Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 119 112

T>
T 'T t O Pr r v Ằ A T A o
ŨỤ
uo iTnÁ u lỹỤv^
Oc £/A w ir \v j

P Ô

J-J

VX Ti lPj

TRƯỜNG ĐẠI
HỌC
D ược
HÀ NỘI
•
•
•
•

PHẠM
THỊ• HẠNH
•
•

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG
SINH NHỜ STREPTOMYCES 119.112

LUẬN
VĂN THẠC

sĩ
•
•

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ

Dược HỌC
•

•

Dược PHẨM VÀ BÀO CHẾ

MÃ SỐ : 60.73.01

Ngườỉ hướng dẫn khoa học : PGS.TS Cao Văn Thu

Ị TRƯỜNG ĐM DƯỢC HÀ NỘI Ị
T H Ư V I ỆIM ^
í N g ày

Ih ố n g

n ă iT i

SỐĐKCB:___ __ _____ ....,^

HÀ NỘI 2010

Ị

ị


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo
PGS. TS Cao Văn Thu, người đã trực tiếp hướng dẫn ân cần chỉ bảo giúp đỡ
em hoàn thành luận văn này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo, cán bộ kĩ thuật viên bộ
môn Vi sinh và Sinh học, bộ môn Công nghiệp dược trường Đại Học Dược Hà
Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện luận văn.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên em trong
suốt thời gian qua.
Do thời gian có hạn, nên trong bài luận văn này không tránh khỏi những
thiếu sót. Rất mong được sự chỉ bảo của thầy cô và sự góp ỷ của các bạn.
Em xin chân thành cảm om /
Hà Nội ngày 29 tháng 10 năm 2010.
Học viên
Phạm Thị Hạnh


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN Đ Ề ................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỒNG QUAN........................................................................ 2
1.1. Đại cương về xạ khuẩn.......................................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn ........................................................2
1.1.2. Phân loại Streptomyces....................................................................... 3
1.1.3. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces..................... 4
1.2. Cải tạo giống vi sinh v ậ t........................................................................ 5
1.3. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh........................................................7
1.4. Chiết tách và tinh chế............................................................................. 9

1.4.1. Chiết xuất.............................................................................................9
1.4.2. Tinh c h ế ............................................................................................. 10
1.5. Phổ hồng ngoại, phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân... 12
1.5.1. Phổ hồng ngoại (IR).......................................................................... 12
1.5.2. Phổ khối lượng (M S)........................................................................ 12
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NM R)................................................13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ....15
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................15
2.1.1. Giống xạ khuẩn..................................................................................15
2.1.2. Vi sinh vật kiểm định........................................................................ 15
2.1.3. Môi trường nuôi cấ y ......................................................................... 16
2.1.4. Dụng cụ và hoá chất.......................................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứ u .................................................................. 21
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy giữ giống trong ống thạch nghiêng............21
2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán.......21
2.2.3. Phương pháp cải tạo và chọn giống.................................................22
2.2.4. Phương pháp lên men chìm và đánh giá hoạt tính kháng sinh trong
dịch lọc dịch lên m en.................................................................................. 24
2.2.5. Các phương pháp chiết tách kháng sinh..........................................25


2.2.6. Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP....................................27
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THựC NGHIỆM ............................................29
3.1. Nâng cao khả năng sinh tổng họp kháng sinh của Streptomyces
119.112.7........................I ..................... ............. .7....................................29
3.1.1. Kết quả sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces
119.112
trên các môi trường khác nhau:..........................................29
3.1.2. Kết quả cải tạo giống......................................................................30

3.1.3. Kết quả lên men chìm:..................................................................... 38
3.1.4. Bước đầu khảo sát các thành phần môi trường lên men.............. 40
3.2. Kết quả chiết tách và tinh chế kháng sinh....................................... 42
3.2.1. Kết quả chiết kháng sinh bằng các dung môi hữu cơ ở các pH khác
nhau:........................................................................................................... 42
3.2.2. Kết quả tách kháng sinh trong dịch chiết bằng sắc ký lóp mỏng: 44
3.2.3. Kết quả chạy sắc ký cột:................................................................ 45
3.3. Kết quả phổ hồng ngoại, phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt
nhân............................................................................................................ 51
3.3.1. Kết quả đo phổ hồng ngoại (IR )...................................................... 51
3.3.2. Phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân....................................... 52
3.4. Phân loại Streptomyces 119.112 theo IS P ........................................57
CHƯƠNG 4: BÀN LU Ậ N .......................................................................59
4.1. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces
119.112 .1 ........... .7...... ...... ...... .7................... 59
4.2. Nghiên cứu một số tính chất thành phần kháng sinh chính do
Streptomyces 119.112 sinh tổng hợp....................................................... 59
4.3. Phân loại Streptomyces 119.112 theo IS P ....................................... 60
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH Ị................................................................. 61


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIÉT TẮT

ADN

Axit deoxyribonucleic

Z)

Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn

ISP

International Streptomyces Project

MT

Môi trường

MTdd

Môi trường dung dịch

s

Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

RF

Rectiflexibiles : thẳng hơi cong

vsv

Vi sinh vật

VK

Vi khuẩn

c 1, C2

Giống cấp 1, cấp 2

NST

Nhiễm sắc thể

uv

Utra Violet (tử ngoại)

V

Thể tích

Dm

Dung môi

IR

Infrared (hồng ngoại)


DANH MỤC CÁC BẢNG
•

Bảng 1.1: Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces.............
Bảng

2 .1

:Các vi sinh vật kiểm định.....................................................................

7
17

Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml).................

18

Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy vsv kiểm định..................................................

19

Bảng 2.4. Các dung môi sử dụng..........................................................................

21

Bảng 3.1: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh với 10 v s V kiểm định..................

31

Bảng 3.2:Kết quả chọn lọc tự nhiên chủng Streptomyces 119.112..............

33

Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến lần 1...........................

35

Bảng 3.4: Kết quả đột biến lần 2 ............... .........................................................

38

Bảng 3.5: Kết quả đánh giá hoạt tính kháng sinh trong các môi trường lên men

40

Bảng 3.6: Kết quả lên men các biến chủng tốt nhất trong môi trường MTldd..

41

Bảng 3.7: Các thành phần môi trường (g/100ml)................................................

42

Bảng 3.8: Kết quả lên men trong 16 môi trường trên..........................................

43

Bảng 3.9. Kết quả chiết kháng sinh bằng các dung môi hữu cơ ở các pH khác

44

nhau..........................................................................................................................

Bảng 3.10: Kết quả tách kháng sinh trong dịch chiết bằng sắc ký lớpmỏng....

47

Bảng 3.11: Kết quả thử các phân đoạn sắc ký cột.......................................

48

Bảng 3.12: Kết quả sắc kí lóp mỏng với các phân đoạn có hoạt tính........

50

Bảng 3.13: Kết quả chạy SKLM với hệ 5....................................................

51

Bảng 3.14: Kết quả sắc ký cột lần 2 .............................................................

52

Bảng 3.15: Kết quả sắc ký lóp mỏng...........................................................

53

Bảng 3.16: Kết quả phổ NMR của H-l và actinomycin D .........................

57

Bảng 3.17: Các đặc điểm của Streptomyces 119.112 và Streptomyces citreus...

58


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 :Sơ đồ biện giải phổ NMR........... ........
Hình 3.1: cấu trúc hóa học của Actinomycin D
Hình 3.2: Một số tương tác HMBC của H -l.....


ĐẶT VẤN ĐÈ
•

Từ khi kháng sinh được tìm ra và ứng dụng rộng rãi đã có rất nhiều căn
bệnh do nhiễm trùng từng bị coi là nan y đã được chữa trị thành công. Nhưng
các nghiên cứu cho thấy ngày càng có nhiều chủng gây bệnh kháng lại các
kháng sinh đã có sẵn, nhiều kháng sinh đã không còn tác dụng trên một số
chủng gây bệnh nữa.Vì vậy việc tìm ra kháng sinh mới là vấn đề cần thiết và
được toàn thế giới quan tâm hiện nay.
Ngày nay với sự phát triển của công nghệ, khoa học kĩ thuật, kháng
sinh mới thường được nghiên cứu phát hiện và tổng hợp theo 3 hướng chính :
tổng họp hoá học, bán tổng hợp và sinh tổng họp.
Vi sinh vật có khả năng tổng hợp kháng sinh rất đa dạng và phong phú
có thể là vi khuẩn, xạ khuẩn hay nấm. Trong đó thì chi xạ khuẩn Streptomyces
là có nhiều xạ khuẩn có khả năng tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và
đặc điểm kháng khuẩn hon cả. Ngoài ra một số loài xạ khuẩn trong chi này
còn tổng hợp các chất chữa ung thư như Streptomyces antibỉotỉcus sinh tổng
họp Actinomycin D được phát hiện đầu tiên năm 1952.
Do đó, chúng tôi chọn đề tài:
“Nghiên cứu sinh tằng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 119.112”

với các mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu chất kháng sinh chỉnh do Streptomyces 119.112 sinh tổng hợp
2. Bước đầu xác định cấu trúc thành phần kháng sinh chính

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về xạ khuẩn
1.1.1. Đặc
• điểm sinh học
• của xạ
• khuẩn
1.1.1.1. Đặc điểm chung
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn thực, có một sổ đặc tính đặc biệt. Chúng có khuẩn
lạc khô và có thể có dạng tia phóng xạ phát triển dạng sợi phân nhánh như
nấm. Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân nguyên thuỷ nhưng chúng thường
sinh trưởng dưới dạng sợi và thường tạo thành nhiều bào tử.Thậm chí một số
loại xạ khuẩn còn hình thành nang bào tử như chi Streptosporangium và bào
tử di động như Actinoplanes.
Tuy có đặc điểm phát triển dạng sợi phân nhánh nhưng xạ khuẩn đã được
chứng minh là vi khuấn với những bằng chứng: không có nhân thật, chỉ có
vùng nhân, thường không có vách ngăn, nhạy cảm với kháng sinh tác dụng
lên vi khuẩn.
Đa số xạ khuẩn thuộc nhóm Gram (+), tỷ lệ G + c > 55%, hiếu khí, hoại sinh,
có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty). Xạ khuẩn có khả năng sản sinh
nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như: kháng sinh, enzym, một số
vitamin và acid hữu cơ. Tuy nhiên một số ít xạ khuẩn có thể gây bệnh cho
người, động vật và cây trồng.[3], [10], [12]
1.1.1.2. Đặc điếm phân loại của chi Streptomyces

* Đăc điểm hình thải
- Khuẩn lạc: Khuẩn lạc của xạ khuẩn Streptomyces rất đặc biệt, tạo thành
cụm, bề mặt khô, xù xì, có thể có các nếp, hoặc toả ra theo hình phóng xạ.
Khuẩn lạc có chân khá vững chắc, khó tách khỏi môi trường nuôi cấy.
- Hệ sợi của xạ khuẩn'. Đường kính của khuẩn ty khoảng từ 0,2 - l,0(im đến
2,0fim. Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày khoảng từ 10- 20nm,

2


không có cellulose, kitin, có tác dụng duy trì hình dáng khuẩn ty và bảo vệ tế
bào. Màu sắc khuẩn ty phong phú: trắng, vàng, đỏ, lục, tím, nâu, đen...
Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, bề mặt nhẵn hoặc sần
sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố chỉ tan trong nước,
có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ.
Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành
khuẩn ty khí sinh, có đường kính từ 1,0- l,4|im. Sau một thời gian phát triển
trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện chuồi bào tử.
Chuỗi bào tử có nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, uốn cong, lượn sóng, móc
đơn, móc vòng, xoắn lò xo.. .Các chuỗi bào tử này phân cắt thành bào tử trần.
Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuấn.Bào tử trần có thế có
hình cầu, hình bầu dục, hình trụ.Các bào tử tập hợp với nhau thành chuỗi 3050 bào tử hoặc nhiều hơn. Be mặt bào tử có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc
(wa), có gai (sp) hoặc có tóc (ha).[5], [10], [12]
* Đặc điểm sinh lý:
Streptomyces là vi sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hoá cao. Đe phát triển, chúng
phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng
thời thuỷ phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột.Chúng cũng có thể
khử nitrat thành nìtút.Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ
tối ưu của chúng thường là 25-

30°c, một vài loài có thể phát triển tốt ở nhiệt

độ cao hơn, pH tối ưu thường từ 6 ,8 - 7,5.
Khả năng tạo sắc tố: khả năng tạo sắc tố từ Streptomyces được chia thành 4
loại: sắc tố hoà tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh
(màu sắc của bề mặt khuẩn lạc), sắc tố melanin.[5], [10], [12]
1.1.2. Phân loại Streptomyces
1.1.2.1. Phân loại định tên theo ISP

3


Hội nghị vi sinh vật thế giới lần thứ X đã chọn khoá phân loại của Shirling &
Gottlieb làm khoá phân loại chính để phân loại chi Streptomyces và đặt tên là
khoá phân loại ISP ( The International Streptomyces Project). Khoá phân loại
này dựa trên các đặc điểm:
- Đặc điểm hình thái học của xạ khuẩn: Màu sắc của khuẩn ty cơ chất, màu
của khuẩn ty khí sinh, hình dạng chuỗi bào tử, đặc điểm bề mặt, kích thước và
hình dạng bào tử.
- Đặc điểm sinh lý học: Khả năng tạo sắc tố hoà tan, sắc tố melanoid và khả
năng sử dụng các nguồn hydratcarbon.[4]
1.1.2.2. Phân loại định tên theo giải trình tựgen
Phương pháp phân loại truyền thống dựa vào đặc điểm hình thái đóng một vai
trò quan trọng.Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp hiện tượng thường gây
nhầm lẫn trong phân loại.Những hạn chế này chỉ có thể được giải quyết khi sử
dụng phương pháp phân loại phân tử, dựa vào việc phân tích gen 16S rADN.
Trình tự nuleotid của gen này hầu như không có sự trao đổi giữa các loài, do
vậy trình tự 16S rADN có ý nghĩa đặc biệt cho loài[17]
1.1.3. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces
Các loài xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh

nhất và có cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy
do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là được tổng hợp từ Streptomycesịì 1]

4


r

\

r

t

Bảng 1.1: Một sô kháng sinh có nguôn gôc từ xạ khuân Streptomyces
Kháng sinh

Nguồn gốc

Phổ tác dụng

Actinomycin D

s. antibioticus

Ung thư

Acid clavulanic

s. clavuligeus

Gr(+)

Adriamycin

s. peucetius

Ung thư

Amphotericin B

s. nodosus

Nấm

Bleomycin

s. vertỉcỉllỉus

Ung thư

Candicidin

s. griseus

Nấm

Cloramphenicol

S. Venezuela

Gr(+), Gr(-)

Daunomycin

s. peucetỉus

Ưng thư

Erythromycin

s. erythreus

Gr(+)

Streptomycin

s. griseus

Gr(+), Gr(-)

Tetracyclin

S. aureofaciens

Gr(+), Gr(-)

Nystatin

s. nourseỉ

Nấm

Vancomycin

S. oriental is

Gr(+)

1.2. Cải tạo giống vi sinh vật
* Mục đích
Vi sinh vật sinh kháng sinh phân lập từ nguồn cơ chất khác nhau trong tự
nhiên (bùn đất, nước, các mô thực vật...) thường có hoạt tính thấp và hiệu

5


suất sinh tổng hợp không cao. Do đó, để đáp ứng yêu cầu của sản xuất công
nghiệp, một trong những nhiệm vụ hàng đầu của các nhà vi sinh vật học công
nghiệp là cải tạo giống vi sinh vật với các mục đích khác nhau:
- Tăng cường hiệu suất sinh tổng họp kháng sinh.
- Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hon: rút ngắn thời gian lên
men, tạo ít bọt hơn.
- Chỉ sinh tổng họp 1 sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi hơn.
- Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, tạo ra các liên kết mới, nhóm chức
mới.[8],[9]
*Các phương pháp cải tạo giống
Chọn
lọc
tự

nhiên
•
•
•
Các vi sinh vật luôn xuất hiện đột biến tự nhiên tự phát theo tần số khác nhau,
có những cá thể sinh hoạt tính kháng sinh cao hơn

1 0

- 2 0 % so với các cá thể

khác. Nhiệm vụ của phương pháp này là tuyển chọn các cá thể có hoạt tính
kháng sinh cao nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Đôt
biến nhân tao
•
•
Các chủng vi sinh vật chịu tác dụng của các tác nhân gây đột biến mạnh như
ánh sáng UY, tia X hay các tác nhân hoá học như ethylenimin,
dimethylsulfat,nitrosoguanidin... với liều lượng thích hợp và thời gian thích
họp, phần lớn các vi sinh vật sẽ chết. Những cá thể sống sót sẽ xuất hiện dạng
đột biến dẫn tới làm giảm (mất) khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính),
hoặc làm tăng hiệu suất sinh tông hợp kháng sinh của vi sinh vật (đột biến
dương tính).
Ánh sáng u v có khả năng đâm xuyên kém nhưng vơi những tế bào vi sinh
vật có kích thước nhỏ (0,3- 3,0|im) thì nó có thể xuyên thấu tới vùng nhân,
nhân.Vì vậyánh sáng UY được dùng phổ biến trong cải tạo giống. Liều lượng
chiếu được đặc trưng bởi 3 yếu tố: thời gan chiếu, khoảng cách chiếu, độ

6

phaloãng bào tử. Liều lượng chiếu càng cao thì số lượng đột biến càng lớn và
cuối cùng đạt đến một giới hạn nhất định. Thường thì đột biến dương sẽ xuất
hiện ở liều lượng chiếu có độ sống sót từ 0 , 1 - 1 %, còn đột biến âm sẽ xuất
hiện ở những liều lượng chiếu cao hơn. Sau đột biến phải sàng lọc biến chủng
tốt nhất [ 1 ], [2], [7], [8 ]
1.3. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
Lên men bề mặt
Là quá trình vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt rắn, đặc hay lỏng. Vi sinh
vật hấp thu các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để
hô hấp trên bề mặt môi trường.
Vì vậy, yêu cầu của công nghệ lên men bề mặt là môi trường phải rộng và lóp
môi trường không quá sâu (5-10cm).
Ưu điểm của lên men bề mặt là đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư trang thiết bị
ban đầu thấp.
Nhược điểm: hiệu suất sử dụng thấp, tốn diện tích, khó cơ giới tự động hoá.
Vì vậy ngay nay phương pháp này không được sử dụng trong qui mô công
nghiệp.
Lên men chìm
Trong phương pháp này vi sinh vật được nuôi cấy trong các bình lên men,
bình phản ứng sinh học, trong điều kiện sinh lý tối ưu, vi sinh vật phát triển cả
3 chiều. Do đó tạo ra sản phẩm với hiệu suất caotrong môi trường dịch thể.
Phương pháp này có nhiều ưu điểm:
- Sử dụng môi trường dinh dưỡng tốt nhất,đáp ứng được nhu cầu sinh lý
của vi sinh vật.
- Hiệu suất sử dụng không gian cao (3 chiều), lượng hoạt chất được tổng
hợp trong một đơn vị thể tích môi trường cao, hiệu suất lên men cao.

7

- Các thiết bị dễ cơ giới hoá, tự động hoá tiết kiệm được mặt bằng, nhân
công.
Nhược điểm:
- Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn.
- Cán bộ cần được chuyên môn hoá
- Không thể xử lý cục bộ
- Phế liệu thải ra dễ gây ô nhiễm môi trường.
Các kiểu lên men chìm:
- Lẻn men chu kỳ (lên men mẻ):
Quá trình lên men gián đoạn được xem như một hệ thống kín. Tại thời điểm
ban đầu, ta cấy giống vi sinh vật vào môi trường lỏng trong bình lên men, rồi
tiến hàng lên men trong các điều kiện sinh lý tối ưu. Trong suốt thời gian lên
men, không tác động hay bổ sung gì, ngoài cung cấp oxy (đươi dạng không
khí nén), chất phá bọt (nếu cần), chất điều chỉnh pH. Trong quá trình lên men
các thành phần trong dịch lên men biến đổi không ngừng.
- Lên men có bo súng'.
Là kỹ thuật kéo dài pha suy tàn bằng cách cho thêm môi trường mới vào hệ
thống một cách ổn định, thay đổi hay định kỳ mà không lấy ra bớt dịch lên
men. Nồng độ ban đầu cao của một số chất (glucose, các họp chất hữu cơ...)
sẽ ức chế việc tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Do đó để nâng cao hiệu
suất lên men, khi bắt đầu lên men các chất này được đưa vào với nồng độ thấp
và được bổ sung liên tiếp vào hệ thống trong quá trình lên men thành từng
phần nhỏ.
- Lên men bán liên tục:
Khi sinh khối và sản phẩm trao đổi chất trong bình đạt đến một lượng nhất
định thì lấy bớt dịch chiết lên men rồi bổ sung thêm lượng môi trường mới
bằng chính thể dịch lên men đã lấy đi. Việc rút bớt dịch chiết lên men và bổ

8


sung thêm môi trường mới không xảy ra liên tục mà chỉ định kỳ trong một
thời điểm nhất định. Thời điểm lấy bớt dịch và bổ sung môi trường cần tính
toán hợp lý.
- Lên men liên tục:
Lên men liên tục là một quá trình lên men được bổ sung liên tục môi trường
dinh dưỡng vào bình lên men hoạt động như một hệ thống mở, đồng thời
cùng lúc lấy bớt ra khỏi hệ thống liên tục đồng thể tích dịch lên men cùng các
tế bào và sản phẩm trao đổi chất của chúng.[ 1 ], [2 ], [6 ], [8 ]
1.4. Chiết tách và tinh chế
Tuỳ vào đặc tính của loài vi sinh vật mà kháng sinh có thể nằm trong sinh
khối hoặc trong dịch lọc. Vì vậy, để thu được sản phẩm mong muốn phải lựa
chọn phương pháp chiết tách, tinh chế thích hợp.
1.4.1. Chiết xuất
Chiết là quá trình chuyển chất tan từpha này sang pha khác, thường dùng
dung môi hữu cơ (đơn hay hỗn họp) để tách lấy một chấy hay một nhóm chất
từ hỗn hợp cần nghiên cứu.
Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hoà lần vào
nhau.
Với kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dung dịch lên men người ta ứng dụng
phép chiết lỏng - lỏng với các phương pháp chiết:
- Chiết đơn
- Chiết lặp
- Chiết ngược dòng
Với kháng sinh nội bào: tiến hành chiết rắn - lỏng. Nguyên tắc của phương
pháp này là dựa vào sự khuếch tán của khán sinh vào dung môi chiết[2 0 ]

9

1.4.2. Tinh chế
Là một nhóm các phương pháp hoá học, vật lý và hoá lý nhằm đi từ một hỗn
hợp phức tạp đến một hỗn họp đơn giản, và từ hỗn hợp đơn giản đến tách
riêng từng chất. Đối với hỗn hợp đồng nhất, dùng phương pháp chuyển pha,
dùng một dung môi thích hợp để chuyển một chất từ pha này sang pha khá.
Phương pháp bao gồm: chiết, thẩm thấu, sắc ký.
Quá trình tách sắc ký dùng để tách từng thành phần ra khỏi hỗn họp. Dựa trên
sự phân chia khác nhau của các thành phần khác nhau vào hai pha luôn tiếp
xúc và không hoa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động. Quá trình sắc
ký trải qua 3 giai đoạn: đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha
tĩnh và phát hiện chất cần tách.
Một số phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp
kháng sinh:
* Sắc kỷ lớp m ỏng:
Là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác
nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ), ở đây pha tĩnh là
chất rắn, pha động là dung môi.
Phatĩnh trong bản mỏng sắc ký rất đa dạng gồm: chất hấp phụ, chất trao đổi
ion, chất rây phân tử và các dung môi khác nhau trên chất mang.
Do đó sắc kí lớp mỏng có đầy đủ bốn cơ chế tách tuỳ thuộc vào pha tĩnh sử
dụng.
Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích : Hệ số R f .

Trong đó:

Dv: Khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm của vết
Ddm: Khoảng cách dung môi chạy

10


Rf phụ thuộc vào các yếu tố như cách tiến hành, tính chất hoạt độ của chất
hấp thụ, tính chất của dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường chạy
sắc ký, lượng chất chấm.
Vì vậy người ta sắc ký song song với một chất đã biết để đối chứng trên cùng
một bản mỏng và tính Rf.
- Phát hiện các chất phân tích trên bản mỏng:
+ Tận dụng tính chất của các chất có khả năng phát huỳnh quang, xác định
trực tiếp chất khi dùng ánh sáng kích thích.
+ Đưa thêm các chất chỉ thị huỳnh quang và dùng ánh sáng u v chiếu vào để
ghi nhận mẫu.
+ Phun chất ôxy hoá mạnh như HNO3 , KMĨ1 O4 , H 2 SO4 đặc vào sẽ có các
điểm bị ôxy hoá và chuyển sang màu đậm là chất phân tích.
+ Đưa các thuốc thử đặc hiệu như Ninhydrin để hiện hình.
+ Sử dụng các chất tạo phức màu làm cho kim loại có thể nhìn thấy.
- ứ ng dụng của sắc ký lớp mỏng.
+ Thử nghiệm thăm dò cho sắc kí cột.
+ Thử độ tinh khiết
+ Sắc ký chế hoá.
* Sắc kỷ cột
Trong phương pháp này, một cột chứa chất nhồi dùng làm pha tĩnh. Chất nhồi
có thể là: cellulose, nhôm oxyd, silicagel...Đó đều là các chất đã chuẩn hóa
để đảm bảo kích thước chuẩn. Dung môi trong phương pháp này là pha động.
Dựa vào kết quả thăm dò tách các thành phần kháng sinh bằng sắc ký lớp

11

mỏng để lựa chọn hệ dung môi chạy sắc ký lỏng trên cột chi thích
hợp.[9],[13],[20]
1.5. Phổ hồng ngoại, phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1.5.1. Phổ hồng ngoại (IR)
Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ hấp thụ bức xạ hồng ngoại
của một số chất vào số sóng hoặc bước sóng là phổ hấ thụ hồng ngoại hay phổ
hồng ngoại của một chất.
Trong phân tử, khi có nhóm nào đó bị hấp thụ năng lượng và thay đổi trạng
thái hoạt động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR.CÓ mối liên quang giữa
nhóm nguyên tử và dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó.Nhiều
nhóm chức có dải hấp thụ đặc trưng.Đây là cơ sơ cho việc phân tích cấu trúc
bằng phổ IR.[3], [12], [18]
1.5.2. Phổ khối lượng (MS)
Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các hợp chất hữu cơ bằng
cách đo chính xác khối lượng phân tử của chất đó. Chất nghiên cứu trước tiên
được chuyển thành trạng thái hơi sau đó chuyển thành ion.Các ion tạo thành
được đưa vào nghiên cứu trong máy khối phổ.
Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50 - 100 eV) để bắn phá phân
tử hữu cơ ở chân không cao (10‘ 6 mmHg).
Khi các phân tử ở trạng thái khí va chạm với một dòng electron có năng lượng
cao thì sẽ tách ra một hoặc hai ion và trở thành ion có điện tích

+ 1

(chiếm tỷ

lệ lớn) và +2. Loại ion này được gọi là ion gốc hay ion phân tử. Nếu các ion
phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lượng lớn hơn thì chúng
sẽ bị vỡ thành nhiều mảnh ion, thành các ion gốc hay các phân tử trung hoà
khác nhau. Các ion có khối lượng m và điện tích e. Tỷ số m/e gọi là số khối z.

Khi tách ion có số khối khác nhau và xác định được xác suất sự có mặt chúng

12


rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan xác suất có mặt (cường độ I) và số khối
z. Đó là phổ khối lượng.
Để xác định khối lượng phân tử người ta dựa vào các pic ion phân tử cường
độ lớn.
Dựa trên phổ MS thu được: ta biết lon phân tử M+ và các mảnh mi+, m2+. ..
xác định được khối lượng phân tử và góp phần xác định cấu tạo hoá học của
hợp chất. [7], [13]
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Nếu hạt nhân nguyên tủ có từ tính được đặt trong một từ trường, khi thay đổi
từ trường sẽ dẫn đến hấp thụ năng lượng của sóng vô tuyến và xuất hiện phổ
NMR.
Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân có khối
lượng là số chẵn nhưng số thứ tự là số lẻ thì có moment từ và cho tín hiệu
cộng hưởng từ hạt nhân và ngược lại.
Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phố NMR phụ thuộc vào mật
độ điện tử ở vùng lân cận quanh proton đó.
Khi đo phổ NMR, một lượng năng lượng xác định được hấp thụ:
AE = hv

h: hng s planck, v: tn s (Hz)

Mặt khác, năng lượng hấp thụ tỷ lệ với cường độ từ trường, và được xác định
bởi phương trình:
ỴhH

AE = r- ^ ~
2 n

y: hằng số, đặc trưng cho mỗi loại hạt nhân
H: cường độ từ trường
Từ 2 phương trình trên ta có:
,

y h H _v

_ ỵH

hv = — ->v = —
2n

13

2n


Phương trình này nêu lên quan hệ giữ tần số vô tuyến với cường độ từ trường
mà ở đó xảy ra sự hấp thụ năng lượng. Đây là phương trình quan trọng nhất
của cộng hưởng từ hạt nhân.[7]
* Đo phổ NM R
- Mầu chất cần đo được cho vào một ống thuỷ tinh nhỏ và đặtgiữa2 cực của
nam châm. Ống chứa mẫu được bọc bởi

1

bobin cảm ứng.

- Máy phát tần số vô tuyến chuyển năng lượng đến mẫu.
- Mầu hấp thụ năng lượng và tín hiệu cộng hưởng được ghi lại, ta có phổ
NMR[7].

Hình 1.1: Sơ đồ biện giải phổ NMR
- Từ độ chuyển dịch hoá học, ta xác định được sự có mặt của các nhóm có
proton
- Từ độ chuyển dịch hoá học và kết hợp phổ IR, ta xác định được bộ khung
họp chất.
-T ừ tích phân diện tích tín hiệu, phân biệt đồng phân cis - trans.
- Phát hiện sự có mặt của các tạp chất lạ.

14


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1.ĐỐÌ tượng nghiên cứu
2.1.1. Giống xạ khuẩn
Chủng xạ khuẩn Streptomycesl 19.112 được phân lập và tuyển chọn có khả
năng sinh tổng hợp kháng sinh, phổ tác dụng trên vi khuẩn. Chủng xạ khuấn
do bộ môn Vi sinh- Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
2.1.2. Vi sinh vât
• kiểm đinh
•
Vi sinh vật kiểm định do bộ môn Vi sinh- Sinh học Trường Đại học Dược Hà
Nội cung cấp (bảng 2.1).
Bảng 2.1:Các vi sinh vật kiểm định

Vi khuẩn

Tên v s v kiểm định

Tên viết tắt

Bacillus cereus ATCC 6633

B. cereus

Bacillus subtilis ATCC 10241

B. subtilỉs

Bacilluspumilus ATCC 10241

B. pumilus

Sarcina lutea ATCC 9341

s. lutea

Staphyllococus aureus ATCC 1128

S. aureus

Escherichia colỉ ATC C 25922

E. colỉ

Proteus mỉrabilis B V 108

p. mirabilis

Gram
dương
(+)

Vi khuẩn

S. flexneri

Gram âm Shigella flexneri D T 112
(-)

Salmonella typhỉ DT 220

s. typhi

Pseudomonas alruginosa VM 201

p. alruginosa

15


2.1.3. Môi trường nuôi cấy
* Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn:
Thành phần các môi trường sử dụng nuôi cấy xạ khuẩn được trình bày ở bảng
2 .2 :
r

>

't

Bảng 2.2: Thành phân các môi trường nuôi cây xạ khuân (g/100ml).
Thành phần

MT1

MT2

Tinh bột

2

2

Lactoza

MT4

MT3

MT5

M T6

MT7

2,4
3

Glucoza

1

2

Cao ngô

0,5

0,5

Saccaroza

2

Bột đậu
1

tương
Bột ngô

2

0 ,1

Pepton

0,3

0,3

Cao thịt

0,3

0,5

kno3

0 ,1

KC1

0,05

NaN0 3

0 ,2

16


NH4 N 0 3

0 ,2

0 ,2

0,3

0,4

0 ,2

0,05

0 ,1

(NH4)2so4
CaCOs
FeS0 4 .7H20

0 ,0 0 1

K2 HPO4

0,05

0 ,1

0 ,1

M gS0 4 .7H20

0,05

0,05

0,25

NaCl

0,05

0,4

0,15

0,5

0 ,1

0,5

Cao nấm men
Thạch

1 ,8

2

2

2

2

2

1 ,8

Nước

1 0 0

1 00

1 00

100

1 00

100

1 00

7,0-7,2

7,0-7,2

7,0-7,2

7,0-7,2

7,4-7, 6

pH

7,0-7,2

6

,8-7,2

Với môi trường lên men lỏng sử dụng để lên men chìm thì các thành phần
tương tự như môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.
* Môi trường nuôi cấy

vsv kiêm định

Bảng 2.3.MÔÌ trường nuôi cấy vsv kiểm định
MT canh thang (g/100ml)

MT thạch thường

NaCl

0,5

0,5

Pepton

0,5

0,5

Cao thịt

0,3

0,3

-

1 ,6 -1 ,8

Thành phần

Thạch

TRƯỜNG ĐH DƯỢC HÀ NỘI

T H Ư VIỆN
17

N gày......... íh án g....... . năm 20......

So OKCB:.....................................


Nước (ml)

1 00

1 00

7,0 - 7,5

pH

*Các mói trường phân ỉoạỉ theo ISP (kỷ hiệu từ môi trường ISP1 đến ISP9).
Dung dịch muối vi lượng của ISP: MnCl2 .4 H 2 0

0,lg; FeS0 4 .7H20 0,lg;

ZnS0 4 .7H20 0,lg; nước cất vđ 100ml; pH= 7,0-7,2.
ISP1: Tripton 5,0g; cao nấm men 3,0g; nước cất vđ 1000ml; pH= 7,0-7,2.
ISP2: Cao nấm men 4,0g; dịch chiết malt 10,Og; glucose 4,0g; thạch 20,Og;
nước cất vđ 1000ml; pH= 7,3.
ISP3: Yến mạch 20,Og; dung dịch muối vi lượng l,0ml; thạch 18,0g; nước cất
vđ 1000ml; pH=7,2.
ISP4: Tinh bột 10,Og; K 2 H P0 4 l,0g; M gS0 4 .7H20

l,0g; NaCl l,0g;

(NH4 )2 S 0 4 2,0g; CaCƠ3 2,0g; dung dịch muối vi lượng l,0ml; thạch 20,Og;
nước cất vđ 1000ml; pH= 7,0-7,4.
ISP5: L-asparagine l,Og; Glycerin 10,Og; K 2H P O 4 l,Og; dung dịch muối vi
lượng l,Oml; thạch 20,Og; nước cất vđ 1000ml; pEN 7,0-7,4.
ISP 6 :
Dung dịch A: Pepton 20,Og; acid citric 0,384g; FeS 0 4 .7 H2 0 0.556g; N H 4O H
25% 0,264g; Na2 s 2 0 3 10ml; K 2H P O 4 lg; nước cất vđ 1000ml
ISP6: Dung dịch A 36,Og; cao nấm men l,Og; thạch 15g; nước cất vđ
1000ml;pH= 7,0-7,2.

ISP7: Glycerin 15,0g; L-tyrosine 0,5g; L-asparagine l,Og; K 2 HPO4 0,5g;
M gS0 4 .7H20 0,5g; NaCl 0,5g; FeS0 4 .7H20 0,0lg; dung dịch muối vi lượng
l,0ml; thạch dây 20,Og; nước cất vđ 1000ml; pH= 7,2-7,4.
ISP9:

18