môi sử dụng 250 ml, thu đƣợc 7 phân đoạn (kí hiệu từ F1.1 đến
F1.7). Phân đoạn F1.4 (1,0 g) đã đƣợc sắc ký trên cột silica gel (200 gam, 60 x
5 cm) với hệ dung môi rửa giải hexan:axeton (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 4:1, mỗi

hệ dung môi sử dụng 250 ml) thu đƣợc hợp chất AP-5 (153 mg).
Phân đoạn F2 (2,3 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel (200 gam, 60x3 cm)
với hệ dung môi rủa giải hexan:axeton (9:1 , 6:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200
ml) thu đƣợc sáu phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F2.1 đến F2.6). Phân đoạn F2.6
(0,5 g) đƣợc tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 (50 gam, 60x3cm) đƣợc giải
hấp với hệ dung môi CH3OH:H2O thu đƣợc hợp chất AP-1 (41 mg).
Phân đoạn F3 (2,7 g) đƣợc sắc ký cột silica gel (200 gam, 60×3,2 cm)
đƣợc rửa giải bằng hệ dung môi hexan:axeton (9:1, 6:1, 4:1, 1:1, mỗi hệ dung
sử dụng 250ml) để thu đƣợc bốn phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F3.1 đến F3.4).
Phân đoạn F3.2 (0,5 g) tiếp tục đƣợc sắc ký cột pha đảo RP -18 (100 gam, 60 x
3 cm) giải hấp bằng hệ dung môi CH3OH:H2O thu đƣợc hợp chất AP-2 (31
mg).
Phân đoạn F4 (4,7 g) đƣợc phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam,
60 x 5cm) đƣợc rửa giải với hệ dung môi CHCl3:CH3OH (20:1, 10:1, 6:1, 4:1,
2:1, mỗi hệ sử dụng 200 ml) thu đƣợc 5 phân đoạn (ký hiệu từ F4.1 đến F4.5).
Phân đoạn F4.1 tiếp tục đƣợc sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 3 cm) rửa
giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (19:1, 16:1, mỗi hệ dung môi sử dụng
200 ml) thu đƣợc hợp chất AP-4 (43 mg) và AP-3 (21 mg).
Phân đoạn F5 (1,5 g) đƣợc phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam,
60 x 3cm) đƣợc rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (9:1, 6:1, mỗi hệ
dung môi sử dụng 200 ml) thu đƣợc hợp chất AP-6 (13 mg).


6


7
2.4. N
ứ
ừ q x ừ (Khaya senegalensis)

.4. . M
Quả của cây xà cừ (Khaya senegalensis A. Juss) đƣợc thu thập ở Nghệ An
vào tháng 1/2014. Mẫu nghiên cứu đƣợc định danh bởi PGS. TS. Trần Huy
Thái (Viện Tài nguyên và Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam). Tiêu
bản (DHV 2014) đƣợc lƣu giữ tại khoa Sinh học-Trƣờng Đại học Vinh.
2.4.2. P
Quả sau khi sấy khô (4,0 kg) đƣợc xay nhỏ, đƣợc chiết ba lần với MeOH ở
nhiệt độ phòng. Dịch chiết MeOH đƣợc thu hồi dung môi ở áp suất thấp thu
đƣợc cặn màu nâu đen (285,0 g). Cặn methanol đƣợc phân bố trong nƣớc, sau
đó chiết lần lƣợt với hexane và ethyl acetate, thu đƣợc 55,0 gam cặn hexane và
95,0 gam cặn ethyl acetate.
Cặn ethyl acetate đƣợc tiến hành sắc ký cột trên với hệ dung môi gradient nhexane:acetone (100:0; 50:1; 39:1; 30:1; 20:1; 15:1; 9:1; 4:1; 2:1; 1:1) thu
đƣợc 7 phân đoạn chính.
Phân đoạn 3 đƣợc tiến hành sắc ký cột trên silica gel với hệ dung môi
gradient hexane:acetone (20:1; 15:1; 9:1; 2:1) thu đƣợc 5 phân đoạn nhỏ. Phân
đoạn 3.2 đƣợc tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel rửa giải bằng hệ dung môi nhexane:acetone (20:1) thu đƣợc hợp chất KS2 (23 mg). Phân đoạn 3.3 đƣợc
tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane:acetone
(9:1; 4:1) thu đƣợc hợp chất KS1 (15 mg) và hợp chất KS3 (29 mg).
Phân đoạn 4 đƣợc tiến hành sắc ký cột trên silica gel với hệ dung môi rửa
giải chloroform:methanol (9:1) thu đƣợc hợp chất KS4 (12.5 mg).
Phân đoạn 5 đƣợc tiến hành sắc ký cột trên silica gel với hệ dung môi
gradient hexane:acetone (15:1; 9:1; 4:1; 2:1) thu đƣợc 7 phân đoạn nhỏ. Phân
đoạn 5.2 đƣợc rửa giải bằng hệ dung môi chloroform:methanol (20:1) trên sắc
kí cột, sau đó đƣợc tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel thu đƣợc hợp chất KS5
(53 mg). Phân đoạn 5.4 đƣợc rửa giải bằng hệ dung môi chloroform: methanol
(15:1, 9:1), sau đó đƣợc làm tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel thu đƣợc hợp
chất KS6 (71,5 mg).


8

9
2.5. N
ứ
ừq x
(Melia azedarach)
.5. . T
Mẫu quả xoan (Melia azedarach) đƣợc thu hái vƣờn Quốc gia Pù Huống,
Nghệ An, Việt Nam tháng 08 năm 2016, Mẫu nghiên cứu đƣợc định danh bởi
PGS. TS. Trần Huy Thái (Viện Tài nguyên và Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa
học Việt Nam). Tiêu bản (DHV 2016) đƣợc lƣu giữ tại khoa Hóa học-Trƣờng
Đại học Vinh.
.5. . C ế x ,
x
ị
Mẫu thực vật thu thập và sấy khô ở nhiệt độ từ 40 0-500C trong 48 giờ,
sau khi sấy khô và xay nhỏ (5,0kg) ngâm với MeOH, với thời gian 8 ngày, sau
đó lọc và dịch lọc đƣợc cất giảm áp suất bằng thiết bị quay cất chân không thu
đƣợc cao metanol (425g). Phân bố cao metanol trong nƣớc, sau đó chiết lần
lƣợt với các dung môi etyl axetat và butanol, quay cất chân không thu đƣợc
125 g cao etyl axetat và 67 g cao butanol.
Cao etyl axetat đƣợc phân tách trên cột silicagel, với hệ dung môi rửa
giải là cloroform: metanol (100:0, 40:1: 30:1; 20:1; 10:1: 4:1; 2:1) thu đƣợc 7
phân đoạn. Phân đoạn 1 đƣợc phân tách lại bằng sắc ký cột với hệ dung môi
hexane: acetone (15:1) thu đƣợc chất hợp chất MA-6 (128 mg). Phân đoạn 3
đƣợc phân tách lại bằng sắc ký cột với hệ dung môi hexan: axeton (7:1) thu
đƣợc chất hợp chất MA-3 (28 mg) và hợp chất MA-5 (31 mg). Phân đoạn 5
đƣợc tiến hành sắc ký cột với silica gel với hệ dung môi rửa giải cloroform:
metanol (10:1) thu đƣợc chất MA-4 (51mg).

Cao butanol đƣợc phân tách trên cột silicagel, với hệ dung môi rửa giải là
cloroform: metanol (30:1; 20:1; 10:1: 4:1; 2:1) thu đƣợc 5 phân đoạn. Phân
đoạn 2 đƣợc phân tách lại bằng sắc ký cột với hệ dung môi cloroform: metanol
(15:1) thu đƣợc chất hợp chất MA-1 (12) mg) và phân đoạn 3 đƣợc phân tách
lại bằng sắc ký cột với hệ dung môi cloroform: metanol (10:1) thu đƣợc chất
hợp chất MA-2 (21,5 mg). Phân đoạn 5 đƣợc phân tách tiếp với hệ dung môi
cloroform: metanol (10:1) thu đƣợc chất hợp chất MA-7 (41mg).


10


11
.6. T ử
s
ọ
Thử hoạt tính sinh học kháng viêm và thử nghiệm sinh học trực tiếp cho hoạt
tính chống nấm gây bệnh thực vật. Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các hợp
chất phân lập với C. acutatum, C. fragariae, C. gloeosporioides, F. oxysporum,
B. cinerea và P. obscurans.
CHƯ NG
T QUẢ VÀ THẢO LU N
3.1. Q
ộ
ớ (Anphanamixis polystachya)
. . .P
Từ dịch chiết metanol của quả gội nƣớc (Anphanamixis polystachya),
bằng các phƣơng pháp sắc ký cột trên silica gel đã phân lập đƣợc 6 hợp chất và
xác định các hợp chất này bằng các phƣơng pháp phổ (Bảng 3.1).
B

. Các hợp chất đƣợc tách ra từ quả gội nƣớc
S
Ký
T
C
ứ
ố
T
ử
T
(mg)
1 AP-1 Dysobinin
C35H50O7
41
2 AP-2 Chisocheton compound E
C31H46O4
31
3 AP-3 chisocheton compound G
C33H48O5
21
4 AP-4 6α - acetoxyepoxyazadiradione VI
C31H44O5
43
5 AP-5 β-sitosterol
C28H44O
153
6 AP-6 -Sitosterol-3-O--D-glucopyranoside
C28H44O3
13
3.2. Q x ừ (Khaya senegalensis)

. . .P
ộ số
Quả xà cừ (Khaya senegalensis) đƣợc ngâm chiết bằng dung môi
metanol. Cất thu hồi dung môi dịch chiết thu đƣợc cao thô metanol. Hòa tan
cao metanol vào trong nƣớc và chiết phân bố với dung môi cloroform thu đƣợc
cao clorofom và dịch nƣớc.
Từ cao cloroform của quả xà cừ (Khaya senegalensis), bằng các phƣơng
pháp sắc ký cột trên silica gel đã phân lập đƣợc 8 hợp chất và xác định các hợp
chất này bằng các phƣơng pháp phổ (Bảng 3.8).
B
.8 Các hợp chất đƣợc tách ra từ quả xà cừ (Khaya senegalensis)
STT
ý
T
C
ứ
ố
ử
( )
1
Seneganolide
C28H44O
34
KS1
2
Khayanone
C28H44O3
32
KS2
3

Khayanolide B
C30H46O3
9
KS3
4
6-Acetoxy-methyl
C30H48O2
22
KS4
angolensate
5
(-)-Epicatechin
C30H46O4
10
KS5
6
Quercitrin
C27H43O3
20
KS6


12
. .Q x
(Melia azedarach)
. . .P
Quả xoan (Melia azedarach) đƣợc ngâm chiết bằng dung môi metanol, sau
đó lọc. Dịch lọc thu đƣợc cất thu hồi dung môi thu đƣợc cao thô metanol tiếp
tục đƣợc hòa tan trong nƣớc và chiết phân bố với dung môi etyl axetat thu
đƣợc cao etyl axetat.

Từ cao etyl axetat của quả xoan (Melia azedarach), bằng các phƣơng pháp
sắc ký cột trên silica gel đã phân lập đƣợc 8 hợp chất và xác định các hợp chất
này bằng các phƣơng pháp phổ (Bảng 3.15).Kết quả của quá trình nghiên cứu
đƣợc thể hiện ở bảng 3.15.
B
. 5 Các hợp chất đƣợc tách ra từ quả xoan (Melia azedarach)
STT
ý
T
ố
(mg)
1
14
MA1
Chất mới
2
Apigenin
12
MA2
3
21,5
MA3
Quercetin
3-O-[-Lrhamnopyranosyl-(1→6)]--Dglucopyranoside
4
Scopoletin
28
MA4
5
Acid vanillic

31
MA5
6
Taraxerol
25
MA6
7
β-sitosterol
128
MA7
8
41
MA8
-sitosterol-3-O--Dglucopyranoside
. . .X
ị
. . . .H
MA-1 (C
ớ)
Hợp chất MA-1 là chất bột màu trắng có tính quang hoạt và phổ HR-ESIMS của hợp chất MA-1 cho công thức phân tử C37H44O9 (m/z 655,2879,
[M+Na]+). Phổ UV cho hấp thụ cực đại tại 205, 218, 244, và 273 nm chứng tỏ
sự có mặt của vòng benzen liên hợp [99]. Phổ 1H-NMR của hợp chất MA-1
(bảng 3.16.) xuất hiện các tín hiệu singlet đặc trƣng của 4 nhóm methyl [H
1.00 (6H, CH3-20, -22), 1,18 (3H, CH3-18), và 1,25 (3H, CH3-21)], 1 nhóm
oxymethylene [H 3,13 (m) và 3,45 (d, J = 7,5 Hz)], và các tín hiệu của phần
vòng furan [H 6,16 (br s), 7,13 (br s), và 7,28 (br s)], tƣơng ứng, chứng tỏ
rằng hợp chất MA-1 là tƣơng tự nhƣ các hợp chất trichilinin [48]. Ngoài ra,
còn có sự có mặt của các tín hiệu của các proton singlet thuộc nhóm acetyl [H
1,90 (3H) và 1,91 (3H)] và 1 mảnh benzoyl [H 7,43 (2H, t, 7,5), 7,56 (1H, t,
7,5), và 8,08 (2H, d, 7,5)]. So sánh các dự kiện phổ ở trên với trichilinin E

[48], quan sát thấy sự khác biệt hợp chất MA-1 có nhiều hơn 1 nhóm acetyl. Vị


13
trí thế của nhóm acetyl và benzoyl đã đƣợc xác định bởi sự gán phổ 2D NMR
của hợp chất MA-1. Trong phổ HMBC, tƣơng tác 2J, 3J-HMBC từ H-3 đến C1, C-27; từ H-6 đến C-7; từ H-7 đến C-1'; từ H-12 đến C-29; từ H-15 đến C-8,
C-17; từ H-17 đến C-23, C-24, C-26; từ CH3-18 đến C-3, C-4, C-19; từ CH320 đến C-1, C-5, C-9; từ CH3-21 đến C-14; từ CH3-22 đến C-12, C-14, C-17;
từ H-7' đến C-1', tƣơng ứng, đã đƣợc quan sát và thiết lập cấu trúc phẳng 2D
của nó. Cấu trúc lập thể của MA-1 đƣợc xác định dựa trên phổ NOESY. Tín
hiệu tƣơng tác giữa H-1β/20-Me, H-5α/H-9α, H-7β/21-Me, H-12β/21-Me, H17/21Me cho thấy cấu trúc A/B trans, B/C trans, C/D cis và vòng α-furan. Các
thực nghiệm 2D liên tiếp khác đã xác định cấu hình lập thể của hợp chất MA-1
và dự đoán MA-1 thuộc nhóm trichilinin-limonoid.
B
. : Số liệu phổ NMR của MA-1
STT
δH (J =Hz)
δC
STT
δH (J =Hz)
δC
1
3,56 (br s)
71,8
20
1,00 (s)
15,8
2
1,53 (m), 2,27 (m)
24,3
21

1,25 (s)
27,1
3
5,08 (br s)
72,8
22
1,00 (s)
15,4
4
42,3
23
124,6
5
2,55 (d, 12,5)
40,3
24
7,13 (br s)
140,2
6
4,27 (dd, 12,5, 3,0) 73,6
25
7,28 (br s)
141,9
7
5,85 (d, 3,0)
74,2
26
6,16 (br s)
111,8
8

51,7
27
169,0
9
3,15 (dd, 13,0, 7,5) 36,2
28
1,91 (s)
20,8
10
44,1
29
171,0
11
2,04 (m), 2,36 (m)
30,0
30
1,90 (s)
21,3
12
5,08 (m)
77,8
1’
165,0
13
40,2
2’
130,6
14
155,7
3’

8,08 (d, 7,5)
129,5
15
5,70 (br s)
122,7
4’
7,43 (t, 7,5)
128,3
16
2,32 (m)
36,6
5’
7,56 (t, 7,5)
132,9
17 2,97 (dd, 10,8, 7,5) 50,4
6’
7,43 (t, 7,5)
128,3
18
1,18 (s)
18,8
7’
8,08 (d, 7,5)
129,5
19
3,13 (m), 3,45 (d,
77,9
7,5)
Từ những dữ kiện phân tích từ các phổ IR, HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13CNMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY và so sánh với tài liệu [48] cho phép
xác định cấu trúc hợp chất MA-1 là hợp chất mới đƣợc đặt tên là trichilinin F

(3α,12α-diacetoxy-7α-benzoyloxy-1α-hydroxytrichilinin).


14

(MA-1) A3α,12α-diacetoxy-7α-benzoyloxy-1α-hydroxytrichilinin

Hình 3.16: Phổ khối lƣợng ESI-MS của hợp chất MA-1


15

Hình 3.37: Phổ khối lƣợng HR- ESI-MS của hợp chất MA-1

Hình 3.18: Phổ 1H-NMR của hợp chất MA-1


16

Hình 3.19: Phổ 1H-NMR của hợp chất MA-1

Hình 3.20: Phổ 1H-NMR của hợp chất MA-1


17

Hình 3.21: Phổ 13C-NMR của hợp chất MA1

Hình 3.22: Phổ 13C-NMR của hợp chất MA-1

18

Hình 3.25: Phổ DEPT của hợp chất MA-1

Hình 3.27: Phổ HMQC của hợp chất MA-1


19

Hình 3.28: Phổ HSQC của hợp chất MA-1

Hình 3.29: Phổ NOESY của hợp chất MA-1


20

3.3. H

s

ủ

Phƣơng pháp food-poisoned technique-sử dụng để định lƣợng hoạt tính
kháng sinh của chất đối với nấm Fusarium oxysporum đƣợc xác định bằng
cách trộn chất vào môi trƣờng PDA nóng chảy theo đúng nồng độ thử nghiệm
(200 ppm và 500 ppm). Đĩa petri sau khi cấy đƣợc ủ tại 25°C sau 3 và 7 ngày
và đo đƣờng kính tản nấm. Hiệu quả kháng nấm đƣợc tính theo công thức:
CV (%) =100 × (Dc-Dt)/(Dc-4)
Trong đó: Dc: đường kính tản nấm trên đĩa petri đối chứng; Dt: đường

kính tản nấm trên đĩa petri có trộn chất và 4: đường kính miếng PDA tại tâm
đĩa.
Định lƣợng hiệu quả kháng nấm bằng food-poisoned technique của 5
chất: AP2, AP3, KS2, KS3 và KS4 cho thấy chất KS3 có hoạt tính mạnh nhất
và chất KS4 có hoạt tính yếu nhất đối với nấm F. oxysporum. Hiệu quả ức chế
tản nấm của KS3 có hoạt tính mạnh lên đến 81,15% đối với nồng độ 500 ppm
và 47,69% tại nồng độ 200 ppm sau 3 ngày nuôi cấy. Giá trị hiệu quả ức chế
của KS3 tăng lên 82,67% đối với nồng độ 500 ppm và giảm còn 35,83% ở
nồng độ 200 ppm sau 7 ngày nuôi cấy. Chất KS4 thể hiện hiệu quả thấp 9,05%
ở 500 ppm và 5,28% ở 200 ppm sau 3 ngày nuôi cấy. Hiệu quả kháng nấm của
KS4 cũng giảm đi sau 7 ngày nhƣng giá trị hiệu quả ức chế tăng và đều đạt
16,67% ở cả 2 nồng độ (bảng 3.22, hình 3.33 và 3.34). Các chất còn lại có khả
năng kháng nấm trung bình từ 26,96%-47,69% ở 500 ppm và hoạt tính thấp từ
4,34-19,42% ở 200 ppm sau 3 ngày nuôi cấy. Sau 7 ngày nuôi, hiệu quả kháng
nấm và giá trị hiệu quả ức chế của 3 chất còn lại đều giảm.


21
C C HỢP CHẤT PHÂN L P ƯỢC TỪ QUẢ GỘI NƯỚC
(Anphanamixis polystachya)
O

23

O

22

21

12

12

17

11

16

1

3

5

10

7

3

6

4

O

2

15

8

10

13

16

1

14

9

OAc

5

4

O

9
6

OAc

OH

20
17

11

13

2

O

23

22

21
20

14

8
7

15

OAc

OAc

(AP-1) Dysobinin

(AP-2) Chisocheton compound G
O
O

23

22

21

21
12
13

10
3

5

4

O

19

24 13

1

8
7

6

14

9

10

15

3
4

O

OAc
OAc

5

25

26

8
7

6

O

O

16

14

2

9

20
17

11

16

1
2

18
12

20
17

11

O

23

22

15

OAc

OAc

(AP-3) Chisocheton compound E (AP-4) 6α -Acetoxyepoxyazadiradione VI
29
28

29
28
21
18
19

24
23

13
9

2

17

11
8

14

10
7

HO

3

4

5

6

(AP-5) β-Sitosterol

27

22
20

12
1

21
12

25

1

HOH2C

O

4'

HO
HO

5'
3'

2'

O

3

4

5

23
17

13
8

16

14 15

10

6'

27
24

18

11
9

2

26
16

15

19

22
20

7
6

1'

OH

(AP-6) -Sitosterol-3-O--D-glucopyranoside

25
26


22
C C HỢP CHẤT PHÂN L P ƯỢC TỪ QUẢ XÀ CỪ
(Khaya senegalensis)

(KS-1) Seneganolide

(KS-3) Khayanolide B

(KS-5) (-)-Epicatechin

(KS-2) Khayanone

(KS-4) 6-Acetoxy-methyl angolensate

(KS-6) Quercitrin


23
C C HỢP CHẤT PHÂN L P ƯỢC TỪ QUẢ XOAN
(Melia azedarach)

(MA-1) 3α,12α-diacetoxy-7α-benzoyloxy-1α-hydroxytrichilinin

(MA-2) Apigenin

(MA-3) Quercetin 3-O-[-L-rhamnopyranosyl(1→6)]--D-glucopyranoside)

(MA-4) Scopoletin

(MA-6) Vanillin

(MA-5) Taraxerol

(MA-7) β-Sitosterol (MA-8) -Sitosterol-3-O--D-glucopyranoside