XÁC ĐỊNH LD50 (LETHAL DOSE 50%) CỦA Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY NHIỄM QUA ĐƯỜNG TIÊU HÓA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH LD50 (LETHAL DOSE 50%)
CỦA Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA BẰNG PHƯƠNG
PHÁP GÂY NHIỄM QUA ĐƯỜNG TIÊU HÓA
Ngành: Nuôi Trồng Thủy Sản
Chuyên ngành: Ngư Y
Niên khóa: 2006-2010
Sinh viên thực hiện: LÝ ĐỨC TRỌNG

Tháng 07/2010
 
 


XÁC ĐỊNH LD50 (LETHAL DOSE 50%)
CỦA Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY
NHIỄM QUA ĐƯỜNG TIÊU HÓA

Tác giả

LÝ ĐỨC TRỌNG

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành
Nuôi Trồng Thuỷ Sản chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn
TS. NGUYỄN HỮU THỊNH

Tháng 7 năm 2010
i 
 


CẢM TẠ
Chúng tôi xin chân thành cảm tạ:
Cha mẹ và gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên và hỗ trợ cả về tinh thần lẫn vật chất
cho con trong suốt quá trình học tập.
Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Ban Chủ nhiệm Khoa Thuỷ Sản cùng tất cả quý thầy cô đã tận tâm truyền đạt những
kiến thức quí báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho chúng tôi trong suốt quá
trình học tập.
Chúng tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Nguyễn Hữu Thịnh và anh Đỗ Viết
Phương đã hướng dẫn chúng tôi hoàn thành tốt Luận văn này với tất cả trách
nhiệm và lòng nhiệt thành.
Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè và tập thể Lớp Ngư y 32 đã luôn ở bên chúng tôi,
chia sẻ và động viên chúng tôi trong suốt thời gian qua.
Chúng tôi rất mong nhận được sự thông cảm và đóng góp ý kiến của quý thầy cô và
các bạn.

ii 
 


TÓM TẮT
Đề tài ” Xác định LD50 của Edwardsiella ictaluri trên cá tra bằng
phương pháp gây nhiễm qua đường tiêu hóa” được thực hiện bắt đầu từ
25/02/2010 đến 30/05/2010 tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, trường Đại

Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Thí nghiệm được tiến hành để xác định
liều gây chết 50% số cá tra thí nghiệm (LD50) của vi khuẩn E.ictaluri bằng phương
pháp gây nhiễm qua đường tiêu hóa.
Thí nghiệm 1:
+ Tỉ lệ cá chết tích lũy ứng với các mật độ vi khuẩn gây nhiễm 0 CFU/10 g cá, 1,1
x 108 CFU/10 g cá , 1,1 x 107 CFU/10 g cá, 1,1 x 106 CFU/10 g cá, 1,1 x 105
CFU/10 g cá, 1,1 x 104 CFU/10 g cá lần lượt là 0%, 85%, 45%, 22,5%, 2,5%,
2,5%.
+ Liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) là 1,04 x 107 CFU/10 g cá (theo Reed –
Muench), 1,00 x 107 CFU/10 g cá (theo phân tích propit) và 0,8 x 107 CFU/10 g cá
(theo phương trình hồi quy tuyến tính - R2 là 0,928).
Thí nghiệm 2:
+ Tỉ lệ cá chết ứng với các mật độ vi khuẩn 0 CFU/10 g cá, LD50 CFU/10 g cá, 5 x
LD50 CFU/10 g cá lần lượt là 0%, 60%, 82%.

iii 
 


MỤC LỤC
ĐỀ MỤC

Trang

Trang tựa

i

Lời cảm ơn

ii

Tóm tắt

iii

Mục lục

iv

Danh sách các chữ viết tắt

viii

Danh sách các bảng

ix

Danh sách các hình ảnh

x

Danh sách các biểu đồ

xi

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU

1

1.1 Đặt Vấn Đề

1

1.2 Mục Tiêu Đề Tài

1

1. 3 Nội Dung Đề Tài

2

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN

3

2.1 Đặc Điểm Sinh Học của Cá Tra

3

2.1.1 Phân loại

3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

3

2.1.3 Đặc điểm hình thái

3

2.1.4 Điều kiện môi trường sống

4

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng

4

2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng – sinh sản

4

2.1.6.1 Sinh trưởng

4

2.1.6.2 Đặc điểm sinh sản

5

2.2 Một Số Quan Niệm Về Bệnh

5

2.3 Bệnh Gan Thận Mủ Trên Cá Tra

6

2.3.1 Sơ lược về bệnh

6

2.3.2 Tác nhân gây bệnh

7

2.3.3 Đường lây truyền của E. ictaluri vào cơ thể cá
iv 
 

8


2.3.4 Triệu chứng và bệnh tích

8

2.3.5 Phương pháp chẩn đoán bệnh

9

2.3.6 Phương pháp phòng và trị bệnh

9

2.4 Các Phương Pháp Gây Cảm Nhiễm Nhân Tạo Cho Cá Tra

9

2.4.1 Phương pháp tiêm

9

2.4.2 Phương pháp ngâm

10

2.4.3 Phương pháp nuôi chung

10

2.4.4 Phương pháp đường tiêu hóa

10

2.5 Sơ Lược Về LD50

11

2.5.1 Định nghĩa

11

2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến LD50

11

2.5.3 Phương pháp xác định LD50 theo Reed và Muench (1938)

11

2.5.4 Một số nghiên cứu về LD50 của E. ictaluri

12

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

14

3.1 Thời Gian Và Địa Điểm

14

3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu

14

3.2.1 Dụng cụ

14

3.2.2 Hóa chất và môi trường

14

3.2.2.1 Hóa chất

14

3.2.2.2 Môi trường

15

3.2.3 Đối tượng thí nghiệm

15

3.2.3.1 Cá thí nghiệm

15

3.2.3.2 Vi khuẩn

15

3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu

15

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

15

3.3.1.1 Thí nghiệm 1: Xác định LD50 của E. ictaluri trên cá tra

15

3.3.1.2 Thí nghiệm 2: Xác định liều 5 x LD50 của E. ictaluri trên cá tra

16

3.3.1.3 Các chỉ tiêu theo dõi

17

3.3.2 Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn

17

3.3.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn

18

3.3.4 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm

18

v 
 


3.3.5 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm

19

3.3.6 Phương pháp cấy phân lập

20

3.3.7 Phương pháp cấy thuần

20

3.3.8 Phương pháp định danh sơ bộ

20

3.3.8.1 Phương pháp nhuộm gram

20

3.3.8.2 Thử nghiệm khả năng di động

21

3.3.8.3 Thử nghiệm Catalase

21

3.3.8.4 Thử nghiệm Oxidase

21

3.3.9 Định danh vi khuẩn bằng bộ kit định danh Nam Khoa (IDS 14 GNR)

22

3.3.9.1 Thử nghiệm LDC bằng kit định danh IDS 14 GNR

23

3.3.9.2 Thử nghiệm di động bằng kit định danh IDS 14 GNR

23

3.3.10 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng của cá

23

3.3.11 Phương pháp tính LD50

24

3.3.12 Phương pháp xử lí số liệu

25

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN

26

4.1 Các chỉ tiêu môi trường

26

4.2 Kết Quả Thí Nghiệm 1

27

4.2.1 Trọng lượng cá thí nghiệm

27

4.2.2 Kết quả kiểm tra kí sinh trùng

27

4.2.3 Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá

28

4.2.4 Kết quả định danh vi khuẩn

28

4.2.5 Triệu chứng và bệnh tích

31

4.2.6 Tỷ lệ cá chết

34

4.2.7 Kết quả phân lập cá còn sống sau 14 ngày gây nhiễm

36

4.2.8 Kết quả LD50

37

4.3 Kết quả thí nghiệm 2

40

4.3.1 Trọng lượng cá thí nghiệm 2

40

4.3.2 Kết quả kiểm tra kí sinh trùng

40

4.3.3 Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá

40

4.3.4 Kết quả định danh vi khuẩn

41

4.3.5 Triệu chứng và bệnh tích

41
vi 

 

4.3.6 Tỷ lệ cá chết

42

4.3.7 Kết quả phân lập cá còn sống sau 14 ngày gây nhiễm ở thí nghiệm 2

45

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

47

5.1 Kết Luận

47

5.2 Đề Nghị

47

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

vii 
 


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

LD50

Lethal Dose 50%

BNP

Bacillacy Necrosis of Pangasius

BHIA

Brain Heart Infusion Agar

BHIB

Brain Heart Infusion Broth

VP

Voges-poskauer

ONPG

O-Nitrophenyl β – D Galactopyrannoside

PAD

Phenyl Alanin Deaminnase

LDC

Lysin decarboxylase

DO

Dissolve Oxygen

TSA

Tryptic Soy Agar

PCR

Polymerase Chain Reaction

CFU

Colony Forming Unit

viii 
 


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Tỷ lệ thức ăn, nước và huyền dịch vi khuẩn
gây nhiễm thí nghiệm 1

15

Bảng 3.2: Tỷ lệ thức ăn, nước và huyền dịch vi khuẩn

gây nhiễm thí nghiệm 2

16

Bảng 3.3: Số thứ tự các đĩa giấy trong các giếng

22

Bảng 4.1: Các chỉ tiêu môi trường của quá trình thí nghiệm

26

Bảng 4.2: Trọng lượng cá trung bình của các nghiệm thức
Thí nghiệm 1

27

Bảng 4.3: Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá của các
nghiệm thức thí nghiệm 1

28

Bảng 4.4: Kết quả các phản ứng sinh hóa của E. ictaluri
bằng test định danh ISD 14 GNR của công ty Nam Khoa.

29

Bảng 4.5: Tỷ lệ cá chết của các nghiệm thức trong thí nghiệm 1

34

Bảng 4.6: Tỷ lệ nhiễm E. ictaluri (%) trong cơ thể cá còn sống
thí nghiệm 1

36

Bảng 4.7: Tỷ lệ sống và chết (%) của cá thí nghiệm
trong mỗi nồng độ pha loãng

37

Bảng 4.8: Tương quan giữa tỷ lệ chết với độ pha loãng
được tính bằng phần mềm MiniTab

38

Bảng 4.9: Trọng lượng cá trung bình của các nghiệm thức
thí nghiệm 2

40

Bảng 4.10: Mật độ vi khuẩn gây nhiễm cho cá
theo lý thuyết và theo thực tế

41

Bảng 4.11: Tỷ lệ cá chết của các nghiệm thức trong
thí nghiệm 2

43

Bảng 4.12: Tỷ lệ chết theo tính toán và theo thực tế

43

Bảng 4.13: Tỷ lệ nhiễm E. ictaluri trong cơ thể cá còn sống thí nghiệm 2

46

ix 
 


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 3.1: Thao tác cân khuẩn lạc vi khuẩn

17

Hình 3.2: Ống tiêm dùng để bơm hỗn hợp
thức ăn và vi khuẩn vào dạ dày của cá

18

Hình 3.3: Thao tác gây nhiễm cho cá

19

Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn E. ictaluri
phân lập từ cá bệnh

30

Hình 4.2: Hình dạng của vi khuẩn E. ictaluri
khi nhuộm gram

30

Hình 4.3: Kết quả định danh E. ictaluri bằng
test định danh ISD 14 GNR của công ty Nam Khoa

31

Hình 4.4: Cá thí nghiệm 1 bị xuất huyết các gốc vây và mang
sau 9 ngày gây nhiễm E. ictaluri

32

Hình 4.5: Cá thí nghiệm xuất hiện các đốm mủ trắng
trên gan thận lách ở ngày thứ 9

33

Hình 4.6: Cá thí nghiệm 2 xuất hiện các đốm mủ trắng
trên gan thận lách ở ngày thứ 5

42

x 
 

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình của các
nghiệm thức thí nghiệm 1 trong 14 ngày gây bệnh

35

Biểu đồ 4.2: Đồ thị tương quan giữa tỷ lệ chết
và nồng độ gây nhiễm

38

Biểu đồ 4.3: Đồ thị tương quan giữa độ pha loãng và tỷ lệ chết

39

Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ cá chết tích lũy trung bình của các
nghiệm thức thí nghiệm 2 trong 14 ngày gây bệnh

xi 
 

44


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt Vấn Đề

Vài năm trở lại đây, nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam ngày càng chứng tỏ được
vai trò trọng yếu của mình trong cơ cấu kinh tế nước nhà, với những thành quả đã gặt
hái và tiềm năng phát triển rộng mở trong tương lai.
Sản phẩm chế biến từ đối tượng cá tra nuôi đã cho thấy vai trò chiến lược quan
trọng của mình trong cơ cấu ngành thủy sản Việt Nam. Theo Hiệp Hội Chế Biến Và
Xuất Khẩu Thủy Sản Việt Nam (VASEP), trong 5 tháng đầu năm 2009 kim ngạch xuất
khẩu cá tra lên đến 477 triệu đô la Mỹ, trong khi đó kim ngạch xuất khẩu tôm chỉ đạt
441 triệu đô la Mỹ. Dự kiến trong toàn năm 2010, kim ngạch xuất khẩu cá tra sẽ vượt
ngưỡng 1,5 tỉ đô la Mỹ.
Tuy nhiên, bên cạnh những kết quả ấn tượng về sản lượng, kim ngạch xuất khẩu
và thị phần trên thị trường thế giới, nghề nuôi cá tra Việt Nam vẫn còn đó rất nhiều bất
cập tồn đọng, như vấn đề quản lý nghề nuôi còn chưa tốt, thiếu đồng bộ, giá cả sản
phẩm thất thường, người nuôi vẫn còn thiếu những hỗ trợ kĩ thuật cần thiết nhưng đáng
quan ngại nhất trong số đó chính là vấn đề dịch bệnh, đặc biệt là dịch bệnh gan thận mủ
do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra.
Hàng năm, dịch bệnh gan thận mủ trên cá tra do Edwardsiella ictaluri vẫn gây ra
những thiệt hại rất to lớn cho nghề nuôi cá tra đồng bằng sông Cửu Long. Bệnh này
được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1992 (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007), nguyên nhân
bùng phát dịch bệnh chủ yếu là do vùng nuôi phát triển tự phát không theo quy hoạch,
mật độ nuôi ngày càng cao nhưng thiếu các biện pháp quản lý phòng ngừa dịch bệnh.
Trước đây, bệnh thường xảy ra chỉ khoảng 1 – 2 lần/ năm, nhưng hiện nay bệnh có thể
xảy ra gần như quanh năm.
1 
 


Về tác nhân gây bệnh, vi khuẩn E. ictaluri có độc lực rất mạnh và có thể lây
truyền qua nhiều đường. Trong đó, con đường truyền lây qua đường tiêu hóa rất quan
trọng và nguy hiểm cho cá tra nhưng hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về vấn đề
này. Do đó, việc xác định được liều vi khuẩn cần thiết có thể dẫn đến biểu hiện bệnh gan

thận mủ ở cá tra thông qua con đường tiêu hóa là rất cần thiết. Từ những lý do trên, lại
được sự phân công và hỗ trợ của Khoa Thủy Sản trường Đại học Nông Lâm Thành Phố
Hồ Chí Minh, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “ Xác định LD50 của Edwardsiella
ictaluri trên cá tra bằng phương pháp gây nhiễm qua đường tiêu hóa”.
1.2 Mục Tiêu Đề Tài
Gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp cho ăn thức ăn có chứa vi khuẩn, từ đó
xác định LD50 của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.
1.3 Nội Dung Đề Tài
- Tiến hành gây cảm nhiễm cá tra với vi khuẩn E. ictaluri bằng phương pháp gây
nhiễm qua đường tiêu hóa.
- Quan sát triệu chứng bệnh tích và ghi nhận tỷ lệ cá chết.
- Tiến hành phân lập và định danh vi khuẩn.
- Khảo sát tỷ lệ cá chết, tính LD50 và đưa ra kết luận.

2 
 


 
 

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đặc Điểm Sinh Học của Cá Tra
2.1.1 Phân loại
Ngành: Chordata.
Ngành phụ: Vertebrata.
Lớp: Osteichthyes.
Bộ: Siluriformes.
Họ: Pangasiidae.

Giống: Pangasianodon.
Loài: Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1880)
2.1.2 Nguồn gốc và phân bố
Cá tra trong tự nhiên phân bố khá rộng ở vùng Đông Nam Á. Ở Việt Nam, cá tra
phân bố dọc theo khu vực sông Mêkông. Những năm trước đây, khi chưa có sinh sản
nhân tạo cá tra, thì cá bột và cá giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Cá trưởng
thành chỉ thấy trong ao nuôi, rất ít gặp trong địa phận Việt Nam do cá có tập tính di cư
ngược dòng sông Mêkông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên.
2.1.3 Đặc điểm hình thái
Cá tra có đầu rộng, dẹp bằng, mõm ngắn. Răng nhỏ mịn, răng vòm miệng chia
làm bốn đám nhỏ mỏng chia làm đường vòng cung. Có hai đôi râu, râu mép ngắn kéo
dài chưa đến gốc vây ngực.
Thân thon dài, không vảy, màu sắc đen xám trên mặt lưng của đầu và thân,
bụng màu trắng bạc, phần chót đuôi hơi đỏ, tỷ lệ giữa chiều dài và chiều rộng của đầu cá
tra lớn hơn cá basa.

3 
 


Đường bên kéo dài hoàn toàn theo chiều dọc của thân và phân nhánh bắt đầu từ
mép trên của lỗ mang đến gốc vây đuôi, mặt sau của gai vi lưng và vi ngực có răng cưa.
Cá khi còn nhỏ thì phần lưng của đầu và thân có màu xanh lục. Ngoài ra, cá còn
có hai sọc màu xanh lục chạy dài theo chiều dọc của thân, sọc này lợt dần và mất đi khi
cá lớn.
2.1.4 Điều kiện môi trường sống
Cá tra sống được ở các thủy vực nước chảy và nước tĩnh. Cá sống chủ yếu ở
thủy vực nước ngọt, cũng có thể sống ở nước lợ với nồng độ muối thấp.
Oxy hòa tan: Số lượng hồng cầu trong máu cá tra nhiều hơn trong máu các loài
cá khác. Chúng có cơ quan hô hấp phụ, có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chịu đựng

được môi trường thiếu oxy hòa tan. Hàm lượng oxy hòa tan tối ưu cho cá là 3 – 6mg/L.
Nhiệt độ: 26 – 30oC (ở 15oC cường độ bắt mồi giảm nhưng cá vẫn sống. Ở 39oC
cá bơi lội không bình thường).
pH tối ưu: 6,5 – 8 (ở pH = 5 cá mất nhớt, râu teo hoạt động chậm chạp, khi pH =
11 cá lờ đờ và có biểu hiện mất nhớt).
Độ mặn: Cá có thể chịu đựng được độ mặn từ 8 – 10o/oo, tuy nhiên cá chủ yếu
sống ở nước ngọt.
2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng
Cá sau khi tiêu hết noãn hoàng thích ăn mồi tươi sống. Vì vậy, chúng có thể ăn
thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp và trong quá trình ương nuôi nếu không được cho ăn đầy
đủ. Trong quá trình ương giống, chúng ăn động vật phù du có kích thước vừa cỡ miệng
và ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổi loại thức ăn. Trong điều kiện thiếu thức
ăn, chúng có thể sử dụng các loại thức ăn bắt buộc khác như: Mùn bã hữu cơ, thức ăn có
nguồn gốc động vật. Trong ao nuôi, cá tra có thể thích nghi với nhiều loại thức ăn khác
nhau như cám, rau, động vật đáy, …
2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng – sinh sản
2.1.6.1 Sinh trưởng
Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, lúc nhỏ cá tăng nhanh về chiều
dài. Cá ương trong ao sau 2 tháng có thể đạt chiều dài 12 cm (14 đến 15 g).
Cá trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm. Đã gặp cỡ cá trong tự nhiên 18 kg
hoặc có mẫu cá dài tới 1,8 m. Trong ao nuôi cá bố mẹ cho đẻ đạt tới 25 kg ở cá 10 tuổi.
4 
 


Nuôi trong ao 1 năm cá đạt 1 – 1,5 kg/con (năm đầu tiên), những năm về sau cá
càng tăng trọng nhanh hơn, có khi đạt tới 5 – 6 kg/năm.
2.1.6.2 Đặc điểm sinh sản
Tuổi thành thục của cá đực là 2 tuổi và cá cái là 3 tuổi, trọng lượng cá thành
thục lần đầu từ 2,5 – 3 kg. Cá tra không có cơ quan sinh dục phụ (sinh dục thứ cấp), nên

nếu chỉ nhìn hình dạng bên ngoài thì khó có thể phân biệt được cá đực hay cá cái. Ở thời
kỳ thành thục, tuyến sinh dục ở cá đực phát triển lớn gọi là buồng tinh hay tinh sào, ở cá
cái gọi là buồng trứng hay noãn sào. Tuyến sinh dục đực, cái của cá tra có thể được phân
biệt từ giai đoạn II tuy màu sắc chưa khác nhau nhiều. Các giai đoạn sau, buồng trứng
tăng về kích thước, hạt trứng màu vàng, tinh sào có màu hồng chuyển dần sang trắng
sữa. Hệ số thành thục của cá tra trong tự nhiên (P = 8 – 11 kg) được khảo sát vào khoảng
1,76 đến 12,74 (cá cái) và từ 0,73 đến 2,1 (cá đực) (Nguyễn Văn Trọng, 1994). Trong bể
nuôi vỗ, hệ số thành thục cá tra cái có thể đạt tới 19,5%.
Trong tự nhiên cá tra không sinh sản ở Việt Nam. Đến mùa sinh sản, chúng di
cư ngược dòng sông Mêkông đến bãi đẻ nằm trên sông Mêkông từ Sanbo đến
Campuchia.
Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 – 6 dương lịch. Cá
có tập tính di cư, đẻ tự nhiên trên những khúc sông có điều kiện sinh thái thích hợp thuộc
địa phận Campuchia và Thái Lan, không đẻ tự nhiên ở vùng sông của Việt Nam.
Cá đẻ trứng dính vào các giá thể, thường là rễ của loài cây ven sông Gimenila
aiatica, sau 24 giờ thì trứng nở thành cá bột và trôi về hạ nguồn.
Số lượng trứng đếm được trong buồng trứng của cá tra từ 200 ngàn đến vài triệu
trứng (sức sinh sản tuyệt đối). Sức sinh sản tương đối của cá tra có trọng lượng 3,2 kg là
139.000 trứng/ kg thể trọng. Cá đẻ trứng dính, trứng sắp đẻ có đường kính 1mm, sau khi
trương nước có thể đạt 1,5 – 1,6 mm.
2.2. Một Số Quan Niệm Về Bệnh
Tôm cá sống ở trong nước hay nói một cách khác nước là môi trường sống của
tôm cá. Tôm cá muốn sống được phải có một môi trường sống tốt đồng thời chúng phải
có khả năng thích ứng với môi trường. Nếu môi trường sống của tôm cá xảy ra những
thay đổi không có lợi cho chúng thì những con nào thích ứng được sẽ duy trì được cuộc
sống, những con không thích ứng được sẽ mắc bệnh hoặc chết. Tôm cá và môi trường
5 
 

sống là một thể thống nhất. Cá tôm mắc bệnh là kết quả tác dụng lẫn nhau giữa cơ thể và
môi trường sống (Bùi Quang Tề, 2006).
Bệnh là biểu hiện trạng thái bất thường của cơ thể sinh vật với sự biến đổi xấu của
môi trường xung quanh, cơ thể nào thích ứng thì tồn tại, không thích ứng thì mắc bệnh
và chết. Hay nói cách khác, bất cứ sự thay đổi trạng thái nào đó của cơ thể hoặc một bộ
phận, cơ quan nào làm ảnh hưởng đến chức năng sinh lý bình thường của cơ thể sinh vật
được gọi là bệnh.
Căn cứ vào nguyên nhân gây bệnh có thể chia làm 2 loại bệnh: Bệnh truyền nhiễm
và bệnh không truyền nhiễm.
Bệnh truyền nhiễm do: Vi khuẩn, nấm, virus. Tính chất lây truyền mạnh và có thể
tạo thành những ổ dịch lớn, gây chết hàng loạt và có thể nhầm lẫn với nhiễm độc hóa
học.
Bệnh không truyền nhiễm do: Môi trường, dinh dưỡng, độc tố (Dung, 2005).
2.3 Bệnh Gan Thận Mủ Trên Cá Tra
2.3.1 Sơ lược về bệnh
Bệnh mủ gan được ghi nhận đầu tiên xuất hiện trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào
cuối năm 1998 và có tên là BNP (Bacillacy Necrosis of Pangasius) (Dung và ctv, 2005).
Bệnh này gây hại nghiêm trọng về kinh tế trên cá tra nuôi thâm canh.
Bệnh xuất hiện mạnh vào mùa lũ, chất lượng nước biến động, nước chảy mạnh
cá dễ bị sốc, sức khỏe giảm. Khả năng đề kháng đối với mầm bệnh giảm vì thế bệnh dễ
dàng bộc phát, trong một vụ nuôi bệnh mủ gan có thể xuất hiện 3 - 4 lần. Tỷ lệ hao hụt
lên đến 10 - 50% tùy thuộc vào chế độ chăm sóc và vệ sinh ao (Từ Thanh Dung, 2005).
Những khu vực bị ảnh hưởng chủ yếu là những vùng có nghề nuôi cá tra phát
triển mạnh, mang tính chất công nghiệp như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và Vĩnh
Long, sau đó lây lan sang các vùng lân cận. Đặc biệt những năm gần đây bệnh này cũng
xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nghề nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc
Trăng (Từ Thanh Dung và ctv, 2003).
Bệnh do E. ictaluri có khả năng lây lan mạnh với tỷ lệ chết cao. Bệnh có thể lây
trực tiếp từ cá sang cá thông qua chất thải như phân cá bệnh hoặc do cá khỏe ăn cá bệnh,
cá chết.

6 
 


E. ictaluri có thể lây từ ao này sang ao khác qua lưới, vợt hay một số dụng cụ
khác dùng chung giữa các ao. Tuy nhiên, nếu các dụng cụ này được phơi nắng trực tiếp
thì có khả năng giết chết vi khuẩn.
Chim, cò, vật nuôi (chó, mèo…) và người cũng góp phần làm lây lan mầm bệnh.
2.3.2 Tác nhân gây bệnh
Ban đầu vi khuẩn Hafnia alvei và Plesiomonas shigelloides được cho là tác
nhân gây bệnh (Trần Thị Minh Tâm và ctv, 2003). Về sau tác nhân gây bệnh được xác
định là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra (Từ Thanh Dung và ctv, 2003).
Đặc điểm của E. ictaluri: E. ictaluri thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, là
trực khuẩn gram âm kích thước 1 x 2 – 3 μm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy
nghi, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không oxy hoá, lên men trong môi
trường glucose. E. ictaluri có từ 1 - 3 plasmid (Newton và ctv, 1989). Chức năng của
chúng vẫn chưa được làm rõ, nhưng có giả thuyết cho rằng chúng quan trọng trong việc
nâng cao tính kháng đối với kháng sinh của E. ictaluri. Vi khuẩn phát triển chậm trên
môi trường nuôi cấy, cần mất 36 - 48 giờ để hình thành những khuẩn lạc nhỏ li ti trên
môi trường thạch BHIA tại 28 – 300C, phát triển yếu hoặc không phát triển ở 370C. Khi
trong môi trường nuôi cấy có sự hiện diện của một loài vi khuẩn phát triển nhanh hơn E.
ictaluri (như Aeromonas.sp) thì khi đó chúng sẽ ức chế hoặc làm cho E. ictaluri phát
triển rất chậm (Shotts và Walman, 1990).
E. ictaluri có khả năng sinh tồn yếu, do nó chỉ sống được trong nước một thời
gian ngắn, khoảng 8 ngày (Hawke, 1979). Tuy nhiên, chúng có thể tồn tại trong bùn đến
95 ngày ở 25 oC (Plumb và Quinlan, 1986).
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có khả năng gây bệnh tự nhiên trên nhiều loài
cá như bệnh viêm ruột và nhiễm trùng máu trên cá nheo Ictalurus punctatus (Hawke,
1979, Hawke và ctv., 1981), cá dao xanh Eigemannia virescens (Kent và Lyons, 1982),
cá danio Danio devano (Waltman và ctv., 1985), và cá trê Clarias batrachus

(Kasornchandra và ctv., 1987).

7 
 


2.3.3 Đường lây truyền của E. ictaluri vào cơ thể cá
E. ictaluri có thể lây nhiễm cho cá qua nhiều con đường khác nhau:
+ Vi khuẩn trong nước có thể xâm nhập vào cơ thể cá thông qua đường mũi, đến
dây thần kinh khứu giác, đến màng não, rồi sau đó tiếp tục đến hộp sọ và da (Morrision
và Plumb, 1994). Vi khuẩn này tấn công vào mũi làm giảm chức năng của niêm mạc
mũi ở lớp màng nhầy. Khi quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy có sự hiện diện E.
ictaluri trên bề mặt màng nhầy và trong biểu mô.
+ E. ictaluri cũng có thể xâm nhập qua đường tiêu hóa. Đầu tiên vi khuẩn qua
đường miệng, phát triển ở ruột, gan, thận và cơ, sau 2 tuần gây cảm nhiễm làm ruột
trương to, đầy hơi (Francis – Floyd và ctv., 1987). Bằng con đường này thì vi khuẩn vào
mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố da. Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thể
xâm nhập qua đường tiêu hóa, qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu.
+ E. ictaluri cũng xâm nhập qua mang. Một số thí nghiệm đã chứng minh trong
suốt quá trình ngâm, vi khuẩn sống thành tập đoàn trên biểu bì mang với số lượng lớn,
sau đó gia tăng ở gan và ít phát triển ở thận sau, ruột và não (Nusbaum và Plumb, 1996).
2.3.4 Triệu chứng và bệnh tích
Triệu chứng: Cá bệnh có xu hướng tập trung ở đầu nguồn nước hoặc hai mặt của
ao, tách đàn, treo mình lơ lửng trong tầng nước, bơi lội và hô hấp chậm hơn bình thường,
các phản ứng kích thích thường chậm chạp, cá bị mất thăng bằng và bơi xoay vòng. Cá
bỏ ăn ngay sau khi nhiễm khuẩn.
Bệnh tích: Theo Từ Thanh Dung và ctv. (2003), cá tra bị nhiễm bệnh do E.
ictaluri có những triệu chứng và bệnh tích điển hình nhất là: Gan, thận, lách sưng và
hoại tử. Nếu bệnh nặng có thể phát triển thành các đốm mủ trắng có đường kính từ 1 – 3
mm khắp trên bề mặt của các cơ quan này.

8 
 


2.3.5 Phương pháp chẩn đoán bệnh
Phân lập vi khuẩn trong môi trường BHIA hoặc môi trường TSA có bổ sung
5% máu (cừu, thỏ). Đĩa cấy ủ ở nhiệt độ 28 – 30OC trong 48 giờ. Dùng KIT API 20E
hoặc Nam Khoa để định danh.
Phản ứng miễn dịch: Phản ứng ngưng kết trên phiến kính, phản ứng ELISA.
Dùng kĩ thuật PCR nhưng phức tạp và đòi hỏi kĩ thuật cao.
2.3.6 Phương pháp phòng và trị bệnh
Biện pháp phòng bệnh quan trọng nhất là quản lí môi trường nuôi tốt: Kiểm tra
các chỉ tiêu chất lượng nước như: DO, NH3, nhiệt độ, pH, độ mặn, độ kiềm,…
Các loại thuốc hóa chất dùng sẽ không có hiệu quả khi bệnh xảy ra. Cải tạo đáy ao và
hút bùn thật kĩ. Khi ao xảy ra bệnh thì nên giảm ăn, vớt bỏ và tiêu hủy cá bệnh. Dụng cụ
được sử dụng riêng để ngăn chặn mầm bệnh lây lan và khử trùng mỗi khi sử dụng.
Chọn cá giống khỏe mạnh và được kiểm tra kĩ không có mầm bệnh. Vận
chuyển cá giống đúng kĩ thuật.
2.4 Các Phương Pháp Gây Cảm Nhiễm Nhân Tạo Cho Cá
Hiện nay, để gây cảm nhiễm nhân tạo cho cá, thường có các phương pháp sau
đây: Phương pháp tiêm, phương pháp ngâm, phương pháp nuôi chung và phương pháp
đường tiêu hóa.
2.4.1 Phương pháp tiêm
Theo Nguyễn Hữu Thịnh (2008), phương pháp tiêm là phương pháp gây bệnh
bằng cách đưa trực tiếp vi khuẩn vào cá qua đường tiêm. Thông thường, tiêm vi khuẩn
vào xoang bụng hoặc cơ lưng. Phương pháp này làm cho cá bệnh nhanh do vi khuẩn
xâm nhập trực tiếp vào máu.
Hiện nay, phương pháp tiêm được xem như là phương pháp gây bệnh phổ biến
nhất trong các thí nghiệm với đối tượng cá da trơn. Theo Mai Trâm (2008), khi tiến hành

tiêm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra ở các mật độ 5,5 × 103 cfu/mL; 5,5 × 104 cfu/mL;
5,5 × 105 cfu/mL; 5,5 × 106 cfu/mL, cá tra thí nghiệm bắt đầu chết sau 3 ngày với các tỷ
lệ chết tương ứng là 93,55%, 95,65%, 97,4%, 99,77%. Theo Williams và Lawrence
(2005) sử dụng mật độ vi khuẩn E. ictaluri R4383WT tăng dần 5,2 x 103 cfu/mL; 5,2x
104 cfu/mL và 5,2x 105 cfu/mL tiêm trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus giống, trong
khoảng nhiệt độ nước 26oC cũng gây chết cá với tỷ lệ lần lượt là 67,2%, 100% và 100%.
9 
 


Trong khi đó E. ictaluri WT tiêm với mật độ 5,7 x 103 cfu/mL; 5,7 x 104 cfu/mL; 5,7 x
105 cfu/mL; 5,7 x 106 cfu/mL gây chết cá với tỷ lệ là tăng dần từ 63,5% đến 100%.
2.4.2 Phương pháp ngâm
Theo Nguyễn Hữu Thịnh (2008), phương pháp ngâm là phương pháp gây bệnh
bằng cách cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá thông qua mang, mũi, đường bên.
Phương pháp này tiến hành bằng cách ngâm cá trong một thể tích nước cố định có pha
vi khuẩn trong một khoảng thời gian xác định.
Cùng với phương pháp tiêm, phương pháp ngâm cũng là một phương pháp
được áp dụng rất phổ biến trong các thí nghiệm gây cảm nhiễm nhân tạo với đối tượng
cá da trơn. Theo Mai Trâm (2008), khi tiến hành ngâm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra ở
các mật độ 5,5 × 102 cfu/mL; 5,5 × 103 cfu/mL; 5,5 × 104 cfu/mL; 5,5 × 105 cfu/mL, cá
tra thí nghiệm bắt đầu chết sau 6 ngày với các tỷ lệ chết tương ứng là 1,35%, 2,75%,
12,6%, 66,9%. Theo Williams và Lawrence (2005) sử dụng E. ictaluri R4383 WT và E.
ictaluri R4383 HM với mật độ 7 x 107 cfu/mL và 7,2 x 107 cfu/mL ngâm trên cá da trơn
Mỹ, kết quả cho thấy tỷ lệ cá chết lần lượt là 85% và 90%.
2.4.3 Phương pháp nuôi chung
Là phương pháp gây bệnh bằng cách nuôi chung cá thí nghiệm với cá đã nhiễm
bệnh từ trước. Trong quá trình nuôi, cá thí nghiệm sẽ bị lây nhiễm từ cá bệnh thông qua
tiếp xúc và môi trường nước. Hiện nay phương pháp này vẫn chưa được sử dụng nhiều
trong các thí nghiệm gây cảm nhiễm với đối tượng cá tra.

2.4.4 Phương pháp đường tiêu hóa
Là phương pháp gây bệnh bằng cách cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá thí
nghiệm qua con đường tiêu hóa. Theo phương pháp này, vi khuẩn sẽ được trộn với thức
ăn rồi đưa vào ống tiêu hóa của cá bằng dụng cụ chuyên biệt. Cũng như phương pháp
nuôi chung, hiện nay vẫn chưa có nhiều những nghiên cứu về việc áp dụng phương pháp
này trên đối tượng cá tra.

10 
 


2.5 Sơ Lược Về LD50
2.5.1 Định nghĩa
LD50 ( Lethal dose 50%) là kí hiệu liều chết một nửa, nghĩa là lượng thuốc cần
thiết để gây chết 50% cá thể thí nghiệm, được tính bằng mg hoạt chất/kg trọng lượng
cơ thể. Người ta thường chia làm ba nhóm:
Loại thuốc có độ độc mạnh khi LD50 = 100 mg/kg thể trọng.
Loại thuốc có độ độc trung bình khi LD50 = 100 đến 300 mg/kg thể trọng.
Loại thuốc ít độc khi có LD50 trên 300 mg/kg thể trọng.
Như vậy, độ độc càng cao thì trị số LD50 càng nhỏ.
Trong trường hợp khi tiến hành gây bệnh thực nghiệm trên cá bằng vi khuẩn,
LD50 được hiểu là lượng vi khuẩn cần thiết để gây chết 50% số cá thí nghiệm, được
tính bằng CFU/ đơn vị trọng lượng cá.
2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến LD50
Mỗi loại thuốc khác nhau thì có trị số LD50 khác nhau.
Liều LD50 giữa các sinh vật khác nhau cũng khác nhau và cũng có thể khác
nhau giữa cá thể đực và cá thể cái.
Liều LD50 của thuốc đối với cơ thể còn phụ thuộc vào cách thức xâm nhập của
thuốc vào cơ thể. Cùng một loại thuốc với cùng một cơ thể, khi xâm nhập qua miệng
vào đường ruột tác động có thể khác xâm nhập qua da, vì vậy liều LD50 qua miệng cũng

có thể khác liều LD50 qua da.
2.5.3 Phương pháp xác định LD50 theo Reed và Muench (1938)
Là phương pháp thường được sử dụng tính toán trong các thí nghiệm để chuẩn
độ virus, vi khuẩn bảo hộ 50% động vật thí nghiệm và liều gây chết 50% động vật thí
nghiệm.

11 
 


Trên thực tế thường khó tìm ra độ pha loãng của canh trùng với liều gây chết
50% động vật thí nghiệm, do đó phải tìm giữa hai nồng độ pha loãng để có tỷ lệ gây chết
50%.
Độ pha loãng của canh trùng thường pha loãng gấp 10 lần: 10-1,…, 10-9, 10-10.
* Cách tính LD50
Tính số cá thể chết và sống trong mỗi nhóm thí nghiệm, sau đó cộng dồn từ
thấp đến cao.
Tính tỷ lệ chết trên tổng của cột chết và cột sống cộng dồn.
Tính khoảng cách tương ứng giữa hai độ pha loãng có tỷ lệ chết cao hơn và
thấp hơn 50% gần nhất.
pd = (> 50% - 50%)/(> 50% - < 50%)
LD50 = pd x (độ pha loãng thấp hơn 50% - độ pha loãng) + độ pha loãng cao hơn 50%.
Hoặc log LD50 = [log (> 50%)] + [log (10-1) x pd] = y →LD50 = 10y.
2.5.4 Một số nghiên cứu về LD50 của E. ictaluri
Theo Mai Trâm (2008), khi gây cảm nhiễm bằng cách ngâm cá tra với các mật
độ vi khuẩn E. ictaluri là 5,5 × 102 cfu/mL; 5,5 × 103 cfu/mL; 5,5 × 104 cfu/mL; 5,5 ×
105 cfu/mL, sau 14 ngày theo dõi tính được LD50 là 2,34 × 105 cfu/mL (theo Reed –
Muench) và 3,09 × 105 cfu/mL (theo phương trình tương quan hồi quy tuyến tính). Khi
gây cảm nhiễm bằng cách tiêm cá tra với các mật độ vi khuẩn E. ictaluri là 5,5 × 103
cfu/mL; 5,5 × 104 cfu/mL; 5,5 × 105 cfu/mL; 5,5 × 106 cfu/mL, sau 14 ngày theo dõi

tính được LD50 là 2,13 × 104 cfu/mL (theo Reed – Muench) và 1,86 × 104 cfu/mL (theo
phương trình tương quan hồi quy tuyến tính).
Hảo và Thắng (2008), đã tiến hành gây cảm nhiễm cá tra có trọng lượng
khoảng 30 g bằng phương pháp tiêm E. ictaluri, trong thí nghiệm cá tại các nghiệm thức
được tiêm 0,2 mL vi khuẩn E. ictaluri với những nồng độ khác nhau. Kết quả sau cùng
của thí nghiệm cho phép xác định được liều LD50 là 2,5 × 104 cfu/mL.

12 
 


Theo Plumb và ctv. (1987), khi tiến hành gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri
trên cá nheo Châu Âu (Silurus glanis) và cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) bằng phương
pháp tiêm, sau 15 ngày theo dõi đã tính được LD50 của 2 loài trên lần lượt là 5,4 × 106
cfu/mL và 7,1 × 104 cfu/mL.
Theo Groff và ctv. (1990), khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên cá hồi
Bắc Mỹ ở các mật độ vi khuẩn tương ứng là 4 × 106 cfu/mL, 4 × 107 cfu/mL, 4 × 108
cfu/mL, sau thí nghiệm tính được LD50 là 3,4 × 107 cfu/mL.

13