BƯỚC ĐẦU NUÔI CẤY LEPTOSPIRA DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN HUYẾT THANH HỌC LEPTOSPIROSIS

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

KHÓA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
BƯỚC ĐẦU NUÔI CẤY LEPTOSPIRA DÙNG TRONG CHẨN
ĐOÁN HUYẾT THANH HỌC LEPTOSPIROSIS

Sinh viên thực hiện: NGÔ NGỌC ANH THƯ
Lớp: DH05TY
Ngành: Thú Y
Niên khóa: 2005 – 2010

THÁNG 08/2010

 
 


BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y
***********************

NGÔ NGỌC ANH THƯ

BƯỚC ĐẦU NUÔI CẤY LEPTOSPIRA DÙNG TRONG CHẨN
ĐOÁN HUYẾT THANH HỌC LEPTOSPIROSIS

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ thú y

Giáo viên hướng dẫn
PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
ThS. NGUYỄN THỊ KIM LOAN

THÁNG 08/2010

ii 
 


LỜI CẢM TẠ
Thành kính ghi ơn
Cha Mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ và hy sinh để cho con có được như
ngày hôm nay.
Chân thành cám ơn
Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM
Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi - Thú y, Bộ môn Vi sinh - Truyền nhiễm, cùng
toàn thể Thầy Cô Khoa Chăn nuôi - Thú y.
Lòng biết ơn sâu sắc đến
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải
ThS. Nguyễn Thị Kim Loan
BSTY. Lê Thị Hà
Đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực tập tốt
nghiệp.
Ngô Ngọc Anh Thư

iii 
 

TÓM TẮT LUẬN VĂN
Đề tài nghiên cứu “Bước đầu nuôi cấy Leptospira dùng trong chẩn đoán huyết
thanh học Leptospirosis” được tiến hành tại Phòng Vi sinh, Bộ môn Vi sinh - Truyền
nhiễm, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường đại học Nông Lâm Tp. HCM thời gian từ tháng
03/2010 đến 07/2010.
Kết quả thu được:
Từ hai bộ kháng nguyên Leptospira của viện Pasteur TP. HCM gồm 12 serovars,
đề tài đã nuôi cấy thử nghiệm thành công Leptospira trên môi trường EMJH. Bộ kháng
nguyên thứ nhất nuôi cấy thành công 8 serovars với tỷ lệ nhiễm ở cấy chuyển lần 1 là 75
%; lần 2 là 12,5 %. Bộ kháng nguyên thứ hai nuôi cấy thành công 10 serovars với tỷ lệ
nhiễm ở cấy giống lần 1 là 58,33 %; lần 2 là 30 %. Canh cấy đạt mật độ 4+ khoảng 6 – 8
ngày sau nuôi cấy.
Xét nghiệm MAT định tính mẫu huyết thanh chuột thu được từ thực địa, tỷ lệ
dương tính ở bộ kháng nguyên Leptospira của viện Pasteur TP. HCM và bộ kháng
nguyên Leptospira nuôi cấy thử nghiệm đều là 40 %. Xét nghiệm MAT định lượng, tỷ lệ
dương tính ở bộ kháng nguyên Leptospira của viện Pasteur là 36,67 %, tỷ lệ dương tính ở
bộ kháng nguyên Leptospira nuôi cấy là 40 %.

iv 
 


MỤC LỤC
Trang tựa ........................................................................................................................... i
Lời cảm tả ........................................................................................................................ ii
Tóm tắt luận văn .............................................................................................................. iii
Mục lục ............................................................................................................................ iv
Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................................ vi
Danh sách các bảng ........................................................................................................ vii
Danh sách các hình ........................................................................................................ viii

Chương I: MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2 Mục đích và yêu cầu ................................................................................................. 2
Chương II: TỔNG QUAN ................................................................................................ 3
2.1 Sơ lược về Leptospira ............................................................................................. 3
2.1.1 Đặc điểm vi khuẩn học ............................................................................................. 3
2.1.2 Sự phân bố trong tự nhiên ................................................................................. 7
2.1.3 Loài cảm thụ ............................................................................................................. 8
2.2 Các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm đối với Leptospira ....................... 10
2.2.1 Chẩn đoán vi khuẩn học ......................................................................................... 10
2.2.2 Chẩn đoán huyết thanh học .................................................................................... 12
Chương III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 14
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện thí nghiệm ............................................................. 14
3.1.1 Thời gian ................................................................................................................ 14
3.1.2 Nơi thực hiện thí nghiệm ....................................................................................... 14
3.2 Vật liệu ...................................................................................................................... 14
3.2.1 Thiết bị và hóa chất dùng trong thí nghiệm ........................................................... 14
3.2.2 Môi trường nuôi cấy ............................................................................................... 14
3.2.3 Giống Leptospira .................................................................................................. 14

v 
 


3.2.4 Huyết thanh dùng trong thí nghiệm ....................................................................... 15
3.3 Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 15
3.4 Phương pháp thực hiện.............................................................................................. 15
3.4.1 Nuôi cấy thử nghiệm kháng nguyên Leptospira ở điều kiện hiện có của phòng thí
nghiệm ............................................................................................................................. 15
3.4.1.1 Đánh giá tình trạng giống và xử lý giống bị vấy nhiễm vi khuẩn trước khi nuôi

cấy (theo tài liệu chẩn đoán Leptospira - Viện Pasteur Paris). ...................................... 15
3.4.1.2 Nuôi cấy và đánh giá sự phát triển của kháng nguyên Leptospira ................... 16
3.4.2 Đánh giá hiệu quả bộ kháng nguyên nuôi cấy thử nghiệm bằng kỹ thuật vi ngưng
kết MAT .......................................................................................................................... 17
3.4.2.1 Cách tiến hành .................................................................................................... 17
3.4.2.2 Tiến hành phản ứng vi ngưng kết MAT ............................................................. 17
3.5 Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm ......................................................................... 21
3.6 Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................................ 21
Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 22
4.1 Kết quả về đánh giá tình trạng giống trước khi nuôi cấy .......................................... 22
4.2 Thời gian xuất hiện vẩn đục, mật độ xoắn thể đạt được tương ứng và sự vấy nhiễm vi
khuẩn trong canh cấy ...................................................................................................... 24
4.3 Hiệu quả của bộ kháng nguyên nuôi cấy trong điều kiện hiện có của phòng thí
nghiệm ............................................................................................................................. 30
Chương V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 33
5.1 Kết luận .................................................................................................................... 33
5. 2 Tồn tại ...................................................................................................................... 33
5.3 Đề nghị ...................................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 34

vi 
 


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
EMJH

Ellinghausen - McCullough cải tiến bởi Johnson và Harris

MAT

Microscopic Agglutination Test

PCR

Polymerase Chain Reaction

ADN

Acid Deoxyribonucleic

PBS

Phosphate Buffer Saline

KN

Kháng nguyên

HT

Huyết thanh

KN

Kháng nguyên

SLNK

Số lần ngưng kết

TSLNK

Tổng số lần ngưng kết

OIE

The World Organisation for Animal Health

vii 
 


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các serogroups và serovars tương ứng với các loài trong giống Leptospira .. 4
Bảng 2.2: Các đặc tính dùng phân biệt L. interrogans và L. biflexa ............................... 5
Bảng 2.4: Sự phân bố một số serogroups của L. interrogans trên thế giới ...................... 8
Bảng 2.5: Tính mẫn cảm của các loài ký chủ với các serovars ....................................... 9
Bảng 2.6: Các serogroups đại diện cho các chủng Leptospira dùng sản xuất kháng 3 
Bảng 3.1: Các chỉ tiêu đánh giá tình trạng giống và xử lý giống bị vấy nhiễm vi khuẩn 15
Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm và các chỉ tiêu theo dõi ...................................................... 17
Bảng 4.1 : Đánh giá mật độ và sự vấy nhiễm hai bộ kháng nguyên Leptospira của viện
Pasteur Tp. HCM trước khi cấy chuyển ......................................................................... 22 
Bảng 4.2: Kết quả theo dõi mật độ xoắn khuẩn và sự vấy nhiễm của các canh cấy trong 
10 ngày ở bộ kháng nguyên 1 ........................................................................................ 24
Bảng 4.3: Kết quả theo dõi mật độ và sự vấy nhiễm các canh cấy trong 10 ngày sau khi  
cấy chuyển lần 2 ở bộ kháng nguyên 1 .......................................................................... 26
Bảng 4.4: Kết quả theo dõi mật độ và sự vấy nhiễm canh cấy trong 10 ngày ở bộ kháng  
nguyên 2 ........................................................................................................................ 27
Bảng 4.5: Kết quả theo dõi mật độ và sự vấy nhiễm trong 10 ngày sau khi cấy chuyển lần

2 ở bộ kháng nguyên 2 .................................................................................................... 29 
Bảng 4.6: Kết quả các mẫu dương tính khi thực hiện MAT ......................................... 30
Bảng 4.7: So sánh hiệu giá kháng thể giữa hai bộ kháng nguyên .................................. 31

viii 
 


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1: Mô tả hình thái của Leptospira ........................................................................ 5
Hình 2.2: Leptospira dưới kính hiển vi điện tử (độ phóng đại 6000 lần) ........................ 6
Hình 3.1: Sơ đồ thực hiện kỹ thuật MAT định tính ....................................................... 19
Hình 4.1: Tiêu bản nhuộm canh trùng trước khi cấy chuyển ......................................... 23
Hình 4.2: Leptospira được nuôi cấy trong môi trường EMJH ở ngày thứ 2 ................. 28
Hình 4.3: Tiêu bản nhuộm canh trùng nuôi cấy ............................................................. 28
Hình 4.4: Kết quả phản ứng vi ngưng kết MAT dưới kính hiển vi nền đen .................. 32

ix 
 


Chương I
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Leptospirosis là bệnh chung giữa người và thú do các xoắn thể (spirochete) thuộc
giống Leptospira gây ra. Dựa vào đặc tính huyết thanh học, tác nhân gây bệnh chung
giữa người và thú, Leptospira interrogans, được chia thành 220 serovars với hơn 23
serogroups. Nhiễm trùng Leptospira trên người thường chiếm tỷ lệ cao ở các nước nhiệt
đới hơn là các nước ôn đới do điều kiện môi trường, hoạt động nghề nghiệp thường
xuyên tiếp xúc các yếu tố có nguy cơ tồn trữ Leptospira (nông nghiệp, thú y, công nhân

giết mổ, công nhân vét cống rãnh,...).
Chẩn đoán nhiễm trùng Leptospira chủ yếu dựa vào vi khuẩn học và huyết thanh
học. Tuy nhiên, xét nghiệm huyết thanh học được xem là phương pháp thông dụng trong
chẩn đoán Leptospirosis, trong đó kỹ thuật MAT (Microscopic Agglutination Test) được
sử dụng nhiều nhất do tính đặc hiệu, độ nhạy và cho kết quả nhanh. MAT cho phép phát
hiện nhanh kháng thể IgG trong huyết thanh nên kỹ thuật này được xem như một công cụ
cho điều tra về bệnh do Leptospira trên người, thú và nguồn lưu trữ xoắn thể này trong tự
nhiên (Ajay R.B et al, 2003; Ganière J.P et al, 2001). Ngoài ra, việc phát hiện, loại thải
thú mang trùng các serogroups của Leptospira và các nghiên cứu gây bệnh trên thú thí
nghiệm với các chủng Leptospira đều có sự hỗ trợ của MAT (Tucunduva de Faria M et
al, 2008). Theo tài liệu của Viện Pasteur Paris (2000), kỹ thuật MAT luôn đòi hỏi nguồn
kháng nguyên sống Leptospira được nuôi cấy ở ngày thứ 6 đến ngày thứ 10, do vậy việc
sản xuất và bảo quản kháng nguyên là công việc bắt buộc ở các phòng thí nghiệm chẩn
đoán Leptospirosis. Vấn đề đặt ra cho việc sản xuất kháng nguyên sống là yêu cầu về chỉ
tiêu vi sinh (không tạp nhiễm giữa các serogroups của Leptospira, không vấy nhiễm vi
sinh vật khác, nồng độ xoắn thể đạt tiêu chuẩn 108 Leptospira/ml).
1 
 


Việc nuôi cấy Leptospira là công việc không dễ dàng, nghiên cứu tự nuôi cấy
Leptospira từ bộ kháng nguyên Lep MAT – kit của Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí
Minh sẽ cho phép khi cần thiết chủ động nguồn kháng nguyên trong chẩn đoán
Leptospirosis phục vụ sản xuất và nghiên cứu.
1.2 Mục đích và yêu cầu
Mục đích
Bước đầu nuôi cấy thử nghiệm bộ kháng nguyên sống Leptospira để phục vụ cho
chẩn đoán huyết thanh học Leptospirosis
Yêu cầu
Nuôi cấy kháng nguyên sống Leptospira trong môi trường chuyên biệt cho

Leptospira EMJH (Ellinghausen - McCullough cải tiến bởi Johnson và Harris).
Đánh giá mức độ thuần khiết của canh cấy nuôi cấy từ ngày thứ 2 đến ngày thứ
10 sau nuôi cấy.
Đánh giá mật độ Leptospira trong canh trùng nuôi cấy từ ngày thứ 2 đến ngày
thứ 10 sau nuôi cấy.
Đánh giá hiệu quả của bộ kháng nguyên tự nuôi cấy bằng kỹ thuật MAT
(Microscopic Agglutination Test) trên huyết thanh chuột được bẫy bắt ở khu vực quận
Thủ Đức.

2 
 


Chương II
TỔNG QUAN
2.1 Sơ lược về Leptospira
2.1.1 Đặc điểm vi khuẩn học
 Phân loại
Theo khóa phân loại học của Bergey (1994), Leptospira thuộc:
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Spirochaetales
Họ: Leptospiraceae
Giống: Leptospira
Loài: gồm 12 loài (L. alexanderi, L. biflexa, L.
borgpetersenii, L. fainei, L. inadai, L. interrogans, L. kirschnei, L. noguchii, L.
santarosai, L. weillii, L. meueri và L. wjolbacchii). Ngoài ra, dựa vào đặc tính huyết
thanh học, các loài được phân thành các serogroups với các serovars đại diện được trình
bày ở bảng 2.1.

3 

 


Bảng 2.1: Các serogroups và serovars tương ứng với các loài trong giống Leptospira
Loài

Serovars
australis

Australis

bratislava

Australis

bataviae

Bataviae

canicola

Canicola

hebdomadis

Hebdomadis

icterohaemorrhagiae

Icterohaemorrhagiae

copenhageni

Icterohaemorrhagiae

lai

Icterohaemorrhagiae

pomona

Pomona

pyrogenes

Pyrogenes

hardjo

Sejroe

L.alexanderi

manhao3

Manhao

L.fainei

hustbridge

Hustbridge

L.inadai

lyme

Lyme

L.kirsxhneri

bim

Autumnalis

cynopterie

Cynopterie

grippotyphosa

Grippotyphosa

mozdok

Pomona

panama

Panama

L.meyeri

semaranga

Semaranga

L.borgpetersenii

ballum

Ballum

castellonis

Ballum

javanica

Javanica

sejroe

Sejroe

tarassovi

Tarassovi

L.welli

celledoni

Celledoni

L.noguchii

fortbragg

Autumnalis

L.santarosai

brasiliensis

Bataviae

georgia

Mini

L.biflexa

patoc

Semaranga

L.wolbachii

codice

L. interrogans

4 
 

Serogroups


(Nguồn: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA và ctv, 2003)

Trong số 12 loài của giống Leptospira, L. interrogans được biết là loài gây bệnh
và L. biflexa là loài hoại sinh không gây bệnh. Theo Quinn (1998), một số tính chất có
thể giúp phân biệt L. interrogans và L. biflexa được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng2.2 Các đặc tính dùng phân biệt L. interrogans và L. biflexa
Đặc tính

L. interrogans

L. biflexa

Khả năng gây bệnh

+

-

Nuôi cấy ở 13 0C/môi trường EMJH

-

+

-

+

+

-

Ức chế phát triển khi có mặt của
8 - azaguanine (225 μg/ml)
Biến dạng hình cầu khi có NaCl 1 mol
Ghi chú: (+): dương tính, (-): âm tính

 Hình thái
Leptospira có kích thước (6 – 20 μm x 0,1 μm). Tế bào có dạng xoắn nên gọi là
xoắn thể với các vòng xoắn mảnh (18 - 30 vòng), rất sát nhau nên chúng không được phát
hiện dưới kính hiển vi quang học, hai đầu ngoài cùng của tế bào uốn cong như hình móc.
Leptospira di động mạnh nhờ sự co rút của sợi trục, quay hướng dọc, ngang và
xoay tròn trong khi toàn bộ tế bào vẫn giữ nguyên do sự vận động của sợi trục nguyên
sinh chất và làm cho toàn bộ tế bào xoắn trùng chuyển động theo.

Hình 2.1: Mô tả hình thái của Leptospira (12)
5 
 


Hình 2.2: Leptospira dưới kính hiển vi điện tử (độ phóng đại 6000 lần) (12)

Với đặc tính di động toàn thân, đường kính tế bào rất nhỏ và sự mềm dẻo cho phép
xoắn thể qua lọc có đường kính lỗ lọc từ 0,45 μm và 0,22 μm dễ dàng. Dựa vào đặc tính
này, trong phòng thí nghiệm, Leptospira có thể được tách ra khỏi các canh cấy bị vấy
nhiễm vi khuẩn khác (9).
Xoắn thể không bắt màu dễ dàng các phẩm nhuộm aniline thông thường, mà phải
dùng các phương pháp nhuộm đặc biệt như Romanowsky, nhuộm thấm bạc Fontana Tribondeau và có thể nhuộm bằng phương pháp Giemsa (Carter, 1994)
 Đặc điểm nuôi cấy
Leptospira hiếu khí tuyệt đối, chúng mọc rất chậm (từ 4 - 5 ngày đến 1 tháng hoặc
hơn 1 tháng) tùy theo chủng, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển (28 – 30 OC), tránh
hoàn toàn ánh sáng, cần môi trường giàu dưỡng chất với pH (7,2 - 7,4) và sẽ mọc tốt nếu
thêm vào môi trường 5 – 10 % huyết thanh bò.
Vitamin B12, glycerol, pyruvate, tween 80 và các yếu tố khoáng rất cần thiết cho
sự phát triển của Leptospira. Trong môi trường chuyên biệt (EMJH: Ellighausen - Mc
Culloungh - Johnson - Harris) với đầy đủ nhu cầu O2, có thể thu hoạch đến 109
Leptospira/ml (9).

6 
 


 Cấu trúc kháng nguyên
Theo Brouqui và ctv (1990), Leptospira có 2 loại kháng nguyên là kháng nguyên
bề mặt (P) và kháng nguyên thân (S):
Kháng nguyên bề mặt: có bản chất là protein-polysaccharide, không chịu nhiệt,
nằm ở lớp màng ngoài, một số mang các vị trí quyết định kháng nguyên, nhờ đó mà ta có
thể xác định được các serovars và serogroups trong phản ứng ngưng kết.
Kháng nguyên thân: có cấu tạo là lipopolysaccharide, chịu nhiệt, các kháng nguyên
này nằm ở tế bào và một số đặc trưng cho serogroups với các vị trí quyết định kháng
nguyên đặc hiệu của serovars.

Do sự khác biệt về cấu trúc kháng nguyên, Leptospira có rất nhiều serogroups khác
nhau, mỗi serogroups có nhiều biến thể huyết thanh học gọi là serovars. Cho đến nay, có
khoảng 23 serogroups và hơn 220 serovars khác nhau được tìm thấy, sự phân bố các
serovars có khuynh hướng kết hợp với vật chủ chuyên biệt, một số serovars có thể hiện
diện ở nhiều vật chủ và một vật chủ có thể chứa nhiều serovars. Ngoài ra, các serovars
còn được phân tán theo tính đa dạng về vùng địa lí (Nguyễn Quang Thông, 2004)
2.1.2 Sự phân bố trong tự nhiên
Trong tự nhiên, Leptospira thường được tìm thấy trong đất, nước thải chăn nuôi,
nước cống rãnh, nước ao hồ tù động, …Ngoài ra, ở động vật (thú nuôi, thú hoang) cũng
là nguồn mang trùng và bài thải xoắn thể bên cạnh nguồn lưu trữ tự nhiên dồi dào và phát
tán mạnh mẽ xoắn thể ở loài gậm nhắm. Leptospira thường hiện diện trong tự nhiên dưới
dạng các ổ chứa sau:
+ Ổ chứa thường xuyên: chủ yếu là loài gặm nhấm, gồm tất cả các loài chuột,
nhất là chuột lớn mang xoắn thể và bài thải qua nước tiểu.
+ Ổ chứa không thường xuyên: chủ yếu là gia súc, nhưng không phải bất cứ loài
nào cũng mang trùng Leptospira và gia súc không mang suốt đời như loài gặm nhấm.
+ Ổ chứa tự nhiên: chủ yếu là thú rừng như cầy, cáo, nhím… xoắn thể luôn được
bài thải ra ngài qua nước tiểu, từ đó người và gia súc dễ mắc phải.
Leptospira phân bố khắp nơi trên thế giới, đặc biệt các serogroups của L.
interrogans xuất hiện ở nhiều quốc gia trên nhiều loài động vật khác nhau
7 
 


Bảng 2.4: Sự phân bố một số serogroups của L. interrogans trên thế giới
Serogroups

Động vật mang

Động vật mắc bệnh

Phân bố

trùng
Icterohaemorrhagiae

Loài gậm nhắm

Chó, mèo, gia súc khác

Khắp nơi

Canicola

Chó

Heo, gia súc khác

Khắp nơi

Ponoma

Heo, gia súc khác,

Ngựa, chó, dê, gia súc

Khắp nơi

gậm nhắm

khác

Loài gậm nhắm

Ngựa, chó, dê, gia súc

Grippotyphosa

Khắp nơi

khác
Autumnalis

Loài gậm nhắm

Chó, gia súc khác

Đông Nam Á, Nhật,
Mỹ

Bataviae

Chuột, gậm nhắm

Chó, mèo

khác
Australis

Chuột

Đông Nam Á, Châu
Âu, Châu Phi, Nhật

Chó, heo, gia súc khác

Âu, Úc, Mỹ, Nhật,
Đông Nam Á

Hebdonalis

Loài gậm nhắm

Chó, gia súc khác

Nhật

Pyrogenes

Chuột

Ballum

Chuột

Chuột, mèo, heo

Âu, Mỹ, Israel

Mitis

Heo

Gia súc

Âu, Úc, Mỹ, Nam Mỹ

Đông Nam Á

(Nguồn: Nguyễn Việt Lan, 1996)

2.1.3 Loài cảm thụ
Trong tự nhiên, Leptospira thường bắt gặp ở: bò, chó, heo, ngựa, cừu, dê, mèo và
ở thú hoang dã, báo là loài dễ nhiễm xoắn thể Leptospira. Theo Quinn (1998), mỗi ký
chủ có tính cảm thụ với các serovars khác nhau

8 
 


Bảng 2.5: Tính mẫn cảm của các loài ký chủ với các serovars
Serovars

Loài ký chủ
Trâu bò

australis

+

ratislabva

+

Heo

Chó

Ngựa

Cừu

Gậm nhắm

Thú hoang dã
+

+

+

autumnalis

+

+

ballum

+

+

bataviae

+

canicola

+

+
+

+

+

hebdomadis

+

szwajizak

+

icterrohaemorrphagiae

+

copenhageni

+

pomona

+

balcanica

+

hardjo

+

saxkoebing

+

sejroe

+

tarassovi

+

+

+

+

+

+
+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Trong phòng thí nghiệm, thường dùng chuột lang để gây bệnh (đặc biệt là chuột
lang non): Leptospira được tiêm qua đường xoang bụng hoặc dưới da của chuột lang. Sau
khi tiêm 2 - 3 ngày, chuột bị sốt (40,5 - 41,5 OC) trong 3 ngày kèm các triệu chứng (gầy
đi, niêm mạc mắt và da có màu vàng), xuất huyết sau 6 - 12 ngày, thân nhiệt hạ và chết.
Người cũng mắc bệnh do súc vật truyền sang qua niêm mạc hay vết thương ở da
cũng có thể qua đường tiêu hóa (như ăn phải thức ăn nhiễm nước tiểu của chuột) hay tiếp
xúc trực tiếp với môi trường có chứa Leptospira thông qua các hoạt động nghề nghiệp
(công nhân lò mổ, người chăn nuôi, thú y viên, nhân viên phòng thí nghiệm, công nhân

9 
 


làm vệ sinh cống rãnh, người làm công việc nông nghiệp) và các sinh hoạt giải trí trong
môi trường nước.
2.2 Các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm đối với Leptospira
2.2.1 Chẩn đoán vi khuẩn học
 Phương pháp phân lập thông thường
- Lấy mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm được lấy dựa vào sự tiến triển của bệnh: trong tuần lễ đầu, bệnh phẩm
thường là máu, dịch não tủy; từ ngày thứ 12 trở đi thì lấy nước tiểu, nội tạng. Trong
trường hợp sảy thai thì lấy màng thai và thai sảy.
- Nuôi cấy trong môi trường chuyên biệt
Bệnh phẩm (ngay sau khi lấy) phải được cấy nhanh nhất có thể vào môi trường chuyên
biệt cho Leptospira (EMJH) với tỷ lệ bệnh phẩm là 1 - 10 % thể tích môi trường nuôi
cấy:
Máu: nhỏ 5 - 10 giọt máu vào ống nghiệm đầu tiên có chứa 10 ml môi trường
EMJH (xem như nồng độ thứ nhất), tiếp tục pha loãng bệnh phẩm trong môi trường
EMJH với tỷ lệ 1/100, 1/1000 và 1/10000 nhằm hạn chế các yếu tố (sẵn có trong máu) có

thể ức chế sự phát triển của xoắn thể.
Nước tiểu: nhỏ vài giọt nước tiểu vào môi trường EMJH, tiếp tục pha loãng nước
tiểu trong môi trường EMJH theo cấp số 10 lần. Để loại bỏ vi khuẩn tạp nhiễm có trong
nước tiểu, việc lọc canh cấy với màng lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 µm sau đó 0,22 µm
trước khi cấy chuyển sang môi trường EMJH có và không bổ sung 5 fluoro-uracile (ức
chế sự phát triển của vi khuẩn) là rất cần thiết.
Nội quan: thận hay gan được nghiền nát trong túi dập mẫu hay trong syringe vô
trùng, sau đó pha loãng với EMJH ở 3 độ pha loãng liên tiếp nhau (1/10, 1/100 và
1/1000).
Việc nuôi cấy được thực hiện ở 28 - 30 0C, trong bóng tối do tính nhạy cảm tự
nhiên của Leptospira với ánh sáng. Ngoài ra, Leptospira cần O2 cho sự phát triển, do vậy
nuôi cấy với chế độ lắc sẽ giúp đạt được nồng độ xoắn thể cao trong canh cấy.

10 
 


- Theo dõi và đánh giá kết quả nuôi cấy
Việc theo dõi sự xuất hiện của Leptospira trong canh cấy được thực hiện mỗi tuần
và theo dõi liên tục trong 1 - 2 tháng (tùy từng chủng Leptospira) bằng cách quan sát
canh cấy dưới kính hiển vi nền đen (vật kính x 10), xoắn thể được phát hiện nhờ vào đặc
điểm hình dạng và sự di chuyển của chúng. Ngoài ra, việc đánh giá mật độ xoắn thể có
trong canh cấy còn được thực hiện dựa vào các cách sau đây
Mật độ xoắn thể có trong 1 hiển vi trường: (+) khi có vài xoắn thể trong một hiển
vi trường; (4+) sự dày đặc của xoắn thể trong hiển vi trường, chúng tạo thành nhiều lớp
chồng chất lên nhau.
Buồng đếm Petroff-Hauser, cho phép xác định số lượng cụ thể của xoắn thể có
trong canh cấy.
Máy quang phổ: cho phép xác định số lượng xoắn thể hiện diện trong canh cấy ở
bước sóng 420 nm.

Đánh giá chung: nếu mật độ xoắn thể ít hơn 107 (tế bào/ml canh cấy) thì môi
trường trong và môi trường vẫn đục mạnh khi nồng độ xoắn thể đạt khoảng 109 (tế
bào/ml) nhưng hiếm khi đạt được trong điều kiện nuôi cấy tĩnh. Canh cấy được kết luận
âm tính nếu sau 2 tháng theo dõi môi trường nuôi cấy mà không bắt gặp xoắn thể có
trong canh cấy.
 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR dựa trên việc khuếch đại điểm khởi đầu của gen mã hóa tiểu thể rrs
- ribosome RNA 16S (vị trí nucleotide 38 đến 368) đặc trưng của Leptospira.
Nhờ độ nhạy và tính đặc trưng cao, PCR cho phép chẩn đoán nhanh Leptospirosis
trong vòng 36 giờ và cho phép phát hiện Leptospira trong bệnh phẩm được lấy vào
những ngày đầu tiên theo sau sự xuất hiện triệu chứng lâm sàng. Đặc tính này không chỉ
giúp chẩn đoán phân biệt các tác nhân nhiễm trùng khác có cùng triệu chứng lâm sàng
ban đầu với Leptospirosis mà còn giúp đưa ra liệu pháp điều trị thích hợp. Ngoài ra, PCR
còn hổ trợ các kỹ thuật chẩn đoán thường qui (vi khuẩn học và huyết thanh học) và được
sử dụng trong đánh giá sự tiến triển mãn tính của bệnh do Leptospira.
11 
 


2.2.2 Chẩn đoán huyết thanh học
Rất nhiều kỹ thuật huyết thanh học hữu ích cho chẩn đoán Leptospirosis được mô
tả bởi tính nhạy và đặc hiệu của chúng: ngưng kết trên phiến kính, ELISA và vi ngưng
kết được sử dụng thường xuyên trong các phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, kỹ thuật vi
ngưng kết (MAT: Microscopic Agglutination Test) được xem là kỹ thuật đại diện và
được sử dụng phổ biến nhất. MAT được chứng minh bởi Martin và Pettit vào năm 1918
dựa trên sự đồng nhất huyết thanh cần kiểm tra với canh cấy của Leptospira và đánh giá
kết quả dưới kính hiển vi nền đen qua mức độ xoắn thể bị ngưng kết.
Tương tự các kỹ thuật huyết thanh học khác, việc biện luận kết quả cho kỹ thuật
MAT liên quan đến bản chất mẫu, khoảng cách giữa 2 lần lấy mẫu huyết thanh (ít nhất 10
ngày), việc lấy huyết thanh ở lần thứ 3 đôi khi rất cần thiết cho việc phát hiện serogroups

giữ vai trò chính trong nhiễm trùng Leptospira.
Ngoài ra, MAT luôn đòi hỏi nguồn kháng nguyên sống sẵn sàng trong các phòng
xét nghiệm về Leptospira với nhiều serogroups đại diện cho các chủng Leptospira khác
nhau. Các bộ kit kháng nguyên sống thương mại của Leptospira thường có 23 serovars và
được cung cấp bởi các phòng thí nghiệm chuyên sản xuất nguồn kháng nguyên sống này.

12 
 


Bảng 2.6: Các serogroups đại diện cho các chủng Leptospira dùng sản xuất kháng nguyên
STT Serogroups

Serovars

Chủng

1

Australis

australis

Ballico

2

Autumnalis

autumnalis

Akiyami A

3

Bataviae

bataviae

Van Tienen

4

Canicola

canicola

Hond Utrecht IV

canicola

Chiffon

5

Ballum

castellonis

Castellon 3

6

Pyrogenes

pyrogenes

Salinem

7

Icterohaemorrphagiae

copenhageni

Wjinberg

tonkini

LT 96 68

icterohaemorrphagiae

Verdun

8

Cynopterie

cynopterie

3522 C

9

Grippotyphosa

grippotyphosa

Moskva V

10

Hebdomadis

hebdomadis

Hebdomadis

11

Javanica

javanica

Veldrat Bataviae 46

12

Panama

panama

CZ 214K

13

Semaranga

patoc

Patoc I

14

Pomona

pomona

Pomona

15

Tarassovi

tarassovi

Mitis Johnson

vughia

LT 09 68

hardjo

Hardjo prajitno

hardjo

Hardjo Bovis

saxkoebing

Mus 24

louisiana

LSU 1945

16

17

Sejroe

Louisiana

(Nguồn: Viện Pasteur - TpHCM, 2000)

13 

 


Chương III
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện thí nghiệm
3.1.1 Thời gian
Từ tháng 3/2010 đến tháng 7/2010
3.1.2 Nơi thực hiện thí nghiệm
Phòng Vi sinh, Bộ môn Vi sinh - Truyền nhiễm, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường
đại học Nông Lâm Tp. HCM.
3.2 Vật liệu
3.2.1 Thiết bị và hóa chất dùng trong thí nghiệm
- Màng lọc (0,45 µm và 0,22 µm).
- Màng paraffin, eppendoff (1,5 ml), vỉ nhựa (loại 96 giếng), lame kính và lamelle.
- Micropipette (5 - 50 µl, 100 - 1000 µl).
- Kính hiển vi nền đen.
- Syringe (5 ml) và kim tiêm
- Găng tay, khẩu trang, bông tẩm cồn.
- Cồn 70 0, thuốc sát trùng TH4, dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffer Saline).
3.2.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy chuyên biệt cho Leptospira (EMJH: EllinghausenMcCullough cải tiến bởi Johnson và Harris) được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Axcel Pháp.
3.2.3 Giống Leptospira
Bộ kháng nguyên sống Leptospira thương mại gồm 12 serovars do Viện Pasteur
Tp. HCM cung cấp. Kháng nguyên được nuôi cấy trong điều kiện chuẩn: môi trường nuôi

14 
 

cấy chuyên biệt cho Leptospira (EMJH), nhiệt độ 28 0C, tránh hoàn toàn ánh sáng và ở
ngày thứ 4 sau nuôi cấy.
3.2.4 Huyết thanh dùng trong thí nghiệm
Huyết thanh chuột được bẫy bắt ở khu vực Thủ Đức: 30 mẫu
3.3 Nội dung nghiên cứu
Nuôi cấy thử nghiệm kháng nguyên Leptospira ở điều kiện hiện có của phòng thí
nghiệm (không có tủ ấm 28 – 30 0C và không có buồng cấy hút).
Đánh giá bộ kháng nguyên nuôi cấy thử nghiệm bằng kỹ thuật vi ngưng kết MAT.
3.4 Phương pháp thực hiện
3.4.1 Nuôi cấy thử nghiệm kháng nguyên Leptospira ở điều kiện hiện có của phòng
thí nghiệm
3.4.1.1 Đánh giá tình trạng giống và xử lý giống bị vấy nhiễm vi khuẩn trước khi
nuôi cấy (theo tài liệu chẩn đoán Leptospira - Viện Pasteur Paris, 2000 ).
Cho 25 µl giống (đã đồng nhất bằng cách lắc đều canh trùng) lên lame kính có sẵn
25 µl PBS và trộn đều canh trùng với PBS.
Quan sát các lam kính dưới kính hiển vi nền đen. Ghi nhận kết quả dựa vào sự
hiện diện của Leptospira, có thể xảy ra các trường hợp sau:
Bảng 3.1: Các chỉ tiêu đánh giá tình trạng giống và xử lý giống bị vấy nhiễm vi khuẩn
(theo tài liệu chẩn đoán Leptospira - Viện Pasteur Paris, 2000 ).
Các chỉ tiêu đánh giá
Mức độ hiện diện Leptospira trên hiển vi trường
-

không có sự
hiện diện của
Leptospira
trong hiển vi
trường

+

có vài
Leptospira
trong một hiển
vi trường

4+

Leptospira dày
đặc trong hiển vi
trường và phân
bố thành nhiều
lớp

15 
 

Sự vấy nhiễm vi khuẩn và cách
xử lý
Không nhiễm

Có nhiễm

 Cấy trực

 màng lọc

tiếp

0,45 µm

Ghi chú: kháng nguyên sống Leptospira dùng trong chẩn đoán huyết thanh học với kỹ
thuật MAT phải có mật độ xoắn khuẩn ở mức độ (4+).
3.4.1.2 Nuôi cấy và đánh giá sự phát triển của Leptospira
 Các điều kiện liên quan đến nuôi cấy thử nghiệm Leptospira
- Môi trường nuôi cấy: EMJH
- Tỷ lệ cấy giống: 10 %
- Nhiệt độ: 30 - 32 0C
- Thời gian theo dõi: 1 - 10 ngày
- Ánh sáng: tránh hoàn toàn ánh sáng
 Cách tiến hành
Dùng ống tiêm loại 5 ml hút lấy 1 ml kháng nguyên sống (canh trùng gốc) lọc
qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm vào môi trường EMJH. Môi trường sẽ được ủ
ở 28 - 30 0C trong khoảng thời gian 10 ngày.
Trong quá trình theo dõi, các canh cấy có sự vấy nhiễm vi khuẩn khác thì lọc
các canh cấy bị vấy nhiễm vi khuẩn qua màng lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 µm vào 1
ống môi trường EMJH mới và kiểm tra tình trạng canh khuẩn ở các ngày kế tiếp.
 Các chỉ tiêu theo dõi sự phát triển của Leptospira
Độ đục của môi trường nuôi cấy (quan sát mỗi ngày bằng mắt thường): lắc đều
canh cấy và so sánh canh cấy với môi trường chưa nuôi cấy, ghi nhận ngày canh khuẩn
xuất hiện vẩn đục.
Mật độ Leptospira trong canh cấy (kiểm tra dưới kính hiển vi nền đen ở vật
kính x10) ở ngày đầu tiên khi canh cấy xuất hiện vẩn đục, các lần kiểm tra kế tiếp cách
nhau 2 ngày/lần. Các trường hợp thường gặp như sau:
(-): không có sự hiện diện của Leptospira trong hiển vi trường;
(+): có vài Leptospira trong một hiển vi trường;
(4+): Leptospira dày đặc trong hiển vi trường và phân bố thành nhiều lớp.

16