Nghiên cứu tạo chủng escherichia coli tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp b carotene

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG Escherichia coli
TÁI TỔ HỢP CÓ KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP β-carotene

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60.42.02.01

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Dương Văn Cường
2. TS. Nguyễn Xuân Cảnh

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo
vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám
ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hà

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,
đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới TS Dương Văn Cường và TS Nguyễn Xuân Cảnh đã tận tình hướng dẫn,
dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và
thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn công nghệ vi sinh, Khoa công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận
tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ bộ môn Sinh học phân tử và công
nghệ Gene, Viện Khoa học sự sống - Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo
điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hà

ii


MỤC LỤC

Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii
Mục lục ........................................................................................................................... iii
Danh mục từ viết tắt .......................................................................................................... v
Danh mục bảng ................................................................................................................ vi
Danh mục hình ................................................................................................................ vii
Trích yếu luận văn ......................................................................................................... viii
Thesis abstract.................................................................................................................. xi
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2

1.3.

Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................... 2

1.3.1.

Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 2

1.3.2.

Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................ 3

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4
2.1.

Khái quát về sắc tố β-carotene ............................................................................ 4

2.1.1.

Cấu trúc và tính chất lý hóa ................................................................................ 4

2.1.2.

Vai trò của β-carotene con người ....................................................................... 4

2.1.3.

Con đường tổng hợp β-carotene ......................................................................... 9

2.1.4.

Các nguồn cung cấp β-carotene ........................................................................ 14

2.1.5.

Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp vào sản xuất β-carotene tự nhiên.......... 18

2.2.

Vi khuẩn E. coli và các hệ vector biểu hiện trong sản xuất protein tái tổ hợp ......... 19

2.2.1.

Đặc điểm của vi khuẩn E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp ...................... 19

2.2.2.

Một số hệ thống vector biểu hiện trong vi khuẩn E. coli.................................. 21

2.3.

Vai trò gene crtB trong con đường sinh tổng hợp β-carotene .......................... 23

2.4.

Tình hình trong và ngoài nước ......................................................................... 24

2.4.1.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................... 24

2.4.2.

Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................................... 25

iii


Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 27
3.1.

Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 27

3.1.1.

Vi khuẩn ........................................................................................................... 27

3.1.2.

Vật liệu ............................................................................................................. 27

3.1.3.

Hóa chất ............................................................................................................ 30

3.1.4.

Dụng cụ............................................................................................................. 31

3.1.5.

Thiết bị .............................................................................................................. 31

3.1.6.

Phạm vi nghiên cứu .......................................................................................... 32

3.2.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................... 32

3.3.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 33

3.4.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 34

3.4.1.

Phương pháp tách chiết DNA tổng số .............................................................. 34

3.4.2.

Phương pháp PCR ............................................................................................ 35

3.4.3.

Phương pháp điện di DNA trong gel agarose ................................................... 36

3.4.4.

Phương pháp lập bản đồ giới hạn ..................................................................... 37

3.4.5.

Phương pháp thu nhận DNA từ gel agarose ..................................................... 37

3.4.6.

Phương pháp gắn đoạn gen mong muốn lên vector biểu hiện .......................... 38

3.4.7.

Phương pháp chuẩn bị tế bào E. coli khả biến.................................................. 38

3.4.8.

Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến bằng sốc nhiệt ....... 39

3.4.9.

Phương pháp tách chiết DNA plasmid ............................................................. 39

Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 41
4.1.

Tách dòng gene crtB từ vi khuẩn Pantoea ananatis......................................... 41

4.1.1.

Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn Pantoea ananatis................................. 41

4.1.2.

Kết quả nhân gene crtB bằng phương pháp PCR. ............................................ 41

4.1.3.

Kết quả gắn nối đoạn gene crtB vào vector tách dòng ..................................... 42

4.2.

Thiết kế vector biểu hiện chứa 5 gene mã hóa cho các enzyme tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp β-carotene. ........................................................... 46

4.3.

Kết quả cảm ứng biểu hiện 5 gene đích tạo ra β-carotene và đánh giá sơ
bộ mức độ biểu hiện bằng màu sắc cặn tế bào ................................................. 48

Phần 5. Kết luận và kiến nghị ...................................................................................... 50
5.1.

Kết luận............................................................................................................. 50

5.2.

Kiến nghị .......................................................................................................... 50

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 51

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

Amp

: Ampicillin

Bp

: Base pair

CoA

: Coenzyme Acetoacetyl

Cs

: Cộng sự

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

E. coli

: Escherichia coli

EDTA

: Etilendiamin tetra axetic acid

IPTG

: Isopropyl Thiogalactoside

Kb

: Kilo base

LB

: Lauria Broth

NCBI

: Nation Cetrer for Biotechnology Information

PCR

: Polymerase Chain Recation

TAE

: Tris-acetate-EDTA

UV

: Ultraviolet

X-gal

: 5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactoside

ROS

: Reactive Oxygen Species

RNS

: Reactive Nitrogen Species

IPP

: Isopentenyl pyrophosphate

DMAPP

: Dimethylallyl pyrophosphate

MAV

: Mevalonate

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Hàm lượng carotenoid có trong thực vật ..................................................... 14
Bảng 3.1. Trình tự cặp mồi crtB. .................................................................................. 27
Bảng 3.2. Các thành phần của vector pRSET-A .......................................................... 28
Bảng 3.3. Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài.................................................. 32
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR .......................................................................... 35
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng gắn nối ...................................................................... 38

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Công thức cấu tạo của β-carotene .................................................................. 4
Hình 2.2. Sơ đồ chuyển hóa β-carotene thành vitamin A .............................................. 6
Hình 2.3. Biểu đồ khảo sát thị trường carotenoid năm 2010 và dự kiến đến năm 2018. ........ 9
Hình 2.4. Sinh tổng hợp IPP và DMAPP theo con đường MAV ................................ 10
Hình 2.5. Sinh tổng hợp IPP và DMAPP theo con đường MEP ................................. 11
Hình 2.6. Quá trình sinh tổng hợp carotenoids từ IPP và DMAPP ............................. 12
Hình 2.7. Quá trình chuyển hóa phyopene thành lycopene ......................................... 13
Hình 2.8. Tổng hợp β-carotene từ lycopene ................................................................ 13
Hình 2.9. Sơ đồ tổng hợp β-carotene của BASF.......................................................... 16
Hình 2.10. Sơ đồ tổng hợp β-carotene của Roche ......................................................... 17
Hình 2.11. Cơ chế kiểm soát sự phiên mã của T7 promoter.......................................... 20
Hình 2.12. Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pRSET ...................................................... 21
Hình 2.13. Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pET ........................................................... 22
Hình 2.14. Tương tác giữa protein tái tổ hợp chứa 6xHis và giá thể Niken .................. 22

Hình 2.15. Quá trình chuyển hóa β-carotene dưới sự tham gia các gene Crt ................ 23
Hình 3.1. Cấu trúc vector biểu hiện pRSET ................................................................ 28
Hình 3.2. Cấu trúc vector tách dòng ............................................................................ 29
Hình 3.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR .............................................................. 36
Hình 4.1. Hình ảnh tách chiết DNA tổng số của P. ananatis ...................................... 41
Hình 4.2. Kết quả khuếch đại gene crtB của vi khuẩn P. ananatis ............................. 42
Hình 4.3. Kết quả biến nạp vào tế bào E. coli DH5α................................................... 43
Hình 4.4. Kết quả điện di plasmid của các dòng khuẩn lạc đã chọn ........................... 43
Hình 4.5. Kết quả chọn lọc các dòng bằng cắt với enzyme EcoRI và KpnI ................ 44
Hình 4.6. Kết quả giải trình tự (A) và dịch mã insilico gene crtB (B)......................... 45
Hình 4.7. Kết quả điện di kiểm tra các dòng plasmid pR-iEIBY ................................ 46
Hình 4.8. Sản phẩm cắt vector pRSET-iEIBY với EcoRI và NcoI. .................................... 47
Hình 4.9. Kết quả biểu hiện của 5 gene idi, crtE, crtI, crtB và crtY nằm trên
vector pRSET-A trong E. coli BL21(DE3).................................................. 49

vii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Nguyễn Thị Hà
Tên luận văn: Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli tái tổ hợp có khả năng sinh tổng
hợp β-carotene
Ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60.42.02.01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
β-carotene thuộc nhóm carotenoid, có sắc tố vàng hoặc da cam, được tổng hợp tự
nhiên trong một số loài thực vật như cà rốt, khoai lang, đậu hà lan (Desobry et al.,
1998). β-carotene còn được gọi là provitamin A, là tiền chất để tổng hợp vitamin A –

một loại vitamin rất cần thiết cho mắt (Lampert et al., 2003; Stutz et al., 2015). Cũng
giống như các carotenoid khác, β-carotene là chất chống oxy hoá sinh học, bảo vệ tế bào
và mô khỏi tác hại của gốc tự do, vì vậy có tác dụng ngăn ngừa bệnh ung thư (Britton
1995). Một tác dụng khác của β-carotene là giảm thiểu các bệnh về tim mạch – một
nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở người. Mặc dù có vai trò quan trọng trong bảo vệ
sức khoẻ, song bản thân cơ thể con người lại không tự tổng hợp được β-carotene mà
phải đưa vào nhờ thực phẩm. Và cũng nhờ những tác dụng hữu ích của β-carotene nên
nhu cầu sử dụng chất này trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm ngày
càng cao (Mata-Gómez et al., 2014). Thị trường của β-carotene trong năm 2010 là 261
triệu USD và dự tính đến 2018 sẽ đạt 334 triệu USD (BCC 2011).
Tổng hợp β-carotene thường theo hai phương pháp chính là tách chiết từ các
nguồn tự nhiên hoặc tổng hợp hoá học (Ribeiro et al., 2011; Vachali et al., 2012).
Những phương pháp này đều có những nhược điểm nhất định. Tổng hợp hoá học tạo ra
chất thải ô nhiễm, sản phẩm có hoạt tính sinh học thấp hơn β-carotene tự nhiên do
không có các đồng phân α-carotene và γ-carotene (Voutilainen et al., 2006; Baky and
El-Baroty, 2013). Trong khi đó β-carotene tách chiết từ các nguồn tự nhiên sẽ cho hàm
lượng không nhiều và phụ thuộc vào nguồn cung vật liệu có chứa β-carotene.
Nhằm góp phần khắc phục những yếu điểm của các phương pháp nói trên, hướng
nghiên cứu sử dụng kỹ thuật di truyền tạo ra các chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng sản
xuất β-carotene đang là một hướng đi được quan tâm. E. coli tự nhiên không tổng hợp được
provitamin β-carotene vì không có các enzyme chuyển hóa từ DMAPP đến chất này. Gene
idi mặc dù có trong hệ gene của E. coli nhưng cũng cần được đưa vào vector biểu hiện để
tăng cường mức độ biểu hiện, từ đó giúp cân bằng nguồn cơ chất IPP và DMAPP. Đã có
một số nghiên cứu sinh tổng hợp carotenoid nói chung và β-carotene nói riêng sử dụng
E. coli làm vật chủ cho thấy tiềm năng phát triển ở quy mô công nghiệp, tuy nhiên để đưa

viii


vào thực tiễn sản xuất vẫn cần được tối ưu hơn nữa (Kirby and Keasling 2009).

Mục tiêu của nghiên cứu này là thiết kế vector biểu hiện pRSET-iEIBY mang
các gene idi, crtI, crtB, crtE và crtY mã hoá cho các enzyme xúc tác quá trình tổng hợp
β-carotene trong vi khuẩn E. coli. Vector pRSET-iEI đã được tạo ra trước đó bằng việc
gắn 3 gene idi, crtI và crtE vào vector biểu hiện pRSET-A. Gene crtB được tách dòng
và xác định trình tự trước khi gắn vào vector pRSET-iEI để tạo thành pRSET-iEIB.
Gene crtY được cắt ra từ vector pLUG-Y và gắn vào pRSET-iEIB để tạo vector biểu
hiện pRSET-iEIBY.
Phương pháp thí nghiệm
Vi khuẩn P. ananatis được nuôi tăng sinh khối và tách DNA tổng số, làm nguyên liệu
để khuếch đại đoạn gene crtB bằng cặp mồi đặc hiệu. Đoạn gene crtB sau khi được khuếch
đại thành công, thì được gắn nối vào vector tách dòng pLUG và chọn lọc các dòng plasmid
tái tổ hợp mang đoạn gene crtB mong muốn.
Sau khi sàng lọc được dòng plasmid tái tổ hợp mang đoạn gene crtB mong muốn,
plasmid này lại được dùng làm nguyên liệu để thiết kế vector biểu hiện mang các gene mã
hóa sinh tổng hợp β-carotene. Plasmid pLUG-B (là plasmid mang đoạn gen crtB) và pRiEIY (là vector biểu hiện pRSET đã được gắn thành công các gene idi, crtE, crtI và crtY đã
được gắn thành công trước đó). Hai vector này được cắt đồng thời bằng hai enzyme EcoRI
và KpnI với mục đích thu đoạn gene crtB và cắt mở vòng vector biểu hiện. Sau đó, sản
phẩm đoạn gene crtB được cắt và vector được nối lại với nhau bằng enzyme gắn nối lygase.
Sản phẩm gắn nối tiếp theo lại sàng lọc và chọn lọc các dòng tái tổ hợp mới.
Sau khi chọn lọc được vector biểu hiện mang 5 gene mã hóa sinh tổng hợp
β-carotene, được biến nạp vào trong vi khuẩn E. coli BL21 để cảm ứng biểu hiện sinh
tổng hợp β-carotene.
Sau quá trình thực hiện đề tài chúng tôi thu được 1 số kết quả như sau:
Kết quả thứ 1: Kết quả tách dòng gene crtB từ vi khuẩn P.ananatis
+ Vi khuẩn P. ananatis được nuôi tăng sinh trên môi trường LB lỏng và được tách
DNA tổng số. Kết quả cho thấy đã tách chiết thành công DNA tổng số vi khuẩn
P.ananatis, DNA tổng số có chất lượng tương đối tốt, ít bị đứt gãy.
+ Tiếp theo tiến hành khuếch đại đoạn gene crtB. Kết quả cho thấy sản phẩm PCR
thu được có 1 băng kích thước xấp xỉ 1 kb tương đương với kích thước đoạn gene crtB
lý thuyết là 930 bp.

Kết quả thứ 2: Thiết kế vector biểu hiện mang 5 gene mã hóa cho các enzyme
tham gia quá trình sinh tổng β-carotene.
Để thiết kế vector biểu hiện mang 5 gene mã hóa cho quá trình sinh tổng hợp

ix


β-carotene chúng tôi sử dụng vector tách dòng pLUG-B (đã được tách dòng) và vector
biểu hiện pR-iEIY là vector biểu hiện pRSET-A đã được gắn thành công 4 gene: idi, crtE,
crtI, crtY trước đó.
Kết quả thứ 3: Kết quả cảm ứng biểu hiện 5 gene đích tạo ra β-carotene và đánh giá
sơ bộ mức độ biểu hiện bằng màu sắc cặn tế bào
Sau khi gắn được 5 gene vào vector, biến nạp vector vào chủng vi khuẩn E. coli
BL21(DE3) và cảm ứng bằng IPTG, chúng tôi thu được dòng khuẩn lạc có màu vàng
cam đặc trưng của β-carotene

KẾT LUẬN
Đã tách dòng thành công gene crtB có kích thước 930 bp từ vi khuẩn P.ananatis
có trình tự nucleotide trùng khớp với với trình tự gene crtB của vi khuẩn P. ananatis
LMG 20103 đã công bố trước đó trên ngân hàng gene NCBI với mã số CP001875.2.
Đã thiết kế thành công vector pRSET-iEIBY mang policistrongồm 5 genes idi,
crtE, crtI, crtB và crtY mã hoá cho các enzyme xúc tác con đường sinh tổng hợp
β-carotene. Cảm ứng biểu hiện tổ hợp gene trong E. coli BL21(DE3) dưới sự điều khiển
của promoter T7 thu được cặn khuẩn tế bào có màu da cam đặc trưng của β-carotene.
Kết quả này là tiền đề cho các bước nghiên cứu tiếp theo bao gồm xác định hàm lượng
β-carotene tái tổ hợp bằng HPLC, thiết kế các hệ thống vector khác để so sánh tìm ra hệ
biểu hiện có năng lực tối ưu.

x

THESIS ABSTRACT
Master candidate: Nguyen Thi Ha
Thesis title: Research to create recombinant strains of Escherichia coli capable of βcarotene biosynthesis
Major: Biotechnology

Code: 60.42.02.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
β-caroten belongs to carotenoid group that are pigmented yellow or orange,
synthesized naturally in some plants such as carrots, sweet potatoes, peas (Desobry et
al., 1998). β-carotene is also known as provitamin A, the precursor for the synthesis of
vitamin A - a vitamin essential for the eye (Lampert et al., 2003; Stutz et al., 2015).
Like other carotenoids, β-carotene as biological antioxidants, protecting cells and
tissues from the damaging effects of free radicals, so it works to prevent cancer (Britton,
1995). One other effect of β-carotene is to reduce cardiovascular disease - a cause of
death in human beings. Although there is a crucial role in health protection, but the
human body itself is not able to synthesize β-carotene. Therefore t β-carotene has been
supplied through food. And also thanks to the effects of β-carotene, this material is now
increasingly being used in the fields of food, cosmetics and pharmaceuticals (MataGómez et al., 2014). β-carotene market in 2010 was USD 261 million and is projected
to reach 334 million in 2018 (BCC, 2011).
β-carotene synthesis usually following two main methods that is extracted from
natural sources or synthetic chemicals (Ribeiro et al., 2011; Vachali et al., 2012). These
methods have certain disadvantages. Synthetic chemicalsgenerate polluted waste,and
their products have lower bioactive natural β-carotene in the absence of α-carotene
isomers and γ-carotene (Voutilainen et al., 2006; and El Baky Baroty, 2013).
Meanwhile β-carotene extracted from natural sources is not enough and will depend
supplying materials containing β-carotene.
In order to overcome the weaknesses of the above methods, the tendency of
research using genetically engineered research on E. coli strains produce recombinant βmanufacturing capabilities is a β-carotene trend. Natural E. coli itself does not

synthesize β-carotene provitamin since no metabolic enzymes from DMAPP to this
substance. Although Idi gene is in in the genome of E. coli but it also needs to be put
into the expression of vector to increase expression levels, thereby helping to balance
and DMAPP IPP carbon sources. There have been some studies on the biosynthesis of
carotenoids β-carotene in general and in particular to use of E. coli as a host for the

xi


potential development of industrial scale; however, to put into practice, the production
still needs to be further optimization. (Kirby and Keasling, 2009).
The objective of this study was to design the vector expression carrying the genes
of pRSET-iEIBY idi, crtI, crtB, crtE, and crtY coded for enzymes that catalyze the
synthesis of β-carotene in the bacteria of E. coli.Vector pRSET-IEI was created earlier
by attaching 3 gene idi, crtI and crtE on pRSET-A expression vector. CrtB genes were
cloned and sequenced before mounting on pRSET-IEI vector to form pRSET-iEIB.
Gene crtY was cut from the vector Y and plugged into pRSET-iEIB for creating
pRSET-iEIBY expression vector.
Experimental methods
P. ananatis was grown to increase biomass and separate DNA, as raw materials
for the amplified segments of crtB gene using specific primers. CrtB sequence as
amplified successfully, and attached to the pLUG cloning vector and selectively plug
the recombinant plasmid carrying line segments of desired crtB gene.
After screening recombinant plasmid carrying line gene segments of desired crtB,
this plasmid was used as raw materials to design vector expression carrying the
encoding gene of the β-carotene biosynthesis. Plasmid pLUG-B (the plasmid carries the
crtBgene segment) and PR-iEIY (the expression vector that has been mounted
successfully pRSET genes as idi, crtE, crtI and crtY was mounted successfully before).
Two vectors are cut simultaneously by two enzymes E.coRI and for the purpose of
collecting KPN gene segments and cut open round crtB expression vector. Then, the

crtB gene was cut and vector crtB could be joined together using enzymes bind lygase.
The next joining product screens and selects another new recombinant strains.
After selective expression vector carrying the gene encoding 5 β-carotene
biosynthesis, it was transformed into E. coli BL21 to induce the expression of
β-carotene biosynthesis.
After the process of implement the project we obtained one of the following
results:
Result No 1: Results of the crtB cloned genes from P.ananatis
+ P. ananatis were cultured on LB liquid medium enrichment and DNA was
extracted total DNA. The results shown the success of total P.ananatis DNA, DNA of
relatively good quality, less prone to faults.
+ Next we conduct crtB amplified gene segment. Results show that our PCR
products obtained with 1 band approximately 1 kb in size equivalent to the size crtB
theoretical sequences is 930 bp.

xii


Result No 2: Designing vector expression carrying the 5 encoding genes for
enzymes involved in β-carotene biosynthesis.
To design the expression vector carrying the 5 encoding genesfor the β-carotene
biosynthesis, we use vector halftone-B plug (was prewarsly cloned) and PR-iEIY
expression vector is the pRSET vector expression that was successfully camping 4
genes such as idi, crtE, crtI and crtY.
Result No 3: 5 targeted genes expression induces β-carotene and creates a
preliminary assessment of the level of expression by cell color residue.
After binding 5 genes into the vector, the vector was transformed into E. coli
strain BL21 (DE3) and induced by IPTG, we obtain the lines of characterizedorange
colonies of β-carotene

CONCLUSION
Gene CrtB was successfully cloned with the size of 930 bp from bacteria
P.ananatis that has nucleotide sequence with the crtB genetic sequence of the bacterium
P. ananatis LMG 20103 that was depisited NCBI gene bank with the accession number
CP001875.2.
Vector pRSET-iEIBY has successfully designed by the carries of these genes
including idi policistron 5, crtE, crtI, crtB and crtY encoding for enzymes of catalyzed
biosynthetic path β-carotene. The gene expression in E. coli combination BL21 (DE3) is
under the control of the promoter T7 bacterial residue obtained orange cells of βcarotene characteristics. This result is a prerequisite for the next research steps including
determining β-carotene content by HPLC and design of other vector systems to compare
and find optimal capacity of expression system.

xiii


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Carotenoid là một dạng sắc tố tự nhiên xuất hiện chủ yếu ở thực vật và các
loài sinh vật quang hợp khác như nấm, tảo và một vài loại vi khuẩn (SchmidtDannert, 2000). Chúng có vai trò hình thành màu sắc cho cây, che chắn ánh sáng
(Vershinin, 1999) và có khả năng chống oxy hóa mạnh (Stahl and Sies, 2003).
Ngày nay có khoảng 600 loại carotenoid được tìm thấy và 40 loại trong số đó là
cần thiết cho chế độ dinh dưỡng của con người (Rao and Rao, 2007).
β-carotene là sắc tố có màu vàng hoặc da cam, được tìm thấy ở một số loại
cây như cà rốt, khoai lang, hay đậu hà lan (Desobry, Netto et al., 1998). Chúng
được biết đến như một tiền chất để tổng hợp vitamin A – một loại vitamin rất cần
thiết cho mắt (Lampert, Holzschuh et al., 2003; Stutz, Bresgen et al., 2015).
Theo tổ chức WHO và FAO mỗi năm có hàng triệu trẻ em bị mắc các bệnh về
mắt mà nguyên nhân chủ yếu là thiếu provitamin A trong khẩu phần ăn (Harjes,
Rocheford et al., 2008). Ở động vật, β-carotene được sử dụng trong suốt quá
trình sinh trưởng, chúng tham gia vào các quá trình sinh lý, sinh sản, phát triển

cấu trúc biểu bì, xương và tăng cường khả năng miễn dịch (Sklan, 1987). Nhiều
nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-carotene có tác dụng ngăn ngừa quá trình oxy hóa
bằng cách loại bỏ các gốc oxy tự do để bảo vệ tế bào và cơ thể, ngăn ngừa quá
trình phát triển của tế bào ung thư và các bệnh tim mạch (Igielska-Kalwat,
Goscianska et al., 2015).
Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng β-carotene ngày càng tăng.
Theo thống kê của công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường cho carotenoid
đạt 1,2 tỉ USD trong năm 2010 và có thể tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm 2018.
Trong đó, nhu cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao nhất với 262 triệu USD
(chiếm 21,8%) trong năm 2010; với mức tăng trưởng bình quân hằng năm là
1,8% dự kiến đến năm 2018 sẽ tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011). Để đáp ứng
nhu cầu đó β-carotene được sản xuất theo hai con đường chính: Một là con
đường tổng hợp hóa học, hai là chiết xuất từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên
(Bernardo Dias Ribeiro, Daniel Weingart Barreto et al., 2011; Vachali, Bhosale
et al., 2012). Tuy nhiên, sản phẩm β-carotene tổng hợp hóa học chỉ có chứa 1
đồng phân duy nhất, trong khi đó β-carotene tự nhiên không những có chứa

1


β-carotene mà còn có α-carotene và γ-carotene; do đó β-carotene tự nhiên có hoạt
tính sinh học cao hơn 10% so với tổng hợp hóa học (Voutilainen, Nurmi et al.,
2006; Baky and El-Baroty. 2013). Bên cạnh đó thì các sản phẩm β-carotene tự
nhiên cũng được ưa thích hơn, song ở mức độ công nghiệp thì nguồn cung
β-carotene tự nhiên có nhược điểm là phụ thuộc thời vụ, phức tạp trong xây dựng
và quản lý vùng nguyên liệu. Vấn đề đặt ra là cần phải có phương pháp khác để
tạo nguồn cung β-carotene tự nhiên.
Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và công nghệ
sinh học nói riêng, việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cùng với ứng dụng
các kĩ thuật di truyền đã giải quyết được các vấn đề nêu trên. Các nghiên cứu về

tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh ra các enzyme tham gia vào quá trình
tổng hợp β-carotene đang gặt hái được những thành công nhất định. Năm 1990,
Misawa và cộng sự tạo chủng sinh vật có khả năng sinh tổng hợp carotene, thành
công đầu tiên trên Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens (Misawa,
Yamano et al., 1991) và sau đó là trên Escherichia coli (Lee, Momen et al.,
2003).
Hiện nay, việc sản xuất các hợp chất carotenoid ở Việt Nam vẫn còn một
vấn đề mới, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc tách chiết từ thực vật và phân
lập các chủng vi sinh vật sản xuất β-carotene ở quy mô nhỏ. Việc sử dụng các
hợp chất β-carotene ở Việt Nam chủ yếu do nhập khẩu từ nước ngoài với giá
thành cao. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo
chủng Escherichia coli tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp β-carotene”.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
+ Mục tiêu 1: Tách dòng gene crtB mã hóa cho enzyme phytoene
desaturase từ vi khuẩn Pantoea ananatis.
+ Mục tiêu 2: Thiết kế vector biểu hiện chứa 5 gene mã hóa cho các
enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp β-carotene.
+ Mục tiêu 3: Cảm ứng biểu hiện 5 gene đích tạo ra β-carotene và đánh giá
sơ bộ mức độ biểu hiện bằng màu sắc cặn tế bào.
1.3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu về biểu hiện β-carotene
trong E. coli sau này.

2


1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sản phẩm của nghiên cứu mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng sản xuất
β-carotene mới, rút ngắn thời gian sản xuất đáp ứng nhu cầu thực tiễn.

3


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. KHÁI QUÁT VỀ SẮC TỐ β-carotene
2.1.1. Cấu trúc và tính chất lý hóa
Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên được tìm thấy chủ yếu trong các loài
thực vật, chúng có màu vàng, da cam đến đỏ, bao gồm 65-70 sắc tố tự nhiên và là
một trong những hợp chất màu quan trọng nhất được sử dụng trong công nghiệp
thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm. Carotenoid thường được chia làm hai nhóm:
Thứ nhất là nhóm caroten hydrocacbon như là β-carotene, torulen và nhóm còn
lại là xanthophyl bị oxy hóa như astaxanthin. Hiện nay, nhóm caroteonid đang
được nghiên cứu rộng rãi, tiêu biểu trong đó phải kể đến β-carotene.
Cấu trúc: β-carotene là một trong số hơn 600 loại caroteoid đã được tìn
thấy trong tự nhiên. Chúng là một dẫn xuất isoprene chưa bão hòa bao gồm 40
nguyên tử cacbon và 56 nguyên tử hydro (C40H56) β-carotene có dạng tinh thể
hình kim, trong cấu trúc có các nối đôi đơn xen kẽ tạo nên một chuỗi polyen
(hình 2.1).

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của β-carotene
Tính chất lý hóa: β-carotene là hợp chất có màu vàng cam, tan tốt trong
dầu và các dung môi hữu cơ như aceton, etyl-ete, metanol, nhưng lại không tan
trong nước. Nhờ có hệ thống nối đôi liên hợp dài mà β-carotene có ái lực mạnh
với oxy đơn bội nên dễ bị oxy hóa, đồng phân hóa khi tiếp xúc với không khí,
ánh sáng hay nhiệt độ (Goodwin, 1980).
2.1.2. Vai trò của β-carotene đối với con người
2.1.2.1. Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe con người
Hiện nay, β-carotene được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm nghiên cứu
bởi tác dụng hữu ích của nó đối với sức khỏe con người (Nagao, 2009). β-carotene

được biết đến như tiền chất vitamin A rất cần thiết cho mắt (Lampert, Holzschuh

4


et al., 2003), bên cạnh đó chúng cũng có khả năng chống oxy hóa mạnh và ngăn
ngừa một số bệnh ung thư.
Vai trò là chất chống oxy hóa
Gốc tự do là những phân tử bị thiếu hụt điện tích. Các gốc tự do này thường
không cân bằng và rất dễ phản ứng. Chúng luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử từ
các phân tử khác, các phân tử bị mất điện tích sẽ lại trở thành những gốc tự do
mới. Quá trình này được gọi là quá trính oxy hóa và gốc tự do đó được gọi là
chất oxy hóa. Chất oxy hóa tiêu biểu đến nay được phát hiện là ROS. ROS là một
sản phẩm phụ của quá trình hô hấp và trao đổi chất trong cơ thể, đồng thời ROS
cũng được kích thích sinh ra do các tác động của môi trường như tia UV hay tiếp
xúc với nhiệt độ cao. ROS tích lũy có thể gây tổn thương tế bào và các phân tử
sinh học như DNA, protein (Adetayo O.Omoni and Aluko, 2005). Theo nhiều
nghiên cứu đã chỉ ra ROS tích lũy trong tế bào và cơ chế quá mức là nguyên
nhân gây ra các bệnh thoái hóa như Alzheimer, ung thư, Parkinson, các bệnh
mãn tính, bệnh tim mạch. Các chất chống oxy hóa là các chất giúp ngăn chặn
hoặc làm chậm quá trình oxy hóa. Chúng ngăn quá trình phá hủy này bằng cách
khử đi các gốc tự do (Guerin, Huntley et al., 2003). Carotenoid đã được chứng
minh là chất chống oxy hóa sinh học, bảo vệ tế bào và mô từ các tác hại của các
gốc tự do (Maiani, Caston et al., 2009). Trong carotenoid, β-carotene có hiệu quả
trong việc bảo vệ màng lipid của tế bào khỏi tác hại của các gốc tự do (Britton,
1995), bên cạnh đó cùng với một số nhóm carotenoid khác như lycopene có khả
năng loại bỏ oxy tốt nhất, lutein và zeaxanthin có hiệu quả trong việc loại bỏ các
gốc tự do là tăng tính toàn vẹn của tế bào (Smith, 1998).
β-carotene là tiền chất vitamin A
β-carotene còn được biết đến với tên gọi là tiền chất vitamin A (Lampert,

Holzschuh et al., 2003). Khi vào cơ thể, β-carotene bị phân cắt ở giữa mạch
cacbon trung tâm tạo thành hai phân tử retinal bằng enzyme 15,15’dioxygenase
(Biesalski, Chichili et al., 2007). Retinal tiếp tục được chuyển hóa bởi enzyme
thành retinol. Retinol tạo thành có thể được hấp thu trực tiếp từ thức ăn vào thành
ruột hay sẽ được vận chuyển nhờ liên kết với protein đến các cơ quan cần thiết
hoặc đến gan là nơi tích lũy vitamin A dưới dạng retinyl este. Khi cơ thể cần,
retinyl este được thủy phân thành retinol tự do và acid hữu cơ trước khi được hấp

5


thụ. Quá trình thủy phân này được enzyme dịch tụy xúc tác, axit hữu cơ tạo thành
thường là acid palmitat chiếm thành phần chủ yếu trong retinyl este thực phẩm.
Quá trình chuyển hóa β-carotene thành vitamin A được kiểm soát chặt chẽ nên
không tạo thành lượng dư thừa vitamin A có độc tính cao. Con người và động vật
cần β-carotene trong suốt quá trình sinh trưởng của mình, song bản thân chúng
lại không có khả năng tổng hợp được mà chủ yếu thu nhận qua con đường tiêu
hóa (Fujisawa, Watanabe et al., 2008).

Hình 2.2. Sơ đồ chuyển hóa β-carotene thành vitamin A
Tăng cường thị giác
Trong máu phân tử vitamin A dưới dạng retinol sẽ chuyển hóa thành
retinal. Trong bóng tối, retinal kết hợp với protein opsin để tạo thành Rhodopsin
– một sắc tố nhạy cảm với ánh sáng ở võng mạc mắt, giúp võng mạc nhận được
các hình ảnh trong điều kiện thiếu sáng. Sau đó, khi ra sáng Rhodopsin lại bị

6


phân hủy thành opsin và trans-retinal, rồi trans-retinal vào máu để trở lại cisretinol (Wolf, 2001). Bên cạnh đó, theo một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng

β-carotene có khả năng làm chậm sự tiến triển của bệnh thoái hóa điểm vàng làm
giảm thiểu các nguy cơ mù lòa (Snodderly, 1995; Gordon and Schooff, 2002).
Việc thiếu hụt vitamin A gây ra một loạt các thay đổi về sinh lý mà trong đó cơ
quan bị ảnh hưởng nhiều nhất là mắt. Một trong những biểu hiện đầu tiên là sự
suy giảm thị lực, điển hình như là bệnh quáng gà (khả năng nhìn giảm mạnh khi
độ chiếu sáng thấp) (Roncone, 2006).
Giảm thiểu các bệnh về tim mạch
Theo WHO, bệnh tim mạch đang là nguyên nhân tử vong hàng đầu ở người
trên toàn thế giới và chiếm nhiều nhất ở các nước đang phát triển. Mỗi năm,
người chết do bệnh tim và đột quỵ nhiều hơn cả ung thư, lao, sốt rét và HIV cộng
lại (Moran, Forouzanfar et al., 2014). Năm 1990, số ca tử vong do các bệnh tim
mạch là 13,3 triệu ca chiếm 25,8%, đến năm 2013 con số này đã tăng lên 17,5
triệu người chiếm 31,5% tổng số ca tử vong trên toàn thế giới (Mendis, Shanthi;
et al., 2014). Bệnh tim mạch bao gồm các bệnh suy tim, sơ vữa động mạch, động
mạch vành và nhồi máu cơ tim (GBD 2015). Bệnh tim mạch được hình thành do
sự tích lũy quá nhiều sản phẩm oxy hóa gây nên (Singh, Dhalla et al., 1995), đặc
biệt là quá trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) do ROS dẫn đến hình
thành các mảng bám trên thành mạch gây sơ vữa thành mạch (Dhalla, Temsah et
al., 2000). Tác động chính của β-carotene tới các bệnh tim mạch là chống lại quá
trình oxy hóa, do β-carotene được vận chuyển trong các lipoprotein tỷ trọng thấp
thông qua đó có thể trực tiếp ức chế quá trình oxy hóa của LDL (Reaven,
Ferguson et al., 1994). Chính vì thế, các chuyên gia thường khuyến các sử dụng
các thực phẩm giàu carotene để phòng ngừa và chữa trị các bệnh về tim mạch.
Ngăn ngừa bệnh ung thư
Oxy là yếu tố không thể thiếu đối với cuộc sống. Khi các tế bào sử dụng
oxy để tạo ra năng lượng, các sản phẩm phụ được tạo ra như là một hệ quả của
ATP (adenosine triphosphate) sản xuất bởi các ty thể và lạp thể. Những sản phẩm
phụ thường là chất oxy hóa (ROS) và các nitơ phản ứng (RNS). ROS và RNS
đóng một vai trò kép vừa có lợi, vừa có hại đối với có thể. Ở mức độ thấp hoặc
trung bình, ROS và RNS phát huy tác dụng có lợi trên các phản ứng của tế bào

và chức năng miễn dịch. Ở nồng độ cao, chúng tạo ra sự căng thẳng oxy hóa có

7


thể làm hỏng tất cả các cấu trúc tế bào gây nên các sai hỏng (Young and
Woodside, 2001; Lien Ai Pham-Huy, Hua He et al., 2008). Những đột biến này
thường xảy ra ở một tế bào hoặc một nhóm tế bào dẫn đến sự tăng lên không
kiểm soát hình thành các khối U (Cooper GM, 1992). β-carotene tác động mạnh
mẽ vào tế bào ung thư do chúng điều khiển tăng trưởng của tế bào, điều hòa biểu
hiện gene và tác động lên các tế bào miễn dịch, hạn chế các sai khác bất thường
dẫn tới sự phát triển không ngừng của tế bào ung thư. β-carotene tác động vào
quá trình ung thư theo hai hướng: Một là chúng tác động vào quá trình oxy hóa tế
bào do tính chất chống oxy hóa mạnh, hai là chúng tham gia vào quá trình biệt
hóa và phân chia tế bào (Heller, Descamps et al., 1998).
2.1.2.2. Ứng dụng của β-carotene trong công nghiệp
β-carotene có tính chống oxy hóa mạnh giúp tăng cường hệ miễn dịch, ngăn
ngừa bệnh ung thư, các bệnh tim mạch và các bệnh mãn tính khác chính vì vậy
chúng được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm và dược
phẩm (Luis Carlos Mata-Gómez, Julio César Montanez et al., 2014). Trong đó,
có hai mảng ứng dụng lớn là màu thực phẩm và thực phẩm bổ sung. Trong công
nghiệp dược phẩm, β-carotene được sản xuất dưới dạng dược chất, sử dụng bổ
sung ngoài chế độ ăn của con người. Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, βcarotene được thêm vào với tác dụng bảo vệ da chống lại tác hại của UV (Del
Campo, Moreno et al., 2000). Trong lĩnh vực màu thực phẩm, do có khả năng
mang màu sắc nên β-carotene được sử dụng là chất bổ sung màu cho các thực
phẩm tự nhiên như lòng đỏ trứng gà, thịt gà, cá. Đồng thời bên cạnh các thuộc
tính màu sắc, β-carotene còn có tác dụng bảo quản thực phẩm, là nguồn cung cấp
chất chống oxy hóa cho thực phẩm. Ngoài ra, sử dụng β-carotene từ nguồn vi tảo
có thể tận dụng lượng chất khoáng có trong vi tảo để kích thích quá trình đồng
hóa trong tế bào và cơ thể. Việc sử dụng β-carotene làm màu thực phẩm ngày

nay rất phổ biến và không gây độc hại cho sức khỏe
Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng β-carotene ngày càng tăng.
Theo báo cáo của công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường dành cho
carotenoid đạt 1,2 tỉ USD trong năm 2010 và có thể tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm
2018. Trong đó, nhu cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao nhất với 262 triệu
USD trong năm 2010; với mức tăng trưởng bình quân hằng năm là 1,8% dự kiến
đến năm 2018 sẽ tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011) (hình 2.3).

8


Hình 2.3. Biểu đồ khảo sát thị trường carotenoid năm 2010
và dự kiến đến năm 2018
Để đáp ứng nhu cầu đó, β-carotene được sản xuất bằng hai phương pháp:
Đó là tổng hợp hóa học và chiết xuất từ tự nhiên. Những nghiên cứu gần đây cho
thấy việc sử dụng β-carotene tổng hợp hóa học ở liều lượng cao có liên quan đến
hiện tượng biến đổi nhiễm sắc thể, dẫn đến nguy cơ ung thư trong khi đó βcarotene tự nhiên lại có khả năng chống lại sự sai khác này do đó có khả năng
ngăn ngừa ung thư. Bên cạnh đó thì các sản phẩm β-carotene tự nhiên cũng được
ưa thích hơn, song ở mức độ công nghiệp thì nguồn cung β-carotene tự nhiên có
nhược điểm là phụ thuộc thời vụ, phức tạp trong xây dựng và quản lý vùng
nguyên liệu. Sự chênh lệch về giá giữa β-carotene tự nhiên (1000-2000 USD/kg)
và β-carotene tổng hợp hóa học (400-800 USD/kg) (Tawfiq Abu-Rezq S., Suad
Al-Hooti et al., 2010) cũng luôn thôi thúc các nhà khoa học tìm ra con đường
chuyển hóa β-carotene tự nhiên.
2.1.3. Con đường tổng hợp β-carotene
Tất cả các carotenoid nói chung và β-carotene nói riêng quá trình sinh tổng
hợp đều đi theo con đường isoprenoid. Con đường tổng hợp isotenoid được chia
thành ba giai đoạn: (1) hình thành các đơn phân 5 cacbon (C5) gồm IPP và
DMAPP, (2) giai đoạn hình thành các hợp chất C40, (3) thay đổi chuỗi C40 trong
hệ thống các carotenoid để tạo thành β-carotene.

9


Giai đoạn một: Sinh tổng hợp các chất đầu tiên để đi đến DMAPP và IPP
diễn ra theo 2 con đường riêng biệt: Con đường mevalonate (MAV) và con
đường non-mevalonate (MEP).
Sinh vật nhân chuẩn thường sử dụng con đường MAV để chuyển hóa
acetyl-CoA thành IPP, tiếp theo là đồng phân hóa IPP thành DMAPP. Sinh vật
nhân sơ trừ một số trường hợp ngoại lệ, thường sử dụng con đường MEP để sản xuất
IPP và DMAPP qua phản ứng ngưng tụ đầu tiên giữa pyruvate and glyceraldehyde-3phosphate. Thực vật và Streptomycetes thì sử dụng cả hai con đường (Yoon, HyeMin Park et al., 2007).
Con đường MAV
Con đường MAV lần đầu tiên được phát hiện bởi Bloch và Lynen vào
những năm 60 (Lynen, 1967). Trong con đường này, hai phân tử acetyl-CoA đầu
tiên sẽ kết hợp lại với nhau để tạo thành acetoacetyl-CoA, sau đó một phân tử
acetyl-CoA thứ ba được đưa vào thông qua liên kết cộng aldol để tạo thành betaHydroxy-beta-methylglutaryl-CoA (HMG – CoA). Sau đó, dưới sự xúc tác của
enzyme HMG – CoA reductase, HMG – CoA được chuyển hóa thành
mevalonate. Mevalonate sau đó được phosphoryl hóa hai lần và decarbonxyl để
tạo ra IPP (Isopentenyl pyrophosphate). IPP sau đó được đồng phân hóa thành
một isoprene khác là DMAPP (Dimethylallyl pyrophosphate) nhờ sự xúc tác của
enzyme IPP isomerase.

Hình 2.4. Sinh tổng hợp IPP và DMAPP theo con đường MAV

10


Con đường MEP
Sau khi con đường MAV được khám phá, các nhà khoa học đã nghiên cứu
và phát hiện một số loại vi khuẩn như E. coli và S. chromofuscus có con đường

sinh tổng hợp carotenoid không phụ thuộc vào mevalonate, con đường này được
gọi là non-mevalonate hay còn gọi là MEP. Trong con đường này quá trình sinh
tổng hợp IPP và DMAPP không cần mevallonate. Cơ chất đầu tiên là phản ứng
ngưng tụ giữa pyruvate với glyceraldehyde-3-phosphate tạo thành DXD nhờ xúc
tác của DXD synthetase, tổng hợp chất trung gian không những cho IPP và
DMAPP mà còn để tổng hợp thiamine và pydoxol. DXD có thể được đưa vào E.
coli và A. thaliana làm tiền chất cho các hợp chất này. Sau đó diễn ra một loạt
các phản ứng chuyển hóa thành MEOP, MEP và tạo ra IPP và DMAPP. Con
đường MEP không có mặt trong các loài động vật có vú nhưng có nhiều trong vi
khuẩn gây bệnh và kí sinh trùng.

Hình 2.5. Sinh tổng hợp IPP và DMAPP theo con đường MEP

11