Sơ bộ nghiên cứu thành phần chất độc và phương pháp giám định độc chất của cây củ nần (dioscorea hispida dennst , dioscoreaceae) ở việt nam

BÔ GIÁO DUC & ĐAO TAO

TRƯ Ờ N G ĐAI HOC

BÒ

Dược HÀ

rẾ

NỘI

Nguvển Xuân Trường

S ơ BỘ NGHIÊN c ír ư THÀNH PHẦN CHẤT ĐỘC VÀ
PHƯƠNG PHÁP GIÁM ĐỊNH ĐỘC CHẤT CỦA Câ Y c ủ NẦN
(D ioscorea hispida Dennst., D ioscoreaceae)
ở VIỆT NAM

LUẬN VÁN TỐT NGHIỆP THẠC SỶ

Dược

HỌC

Chuvên ngành: Kiếm niĩhíệm dược phììm - Độc chất học
Mã sô': 03.02.05

Nsưới hướns dẫn khoa học:
/. PGS.TS Trần Tử An
2. PGS.TS Hoàng M ạnh Hùng

cú

Ha nui- 2i)0l


JÍỜ3^ ịiờ U L ƠQÍ

Luận văn này hoàn thành với sự giúp đỡ nhiệt tình của:
PGS.TS Trần Tử An, PGS.TS Hoàng Mạnh H ùng đã ch ỉ bảo tận tình
và trực tiếp giúp đỡ tòi hoàn thành mục tiêu của đề tài.
PGS.TS M ai Tất Tô' và các cán bộ, kỹ thuật viên bộ mòn Dược lý
trường đại học Dược H à nội đã giúp đỡ xác định LD50 của mẫu chất độc .
D SC K II Lè Đình Bích đã giúp đỡ ừong việc-iũrn mẫu v« nghiên cứu
hình thái cây.
PGS.TS H à H uy Kế, TS Nguyễn Văn Thuần, đã đóng góp nhiều ý kiến
trong quá ùinh chuẩn bị luận án, chiết xuất hoạt chất.
Cán bộ chiến sĩ phòng Hoáy phòng Pháp y sinh vật, phòng ảnh thuộc
viện Khoa Học Hình Sự đã giúp đỡ tôi trong quá trình thử độc tính trên thỏy
sơ bộ trên chuột và chụp ảnh các kết quả.
Ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học trường đại học Dược Hà
nội; ban lãnh đạo Viện, lãnh đạo phòng Hoá thuộc viện Khoa Học Hình Sự
dã tạo diếu kiện thuận lợi cho tói trong quá trinh thực hiện và bảo vệ luận
văn.
Nhân dịp này, tôi xin chán thành cám ơn sự giúp đỡ quựbáu đó ỉ

DS. Nguyễn Xuán Trường


M Ụ C LỤC

Lòi cảm Qfn

Trane

Ký hiệu và chữ viết tắt

4

Đặt vấn đề

5

C hương 1: Tổng quan

6

1.1. Vài nét về cây củ nần

6

1.2. Tinh hình nghiên cứu về thành phần hoá học và độc tính của
Dioscorea hispida Dennst.,Dioscoreaceae

14

1.3. Phưotig pháp chung phân tích độc chất

18

ChưoTig 2 : Điều kiện và phương pháp thực nghiệm

22

2.1. Xử lý m ẫu

22

2.2. Dụng cụ và hoá chất

22

2.3. Phương pháp sàng lọc chất độc

23

2.4. Các điều kiện xác định chất độc

25

C hương 3 : Kết quả và bàn luận

28

3.1. K ết quả sàng lọc chất độc

28

3.2. Xây dựng qui trình chiết xuất

29

3.3. Về thành phần chất độc

33

3.4. Về tác dụng sinh học và độc tính

43

ChưoTig 4 : Kết luận và đề xuất

50

4.1. Kết luận

50

4.2. Đề xuất

52

Tài liêu tham kháo

53

Phụ lục

56

+ Phụ lục 1: Hình thái thực vật của câv cú nần

56

+ Phụ lục 2: sắc ký đồ, phổ UV-VTS và ER

58


4

CÁC KÝ H IỆ U VÀ C H Ữ V IẾ T T Ắ T

^0

; Alcaloid của dịch chiết một, cho vết lớn nhất và
Rf=8,0/12 trong sắc ký lớp mỏng 1 chiều

A*

Alcaloid chính được tách ra từ A q

DBM

Diamon Back Motíi (tên của m ột loại ấu ừùng)

DCAX

dịch chiết bằng dung môi trong môi UTTỜng acid

DCl

dịch chiết alcaloid toàn phần (thu được sau khi tiến hành
theo qui U'inh)

DCC

dịch chiết cồn (dịch cồn thu được khi ngâm mẫu)

DCX

dịch chiết bàng dung môi trong môi tmờng kiềm

DDA

là dung dịch pha từ 2g D Cl với nước acid HCl tíiành lOg.

DM

dung môi metanol 95®


ĐẶT VẤN ĐỂ

Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, nên có thảm thực vật rất đa
dạng và phong phú. Nó đã, đang và sẽ trực tiếp hoặc gián tiếp góp phần giải
quyết các nhu cầu của đời sống con người về ăn mặc, ở, thuốc chữa bệnh....Từ
lâu cùng với việc tìm hiểu sử dụng mặt có lợi của cây cỏ, người ta đã quan tâm
đến mặt trái của nó, tác hại của cây độc đối với sức khoẻ con người và gia súc.
Lĩnh vực nghiên cứu các cây độc liên quan rộng rãi đến nhiều ngành khoa
học, kinh tế, đặc biệt nó liên quan chặt chẽ với tư pháp và y pháp trong việc

giám định các vụ ngộ độc và đầu độc bằng cây cỏ.
Trong hai mươi năm qua tại viện Kiioa Học Hlnh Sự - bộ Công An mỗi
năm giám định trung bình khoảng mười lăm vụ án liên quan đến cây cỏ độc
;i4][19] . Qua nghiên cứu các vụ ngộ độc chưa rõ nguyên nhân, chúng tôi
thấy có nhiều khả năng liên quan đến cây củ nần ở Việt nam.
Cây củ nần là cây có độc tính cao, phân bố rộng rãi ở hầu hết các tỉnh
miền nam, miền trang và một số tỉnh phía bắc, với một trữ lượng lớn [18] và
được nhàn dân ta dùng làm lương ứiực, làm thuốc chữa bệnh và thuốc độc
trong một số trường hợp [1],[7],[15],[23],[29], nên khả năng gây ngộ độc rất
cao. Tuy vậy việc xác định nguyên nhân gây ngộ độc rất khó khăn vì độc tính
cao, lượna gày ngộ độ'c nhỏ. ở nước ta cho đến nay chưa có một côna trình
nghiên cứu nào về độc únh của cây củ nần [9]. Chính vì vậy chúng tôi đặt vấn
đề xác định sơ bỏ một số tứứi chất của chất độc có trong cây củ nần ở Việt
nam. nhằm phục vụ cho công tác giám định tư pháp.
Để thực hiện mục tiêu này. iuận văn có 3 nội dung chính:
- Tim phưcmg pháp chiết xuất tách chất độc từ cú nần.
- Xác định một số tứih chấi của chất độc,
- Sơ bộ đánh giá khả năne giám định tư pháp thông qua thực nghiệm
trên thỏ.


6

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1. VÀ I N É T VỂ CÂY CỦ NẦN.

1.1.1. Đặc điểm của cây củ nần.
Tên khoa học: Dioscorea hispida Dennst., Dioscoreaceae.
Tên khác: củ nê, củ nâu trắng, dây nần, Idioai từ nhám, cây dây tên

[I],m .

Tên đồng nghĩa: [lj,[7]
D. dacmaora Dox.
D. hirsrita Dennstedt
D. mollissima Blume
D. ùiphylla L.
Hình thái thực vật.
Cây leo dài tới hàng chục mét thân quấn trái có cạnh nông, đường kính
thân thường 9 mm, đoạn ở gốc đạt tới 12 mm [1], có nhiều gai nhọn, màu
xanh hay màu rơm [231. Ban đầu khi thân ngọn còn non thì được phủ bằng
một lớp lông mềm. Lá mọc so le, là loại lá kép gồm ba lá chét, lá chét giữa
hình bầu dục, cân đối dài 16-25 cm. rộng 12-17 cm, có năm gân lồi ớ mặt
dưới, đầu lá nhọn hơi lớn hưn lá chét bên. Hai lá chét bên không cân đối
thường lệch phía ngoài ỉ/3 ỉá. có ba gân ở pnía ngoài và một gân ở nửa trong,
kích thước dài 16-21 cm . rõrm 11-13 cm. Hai mặt lá đươc phú ỉớp lông tơ
màu vàng, mịn, ngọn ỉá oó tuvên. cuốn«: lá dài 10-20 em, có ỉônu- có gai hoặc
không. (Hinh 1-1 ừang ĩ) , Rễ củ phàn nhánh, cú hình cáu Rhiều thuỳ đôi khi
hơi dài, nặng tới 35 kg. ĩhậm chí hơn [231. v ỏ củ màu nàu rơm hoặc nâu sáng,
thịt củ rấl mịn, màu ĩrắn^ hay màu chanh nhạt [1 j. \1\. |2 3 | (Hình ỉ -8 PL. 1-9
PL, 1-10 PL phần phu iuc ..


Hoa đực mọc thành bông lóìi, dài tới 50cm, hoa xếp dàv đặc trên trục,
đầu trục cũng có hoa; bông ngắn mang khoảng bốn mươi hoa, trục bông và
hoa phủ lông vàng mịn. Lá bắc rất nhỏ (0,3

X

0,4 mm); ba cánh hoa hình tròn,

m ặt ngoài có lông mịn kích ứiước Im m , ba lá đài hơi to hơn, đỉnh nhọn hơn,
có lông ở lưng trên m ột đường nhỏ ở giữa; sáu nhị, chỉ nhị rất ngắn và ngắn
hơn bao hoa phấn, nhị hướng lên phía trên, bao phấn hơi choãi ra, hai ô nứt
dọc, hướng trong [1], [23].
Cụm hoa cái: bông cong, buông thõng xuống, phủ dày lông vàng mịn.
Quả nang quạt lại có cánh, cuống dài 4 mm, cánh rộng 8 mm ở phía dưới
và 16 mm ở phía ưên điểm giữa của quả, cuối cùng thắt lại th 'n h đỉnh tù hoặc
nhọn, dài 55 mm, theo giá noãn. Hạt to, dài 10 mm, rộng 6 mm cánh lớn, màu
nâu vàng, hướng về gốc quả nang (Hình 1-2).

Hình 1-1: ảnh cúa cây cú nần
(Dioscorea hispida Dennst.,
Dioscoreaceae j ứ Việt nam


/Ị nun

11'

Hình 1-2; Hình thái thực vật của cày cú nần Dioscorea hispida
Dennst.,Dioscoreaceae ở Việt nam
l . Cành mang quả; 2. Quả và hạt; 3-4. Một phần cum hoa đực;
5a. Hoa đực nhìn từ trên xuống; 5b. Hoa đực nhìn từ dưới iên.


9

Vi phẫu thàn cây và sơ đồ cấu tạo được tiình bày ở hình 1-3 và hình í -4.
. Ị _ 3 i ê ’u b ì

■2. Mô mềm vỏ
3. Nội bì
4 . Vỏ trụ hoá mô cứng

^6 . Gỗị
-7. Mô mềm ruột

Hình 1-3: Sơ đồ cấu tạo của thân cây củ nần (Dioscorea hispida
Dennst.,Dioscoreaceae) ở Việt nam

Hình 1- 4:
Anh vi phẫu thán cãv cú nần
(Dioscorea hispida Dennst.,
Dioscoreaceae) o '/ịệt nam


10

Vi phẫu lá và sơ đồ cấu tạo cuống lá, gân lá được uinh bày ở hình 1-5,16 và Hình 1-7.

ị ể Ệ ầ = u l

H

Hình 1-5: Phần cãt ngang gân lá
1. Biểu bì; 2. Mô mềm;
3. Mô cứng; 4. Libe; 5. Gỗ

Hình 1-6: Cấu tạo cuống lá

1. Biểu bì; 2. Mô mềm vỏ; 3. Mô
cứng; 4. Gỗ; 5. Libe; ố. Mô mềm m ột

H ình 1-7:
Anh vi phẫu lá của cây củ nần
íDioscorea hispida Dennst.
Dioscoreaccae 1ớ Việt nam


11

1.1.2. Phùn bố
Càv ít được trồng, thường mọc tì(mng ở hầu khấp nước ta; Lạng Sơn, Bắc
Thái, Quảng Tiị, Bình Thuận, Sòne Bố, Quảng Nam, Đà Nans, Đồng Nai, An
Giang, thành phố Hồ Chí Minh. Ngoài ra còn có ở Tmng Quốc (Phúc Kiến,
Quảng Đông, Vân Nam, Nghiệp Qiâu), Philipin, Thái Lan, Lào, Campuchia,
đảo Borneo, Indonexia, Malaysia. [1J, [6], [7], [15] (Hình 1 " 7).
1

»'

■ "a"

■

a

a

"

>
<ỉ) c
I

ị—

i

w

Dioscorea hispida Dennst,,
Hình 1-7; Phân bổ cúa cãy củ nần ở Việi Nam


12

1.1,3. Độc tính và công dụng:

Về hình thái, cây củ nần không có gì đặc biệt so với các cày không độc
khác. M ột số vùng dân bản xứ đã từng dùng củ nần như một nguồn lương thực
chính ưong thời kì chiến tranh, vì nó phân bố rộng, trữ lượng lớn [18]. Ngoài
ra củ nần còn được nhân dân ta và m ột số nước dùng làm tíiuốc chữa bệnh. Do
độc tính cao và nhiều nguyên nhân khác nhau ti'ong quá ưình sử dụng đã gây
ra nhiều trường hợp ngộ độc đáng tiếc. Củ nần độc với cả người và súc vật
[23 J. Những nãm gần đây, người ta đã nghiên cứu ứiăm dò và chiết tách
Diosgenin từ củ nần làm nguyên liệu khởi đầu cho bán tổng hợp các hormon
steroid [9],[11],[12],[35].
* Cãy củ nần được dùng như một chất độc:
ở Ấ i Độ ngoài việc sử dụng làm lương thực sau khi chế biến [29], người

ta còn dùng củ tươi làm mồi diệt hổ. Một số vùng dân tộc lấy nước ép củ trộn
với nhựa sui để làm thuốc độc tấm mũi tên nỏ theo tỉ lệ 1/2 [7],[23].
ở M alayxia và An Độ dùng bột củ nần để đầu độc người [23]. Một phần
củ to bằng quả táo có thể làm chết một người lớn sau sáu giờ [7],[15],[23].
Triệu chứng đầu tiên của sự ngộ độc là khó chịu trong họng, tiếp ứieo là có
cảm giác rát bỏng, chóng mặt, nôn ra máu, tức thử, rồi xỉu đi [7],[15],[23J.
* Cđv củ nần dùng làm ỉươỉìíỊ thực:
Củ nần đã được ghi nhận có vai trò quan trọng trong việc cứu đổi vì cú
to, chứ a n h iều tinh bột, có thể trên 70% [7| và nguvên tố Vỉ íưíMtĩ [2 8 1, củ

mọc tập trunư [1]. Cách chế biến đơn giản: sau khi thu hoạch ’ ề. dùnu khãn
iTÍa sạch bằng nước, rỗi thái thành lát thật mỏnư;. trà kv. đem ngâm uạn nhiều
lần trong vài ngàv với nước biển hoặc nước muối là
sạch phơi khô, nấu chín trước khi ăn.

iố t

nhât. Cuỏị jùrm.

I lia


13

Theo kinh nghiệm chế biến của người thổ dân, củ được thu lượm về m a
sạch, thái mỏng cho vào bao dứa ngâm nơi nước suối chảy từ ba đến nãm
nơày, vớt lên rửa sạch, phơi khô. Nấu chín tmớc khi ăn. Muốn kiểm tra sản
phẩm củ nần đã ăn được chưa, người ta đem đốt một ít bột, nếu cháy bình
thường, bột không vặn soắn hoặc ứiử cho gia súc ăn mà không có dấu hiệu
nhiễm độc là được [34].

* Cây củ nần còn dùng làm thuốc:
Cây có vị ngọt sáp, tính mát, có tác dụng giải nhiệt tiêu độc, tiêu sưng
giảm đau, khử ứ, cầm máu. Củ có độc đối với nhiều loại côn trùns, vi Ichuẩn
và động vật nhưng không có hiệu quả đối với đỉa. Dùne củ giã nhỏ đắp tiị
nhọt độc, sâu quảng, đòn ngã bị thương [7].
ở Malayxia, người ta dùng nước sắc của thân rễ để uống làm thuốc lợi
tiểu và thấp khớp mãn tính [7].
ở Campuchia, người ta dùng củ ăn sống kịp ứiời ngay sau lúc bị rắn hổ
mang cắn để ngăn ngừa những biến chứng gây rối loạn trong cơ thể [7 .
ở Phillipin củ nần còn được dùng trong chữa dịch hạch, phong thấp cấp
tính [7].
Người ta còn nghiền củ thành bột, dùng riêng hoặc phối hợp với dầu dừa,
lá thuốc lá, lá cà độc dược hoặc quả ớt để tiị bệnh loét lở ngoài da cổ giòi của
gia súc [71. Năm 1996 một nhóm tác giả người Nhật đã nshiên cứu ảnh hương
của alcaloid trong Dioscorea hispida trên việc nuôi dưỡng và phát triển của ấu
trùng DiamonBack Moth (DBM), Plulẹlla xvlostella. Tác giả kếl luận; alcaloid
hỗn hợp trong câv gày neộ độc cho mộl số cỏn tiòing như gián, rệp. sàu cấn
cây non và mớ ra một iriển vọnti trong việc ứng dụng sản xuất thuốc Irừ sâu
sinh hoc [221. Níiùv nav. trên thế ơiói (lã có các trunu tàm lưu iĩiữ các íziốn»,
cày ăn được và càv ỉàm thuốc của chi Discorea L. Điều dó ỉdiăng định iỊÌá liị
lương thực và làm thuốc cừá chúng [lj,[ 16].


14

1.2. T ÌN H H ÌN H N G H IÊ N CLOJ TH À N H PHẦN HÓ A H Ọ C CỦA
Dioscorea hispida Dennst., Dioscoreaceae.

Hiện chúng tôi thu thập được một số ít công trình liên quan đến độc tính
của củ nần:

1.2.1. Nghiên cứu ở nước ngoài:

1.2.1.1. Jose F.Leyva và cộng sự [31]
Năm 1937 các tác giả đã đưa ra qui trình tách chiết hoạt chất từ củ nần:
- Q iiết bằng bình Soxhlet với dung môi cồn etylic 95°,
- Bay hơi dịch chiết alcol tới khi sền sệt như siro màu nâu sẫm, sau đó từ
cặn này được chiết lại bằng dung dịch alcol-acid (acid hóa bằng acid acetic)
để ỉoại tiìr các chất tạp như albumin, đường, muối, muối khoáng.
- Dịch chiết alcol này chứa alcaloid được lọc và làm bay hơi đến dạng
siro. Sau đó dùng nước để hoà tan các alcaloid, dung dịch có màu vàng, chất
béo được loại ra.
- Nước alcaloid được kiềm hoá bằng Natri carbonat rồi chiết với dung
môi Clorofonn . Dịch 'chiết để bay hơi sẽ thu được cặn màu nâu.
- Tiếp tục làm tinh khiết bằng cách chuyển pha qua lại giữa nước với
Clorotbmi vài lần.
(Theo [31J tác giả Hemando và Punsalour í 1936) cũng dùnu qui trình
chiết xuất tương tự).
Phân iâp:
Tác giả đã tiến hành thực ntihiệm trên bỏn mẫu: phần vỏ củ và phần ruột
củ của Dioscorea hispida mọc hoang và nuòi irổng. Kêí qua cho thấv:
* Có sự dồng nhất về hàm Ịượnií alcaloid ỏ phân ruột củ và vỏ củ.


15

* Có sự kM c nhau về hàm lưỢĩiii alcaloid ở mẫu cày trổng và cày mọc hoang.
Hàm lu'ỢniỊ alcaloid ở mẫu cây trồng ít hcfn ở cày mọc hoang, niíuyên nhàn có
thể do hàm lượng nước ở cây ưồng lớn hơn. Như vậy điều kiện sống của cây
có ảnh hưởng đến hàm lượng alcaloiđ trong củ nần. Tuy vậy tác giả không

công bố tỷ lệ alcaloid chiết xuất được.
Đốc tính:
Khi thử độc tính của alcaloid chiết được trên động vật tác giả tíiu được
kết quả:
* Trên chuột ưắng ư-ọng lượng ti'ung bình 30,5g/chuột, liều chết là 2mư/l chuột.
Triệu chúng ngộ độc: '-un, co giật, rồi chết trong vòng mười lăm phút.
Với liều nhỏ hơn 2 mg không gây ngộ độc và không thấy những bất ứiường
nào trên chuột.
* Cá vàng: Liều chết cho cá vàng trọng lượng 0,5 g được ghi nhận là 8 mg %
(8 mg trong 100 ml nước).
* Với khỉ trọng lượng 980 gam, liều chết là 50 mg (đường tiêm).
Triệu chứng: run, co giật sau khi tiêm mười lăm phút và nôn sau ba mưcd
phút rồi chết trong vòng 1,5 giờ.

1.2.1.2, Alexie Bannaag và cộng sự [22].
Qui trình chiết xuất:
Năm 1997 các tác giả đã tiến hành :
- Chuẩn bị được liệu; củ sau Ichỉ !àm sạch, bỏrễ nhỏ, được tháimỏng vả
ngâm với metanol 95° trong hai tháng.
- Loại alcol từ dịch chiết bằnu cách làm bay hơi dưới áp suất giảm.
- Hoà tan cặn trong nước, rồi chiết lại với ether.
- Phần nước còn lại (sau idii chiết với ether) được kiềm hoá băng
Natricarbonat, rồi chiết với dung mỏi Clorofoiin ,


i6

Phàn lap:
Dịch chiết CloroíbiTn được ioại bcít duns môi và dùng sắc kỷ lóp mỏng
để tách các alcaloid:

+ Bản mỏng silicagel
+ Hệ dung môi: ClorofoiTn-MetanoI-Amoniac (90-10-1)
+ Thuốc hiện màu DragendoríT
+ Kết quả: được ba alcaloid là A,B và c .
Từ đó chế hoá dịch chiết trên bằng sắc ký cột được A,B,C (với tỷ lệ
5:8:2)
(Theo [22] m ột số tác giả: Prinder(1952); Txcte(1977), Leete and
M ichelson (1989) cũng chiết xuất theo phương pháp này)
Thử tác dune sinh hoc:
Tác giả đã tiến hành thử tác dụng sinh học của A,B,C, hỗn hợp A-B và
phần dịch chiết khác từ củ câv không phải là alcaloid trên việc nuôi dưỡnơ và
phát triển của ấu ti'iing Diamon Back Moth (DBM). Kết quả cho ứiấy; alcaloid
c và phần dịch chiết không phải là alcaloid đều không có ảnh hưởng đến sự
nuôi dưỡng và phát triển của DBM. Còn A,B, hổn hợp A-B có tác dụng ức chế
mạnh DBM và hỗn hợp A-B tác dụng mạnh hơn từng thành phần riêng rẽ.

1.2.1.3. Jose F.Leyva [30].
Năm 1937 tác giả đã tiến hành thực nghiệm lìm phươnư pháp khác nhau
loại độc tố ra khỏi củ Dioscorea hispida, bằriỉi các hoá chất thòng thường sẩn
có như muối ãn, acid acetic, phèn chua, vôi. ơ các điều kiện xử Iv mẫu khác
nhau (làm khò mẫu ỏ nhiệt độ phòng, ớ 50-8(i' C dưới ánh sáng mặt trời). Mẫu
sau khi xử lý được chiếl bằriíĩ Scìxhlet với alcoỉ. Lấv phần độc tố còn lai thử
đôc tính trên chuòt.


17

Tác giả thu được kết quả:
* Xử lý bằniĩ cách ngâm nước acid (hoặc nước giấm) loại được nhiều độc tổ
hcfn cả. Với nước muối loại độc tố kém hơn nhưng kinh tế hơn.

* Ánh sáng mạt trời phá hủy m ột lượng rất lớn độc tố trong củ khi làm khô. Sự
giảm độc tố là do phản ứng oxv hoá alcaloid.
* Mẫu làm khô ở nhiệt độ phòng làm giảm 50% độc tính, trong khi đó mẫu
làm khô bằng ánh sáng m ặt ười làm giảm đến 75 % độc tính của củ.
* Cuối cùng tác giả đề xuất cách chế biến củ; củ thái lát mỏng ngâm với nước
muối hoặc nước acid hoặc hỗn hợp hai thứ và kết hợp phơi khô dưới ánh sáng
m ặt trời. Cách xử lý này cho ta một nguồn lương thực an toàn tìr củ Dioscorea
hispida Dennst.
Từ năm 1930 đến nay có nhiều công ư*ình ưên thế giới nghiên cứu về
thành phần hoá học của Dioscorea hispida, nhưng chủ yếu tập tl’ung vào xác
định cấu trúc hoá học của thành phần chính (alcaloid độc chính, steroid chính
(diosgenin))
Theo [21],[24],[25],[27],[33] alcaloid chính trong Dioscorea hispida là
Dioscoiin có công thức hoá học như sau:

cn,
H ,c - c = c n
^ o -c o
X-CH, ;
D io sc o rin

1.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học trong củ nần ở nước ta.
Cho đến nay nước ta chưa có mộl còng ‘rình nchicn cứu về phươne nháp
chiết xuất và xác định chất độc trone càv củ nần i9ị.


18

Một số công trình nghiên cứu về cây củ nần ở nước ta lập trung vào
phương pháp chiết xuất diosgenin và niĩhiên cứu cấu trúc cũng như tác dụnu

sinh học của chất này. Năm 1987 hai tác giả đã nghiên cứu và kết luận: cây củ
nần mọc ở Quảng Nam - Đà Nẵng chứa 10% diosgenin [9].

1.2.3. Nhận xét.
Cách chiết xuất 1.2.1.1: tíiu được alcaloid tinh khiết, nhưng khó áp dụng
trong phân tích độc chất hình sự. Vi mẫu phân tích hình sự rất đa dạng và
phong phú, nhiều khi rất khó định hướng và khoanh vùng chất độc ti'ong mẫu.
M ặt khác cần tránh xử lý mẫu bằng nhiệt ngay từ ban đầu, để phòng ngừa sự
chuyển hoá hoặc phân huỷ chất độc không bền với nhiệt. Thông ứiường ở môi
tmờng acid các alcaloid kém bền với nhiệt hơn ở môi trường kiềm hay môi
tmờng trung tính [2],[10]. Do vậy nên chuyển dịch chiết mẫu về môi trường
trung tính hay môi tmờng kiềm trước khi loại dung môi.
Cách chiết phẩn 1.2.1.2: Do đặc điểm của mẫu độc chất hình sự, đặc biệt
là các mẫu phủ tạng có rất nhiều tạp và phân tán, phải chú ý nhiều đến việc
làm sạch dịch chiết. M ặt khác xử lý mẫu bằng cách ngâm lạnh với alcol sẽ tốn
nhiều dung môi và thời gian. \^1 vậy cách chiết này cũng không tíiích hợp cho
phân tích độc chất hình sự.

1.3. PHƯƠNG PHÁP CHUNG PHÂiN TÍCH ĐỘC CHẤT.
1.3.1. Đặc điểm của mẫu phân í ích trong độc chất
Mảu thử rất phong phú va đa dạng:
Nguvên nhân gàv nsộ đỏc rất đa dạng, có thể do vò V ( như việc nhầm
lẫn về liều lượng, nhầm lẫn vé đỏi tượng sử dụng, chế biến sai khỏne đứng qui
cách, sử dụng sai,..), do cỗ V ; như rự sát. bị đầu độc). Hưn nữa trone nhieu \ u


19

án, đối tượng gày án tạo hiện trưòĩig giả, cố tình che dấu đánh lạc hướng cơ
quan điều tra và đôi klii còn thu nhầm mẫu giám định.

* Cần phân lập một lượng nhỏ chất nghi vấn là chất độc từ một lượng mẫu
thử khá lớn có thành phần phức tạp:
M ẫu độc chất hình sự khác với các mẫu độc chất nói chung; ứiường mẫu
độc chất hình sự chứa chất độc với độc tính rất cao, do đó lượng chất độc rất ít
và đòi hỏi cán bộ thu lượm mẫu phải có hiểu biết nhất định để lấy mẫu đúng,
bảo quản tốt.
* Các chất độc trong cơ thể, trong môi trường thường không giữ nguyên
được cáu trúc thành phần mà bị biến đổi chuyên hoá. Vì vậy thường phải
phân tích hỗn hợp gồm chất độc và các sản phẩm chuyển hoá hoặc phân huỷ
của nó.

L3.2 Các bước tiến hành khi phân tích độc chất.
Gồm ba bước chủ yếu:
L 3 .2 .L Phân lập chất độc ra khỏi mẫu thử:
Có nhiều cách khác nhau để phân lập, tuỳ thuộc vào bản chất chất độc và
điều kiện trang bị kỹ thuật [3], [4], [17], [20 .
* Cất bay hơi: đối với các chất độc bay hơi dùng phưcmg pháp cất kéo hơi
nước.
* Phân lập bằng cồn acid hoặc nước acid: lấy ra được các alcaloid. các base
tổng h(jp, các glucosid (dìinư cồn acid loại được nhiều tạp chất hưnj.
* Phân lập bàng nước kiềm để lấv ra các acid hữu cơ, phenoỉ và dẫn xuất.
* Vô cơ hoá đế tách các kim loại.
* Thẩm tích: lấv mội số anion độc (Ruorid. oxalat).
* ơ iiế t thảng bằnu dung mỏi hữu cơ: xác định dư
trong thực phẩm.

fhưốc Irừ sâu diệt cỏ


* Chất độc nằm ở dạng liên kết với protein, thì cần thuỷ phàn cắt dày nối đó

(ví dụ chiết M oiphin tron^ nước tiểu cần thuv phàn trong dung dịch acid HCĨ).
Có m ột số m ẫu thử không qua giai đoạn này như xác định dư lượng thuốc tiir
sâu txong ứiực phẩm, thường chiết thẳng bằng dung môi hữu cơ.

1 .3 3 .2 . Chọn điều kiện cho quá trình chiết.
Sau khi xử lý sơ bộ mẫu thử ta đưa chất độc vào dung dịch nước cần chọn
điều kiện pH, số lượng và loại dung môi chiết tíiích hợp.
Trong kiểm nghiệm độc chất, hầu hết các chất cần xác định có tính acid
hoặc base yếu. Do đó giai đoạn đầu thường chiết ở pH ’^hẹ (thường dùng các
acid hữu cơ; oxalic, acetic để acid hóa) và chiết được tất cả các acid yếu
thường

gặp. Sau đó đưa pH sang vùng kiềm

nhẹ

(đùng amoniac,

natrihydrocarbonat, Natricarbonat để kiềm hóa) và chiết được hầu hết các
alcaloid và base tổng hợp.
Về dung môi, trong độc chất thường hay dùng ether và Q orotbrm , tùv
từng trường hợp cụ thể để lựa chọn.

1.3.3.3. Tinh khiết hoá dịch chiết:
Cố nhiều kỹ thuật, tuy nhiên thường diiriiz quá trình chuyển pha giữa
nước và dung môi để loại tạp chất hoà tan.


22

CHƯƠNG 2 : Đ lỂ U KIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP TH ựC NGHIỆM

2.L LẤY MẪU.
Củ của Dioscorea hispida Dennst., Dioscoreaceae ứiu hái tại Quảng Nam
- Đà Nẵng.
M ẫu thu lượm về được chia làm hai phần:
+ Phần m ẫu giữ tưcri: Từ mẫu tươi ứiu lượm về chọn củ lành vùi cát, để
nơi khô mát, sử dụng dần.
+ Phần xử lý khô; củ nần tươi được rửa sạch bằng nước, bỏ rễ nhỏ xung
quanh, thái lát mỏng, phơi nắng để loại bớt nước đến khi ứiấy mặt lát cắt se lại
(3-4 ngày), sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 70-80°C đến khi lát cắt củ khô cứng.
Xay nhỏ thành dạng bột thô. Bảo quản nơi khô mát sử dụng dần (gọi là mẫu
dược liệu khô).

2.2. DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHÂT.

2.2.L Dụng cụ:
Bình thủy tinh có nắp dung tích 4 lít.
Bình chiết các loại.
Phễu lọc, giấy lọc.
Cốc thuỷ tinh các loại.
Các Irang thiết bị khác tronsì Labo phân lích hoá học.

2.2.2. Hoá c h ấ t :
Các hóa chất đã sử dụng: ìvletanol. Eửier, Etanoỉ, Benzen, Aceton, Toluen,
Ether- peù'0, Etvlacetat cung cấp từ Dogod (Huniian) đạt tiẻu chuẩn p.a.


23

Clorofonn cung cấp từ Merck (Đức) đạt tiêu chuẩn p.a
Các hoá chất Acid sulfuric. Acid picric. Acid nitric. Acid acetic. Acid
Clohydric, Nalricarbonat, Kalihydroxyd, Kalidicromat đạt chất lượng p.
Codein: Mẫu chuẩn của Liên hiệp Quốc

2.3. PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC CHẤT ĐỘC:

Độc tố trong củ nần ở Việt nam chưa được xác định. Nó có thể thuộc
nhiều chủng loại khác nhau:
- Các chất cyanogen thường gặp trong cây cỏ như các loại đậu, sắn,
dứa,...
- Các chất độc có tính acid như các glucosid.
- Các chất độc có tính base như các alcaloid.
Vì vậy khi xác định đặc điểm chất độc, cần ứiực hiện việc sàng lọc định
nhóm của nó.

2«3.L Kỹ thuật thử chất độc sinh hydrocyanid.
Để khẳng định chất độc trong củ nần có phải là chất độc Cvanogen hay
không, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật thử như sau:
Tiến hành song song với cả hai mẫu: mẫu củ tươi và mẫu củ để khô tự
nhiên ớ nhiệt độ phòng (thái lát mỏng để khoảng ba mần) theo phương pháp
Guignard-Piette [26], VIỗi mẫu lấy khoảng 50 g đã Kay nhỏ cho vào bình nón
thèm 50 ml acid sulfuric N/10 và 400 ml nước cấL
Cách chuẩn bị báng giấy thử: cho băng gia\' vào dung dịch bão hòa acid
picric, sau dó nhúng vào dung dịch natricarbonai 10%. Dùng giấy lọc ép khò
bãng wiấv và phơi trong bóng tối. giấv cỏ .Tiàu v'àn«. Nhúnu mọl nửa bãnu
giấv vào acid acetic 10% để Irung hoà natricarbonat và làm phán so sánh màu.


24

Cho băno giấy đã chuẩn bị iên cổ bình, quan sát sự đổi màu của băn^
giấv troniz 24 giờ. Nếu bănơ giấv (phan nhúns vào Natricarbonat) có màu đỏ
cam là m ẫu thử dương tính. Vì các chất cyanogen U'ong môi tmờng acid sẽ
giải phóng HCN:
(N0,)3C6H ,0H + 3HCN

—

(N 0,)3Q (C N )3(N H 0H )0H + HCNO
iso purpurin (đỏ cam)

băng giấy không đổi màu là âm tính.

2.3.2. Xác định chất độc bằng kỹ thuật chiết ở hai môi trường.
Kỹ thuật chiết ở hai môi trường nhằm phàn lập các chất có tính acid và
tính base [3], [4j, [5], [10], [17], [20]. ‘Thực nghiệm gồm các bước sau:
* Phân lập chất độc:
Lấy 1500 gam bột dược liệu khô ngâm với 03 lít cồn etylic 95'^ ưong một
tuần ( thỉnh thoảng lắc, khuấy) gạn lọc dịch chiết cồn, cho tiếp cồn mới 1,5 lít
ngâm 03 ngày, gạn, lọc. Gộp hai dịch chiết làm bay hơi cồn, phần lỏng ứiu
được khoảng 250 ml (gọi là DCC).
* Xác định phần chứa độc tố:
Lấy khoảng 100 ml DCC aciđ hoá bằng acid acetic (thử môi trườniĩ bằng
giấy quì). Chiết 03 lần với dung môi Q oroíbrm -ether (1:1). Gộp dịch chiết lại,
cho bay hơi dung môi cho đến khi có cặn dạne siro gọi là dịch chiết trong môi
tmờnơ acid (DCAX).
Phần nước còn lại sau khi chiết, được ỉciềm hoa bằníz natricarbonat 10%
(thử với giấv quì) và chiết bằng dune mòi Qoroform -ethcr (1:1) 03 lần. Gộp
dịch chiết 03 lần. bav hơi dung mòi đến cận có dạnu như siro gọi là dịch chiết

trong môi trường kiềm (DCK).


25

Lấy 04 m ẫu của DCAX là í),05g; 0 ,lg ; 0,2g; 0,4g trộn với thức

ăn của

chuột theo thứ tự và để ricne 04 mẫu. Với DCK tiến hành tương tựDCAX.
Thử độc tính trên chuột cho 08 mẫu ứiử này.

2.4. CÁC ĐIỂU K IỆN XÁC ĐỊNH CHẤT ĐỘC.
Căn cứ vào các điều kiện ưang ứiiết bị kỹ thuật, bản chất chất độc trong
củ nầm, chúng tôi đã nghiên cứu, khảo sát, lựa chọn các điều kiện thích hợp
trong quá trình phân tích xác định chất độc:

2.4.1. Sác ký lóp mỏng.

Sắc ký lớp m ỏng m ột chiều :
Bản mỏng silicagel 0,1-0,2 mm tráng đều hoạt hoá ở 120°c trong 02 giờ.
Sau đó bảo quản trong bình hút ẩm.
- Hệ dung môi: Cloroíbnn - Metanol - Amoniac (tỷ lệ 90: 10; 1)
- Thuốc thử: Dragendorff.
- Chất so sánh: Codein.

Sắc ký lớp m ỏng hai chiều:
Bản mỏng tráng sẩn của hãng Merck
- Hệ dung môi ỉ: Clorofomi - Metanoỉ - A m onia: (tỷ lệ 90; 10; l )
- Hệ dung môi 2: Aceton - Toỉuen-Metanol-Amoniac (tỷ lệ 45: 45: 7: 3)

- Tìiuốc thử: DragendoriT.

Sắc ký lớp m ỏng chè hoá:
Bán móng silicagel 0.1-0,2 mm iráng đều hoại hoá ỏ 120''’C trcmg 02 '4 ÌỜ.
Sau đó bảo quản trong bình hut ám.


26

Hệ dung môi : Aceton - Toluen - Metanol - Amoniac (tỷ lệ 45; 45: 7; 3)
Thuốc lìiít. Dragendorff
Q ie m ột phần, phun thuốc thử và cạo vết.

2.4.2. Sắc ký cột điều c h ế :
Q iất hấp phụ; Silicagel của hãng M erck (Đức) kích thước 25-40 Ị.im.
Q iất phản hấp phụ; Clorofoim - Metanol, với các tỷ lệ 7:1, 7:3, 1:1

2.4.3. Sắc ký khí:
Máy GC- 14B (SHIMADZU)
Cột OV-17
Nhiệt độ: 200“C - 240°c, tốc độ 10“C/phút. Đẳng nhiệt sau 10 phút.
Khí mang : Nitơ
Khí đốt

; hỗn hợp khí oxy và nitơ

Tốc độ dòng: 60 ml/phút
Detector; FID

2.4A Phổ tử ngoại:

M áy quang p h ổ tử ngoại-. UV3101-PC (SHIMADZU).
Điều kiện:

Víeasuring Mode

Abs

Scan speed

Fast

Slit Width (nm)

0,5

Sampling Intei-val (nm): Auto
Dung mòi pha mẫu: mẫu pha Ironii dung môi metanol 95° ứ mÒ! Liirờnu
Irung tính, mòi Irườnu acid (dùn« dunu dịch acid sulíìiric o.ỉ N dể aciđ hoá
mòi ưường ). mòi trường kiềm Ị dùng duntỉ dịch base Nalrihvdroxvd 0,1 N đê
kiềm hoá mòi irường ).