Tối ưu một số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng nấm Aspergillus oryzae VTCC – F 0187 (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
------------------------------------------

LÝ THỊ HUYỀN

TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG
ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA
CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE VTCC – F - 0187

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
--------------------------------------------------

LÝ THỊ HUYỀN

TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG
ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA
CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE VTCC – F - 0187
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trịnh Đình Khá

THÁI NGUYÊN - 2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và nhóm
nghiên cứu. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và
chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong
luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Mọi sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể đều
được ghi nhận trong lời cám ơn.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những gì đã cam đoan ở trên.
Tác giả

Lý Thị Huyền


ii

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trịnh Đình Khá
giảng viên trường Đại học Khoa học, đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận
tình hướng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng
như trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong khoa Công nghệ sinh
học trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều
kiện chu đáo cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp
đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được kết quả như
ngày hôm nay.

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự
giúp đỡ quý báu đó !
Thái Nguyên, tháng 10 năm 2018
Học viên

Lý Thị Huyền


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
MỤC LỤCDANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... vii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài .....................................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3
1.1. Protease ................................................................................................................3
1.1.1. Khái niệm ..........................................................................................................3
1.1.2. Phân loại protease .............................................................................................4
1.1.3. Cơ chế xúc tác ...................................................................................................8
1.1.4. Nguồn thu protease ...........................................................................................9
1.1.5. Ứng dụng .........................................................................................................11
1.2. Sinh tổng hợp protease .......................................................................................14
1.2.1. Chủng giống ....................................................................................................14

1.2.2. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................14
1.2.3. Các phương pháp nuôi cấy ..............................................................................14
1.2.4. Thu nhận protease ...........................................................................................15
1.2.5. Các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp protease của A.
oryzae ...............................................................................................................17
1.3. Sản xuất protease từ Aspergillus oryzae ............................................................19
1.3.1. Aspergillus oryzae ...........................................................................................19
1.3.2. Sản xuất chế phẩm protease ............................................................................20
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............24
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu .....................................................................................24


iv

2.1.1. Chủng giống ....................................................................................................24
2.1.2. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................24
2.1.3. Hóa chất ..........................................................................................................24
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ .............................................................................................25
2.1.5. Dung dịch và đệm ...........................................................................................25
2.2. Địa điểm và thời gian .........................................................................................26
2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................26
2.3.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp protease .....................................................................26
2.3.2. Xác định hoạt độ protease ...............................................................................26
2.3.3. Tối ưu một số yếu tố môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng
hợp protease ......................................................................................................29
2.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
protease .............................................................................................................30
2.3.5. Xử lý số liệu ....................................................................................................31
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................32
3.1. Khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187 .............32

3.2. Tối ưu các điều kiện sinh tổng hợp protease ......................................................33
3.2.1. Tối ưu tỉ lệ bột lõi ngô và bột đậu tương ........................................................33
3.2.2. Tối ưu tỉ lệ cám gạo bổ sung ...........................................................................34
3.2.3. Tối ưu độ ẩm ...................................................................................................35
3.2.4. Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy .................................................................................36
3.2.5. Tối ưu pH nuôi cấy .........................................................................................37
3.2.6. Tối ưu thời gian lên men .................................................................................39
3.3. Sản xuất chế phẩm .............................................................................................40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................44
PHỤ LỤC .................................................................................................................48


v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại protease theo pH hoạt động tối ưu ..............................................4
Bảng 2.1. Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm ...........................................24
Bảng 2.2. Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm ...................................................25
Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm được sử dụng trong thí nghiệm ...........25
Bảng 2.4. Nồng độ pha loãng Tyrosine ....................................................................27
Bảng 2.5. Tỉ lệ tương ứng giữa bột đậu tương và bột lõi ngô ...................................29
Bảng 2.6. Tỉ lệ tương ứng giữa bột đậu tương, bột lõi ngô và bột cám gạo .............30


vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2. Sơ đồ phân loại protease ............................................................................5
Hình 1.3. Mô hình phân tử enzyme protease (papain) ...............................................6
Hình 1.4. Mô hình phân tử enzyme protease (renin) .................................................7
Hình 2.1. Đường chuẩn Tyrosine ..............................................................................28
Hình 3.1. Hoạt tính phân giải casein của dịch chiết enzyme ngoại bào từ cơ chất
lên men xốp chủng A. oryzae VTCC-F-0187 ..........................................32
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất bột đậu tương/lõi ngô đến khả năng sinh
tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187..........................33
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cám gạo đến khả năng sinh tổng hợp protease
của chủng A. oryzae VTCC-F-0187 ........................................................35
Hình 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm tới khả năng sinh tổng hợp protease của chủng
A. oryzae VTCC-F-0187..........................................................................36
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của
chủng A. oryzae VTCC-F-0187 ...............................................................37
Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng sinh tổng hợp protease của
chủng A. oryzae VTCC-F-0187 ...............................................................38
Hình 3.7. Khả năng sinh protease theo thời gian của chủng A. oryzae VTCC-F0187 .........................................................................................................39
Hình 3.8 Lên men chủng A. oryzae VTCC-F-0187 sản xuất chế phẩm protease .....41
Hình 3.9. Khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187
trong điều kiện tối ưu sau các lần lên men ..............................................42


vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Tên viết tắt
BĐT

Bột đậu tương

LN

Lõi ngô

CG

Cám gạo

TCA

Tricloacetic acid

OD

Optical density (Độ hấp thụ ánh sáng)

Hdp

Hoạt độ protease

hspl

Hệ số pha loãng

HT

Hoạt tính

HTtb

Hoạt tính trung bình

SS

Sai số


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Enzyme là chất xúc tác sinh học được tổng hợp trong các tế bào sống của
cơ thể sinh vật. Enzyme tham gia các phản ứng sinh hóa trong cơ thể làm tăng
tốc độ của phản ứng nhưng không bị thay đổi sau phản ứng. Enzyme không chỉ
có ý nghĩa với quá trình sinh trưởng, sinh sản của sinh vật mà enzyme còn có
vai trò rất quan trọng với con người trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong
y học, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Nhiều quốc gia đã sử dụng
phổ biến enzyme trong sản xuất và đời sống mang lại lợi nhuận kinh tế lớn cho
con người [2].
Protease là nhóm enzyme có khả năng thủy phân liên kết peptide được úng
dụng nhiều trong công nghiệp, nông nghiệp và công nghệ sinh học [31].
Protease có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp dược phẩm, y tế, thực
phẩm và công nghệ sinh học, chiếm gần 60% thị trường enzyme [27], trong đó
protease từ vi sinh vật ước tính chiếm khoảng 40% tổng lượng enzyme bán ra
trên toàn thế giới [28].
Aspergillus oryzae là một loại nấm sợi được liệt kê như là một sinh vật
"thường được công nhận là an toàn (GRAS)" của Cục quản lý thực phẩm và
dược phẩm Hoa Kỳ. A. oryzae có một lịch sử sử dụng lâu dài trong ngành công

nghiệp thực phẩm trong sản xuất thực phẩm lên men truyền thống, do hoạt tính
phân giải protein cao [16, 24]. A. oryzae có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại
enzyme ngoại bào như amylase, protease, pectinase, lipase, xylanase, cellulase,
catalase, phytase, glucose oxidase [23].
Sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng
kể hiệu quả sản xuất, chế phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên, giá thành chế
phẩm protease còn khá cao do nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng nhiều. Để
phát triển các dây truyền sản xuất protease đạt hiệu quả cao, có nhiều công trình
nghiên cứu đã được tiến hành để chọn lọc chủng giống, tìm kiếm cơ chất mới


2

thích hợp cho sinh tổng hợp protease. Bên cạnh đó thì việc tối ưu các điều kiện
môi trường (nhiệt độ, độ pH, oxy hòa tan, thành phần môi trường) cũng được
các nhà nghiên cứu rất quan tâm, mục đích tìm ra điều kiện nuôi cấy phù hợp
nhất để thu được lượng protease nhiều và hạ giá thành sản phẩm. Để có thể chủ
động sản xuất enzyme protease bằng các nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Tối ưu một số điều kiện môi trường
ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng nấm Aspergillus
oryzae VTCC – F - 0187”
2. Mục tiêu của đề tài
Tạo quy trình sản xuất protease ngoại bào của chủng A. oryzae VTCC F - 0187 từ nguyên liệu rẻ và sẵn có trong nước.
3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát khả năng sinh protease của chủng A. oryzae VTCC - F – 0187
sau thời gian bảo quản chủng giống.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thành phần môi trường và điều kiện
lên men đến khả sinh tổng hợp protease của A. oryzae VTCC - F - 0187.
- Thử nghiệm lên men sản xuất chế phẩm protease thô.

3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Protease
1.1.1. Khái niệm
Protease (peptide – hidrolase 3.4) là nhóm enzyme xúc tác quá trình thuỷ
phân liên kết liên kết peptide (-CO-NH-)n, polypeptide trong phân tử protein
đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Ngoài ra, nhiều protease cũng có
khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển amino acid [1].

Hình 1.1. Sơ đồ enzyme protease thủy phân phân tử Protein [7]
Protease hay các enzyme proteolytic xúc tác các phản ứng thuỷ phân
protein và peptide. Protease có trong nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và trong các
hạt ngũ cốc nảy mầm. Protease có 2 loại: proteinase và peptidase. Proteinase
thuỷ phân protein thành các peptide và amino acid, peptidase thuỷ phân các
peptide thành amino acid. Sự phân chia protease thành hai loại enzyme ở đây
là điều ước lệ vì protease cũng thuỷ phân peptide [6].
Protease được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi
khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (có trong gan, dạ
dày...). Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu. Quá trình
thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều loại chế phẩm.
Quá trình này có thể được thực hiện nhờ các protease vi sinh vật được đưa vào
trong quá trình lên men thu protease để sản xuất chế phẩm [7].


4

1.1.2. Phân loại protease
Theo ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử, protease

(peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống phân loại
các nhóm enzyme; Tuy nhiên, việc định tên cho các protease không dễ dàng
tuân theo cách định tên phổ biến của hệ thống enzyme bởi sự đa dạng về cấu
trúc và khả năng hoạt động.
1.1.2.1. Phân loại dựa vào pH hoạt động tối ưu
Trước đây, protease được phân loại một cách đơn giản dựa vào pH hoạt
động tối ưu thành ba nhóm: Protease acid, protease trung tính và protease kiềm
[1].
Bảng 1.1. Phân loại protease theo pH hoạt động tối ưu
Protease
Protease acid

Đặc điểm
Hoạt động ở pH 2-6, gồm phần lớn là aspartic protease,
một số cysteine protease và metalloprotease

Protease

trung Hoạt động ở pH 7-8, gồm cysteine protease,

tính

metalloprotease và một số serine protease

Protease kiềm

Hoạt động ở pH 8-13, chủ yếu là serine protease

1.1.2.2. Phân loại dựa vào các tiêu chí cơ bản
Phân loại dựa trên ba tiêu chí cơ bản: loại phản ứng xúc tác, bản chất hóa học

của trung tâm xúc tác và mối quan hệ giữa sự tiến hóa có liên quan đến cấu trúc,
protease được chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase [1].


5

Hình 1.2. Sơ đồ phân loại protease [7]
* Exopeptidase
Phân loại dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide exopeptidase
được phân chia thành hai loại:
Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide;
Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Endopeptidase
Dựa vào động học của cơ chế xúc tác endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
Serin proteinase: Là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động


6

xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và
subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như
chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi
khuẩn như Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN. Các serine proteinase
thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất
tương đối rộng.

Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các protease thực vật như papain,
bromelin, một vài protein động vật và protease ký sinh trùng. Các cystein
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng.

Hình 1.3. Mô hình phân tử protease (papain) [11]
Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
rennin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.


7

Hình 1.4. Mô hình phân tử protease (renin) [17]
Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy
ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo
proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới
tác dụng của EDTA.
Trong bốn nhóm protease kể trên, các cysteine proteinase và proteasetiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn suất acid
của amino acid. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không
có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn suất của amino acid. Nhiều
protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về câu
tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu
cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đổi bé, nhất là các
cysteine proteinase. Các cysteine proteinase có trọng lượng phân tử vào
khoảng 20.000- 27.000 dalton. Tuy nhiên, cũng có một số cysteine proteinase
có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme của Penicillium
cyoneo’fulvum (44.000), A. oryzae OUT 5038 (52.000) (Martin 1962,

Morihara và Tsuzuki 1969). Trọng lượng phân tử của các protease kim loại
lớn hơn so với cysteine proteinase (khoảng 33.800 - 48.400). Protease tiol và
nhiều protease-acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000 - 40.000
[8].


8

1.1.3. Cơ chế xúc tác
Một chất xúc tác dù là hóa học hay sinh học đều có tác dụng làm tăng
vận tốc của phản ứng. Vận tốc của phản ứng enzyme là lượng cơ chất bị chuyển
hóa hoặc lượng sản phẩm được tạo thành trong một đơn vị thời gian. Thông
thường, lượng cơ chất hoặc lượng sản phẩm được biểu diễn bằng nồng độ phân
tử (M) và đơn vị thời gian là giây [8].
Sự xúc tác của enzyme thường được thực hiện bằng cách tạo ra ít nhất
một phức hợp tạm thời giữa enzyme và cơ chất. Mô hình đơn giản nhất là mô
hình của Michaelis. Mô hình này thừa nhận rằng phản ứng chỉ xảy ra với một
cơ chất và tạo thành chỉ một sản phẩm [8]:
E + S → ES → P + E
Trong đó: E là Enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme
- cơ chất, P là sản phẩm (Product)
* Giai đoạn đầu: phức hợp enzyme cơ chất dược tạo thành một cách nhanh
chóng và thuận nghịch nhờ các tương tác phi đồng hóa trị giữa cơ chất và các
amino acid nhận biết của tâm hoạt động của enzyme [8].
E (enzyme) + S (cơ chất)→ ES (hợp chất trung gian)
* Giai đoạn 2 (giai đoạn xúc tác ): gồm một chuỗi các phản ứng trung gian
nhằm biến đổi phức ES thành trạng thái quá độ trong đó cơ chất được liên kết
với các gốc amino acid xúc tác của tâm hoạt động enzyme (thường bằng liên
kết đồng hóa trị). Rồi trạng thái quá độ này sẽ tự chuyển hóa thành phức enzyme
- sản phẩm và cuối cùng phức enzyme - sản phẩm sẽ phân ly thành enzyme tự

do và sản phẩm [8].
Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác
sinh học của enzyme người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều
thống nhất ở chỗ quá trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzyme và cơ
chất thành hợp chất trung gian [2].
E (enzyme) + S (cơ chất)→ ES (hợp chất trung gian)


9

1.1.4. Nguồn thu protease
1.1.4.1. Protease động vật
Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều
enzyme nhất.
Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc
nhóm protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến
trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi casein thành paracasein có khả
năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông
tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực
tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm pepsin (trong trường hợp thu chế phẩm
renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra
pepsin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi. Gần đây có nghiên cứu sản xuất
protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Eudothia parasitica
và Mucor purillus [1].
1.1.4.2. Protease thực vật
Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu
được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ
quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để
chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết
tủa protein. Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ

làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hoá. Ficin thu được từ nhựa cây sung (Ficus
carica). Enzyme được sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên [1].
1.1.4.3. Protease vi sinh vật
Enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm
nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces
và một số và một số loại nấm men.


10

* Vi khuẩn: Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào
khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại
endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại
trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả
năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein.
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là
Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc
chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất.
Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng
pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở
khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung
tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được
sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số
giống thuộc chi Clostridium.
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng
phân tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong
khoảng pH rộng 7-12 [1].
* Nấm: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn
protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus

oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum)… Các
loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung
tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân
protein ở pH 2,5-3 [1].
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti...


11

cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản
xuất pho mát.
* Xạ khuẩn: Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên
cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số
chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae,
S. Trerimosus...
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là protease được
tách chiết từ S. grieus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy
phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Từ S.
fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Protease từ
S. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao nên còn được dùng trong công
nghiệp chế biến thịt.
Như vậy, vi sinh vật được coi là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản
xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi
sinh vật có những lợi ích chính như sau: Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi
sinh vật và giống vi sinh vật; Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16-100
giờ nên có thể thu hoặc nhiều lần quanh năm; Có thể điều khiển sinh tổng hợp
enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng
thu hồi); Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ
chức sản xuất. Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố
(gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp [1].

Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh
vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi
nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó [1].
1.1.5. Ứng dụng
Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công


12

thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp…
1.1.5.1. Trong công nghiệp chế biến thịt
Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein
trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Sử
dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được chế
phẩm keratinase thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ
da, lông vũ. Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ mất đi hoàn toàn các amino acid
chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷ phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng
L sang D làm giảm giá trị sinh học của amino acid). Để thuỷ phân sâu sắc và
triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các
protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường dùng
phối hợp cả 3 loại protease của 3 đối tượng: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với
tỷ lệ tổng cộng 1-2% khối lượng protein cần thuỷ phân. Ưu điểm của việc thuỷ
phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo
ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân [25].
1.1.5.2. Trong chế biến thuỷ sản
Khi sản xuất nước mắm (và một số loại mắm) thời gian chế biến thường
là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương,
phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Hiện nay quy trình sản xuất nước mắm
ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật
(bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện

hương vị của nước mắm. Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện
thêm về công nghệ [25].
1.1.5.3. Trong công nghiệp sữa
Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ
sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P. roquerti,
B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất phomat. Trong công nghiệp sản
xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm


13

nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn [25].
1.1.5.4. Trong sản xuất bia
Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của
bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân
protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.
Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự
thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính
làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da
có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc
da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ
quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn
(B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn
(S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại
nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng [25].
1.1.5.5. Trong công nghiệp dệt
Protease từ vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo
(các sợi nhân tạo được tạo ra bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi được
được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã
làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó

làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng.
Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành
khác như: Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng
vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng; Protease của nấm mốc và
vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia
súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm; Điều
chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh,…;
Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy sản xuất mỹ phẩm,…[25].


14

1.2. Sinh tổng hợp protease
1.2.1. Chủng giống
Để sản xuất enzyme protease cần chọn chủng giống A. oryzae thuần
chủng đã được kiểm tra đầy đủ về đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần
đặc biệt lưu ý đến điều kiện bảo quản giống. Thực tế bảo quản giống trong một
thời gian dài có thể tạo các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn, do đó định
kì phải cấy chuyền và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu [6].
1.2.2. Môi trường nuôi cấy
Đây là yếu tố đầu tiên ảnh hưởng đến hoạt động sống và khả năng sinh
tổng hợp protease của A. oryzae. Môi trường cần chứa đầy đủ các chất C, H,
O, N, các chất vô cơ như Mn, P, Ca, S, Fe, K và các chất vi lượng khác [6].
Trong môi trường cần phải có các chất cảm ứng - nguồn nitơ hữu cơ (bột đậu
tương, bột mì, pepton, protein…). Ngoài các nguồn nitơ hữu cơ, người ta
còn bổ sung vào môi trường nuôi cấy các nguồn nitơ vô cơ như các muối
nitrat và amon.
1.2.3. Các phương pháp nuôi cấy
Nuôi cấy vi sinh vật theo hai phương pháp: phương pháp lên men bề mặt
và phương pháp lên men chìm.

1.2.3.1. Phương pháp lên men bề mặt
Phương pháp này còn gọi là phương pháp nổi dùng nuôi cấy nấm mốc
sản xuất enzyme. Nước ta đã có truyền thống lâu đời gây mốc tương theo
phương pháp này. Trong các nhà máy rượu sản xuất từ nguồn tinh bột thì việc
gây hoá mốc đường hoá (myco - malt) cũng làm tương tự. Phương pháp nuôi
cấy bề mặt dựa trên cơ sở nuôi cấy mốc trên các lớp môi trường mỏng tiếp xúc
tốt với không khí. Môi trường dinh dưỡng chủ yếu là cám (cám mỳ tốt hơn cả)


15

loại to, có thêm ít bột, hoặc thêm những loại bã khác (bã bia, bã lõi ngô, bã khô
lạc, khô đậu tương,...) tuỳ theo mục đích sản xuất [6].
1.2.3.2. Phương pháp nuôi cấy chìm (nuôi cấy bề sâu)
Vi sinh vật được dùng trong nuôi cấy theo phương pháp này là vi khuẩn
và nấm mốc. Chúng được cấy vào môi trường dinh dưỡng lỏng trong các nồi
nhân giống và lên men. Trong thời gian nuôi cấy, người ta thổi khí nén vô trùng
để cung cấp oxy cho vi sinh vật hô hấp. Phương pháp này đòi hỏi các trang thiết
bị phức tạp hơn nhiều so với phương pháp bề mặt, nhưng dễ cơ khí hoá, năng
suất cao và mặt bằng sản xuất nhỏ.
Nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp chìm trong các thiết bị kín với môi
trường lỏng vô khuẩn và khuấy đảo cùng thổi khí sạch (vô trùng tuyệt đối) liên
tục. Môi trường lỏng bao gồm các nguồn cacbon, nguồn nitơ vô cơ, hoặc nitơ
hữu cơ (bột đậu tương, khô lạc, các loại khô dầu, cao men, cao ngô,...), các chất
khoáng, các chất sinh trưởng. Trong thành phần môi trường lỏng nuôi cấy vi sinh
vật để thu enzyme, cần chú ý đến cơ chất cảm ứng, ví dụ: đối với amylase cần
có tinh bột, protease cần có protein. Phương pháp nuôi cấy chìm đòi hỏi vô trùng
tuyệt đối, vì vậy yêu cầu công nghệ rất cao [6].
1.2.4. Thu nhận protease
Vi sinh vật là nguồn enzyme vô cùng phong phú và giúp cho ngành công

nghiệp sản xuất những chế phẩm enzyme tiến khá nhanh, phục vụ cho các
ngành sản xuất thực phẩm, hàng tiêu dùng, ăn uống, nông nghiệp, y dược đạt
được hiệu quả kinh tế cao. Nhờ tính ưu việt đó, vi sinh vật đã chiếm ưu thế
tuyệt đối trong sản xuất enzyme. Trong họ hàng vi sinh vật thì nấm mốc chiếm
vị trí khá quan trọng, từ nấm mốc đã thu được các chế phẩm enzyme thương
mại là: amylase, protease, cellulase,... Có tới 80 loại enzyme khác nhau được
chiết từ nấm mốc và trong đó có hơn 10 enzyme đang được ứng dụng rộng rãi
[6].


16

Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này
có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số protease
ngoại bào đã sản xuất trên quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong
nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và y học. Một trong các loài vi sinh vật
có khả năng tổng hợp mạnh protease đó là Aspergillus oryzae. A. oryzae tổng
hợp được cả 3 loại protease là protease axit, protease trung tính và protease
kiềm. Quá trình sản xuất enzyme protease từ A. oryzae gồm hai công đoạn: nuôi
cấy A. oryzae và chiết tách enzyme protease [6].
1.2.4.1. Nuôi cấy chủng nấm A. oryzae
Nuôi cấy vi sinh vật phải cấy giống từ nhỏ đến lớn, nghĩa là giống thuần
chủng từ ống nghiệm được gieo cấy nhân giống rồi nuôi cấy đại trà (lên men)
trên các môi trường thích hợp để cho vi sinh vật sinh nhiều enzyme với hoạt
tính cao. Có thế nói, giai đoạn nuôi cấy vi sinh vật để có nhiều enzyme là vô
cùng quan trọng, đó là khâu mấu chốt của quá trình sản xuất enzyme [6].
Để thu nhận chế phẩm protease từ vi sinh vật cũng như các enzyme khác
có thể dùng hai phương pháp nuôi cấy: phương pháp bề mặt (phương pháp nổi)
và phương pháp bề sâu (phương pháp chìm). Phương pháp bề mặt thường dùng
để nuôi cấy nấm sợi, phương pháp bề sâu thường dùng đối với vi khuẩn và nấm

sợi. Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng, sử dụng phương pháp bề mặt kinh tế hơn
[2].
1.2.4.2. Thu hồi chế phẩm enzyme protease
Các chế phẩm enzyme được sử dụng trong thực tế dưới nhiều dạng khác
nhau. Trong một số trường hợp, môi trường nuôi cấy vi sinh trong đó có chứa
enzyme sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất, nếu các tạp
chất đó không gây tác hại đáng kê đến sản phẩm và kỹ thuật sản xuất sau này
(ví dụ: sản xuất rượu, da, dùng cho chăn nuôi, nước chấm, tương,...).