Nghiên cứu định tính, định lượng đồng thời strychnin và brucin trong bột mã tiền chế và hoàn hydan bằng phương pháp sắc khí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRUỜNG ĐẠI
HỌC
•
•

BỘ Y TẾ

Dược
HÀ NỘI
•
•

D S. Phạm Thị Giảng

NGHIÊN CỨU ĐịNH
TÍNH *, ĐỊNH
LƯỢNG
ĐỒNG THỜI
•
•
•
STRYCHNIN VÀ BRUCIN TRONG BỘT MÃ TIề N

chế và

HOÀN HYDAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC K Ý LỎNG
HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Chuyên ngành: Kiểm nghiêm dược phẩm và độc chất học

Mã số

: 30205

CÔNG TRÌNH TỐT NGHIỆP THẠC s ĩ DUỢC HỌC

Người hưởng dẫn khoa hoc:
PGS.TS. Trịnh Văn Quỳ
TS. Phan Túy

Hà Nội - 1999


Lời cắm ơn

Đ ề tài này được ứiực hiện tại Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế, dưới sự hướng
dẫn của PGS. TS. Trịnh Văn Quỳ- Giám đốc Viện Kiểm nghiệm và TS. Phan Tuý,
cấn bộ giảng dạy bộ môn Hoắ đại cương - Vô Cơ-Hoá lý của Trường Đại học
Dược Hà nội.
Đ ể hoàn thành đ ề tài này, chúng tồi đã nhận được sự chỉ dẫn tận tình của.
PGS.TS. Trịnh Văn Quỳ, TS.Phan Tuý.
Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi cũng nhận được những ý kiến
đóng góp quí báu của PGS.Phạm Gia H u ệ, PGS. TS. Trần Tử An ,TS. Trịnh Văn
Lẩu, PGS. TS. Phạm Quang Tùng và PGS.TS. Bùi Kim Liên cùng các ửiầỵ,cô
giáo . Đồng ửiời chúng tôi cũng luôn nhận được sự giúp đỡ nhiệt thử của cấc
bạn đồng nghiệp tại cắc phòng Đông Dược, phòng Thuốc chuẩn và phòng Vật
lý-Đo lường của Viện Kiểm nghiệm.
Nhân dịp này, chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với sự giúp
đỡ quý báu của các ứiẩỵ,cô giáo và các bạn đồng nghiệp.

Ds. Phạm Thị Giảng


MỤC LỤ C
goG ăcà
Trang

PHẦN MỞ ĐẦU

01

PHẦN NỘI DUNG

04

Chương 1. Tổng quan.

04

1 .1 - M ã tiền ( Nguồn g ố c, thành phần hoá h ọc, ch ế
biến, tác dụng và công dụng).

04

1 .2 -V à i nét về m ột số alcaloid chính của mã tiền.

06

1.2.1. Strychnin

06

1.2.2. Brucin

08

1 .3 - M ột số phương pháp đã được áp dụng để ch iết xuất
strychnin và brucin từ bột m ã tiền.

09

1.3.1. Chiết bằng cách ngâm hoặc lắc siêu âm.

09

1.3.2. Chiết gián đoạn.

10

1.3.3. Chiết liên tục.

11

1 .4 - M ột số phương pháp đã được áp dụng để định
lượng alcaloid toàn phần, strychnin và
brucin hoặc strychnin trong bột m ã tiền

12

1.4.1. Phương pháp chuẩn độ acid-kiềm.

12

1.4.2. Phương pháp đo quang phổ tử ngoại.

13

1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

15


Chương 2 .Đối tượng , nội dung và phương pháp
nghiên cứu.

21

2.1. Đối tượng nghiên cứu.

21

2 .2 . Nội dung và phương pháp nghiên cứu.

22

2.2.1. Nghiên cứu phương pháp chiết xuất strychnin và brucin
từ nguyên liệu bột mã tiền chế và hoàn Hydan.

22

2.2.1.1. Khảo sát phương pháp chiết theo Dược điển Trung Quốc
1997, Dược điển Việt Nam

n, tập 3 và phương pháp của

Dược điển Nhật 1996 trên mẫu Mj và M2.

22

2.2.1.2. Phương pháp đề xuất chiết strychnin và brucin từ bột mã
tiền chế Mj và bột hoàn Hydan tự tạo M2.

22

2.2.2. Xây dựng phương pháp HPLC để phân tích định tính và
đinh lượng đồng thời strychnin và brucin trong bột mã
tiền chế và hoàn Hydan.
2.2.2.1 . Khảo sát điều kiện sắc ký.

24

24

2.2.2.2. Xây dựng phương pháp định tính và đinh lượng đồng
thời strychnin và brucin trong bột mã tiền chế và hoàn Hydan.

24

2.2.3. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả.

26

Chương3.Thực nghiệm, kết quả và bàn luận.

28

3.1- Dụng cụ, hoá ch ất và nguyên vật liệu.

28

3.1.1. Dụng cụ.

28

3.1.2. Hoá c h ấ t , nguyên vật liệu.

28

3.2-T h ự c nghiệm , kết quả và bàn luận.

29


3.2.1. Nghiên cứu phương pháp chiết strychnin và brucin từ bột
29

mã tiền chế và hoàn Hydan.
3.2.1.1. Khảo sát phương pháp chiết theo Dược điển Trung Quốc
1997 và Dược điển Việt Nam

n tập 3.

29

3.2.1.2. Khảo sát phương pháp chiết theo Dược điển Nhật 1996

30

3.2.1.3. Khảo sát điều kiện chiết thích hợp.

31

3.2.1.4. Bàn luận

38

3.2.2. Xây dựng phương pháp xác đinh đồng thời strychnin và
40

brucin bằng HPLC.
3.2.2.1. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký để định tính và đinh lượng
đồng thời strychnin và bracin trong mã tiền chế

40

và hoàn Hydan.
3.2.2.2. Xây dựng phương pháp định tính và đinh lượng đồng thời
strychnin và brucin trong mã tiền chế và hoàn Hydan.

45

3.2.2.3. Áp dụng phương pháp HPLC đã xây dựng để đinh lượng
đồng thời strychnin và brucin trong hoàn Hydan.

54

3.2.2.4. Bàn luận.

57

K ẾT LUẬN V À ĐỀ NGHỊ.

58

TÀI LIỆU THAM KHẢO.

62

PHỤ LỤC.

66

•L«£*4^ «c#^

«L«fc4ỈIP^1»*1»•JL*^

«£«

«1«st*aX*T*T*T*

Những chữ viết tắt dùng trong luận văn.

CTD -V TYT

:

Công ty Dược -Vật tư y tế.

DĐ

:

Dược điển

H PLC

:

Sắc kỷ lỏng hiệu năng cao.

nm

:

Nanomet.

ng

:

M icrogam.

ịim

:

M icromet.

ỊLll

Microlit.

SKS

SỐ kiểm soát.

TCCL
UV-VIS

:

Tiêu chuẩn chất lượng.

:

Tử ngoại - Khả kiến.


1

PHẦN MỞ ĐẦU
Vị thuốc mã tiền từ lâu đã được dùng trong cả tây y và đông y. Vị thuốc
này cũng được đưa vào một số Dược điển của các nước như: Dược điển Trung
Quốc 1997, Dược điển Nhật 1996, Dược điển Anh 1980 ...Để giảm độ độc của vị
thuốc này, trong y học cổ truyền người ta chỉ dùng dưới dạng mã tiền đã chế
biến (Mã tiền chẽ). Có nhiều cách chế biến như: chế vói dầu vừng hoặc dầu lạc,
rang với cát, chế với cam thảo. Mã tiền chế là thành phần chính trong nhiều chế
phẩm thuốc uống, trong các chế phẩm đó, có hoàn Hyđan của Công ty Dược
phẩm tỉnh Thanh Hóa được Bộ Y tế cấp số đăng ký cho phép sản xuất và lưu
hành trên thị trường . Hoàn Hỵdan được người tiêu dùng ưa chuông trong điều trị
các bệnh thấp khớp ,viêm dây thần kinh và đau nhức xương.
Trong hoàn Hydan có bột mã tiền chế chứa các alcaloid, trong đó strychnin
là thành phần chính có tác dụng nhưng độc tính cao. Bên cạnh đó, brucin, một
alcaloid rất độc cũng chiếm một tỷ lệ lớn sau strychnin và rất dễ gây ngộ độc khi
dùng thuốc. Vì vậy, việc xác đinh chính xác hàm lượng cả strychnin và brucin
trong nguyên liệu mã tiền chế với dầu vừng cũng như ừong hoàn Hydan là vấn
đề cần quan tâm ứong công tác tiêu chuẩn hoá và kiểm tra chất lượng để thuốc
vừa có hiệu lực chữa bệnh lại vừa an toàn cho người bệnh.
Trước đây, trong tiêu chuẩn cơ sở của vị thuốc mã tiển chế với dầu vừng
cũng như tiêu chuẩn cơ sở của hoàn Hydan, phương pháp định lượng chỉ mói
dừng lại ở mức độ xác đinh hàm lượng alcaloid toàn phần. Trong những năm gần
đây, Công ty Dược - Vật tư y tế Thanh Hóa đã nghiên cứu xây dựng phương
pháp quang phổ tử ngoại để đinh lượng strychnin nhưng chưa đề cập tới việc xác
đinh hàm lượng brucin nên chưa kiểm soát được độ an toàn của thuốc. Mặt khác,
trong hoàn Hydan ngoài bột mã tiền chế bằng dầu vừng còn có các thành phần
khác như: cao đặc Hy thiêm, cao đặc Ngũ gia bì chân chim có chứa các hoạt
chất khác làm cho kết quả thu được bằng phương pháp quang phổ không ổn
đinh.

2

Vì vậy hiện nay, trong tiêu chuẩn chất lượng xin cấp số đăng ký sản xuất
và lưu hành mặt hàng này, Công ty vẫn sử dụng phương pháp đinh lượng alcaloiđ
toàn phần. Riêng nguyên liệu bột mã tiền chế bằng dầu vừng, ngoài việc đinh
lượng alcaloid toàn phần, ứong tiêu chuẩn cơ sở còn định lượng strychnin bằng
phương pháp quang phổ tử ngoại nhưng chưa có phương pháp định lượng brucin.
Về các phương pháp đinh lượng alcaloid trong mã tiền và trong các chế
phẩm đông dược có chứa mã tiền,trong các tài liệu đã tham khảo chứng tôi thấy:
Hầu hết các Dược điển (Dược điển Việt nam I tập 1 , Dược điển Pháp IX tập 1 và
Dược điển Liên Xô X ) đều định lượng alcaloid toàn phần bằng phương pháp
trung hòa sau khi chiết các alcaloid bằng dung môi thích hợp hoặc định lượng
riêng strychnin bằng phương pháp quang phổ tử ngoại (Dược điển Anh 1980;
Dược điển Trung Quốc 1988, 1997; Dược điển Việt Nam

n tập 3).

Trong Dược

điển Nhật 1996 ,strychnin trong mã tiển chưa chế được định lượng bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sau khi chiết strychnin bằng ether. Nói chung
các Dược điển đều chưa đề cập tới việc định lượng brucin ữong mã tiền nói
chung cũng như trong mã tiền chế bằng dầu vừng nói riêng.Một số tài liệu khác
trong những năm gần đây đã đề cập đến việc định lượng strychnin và bnicin
trong mã tiền chưa chế, mã tiền chế cũng như trong các chế phẩm đông dược có
chứa mã tiền bằng phương pháp quang phổ , HPLC.Tuy nhiên trong các tài liệu
mà chúng tôi đã tham khảo, chưa có tác giả nào nêu lên qui trình chiết xuất và
đinh lượng đồng thòi strychnin và brucin trong mã tiền chế bằng dầu vừng cũng
như trong hoàn Hydan bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Sau khi tham khảo các tài liệu và căn cứ vào tình hình thực tế của công tác
kiểm tra chất lượng thuốc hiện nay, đặc biệt là đối với các chế phẩm thuốc có
chứa dược liệu độc, chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu định tính, định lượng

đồng thời strychnin và bmcin ứong bột mã tiền ch ế và ữong hoàn Hỵdan bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- Mục tiêu của công trình tốt nghiệp:


3

Xây dựng phương pháp chiết và đinh tính, định lượng đồng thời strychnin
và brucin đủ tin cậy nhằm góp phần vào công tác tiêu chuẩn hoá chất lượng vị
thuốc mã tiền chế dầu vừng cũng như hoàn Hydan.
- Nội dung của công trình tốt nghiệp.
+ Khảo sát chọn phương pháp chiết thích hợp để chiết hoàn toàn strychnin và
brucin từ bột mã tiển chế dầu vừng và từ hoàn Hydan.
+ Xây dựng chương trình sắc ký để đinh tính và định lượng đồng thời strychnin
và brucin trong các dịch chiết thu được từ các dịch chiết ữên trên.
- Ý nghĩa khoa học của công trình tốt nghiệp.
+Góp phần triển khai và ứng dụng một kỹ thuật tiên tiến và chính xác vào công
tác kiểm ưa chất lượng thuốc đông dược có chứa dược liệu độc nói chung và
hoàn Hydan nói riêng.
- Ý nghĩa thực tiến của công ừình tốt nghiệp.
+Kết quả của công trình tốt nghiệp là cơ sở về mặt khoa học để xây dựng
phương pháp định tính , định lượng strychnin và brucin trong chuyên luận mã
tiền của Dược điển Việt Nam bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
+Giúp Công ty Dược-Vật tư y tế Thanh Hoá nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng hoàn
Hydan nhằm đảm bảo an toàn và hiệu lực của chế phẩm này.
»7* »x»

«L «£»-L*-X-

alt

'T * •T* •T* T *

*T*

^

•T* ' I s

v

jli*Lf+1?

*T* ' 1'

1'

jli


4

PHẦN NỘI DƯNG
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.1. Mã tiền (Nguồn gốc, thành phần hóa học, chế biến,
tác dụng và công dụng).

Vị thuốc mã tiền (Semen Strychnii) là hạt lấy từ quả chín của cây mã tiền
Strychnos nux-vomica L. hoặc một số loài Strychnos khác thuộc họ Mã tiển
(Loganiaceae) đã được phơi hoặc sấy khô [7],[16],[17],[19],[22]. Loài Strychnos
nux-vomica

thường được nhiều tài liệu nói đến [42],[43],[50] ,loài này mọc

hoang ở vùng rừng núi miền Nam nước ta [7],[22],[30],[32]. Hoạt chất chính
ứong hạt mã tiền Strychnos nux-vomica là alcaloid (2-5%). Trong đó gần 50% là
strychnin, phần còn lại chủ yếu là bracin và 2-3% là alcaloid khác như: a colubrin, pseudostrychnin, P-colubrin, vomicin, novacin [4],[22]. Ngoài ra trong
hạt mã tiền còn chứa các chất béo từ 4 đến 5%, acid igasuric, acid loganic,
stigmasterin, cycloarterol và một glycosid là loganin [4],
Trong y học cổ truyển, người ta chỉ sử dụng mã tiền đã chế biến (Mã tiền
chế). Có nhiều phương pháp chế biến khác nhau, ữong đông y hay sử dụng các
phương pháp sau đây:
- C hế với dầu vừng, dầu lạc.
Đây là phương pháp phổ biến nhất; trong phương pháp này cũng có nhiều
cách làm khác nhau. Thông thường là ngâm hạt mã tiền trong nước vo gạo
khoảng 36 giờ cho mềm, lấy ra loại bỏ vỏ ngoài và mầm ,thái mỏng, sấy khô,
tẩm ướt bằng dầu vừng để qua đêm, sau đó sao vàng đậm cho hết dầu vừng rồi
cho vào lọ kín. Hoặc sau khi sấy khô cũng có thể đem rán với dầu vừng cho đến
khi nổi lên thì vớt ra, dùng giấy bản thấm hết dầu, sấy khô và cho vào lọ kín

[4 ],[2 2 1
- Rang với cắt.


5

Ngâm hạt mã tiền trong nước 36 giờ đến khi mềm, bỏ vỏ ngoài và cây

mầm oếu có. Sấy khô, sau đó cho vào cát nóng rang đến màu vàng đậm hơi
phồng lên, lấy ra sàng loại cát, xát sạch và tán thành bột mịn. Bột được bảo quản
trong lọ kín [ 4 ].

- C hế với cam thảo.
Ngâm hạt mã tiền vào nưóe vo gạo một ngày đêm, vớt ra, rửa sạch và cho
vào nổi nấu với cam thảo ứong 3 giờ theo công thức: lOOg hạt mã tiến cho vào
400ml nước và 20g cam thảo. Lấy dần hạt mã tiền ra, bóc vỏ khi còn nóng. Đun
dầu vừng cho sôi, sau đó bỏ hạt mã tiền vào đến khi thấy hạt nổi lên thì vớt ra
ngay, thái nhỏ, sấy khô và đóng lọ kín [4],[7].
Công ty Dược - Vật tư y tế Thanh Hóa đã áp dụng cách chế biến mã tiền
bằng dầu vừng.
Sau khi chế biến; độc tính và hàm lượng alcaloid toàn phần cũng như hàm
lượng strychnin, brucin đều giảm và mức độ giảm khác nhau tùy theo phương
pháp chế biến [2],[21],[29]. Người ta thấy rằng, trong các loại mã tiền chế, hàm
lượng alcaloid toàn phần cũng như hàm lượng strychnin, bracin giảm so với mã
tiền chưa c h ế , trong đó mã tiền chế với dầu vừng giảm nhiều nhất [21].

Tắc dụng, độc tính và công dụng.
Người ta cho rằng tác dựng của mã tiền là do tác dụng của strychnin. Nó
tác dụng vào tất cả các cơ quan như: dạ dày, hệ thần kinh, tim. Tác dụng nhiều
hay ít tùy theo liều lượng. Vái Hếu thích hợp, nó kích thích dây thần kinh và điều
hòa sự hoạt động của thần kỉnh, đăc biệt là tủy sống, có tác dụng làm tăng huyết
áp do co mạch ngoại vi . Mã tiền còn có tác dụng khai vị, giúp tiêu hóa, giảm
đau, tiêu sưng [3 ] ,[4], [10]. Mã tiền là vị thuốc rất độc,với liều cao nó gây co
giật, co cứng kiểu uốn ván, có thể chết do liệt hô hấp[20],[40]. Mã tiền chưa chế
được bảo quản theo chế độ thuốc độc bảng A, trong khi đó mã tiền chế được bảo
quản theo chế độ thuốc độc bảng B [9].

6

Mã tiền chưa chế được dùng làm nguyên liệu để chiết xuất strychnin và
bracin hoặc thường chỉ dùng ngoài làm thuốc xoa bóp chữa nhức mỏi chân tay
do thấp khớp, đau dãy thần kinh dưới dạng cồn thuốc.
Y học cổ truyền dùng mã tiền chế để điều trị đau nhức, sưng khớp, đau dây
thần kinh, suy nhược thần kinh, bại liệt, nhược cơ, tiêu hóa kém . Dùng với liều:

Người lán: - Liều thường dùng uống: 0,05g/ lần
và 0,15g /ngày.
- Liều tối đa uống : 0,1 Og /lần
và 0,30g / ngày.
Trẻ em dưới 2 tuổi không được dùng.
Từ 2 tuổi trở lên dùng mỗi lần 0,003g cho mỗi tuổi [4], [7], [10],

[16], [17], [19], [30], [32].
Trong Dược điển Trung Quốc, người ta qui định, không dùng mã tiền chưa
chế, không được dùng quá liểu qui đinh Jkhông được dùng trong thời gian dài và
chống chỉ định đối với người có thai [42], [43],

1.2. Vài nét về một số alcaloid chính của mã tiền.
1.2.1. Strychnin.
Strychnin là strychnidin - 10-on, có công thức phân tử :C21H22N20 2 [36],

[471 [48].

Strychnin có thể tổn tại dưới dạng base hoặc các dạng muối

hydroclorid [36], dạng sulfat [ 44], [19 7 và dạng nitrat [14 ]. Hai dạng sulfat và
niừat hay được dừng trong ngành Dược. Strychnin có công thức cấu tạo (I).

(D


7

Độ tan. Strychnin ở dạng muối dễ tan trong nước, tan được ứong ethanol và
không tan trong các đung môi hữu cơ. Ngược lại, dạng base lại không tan trong
nước, tan được trong các dung môi hữu cơ. Strychnin base tan ở tỷ lệ 1/5 ừong
cloroform, 1/150 trong ethanol và 1/260 trong methanol , tan rất ít trong
ether.Strychnin có pKt = 6,0 và PK2 = 11,7.

Đặc tứứi phổ hấp thụ tử ngoại.
Trong dung dịch nước - acid, phổ hấp thụ tử ngoại của strychnin có cực
đại tại X = 254nm với A (l% ,lcm ) = 373 và trong dung dịch nước - kiềm, phổ
hấp thụ tử ngoại của strychnin có 2 cực đại tại 255nm và 278nm [36],

Đặc tính phổ hấp ửiụ hồng ngoại.
Phổ hấp thụ hồng ngoại của strychnin có các đỉnh chính đặc trưng ở các số
sóng sau: 1664, 764, 1050, 1110, 1285, 775 c m 1 [36],[47],[48].

Tắc dụng và công dụng.
Ở liều thấp strychnin có tác dụng kích thích thần kinh trung ương và thần
kinh ngoại vi, có tác dụng chọn lọc trên tủy sống, tăng hoạt động của cơ và dinh
dưỡng cơ, đồng thời kích thích tiêu hóa; trên tim và hệ tuần hoàn, strychnin làm
tăng huyết áp do co mạch ngoại vi.
Strychnin thường được dùng dưới dạng thuốc tiêm để chữa tê liệt dây thần
kinh cơ, suy nhược cơ năng, mỏi mệt, mới ốm dây, kém ăn. Có tác dụng làm giải
ngộ độc thuốc ngủ barbituric [4],[5],[6],[22]. Strychnin là thuốc độc bảng A,
được dùng dưới dạng uống và tiêm với liều tối đa [ 9 ] sau đây:

Uống:

Tiêm dưới da.

Một lần

0,005g

24 giờ

0,015g

Một lần

0,002g

24 giờ

0,010g

Với liều cao, strychnin gây co giật, co cứng. Liểu chết tối thiểu khoảng 15 30mg đối với ừẻ em và 50-100mg đối với người lớn.


8

Do độc tính cao nên strychnin còn được dùng làm thuốc diệt chuột [20],

[36], [40].
1 .2 .2 . Brucĩn.
Brucin là 10,11-Dimethoxystrychnin, có công thức phân tử: C23H26N20 4

[30], [36]. Brucin có thể tồn tại dưới dạng base hoặc các dạng muối hydroclorid,
sulfat, nitrat. Ở dạng base khan có nhiệt độ nóng chảy ở 178°c và dạng base
hydrat chảy ở khoảng

105°c. Brucin có công thức cấu tạo (n).

ƠD

Độ tan.
Brucin ở dạng muối dễ tan ứong nước, tan 1/105 trong ethanol và không
tan ừong các dung môi hữu cơ. Dạng base là bột kết tinh trắng, rất đắng và
không tan trong nước, tan được ưong các dung môi hữu cơ. lg brucin base tan
trong 0,8ml methanol, trong 1,3ml ethanol, trong 5ml cloroform, trong 25 ml
ethyl acetat và ứong 187ml ether.Brucin có pKj = 6,04 và pKj = 11,7 .

Đặc tính phổ hấp thụ tử ngoại.
Trong dung dịch nước - acid, phổ hấp thụ tử ngoại của brucin có cực đại
tại X = 265nm với A (1%, lcm ) = 330 và ở X =300nm ; còn trong dung dịch nước
- kiềm, phổ hấp thụ tử ngoại có 2 cực đại tại 266nm với A (1%, lcm ) = 320 và
304nm/3ố/.

Đặc túih phổ hấp thụ hồng ngoại.
Phổ hấp thụ hồng ngoại bmcin có các đỉnh chính đặc trưng ờ các số sóng
sau: 1500, 1660, 1280, 1195, 1120 và 1212 c m '1. [3 0 ], [36], [47], [48].


9

Tấc dụng và cô n g dung.

Brucin có tác dụng kích thích thần kinh trung ương tương tự strychnin
nhưng thấp hơn 10 lần [6 ] và rất độc, có LD50 uống với chuột là lmg/kg [47]. Do
vậy, bmcin hầu như ít được dùng làm thuốc mà chủ yếu dùng làm thuốc thử
trong phân tích [21], [30], [39], [40], [47], [48].

1.3. Một số phương pháp đã được áp dụng để chiết xuất
strychnin và brucin từ bột mã tiền.
Muốn đinh lượng được chính xác hàm lượng alcaloid toàn phần nói chung
cũng như strychnin và bnicin nói riêng trong bột mã tiền, vấn đề đầu tiên cần
phải quan tâm là chọn phương pháp chiết thích hợp. Phương pháp chiết lỏng - rắn
thường được áp dụng để chiết các hoạt chất từ dược liệu. Ở giai đoạn này, cách
xử lý mẫu là rất quan trọng vì mẫu phân tích thường chứa một hỗn hợp phức tạp
các chất có bản chất hóa học rất khác nhau. Vì vậy cách xử lý trước khi chiết
bằng pha lỏng cũng rất khác nhau nhưng nói chung có một số giai đoạn sau:
- Nghiền nhỏ mẫu dược liệu để tăng diện tích tiếp xúc với dung môi. Độ
mịn của dược liệu ảnh hưởng đến hiệu xuất chiết. Tuy nhiên tùy theo từng dược
liệu mà chọn độ mịn thích họp vì có trường hợp độ mịn tăng là táng lượng hoạt
chất cần chiết nhưng đồng thòi cũng làm tăng lượng tạp chất gây trở ngại cho
quá ứình định lượng.
- Loại tạp chất trước khi chiết. Ví du như loại chất béo bằng ether dầu hỏa,
loại màu bằng than hoạt [1],
Các phương pháp chiết trong những tài liệu mà chứng tôi đẵ tham khảo
được có thể phân thành ba cách sau:
1.3.1. Chiết bằng cách ngâm hoặc lắc siêu âm.
- Qui trình chiết theo Dược điển Tiệp khắc năm 1987 [14 ] (Dung m ôi: ether-

cloroform và tài liệu[52]( dung môi cloroform).


10

3,000g dược liệu đã
được tán mịn

+20g ether

.....

^

Thêm 3,0ml đung dịch natri
carbonat IM, lắc manh 1 giờ

lOg cloroform
lắc manh
Để qua đêm
í

Lọc lớp ether-cloroform qua
Để tách lớp
giấy lọc khô. Lấy 20g dịch lọc
bốc hơi trên cách thuỷ còn 3ml phương pháp trung hoà

-

Lắc mạnh 15 phút, thêm 7,0ml
nước và lắc.

Qui trình chiết theo Dược điển Việt nam ũ tập 3 [19], Dược điển Trung Quốc

[42], [43] và theo tài liệu [11] (Dung môi là cloroform).

1.3.2-C hiết gián đoạn.
- Qui ữình chiết theo Dược điển Nhật [50] (Dung môi ỉà ether).


11

1.3.3. Chiết liên tục.
Phương pháp này được áp dụng ừong Dược điển Anh [35] để đinh lượng
strychnin trong bột mã tiền. Qui trình chiết có thể tóm tắt như sau:


12

1.4. M ột số phương pháp đã được áp dụng để định lượng
alcaloid toàn phần, strychnin và brucin hoặc strychnin
trong bột mã tiền.
Sau khi chiết được alcaloid từ bột mã tiền bằng các phương pháp trên,
người ta tiến hành đinh lượng alcaloid toàn phần, strychnin hoặc đinh lượng
đồng thời strychnin và brucin bằng một ứong các phương pháp sau đây:
1 .4 .1 . Phương pháp chuẩn độ acid - kiềm.
Các alcaloid trong bột mã tiền có tính base có khả năng tạo thành muối
với các acid vô cơ, nên người ta đã tiến hành định lượng alcaloid toàn phần bằng
phương pháp trung hòa [11],[12],[13],[14],[15],[16],[17],[18],[44] với chỉ thị là
methyl đỏ theo nguyên tắc sau đây:
B + HA( cho dư)
HA (dư) + NaOH

=

[BH]A + HA (dư)

= Na A + H20

Trên cơ sở của phương pháp này, một số tác giả đã áp đụng để định lượng
alcaloid toàn phần trong một số chế phẩm đông dược chứa bột mã tiển chế như
viên Kim mã [25], hoàn Hydan [12].
Cũng có thể xác đinh hàm lượng strychnin trong hỗn hợp các alcaloid đã
được tinh chế bằng cách đùng hỗn hợp acid sulfuric 5%, acid nitric 50% và natri
nitrit để

phá

hủybrucin. Sau đó chuyển strychnin sang dạng base,chiếtbằng

cloroform, bốc hơi cloroform. Thêm một lượng chính xác acid sulfuric 0,1N để
hòa tan cắn và chuẩn độ acid dư bằng natri hydroxyd 0,1N [16], [17], [18], [19],

[21], [44].
Để xác đinh hàm lượng bracin, có tác giả dựa vào nguyên tắc nêu trong
Dược điển Pháp [4 4 ] để đinh lượng alcaliod toàn phần, sau đó phá hủy brucin và
tiến hành đinh lượng strychnin. Hàm lượng brucin có trong dược liệu là hiệu số
giữa hàm lượng alcaloid toàn phần và hàm lượng strychnin [21]. Tất nhiên
phương pháp này không thể chính xác vì trong alcaloid toàn phần ngoài
strychnin và bracin còn có các alcaloid khác.


13

Phương pháp trung hòa yêu cầu lượng mẫu thử quá lán khoảng lOg bột mã
tiến, tương ứng với gần 1000 viên hoàn Hydan, sai số lớn và kết quả thu được
không cho biết chính xác hàm lượng strychnin và brucin. Do vậy phương pháp
này chủ yếu áp dụng để định lượng alcaloid toàn phần ứong bột mã tiền chế và
chưa chế.
1 .4.2. Phương pháp đo quang phổ tử ngoại.
Hiện nay, phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại hay được dùng để định
lượng strychnin trong bột mã tiền. Phương pháp này dựa trên định luật Lambert Beer là mật độ quang của dung dịch một chất ở một bước sóng nào đó tỉ lệ thuận
với nồng độ và bề dày của lớp dung dịch đem đo:

D = k .l.c
Trong đó: k là hệ số hấp thụ.

c là nồng độ.
1 là bề đày của lớp dung dịch đem đo.
Trong trường hợp c tính theo nồng độ phần trăm (kl/tt), 1 tính bằng cm thì
hệ số hấp thụ k được gọi là hệ số hấp thụ riêng, ký hiệu là E (l% ,lcm ) và lúc này
ta có:
D = E (l% ,lc m ).

c.l

Đối với dung dịch có hai thành phần mà tại các bước sóng cần đo tuân
theo đinh luật Lambert - Beer và mật độ quang có tính cộng tính, thì mật độ
quang của dung dịch tại 1 bước sóng đã cho bằng tổng mật độ quang của từng
thành phần ở bước sóng đó. Trong trường hợp dung dịch chứa strychnin, brucin
được đo ở hai bước sóng 262nm và 300nm trong cốc lcm , ta sẽ có hệ phương
trình bậc nhất 2 ẩn số:
A 262 = E s262(l% ,lc m ).C s + E b262(l% ,lcm ).C b
A 300 = E s300(l% ,lc m ).C s + E b300(l% ,lcm ).C b

14

Trong đó: - Es262(l% ,lcm ) tại A,=262nm và Es300(l% ,lcm ) tại x=300nm của
strychnin đã biết trước
- Eb262(l% ,lcm ) tại A,=262nm và Eb300(l% ,lcm ) tại ^=300nm của
brucin đã biết trước.
- A262 là mật độ quang của dung dịch đo được tại Ằ-=262nm.
- A300 là mật độ quang của dung dịch đo được tại A-=300nm.
Giải hệ phương trình bậc nhất 2 ẩn số trên ta sẽ tính được Cs và Cb (hàm
lượng phần trăm của strychnin và brucin) trong dung dịch đem đo.
Sau khi chiết hoàn toàn strychnin và brucin ứong bột mã tiền, người ta dựa
vào nguyên tắc trên để tiến hành đinh lượng strychnin trong dịch chiết bằng cách
đo mật độ quang ở hai bước sóng 262nm và 300nm [19], [26], [27], [28], [34],

[42], [43].
Với phương pháp này lượng mẫu thử sử dụng ít hơn nhiều so với phương
pháp trung hòa và chủ yếu dùng để đinh lượng strychnin trong mã tiền chưa chế,
mã tiền chế. Một số tác giả cũng đã áp dụng phương pháp này để định lượng
strychnin trong chế phẩm đông dược có chứa mã tiển như: viên nén Vifotin[28],
hoàn Hydan/2Ố/. Tuy nhiên trong các tài liệu trên, người ta mới áp dụng phương
pháp này để đinh lượng strychnin còn brucin chưa được đề cập tới. Trong tài liệu

[27] người ta đã dựa vào nguyên tắc nêu trên để định lượng đồng thời strychnin
và brucin trong bột mã tiền chưa chế. Song đối vói các chế phẩm đông dược có
chứa một lượng nhỏ bột mã tiền cùng với các dược liệu khác như hoàn Hydan thì
việc đinh lượng đồng thời strychnin và brucin bằng phương pháp quang phổ tử
ngoại sẽ gặp nhiều khó khăn.
Ngoài ra người ta còn sử dụng phương pháp sắc ký lóp mỏng kết hợp với

phương pháp đo quang để đinh lượng strychnin và brucin trong các chế phẩm
đông dược. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: sau khi chiết strychnin và
brucin ừong các chế phẩm, tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng với chương trình sắc
ký thích hợp để tách strychnin và brucin rồi đo mật độ quang của các vết trực


15

tiếp trên bản mỏng. Phương pháp này được chính thức đưa vào Dược điển Trung
Quốc để đinh lượng strychnin trong thuốc đông dược Maquianzi San [42] có
chứa mã tiền chế (rang cát) hoặc để đinh lượng cả strychnin và brucin trong
thuốc Jiufen San [S3].
1 .4.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (H PLC).
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp phân
tích hóa lý dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái
lực khác nhau giữa các chất với hai pha luôn tiếp xúc, nhưng không hoà lẫn vào
nhau: pha tĩnh (trong cột hiộu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Pha
động cùng vói mẫu thừ được bơm qua cột dưới áp xuất cao và các chất cần phân
tích di chuyển theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau tùy theo ái lực của
chúng vói hai pha dẫn đến sự tách giữa các chất. Sự tách này đạt được là do quá
trình phân bố, hấp phụ hoặc trao đổi ion....
Các chất sau khi ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện gọi là
detector. Tùy theo bản chất của các chất cần phân tích mà sử dụng detector thích
hợp. Detector hay được sử dụng nhất là detector ƯV. Đường cong rửa giải sau
một quá trình sắc ký được gọi là sắc ký đổ, nó thường có dạng như hình 1.
t0 (Thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống
tách.
tR (Thời gian lưu): Thời gian cần thiết kể từ khi chất được bơm vào cột cho
đến khi đạt được nồng độ cực đại của nó, xuất hiện ở thời điểm cuối của hộ
thống tách.

t ’R (Thời gian lưu thực) = tR - 10.
ôt (Độ lệch chuẩn): Độ rộng nửa píc tại các điểm uốn tương ứng.
coa 5 : Độ rộng píc ở nửa chiều cao = 2,354 5t .
cob : Độ rộng đáy pic.


16

Hình 1. Cẩc thông số thời giãn của sắc đồ (pic) được mô tả trên hình vẽ.

Thời gian lưu tfc là thông tin về mặt định tính của sắc đồ. Nó là một hằng
số đối với một cấu tử đã cho khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi. Để
đặc trưng cho một chất, thuận lợi hơn, người ta đùng hệ số dung lượng k’.
Thường tính k' theo công thức:
k' = — = ÍãHIs. —ỈR.-1
^0
^0
^0

Ợ)

Trong thực tế các giá trị k' giữa 2 và 5 là tốt nhất; các giá trị k' lớn hơn chỉ
dẫn đến sự doãng pic, độ nhậy thấp và thời gian phân tích kéo dài.
Hai chất chỉ được tách ra nếu chúng có giá trị k' khác nhau và được đánh
giá thông qua độ chọn lọc a :
a =ặ =V ^L

(k’2> k ’,)

(2)

Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết ưên cột
(N). Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức:


<

17

N=

ft R V

f
= 16

= 5,54

(3 )
VO,

V® 0,5/

^6t>

Để đặc trưng cho hiộu lực tách của một qui trình sắc ký (cột), trên thực tế
người ta hay sử dụng độ phân giải R giữa hai pic cạnh nhau. Độ phân giải được
tính theo công thức sau:

R = ^ R' ~hk.1=

®4.1 + ab,2

z lĩìl

(4 )

^0,3.1 + ^0,5.2

Độ phân giải phụ thuộc vào các thông số k2 {hệ số dung lượng của cấu tử

ra sau), độ chọn lọc a và số đĩa lý thuyết N của cột thông qua công thức:
R =

V

4

Ã

X

r

a

X

. k2

(5 )

\+k\

Ngày nay phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được ứng dụng rộng rãi,
ngày càng nhiều trong nnh vực kiểm nghiệm thuốc nói chung và kiểm nghiệm
thuốc đông dược nói riêng. Một số tác giả đã dùng các dung môi hữu cơ như
ether ethyiic [49], cloroform [35],[52] hoậc methanol /"4 //trong môi trường kiềm
để chiết các alcaloid từ bột mã tiền và từ các thuốc đông dược có chứa mã tiền
rồi tiến hành đinh lượng strychnin hoặc cả strychnin và bracin bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao. Trong các tài liệu mà chúng tôi đã tham khảo, các tác
giả đã nêu lên một số chương trình sắc ký sau đây để phân tích các alcaloid của
bột mã tiền.
Chương trình sắc ký của PGS. Phạm Gia Huệ và cộng sự [38] nghiên cứu
tối ưu hóa pha động với qui trình sắc ký sau đây để tách 8 alcaloid của hạt mã
tiền:

Cột sắc ký: Nucleosil C8 (5|im,15cm

X

4,6mm)

Pha động: Acetonitril 10% - Tetrahydrofuran 10% - dung dịch đệm
phosphat pH=2,75 ( 52:15:33 tt/tt).

v \

Tốc độ dòng : 1,5 ml/phút.
Detector ƯV : ở bước sóng 254nm.

Y:\ Ch 4Ũ

/


18

Để đinh lượng strychnin trong bột mã tiền chưa chế, Dược điển Nhật [50]
cũng đầ nêu qui trình sắc ký gồm các điểu kiện sau đây:
Cột sắc ký : Cột thép không gỉ có kích thước 15cm X 4mm
được nhồi bởi

silicagel đã

octadecylsilan hóa

có kích thước 5fiin.
Pha động

: Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphat trong nưóe vừa đủ
1000ml,

sau

đó

ừộn

với

acetonitril

và

triethylamin theo tỉ lệ (45:5:ltt/tt) và điếu chỉnh
đến pH =3.0 với acid phosphoric.
Nhiệt độ c ộ t : Nhiệt độ phòng .
Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lưu
strychnin khoảng 17 phút.
Detector UV: Ở bước sóng 210 nm.
Cũng có tác giả [34] đã nêu lên chương trình sắc ký sau đây để định lượng
strychnin trong mã tiền:
Cột có kích thướe 30cm X 3,9mm được nhồi Porasil (10fim).
Pha động : cloroform có 1% diethylamin -cyclohexan(3:2).
Tốc độ dòng : 0,5ml/phút
Detector U Y 280nm
Một chương trình sắc ký khác được áp dụng để định lượng strychnin trong
thuốc đông dược Shenjin Dan [41] cố mã tiền chế:
C ộ t : Ultrasphere - Cyano ( 5|im , 15cm X 4,6mm )
Pha động : Methanol - nước - acid acetic-triethylamin
(1960 : 31: 6 :3 tt/tt)
Tốc độ dòng : lml/phút
Detector u v 254nm
Robert Verpoorte và cộng sự [45] đã đưa ra chương trình sắc ký với các
điều kiện sau đây để tách các alcaloid của bột mã tiền :


19

Cột sắc ký : Merckosorb Si 60 (30cm X 2,0mm, 5 ụjn)

Detector ư v 254nm
Pha động 1 : Ether ethylic chứa ì % diethylamin
(tốc độ dòng : 2,0ml/phút)
Pha động 2 : Ether ethylic - methanol ( 1 :1 )
(tốc độ dòng : l,15ml/phút)
Zhou Guisheng , Liu Naiqing , Sun Xingong và cộng sự [54] đã xác định
hàm lượng strychnin trong hạt mã tiền bằng phương pháp HPLC với chương trình
sắc ký sau đây :
Cột Zorbax Sil (lOjom, 150mm X 4,6mm)
Pha động : Methanol 0,1 mmol/I - acid acetic 0,1 mmol/1 - amoni
acetat (80:15:5)
Detector u v 254nm
Xu, L. H .; Lu , J. [52] đã nghiên cứu định lượng strychnin và bmcin bằng
phương pháp HPLC với chương trình sau đây :
Cột Platinum Silica ( 15cm X 4,6mm).
Pha động : N- Hexan-Diclomethan - Methanol- Amoniac đặc
(950:950:100:7).
Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
Bước sóng xác định : 254nm.
Villar , A . ; Rios , J. L . ; Gonzalez , J. M .[SlJsử dụng chương trình sau:
Cột Silica A ( 25cmx 2,6mxn).
Pha động : Qoroíorm-methanol-dietìiylamm hoặc ether -methanoldiethylamin với tốc độ từ 0,5-l,5ml/phút. Hoặc có thể
dùng pha đảo với cột HC ODS /Sil ( 25cmx 2,6mm), pha
động là methanol có hoặc không có 0,1 % diethylamin.
Tốc độ dòng : 0 ,5 -1 ,5 ml/phút.
Bước sóng phát hiện : 254nm.