Nghiên cứu định tính và định lượng đồng thời berberin và palmatin trong thân rễ hoàng liên và trong chế phẩm hương liên hoàn bằng phương pháp sắc khí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DUỢC HÀ NỘI

N gu yễn T h ị P h ư ơ n g T h ảo

N G H IÊN c ú u ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG Đ ồ N G THỜI
BERBERIN VÀ PALM ATIN TRONG THÂN RỄ HOÀNG
LIÊN VÀ TRO N G CH Ế PH ẩ M h ư ơ n g l i ê n h o à n b ằ n g
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU N ĂN G CAO (HPLC)

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Dược phẩm - Độc chất học
Ma so: 030205

Luận văn Thạc sĩ dược học

Người hướng dẫn khoa học:

TS. Trịnh Văn Lẩu
C ịs T S

Hà Nội 2002

P h ạ m

T h a n h

K ỳ

LỜƯ c ả m

ƠR

(Dề. t à i nàụ. (tu'o’e. th u a hiệu ta i íUìêtI Ddêtn. ttạlùêtn. - (Bà QJ- tê, d ư ổ i uX
lu íâ ttạ dẫtL c ủ a QcS. Qftinh (JJăn Jlẩu - p h ó giám , (tốn <ĩ)ìên DCiểni m ịhiỀm ũù
eMS, rJ<$. r()lĩíitn ^Jliault DCij. - cá n hỗ- (ịiảniỊ dạiẬ. bô m ô n (Dươe Liêu, trú ò tiạ
('Đại h ạ c nDaỢd 'ãôà QLội.
c ủ a Qc£.

vi n il (Z)ăn M ẩn lùi £ ịẴ ‘ £7c£. rp itạ in Qfltanh DCìị.

'Ji'Ouq qxiẩ tr ìn h th ú c hiên (Tề tà i, elulntj. tó i cũII(Ị n lu ịn ĩtiừỉe những, ý,
líiê n đón tp (ỊỎỊI q u í lưíu c ủ a rp ^ ậ.ci. rp iư u n - ộ ia 'dùuê cùng, eáa títầụ . cà (JÌá tì

khóa.

ồng. th ò i ehúnạ. tò i eủíiạ. lu â n n h à n itu ’rie u i ạiúfL đ ĩí n ỉù êt tĩn h của

các ban (tầng, nạỉù êp. t a i eác pítòtKỊ ty ô tK ị ^Dàổe tíù p h ẻn íỊ /ìlĨỊ, p h ẩ m của
(Viên. DCìểm n ạ h ỉím .
Q ỉlià n tlifL n à ụ,, chúng, tô i xitv Ị)ừụ tả LờtUỊ. hìêt ơn e h â n th à n h đ ỏ i DÓ’i u Ị
(fiứp itõ q u tị lỉáti của eáa thầụ. eầ ạìátì oà cá (í han đồng, nụỉùèp..

rí)(S . QÍẩ ịxìịậỉh ^ ĩlù rỊ )lllì(itl(Ị ^7liả o


MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN Đề

01

Chương 1: TổNG QUAN

03

1.1. Vị Hoàng liên

03

1.2. Vài nét về một số alcaloid chính trong Hoàng liên

04

1.2.1. Berberin

04

1.2.2. Palmatin

05

1.3. Một sô phương pháp đã được áp dụng để chiết xuất
berberin và palmatin từ dược liệu Hoàng liên

06

1.3.1. Phương pháp chiết lạnh theo Lu, p. và Zeng, J. H.

06

1.3.2. Phương pháp chiết nóng

07

1.3.3. Phương pháp chiết theo DĐ Trung Quốc 97

07

1.4. Một sô phương pháp đã được áp dụng để định lượng
alcaloid toàn phần, berberin và palmatin trong Hoàng
liên

08

1.4.1. Phương pháp cân

08

1.4.2. Phương pháp quang phổ tử ngoại

08

1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

10

Chương 2: Đ ố i TƯỢNG, TH IÊT BỊ, NỘI DƯNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

16

2.1. Đối tượng nghiên cứu

16

2.2. Thiết bị và hoá chất

17

2.2.1. Thiết bị

17

2.2.2. Hoá chất

17

2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

18

2.3.1. Nghiên cứu phương pháp chiết xuất berberin và palmatin
từ dược liệu Hoàng liên và viên Hương liên hoàn

18


2.3.1.1. Khảo sát phương pháp chiết theo Lu, p. và cộng sự ,
DĐ Trung Quốc 1997, DĐ Nhật 1996 và phương pháp
chiết lạnh bằng lắc siêu âm trên hai mẫu Mj và M2

18

2.3.1.2. Đề xuất phương pháp chiết berberin và palmatin từ dược
liệu Hoàng liên (mẫu Mị) và bột Hương liên hoàn tự tạo
(m ẫu M 2)

18

2.3.2. Xây dựng phương pháp HPLC để định tính và định lượng
đồng thời berberin và palmatin trong dược liệu Hoàng liên
và trong viên Hương liên hoàn
2.3.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký

20
20

2.3.2.2. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng thời
berberin và palmatin trong dược liệu Hoàng liên và trong
viên Hương liên hoàn

20

2.3.3. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

22

2.3.3.1. Đánh giá hiệu quả chiết

22

2.3.3.2. Định tính

22

2.3.3.3. Định lượng

23

Chương 3: T H ự C NG H IỆM VÀ KẾT QUẢ.

24

3.1. Xây dựng phương pháp chiết berberin và palmatin trong
dược liệu Hoàng liên và trong chê phẩm Hương liên hoàn

24

3.1.1. Khảo sát phương pháp chiết lạnh theo Lu, p. và cộng sự

24

3.1.2. Khảo sát phương pháp chiết lạnh dùng siêu âm

24

3.1.3. Khảo sát phương pháp chiết theo DĐ Trung Quốc97

25

3.1.4. Khảo sát phương pháp chiết theo DĐ Nhật 96

25

3.1.5. Khảo sát điều kiện chiết thích hợp

26

3.1.5.1. Khảo sát dung môi chiết

26

3.1.5.2. Khảo sát số lần chiết thích hợp

29

3.1.6. Nhận xét

29

3.2.

Xây dựng phương pháp định tính, định lượng
đồng thời palmatin và berberin bằng HPLC

31


3.2.1. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký để định tính và định lượng
đồng thời berberin và palmatin trong Hoàng liên và trong
viên Hương liên hoàn

31

3.2.1.1. Chọn pha động và tốc độ dòng thích hợp

31

3.2.1.2. Chọn bước sóng thích hợp

34

3.2.2. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng thời
berberin và palmatin trong Hoàng liên và viên Hương liên
hoàn

36

3.2.2.1. Kiểm tra độ tinh khiết của píc berberin và palmatin thu
được từ dịch chiết m ẫu thử Mị và Mi
3.2.2.2. Xây dựng phương pháp định tính palmatin và berbeim

36
37

3.2.2.3. Xây dựng phương pháp định lượng đổng thời palmatin
và berberin

39

3.2.3. Áp dụng phương pháp HPLC đã xây dựng để định lượng
đồng thời berberin và palmatin trong chế phẩmHương liên
hoàn của Công ty Dược Yên Bái

45

3.2.3.1. Phương pháp định lượng

45

3.2.3.2. Kết quả

46

Chương 4: BÀ N LUẬN VỂ KẾT QUẢ

48

KẾT LU Ậ N VÀ ĐỂ NGHỊ

50

TÀ I LIỆU TH AM KHẢO

52

PH Ụ LỤC

56


BẢNG CHỬ VIẾT TẮT:

DĐ: Dược điển.
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
kl/tt: Khối lượng trên thể tích.
UV-VIS: Tử ngoại - Khả kiến,
vđ: Vừa đủ.


1

ĐẬT VĂN ĐẼ.
Hoàng liên là vị thuốc từ lâu đã được dùng nhiều trong đông y. Vị thuốc
Hoàng liên cũng đã được đưa vào Dược điển một số nước như: DĐ Việt Nam,
DĐ Trung Quốc 97, DĐ Nhật 96,...Hoàng liên là thành phần chính trong nhiều
chế phẩm thuốc uống, trong đó có viên Hương liên hoàn của Công ty Dược Yên
Bái đã được Bộ Y Tế cấp số đăng ký sản suất và lưu hành trên thị trường. Hương
liên hoàn là chế phẩm được dùng theo kinh nghiệm lâu năm, được người tiêu
dùng ưa chuộng trong điều trị các bệnh rối loạn đường tiêu hoá, chữa lỵ, ỉa chảy,
viêm ruột.
Trong viên Hương liên hoàn, thành phần chíi
alcaloid. Trong đó berberin là thành phần chính, tiếp đến là palmatin [42], cả hai
alcaloid này đều có tác dụng điều trị bệnh đường tiêu hoá [19]. Vì vậy, việc xác

định hàm lượng berberin và palmatin trong Hoàng liên cũng như trong chế phẩm
Hương liên hoàn là vấn đề cần quan tâm trong công tác quản lý chất lượng thuốc
nhằm đảm bảo thuốc có hiệu lực chữa bệnh và an toàn cho người sử dụng.
Từ trước đến nay, mặc dù đã qua ba lần nghiên cứu cải tiến công thức, kèm
theo ba lần xây dựng bổ xung tiêu chuẩn, song trong cả 3 tiêu chuẩn đã xây dựng
của viên Hương liên hoàn đều chưa có phương pháp để định lượng berberin và
palmatin. Trong những năm gần đây, Công ty Dược Yên Bái đã nghiên cứu xây
dựng phương pháp quang phổ tử ngoại để định lượng berberin. Tuy nhiên, do
trong Hoàng liên có chứa cả berberin và palmatin mà phổ hấp thụ UV-VIS của 2
alcaloid này tương tự nhau nên việc định lượng berberin bằng phương pháp
quang phổ tử ngoại thông thường cũng như bằng phương pháp quang phổ đạo
hàm khó thực hiện. Do đó, cho đến nay trong tiêu chuẩn chất lượng xin cấp số
đăng ký sản xuất và lưu hành mặt hàng này, công ty vẫn chưa có phương pháp
định lượng berberin và palmatin.
Về các phương pháp đã được áp dụng để định lượng alcaloid trong Hoàng
liên và trong các chế phẩm đông dược có chứa Hoàng liên, qua tham khảo các tài


2

liệu, chúng tôi nhận thấy hầu hết các Dược điển đều chỉ đề cập đến việc định
lượng berberin. DĐ Việt Nam I định lượng bằng phương pháp cân sau khi chiết
và kết tủa berberin bằng dung môi thích hợp. DĐ Trung Quốc 97 dùng sắc ký lớp
mỏng để tách riêng vết berberin sau đó đo cường độ phát quang của vết berberin
trên sắc ký đồ, so sánh với cường độ phát quang của vết berberin chuẩn. DĐ Nhật
96 dùng phương pháp HPLC. Một số tài liệu khác, trong những năm gần đây,
cũng đề cập đến việc định lượng berberin trong Hoàng liên và trong các chế
phẩm đông dược có chứa Hoàng liên bằng phương pháp HPLC. Tuy nhiên, trong
các tài liệu mà chúng tôi đã tham khảo, chưa có tác giả nào nêu lên qui trình
chiết xuất và định lượng đồng thời berberin và palmatin trong dược liệu Hoàng

liên và trong chế phẩm Hương liên hoàn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao. Do đó chúng tôi tiến hành đề tài:
"Nghiên cứu định tính và định lượng đồng thời berberin và palmatin
trong thân rễ Hoàng liên và trong chê phẩm Hương liên hoàn bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)".
- Mục tiêu của công trình là:
Xây dựng phương pháp chiết và định tính, định lượng đồng thời berberin và
palmatin trong vị Hoàng liên và chế phẩm Hương liên hoàn đủ tin cậy nhằm góp
phần nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng vị Hoàng liên và giúp Công ty
Dược Yên Bái nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng viên Hương liên hoàn.
- Công trình thực hiện các nội dung sau:
+ Khảo sát, lựa chọn phương pháp chiết thích hợp để chiết kiệt berberin và
palmatin từ dược liệu Hoàng liên và từ chế phẩm Hương liên hoàn.
+ Xây dựng chương trình sắc ký để định tính và định lượng đồng thời berberin và
palmatin trong các dịch chiết từ các mẫu nghiên cứu nói trên.


3

Chương 1: TỔNG QUAN.
1.1. Vị Hoàng liên.
Vị thuốc Hoàng liên (Rhizoma Coptidis) là thân rễ đã phơi hay sấy khô
của cây Hoàng liên chân gà (Coptis teeta Wall.) và một số loài Hoàng liên khác
(Coptis teetoides C.Y. Cheng, Coptis chinensis Franch.), thuộc họ Mao lương
(Ranunculaceae) [9], [10], [14]. Vị thuốc Hoàng liên được nói đến trong nhiều
tài liệu [30], [31], [36], đây là loài có mọc hoang ở vùng núi cao 1300-2000m, ở
nước ta có mọc hoang ở Sapa (Lào cai), Quảng Bạ (Hà Giang) [6], [14], [17],
[18], [19]. Trong thân rễ Hoàng liên thành phần chính là alcaloid (5-8%) trong
đó chủ yếu là berberin, phần còn lại là palmatin, worenin, coptisin, jatrorizin,
magnoflorin [3], [14]. Ngoài ra trong Hoàng liên còn có tinh bột, acid hữu cơ như

acid ferulic,...
Thân rễ Hoàng liên sau khi thu hái thường được rửa sạch, phơi khô, thái lát
rồi dùng ngay. Trong một số tài liệu, Hoàng liên được chế biến bằng cách đem
sao với rượu (chữa các bệnh nhiệt ở phần trên cơ thể), hoặc đem sao với nước
gừng thành khương hoàng liên (chữa bệnh nhiệt ở dạ dày, điêù hoà chức năng dạ
dày, chống nôn), hoặc sao với nước sắc ngô thù du thành du hoàng liên (tăng
cường chức năng gan, điều hoà chức năng dạ dày, chống nôn) [3], [5], [11], [30],
[31] . Công ty Dược phẩm Yên Bái sử dụng loại Hoàng liên chưa qua chế biến
[7].
Nước sắc Hoàng liên có nhiều tác dụng dược lý: tác dụng kháng khuẩn
(trực khuẩn lị, trực khuẩn phó thương hàn, trưc khuẩn E.Coli, phẩy khuẩn tả, tụ
cầu vàng, liên cầu khuẩn,...), kháng virut, kháng nấm gây bệnh; tác dụng với ký
sinh trùng đơn bào; tác dụng kiện vị giúp tiêu hoá, chống loét đường tiêu hoá; tác
dụng hạ huyết áp, phòng ngừa vữa xơ động mạch; tác dụng chống viêm [19].
Hoàng liên có vị đắng tính hàn, qui vào các kinh tâm, can, vị và đại tràng
có tác dụng thanh nhiệt, táo thấp, tả hoả, giải độc. Hoàng liên là một loại thuốc
bổ đắng, có tác dụng kiện vị dùng trong điều trị tiêu hoá kém, viêm dạ dày, lị, ỉa


4

chảy, nôn mửa. Trong điều trị lị trực trùng, cao lỏng Hoàng liên có tác dụng rất
tốt mà không có hiện tượng kích ứng dạ dày. Với viêm màng tiếp hợp mắt, dùng
dịch chiết Hoàng liên để nhỏ và rửa mắt cũng có tác dụng rất tốt. Theo đông y,
Hoàng liên còn được dùng để chữa sốt, mê sảng, nôn ra máu, chảy máu cam, can
hoả ứ kết, đau dạ dày, nôn ra nước chua, tim đập hồi hộp mất ngủ, loét miệng,
mụn nhọt đầu đinh, vết thương có mủ, bỏng, đau mắt đỏ, viêm tai giữa [19], [35].
Hoàng liên ít độc thường được dùng liều 2-6 g/ngày dạng thuốc sắc.
1.2. Vài nét về một số alcaloid chính trong Hoàng liên.
1.2.1. Berberin.

Berberin là 5,6-dihydro-9,10-dimethoxybenzo[g]-l,3-benzodioxolo [5,6-ữ]
quinolizinium hydroxyd: C^oHjgNOg [3], [14], [23], [39]. Berberin có thể tổn tại ở
dạng muối clorid, sulfat [23]. Dạng muối clorid hay được dùng trong ngành
Dược. Berberin có công thức cấu tạo:

Độ tan:
Dạng base tan trong nước, hơi tan trong ethanol, khó tan trong ether. Dạng
muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400 trong nước, dễ tan trong nước sôi, tan trong ethanol,
thực tế không tan trong cloroform và ether. Dạng muối sulfat khó tan trong nước,
tan trong ethanol.
Đặc tính p h ổ hấp thụ hồng ngoại:
Berberin có các đỉnh đặc trưng ở số sóng: 1505, 1271, 1234, 1030, 1587,
1098 cm '1 (đĩa KBr) [23].
Đặc tính phổ hấp thụ tử ngoại:


5

Berberin trong môi trường acid có cực đại hấp thụ ở 264 nm và 345 nm
[4], [23].
Tác dụng và công dụng:
Người ta cho rằng tác dụng ức chế vi khuẩn của Hoàng liên phụ thuộc chủ
yếu vào hàm lượng berberin. Tuy nhiên, một số vi khuẩn như Staphylococcus
aureus, Streptococcus hemolyticus dễ sinh kháng thuốc với berberin sulfat nhưng
những vi khuẩn này lại khó sinh kháng thuốc đối với Hoàng liên [3]. Berberin có
tác dụng kháng khuẩn được dùng chủ yếu trong các bệnh rối loạn đường tiêu hoá
[24], [37]. Ngoài ra, berberin với liều nhỏ có tác dụng kích thích tim, làm giãn
mạch vành, với liều lớn ức chế hô hấp làm tê liệt trung khu hô hấp trong khi tim
vẫn đập. Berberin còn có tác dụng hạ nhiệt, gây tê, lợi mật, kháng lợi niệu, đối
với đường huyết lúc đầu có tác dụng tăng cao và sau đó thì hạ [19].

Berberin thường được dùng ở dạng viên nén liều 0,2-0,4 g/ngày trong điều trị
bệnh đường tiêu hoá [19].
1.2.2 Palmatin.
Palmatin

là

5,6-dihydro-2,3,9,10-tetramethoxydibenzo

[a,g\

quinolizinium

hydroxyd C^H^NOj. Palmatin chỉ tồn tại ở dạng muối, thông thường là các dạng
muối iodid, nitrat, clorid, sulfat [37]. Palmatin có công thức cấu tạo:

r
OH

V.

OCH3

Độ tan:
Dạng muối iodid khó tan trong nước nóng và alcol, dạng muối nitrat tan
trong hầu hết các dung môi, dạng muối clorid và sulfat dễ tan trong nước nóng và
alcohol [38].


6

Tác dụng và công dụng:
Palmatin clorid có tác dụng ức chế liên cầu khuẩn và tụ cầu khuẩn, tác
dụng lên trung khu hô hấp, tác dụng hạ huyết áp, tác dụng chống nấm đặc biệt là
nấm gây viêm âm đạo. Palmatin clorid được dùng trong điều trị bệnh kiết lỵ, ỉa
chảy dưới dạng viên với liều 0,08-0,2 g/ngày; bệnh đau mắt ở dạng dung dịch 35%; bệnh nấm âm đạo dưới dạng viên trứng hàm lượng 0,2 g [19].
1.3. Một sô phương pháp đã được áp dụng đê chiết xuất berberin và
palmatin từ Hoàng liên.
Muốn định lượng được hàm lượng các hoạt chất trong dược liệu nói chung
cũng như định lượng berberin và palmatin trong Hoàng liên nói riêng, vấn đề đầu
tiên cần quan tâm là chọn được phương pháp chiết thích hợp. Phương pháp chiết
được lựa chọn phải đảm bảo chiết kiệt được hoạt chất cần định lượng và dịch
chiết thu được phải đủ sạch để không làm sai lệch kết quả phân tích. Muốn vậy
cần có biện pháp xử lý mẫu và tinh chế dịch chiết thích hợp. Việc tinh chế và làm
sạch dịch chiết có nhiều phương pháp khác nhau nhưng nhìn chung có một số
phương pháp sau:
- Dựa vào độ tan khác nhau của hoạt chất cần chiết và tạp chất từ đó lựa
chọn, thay đổi dung môi, môi trường chiết để hoà tan tốt được chất cần phân tích
nhưng lại loại được các tạp chất.
- Loại tạp chất trước khi chiết ví dụ loại chất béo bằng ether dầu hoả, loại
màu bằng than hoạt [1]
- Dùng sắc ký cột với các chất nhồi cột như nhôm oxyd, silicagel, dùng
phương pháp chiết pha rắn (SPE) ...[2].
Các phương pháp chiết berberin và palmatin trong Hoàng liên ở các tài liệu
chúng tôi đã tham khảo có thể chia thành 3 phương pháp sau:
1.3.1 Phương pháp chiết lạnh theo L u,p và Zheng J .H [29].
Berberin trong Hoàng liên có thể chiết bằng phương pháp ngâm lạnh như sau:


7

Cân khoảng 0,4g dược liệu đã được tán mịn, cho vào một bình nón nút
mài,thêm 50ml methanol, đậy kín bình, 6 giờ đầu thỉnh thoảng lắc, để yên 18 giờ.
Lọc thu được dịch chiết.
1.3.2. Phương pháp chiết nóng
- Phương pháp chiết nóng theo DĐ Việt Nam I, tập 1 [9].
Cân khoảng 2,5g dược liệu đã được tán mịn, thêm 50ml ethanol 95% và
chiết kiệt hoạt chất bằng bình Zaitchenko. Dịch chiết thu được đem bốc hơi trên
cách thuỷ tới khô. Thêm vào cắn 30ml nước, 2-3g magnesi oxyd, lắc đều. Lọc
thu lấy dịch chiết, rửa cắn bằng nước nóng đến khi nước rửa không còn màu, thu
được dịch chiết.
- Phương pháp chiết theo Wu,P.E và Zhou, L. [43].
Cân khoảng 0,4g dược liệu đã được tán mịn, thêm 50-60ml ethanol, đun
hổi lưu trên cách thuỷ trong 2 giờ, lọc thu được dịch chiết.
- Phương pháp chiết theo Rhee,J.S. [24],
Cân khoảng 0,4 g dược liệu đã dược tán mịn, thêm 50-70ml methanol, đun
hổi lưu trên cách thuỷ ở 60°c trong 2-3 giờ, lọc thu được dịch chiết.
- Phương pháp chiết theo DĐ Nhật 96 [36].
Cân khoảng 0,lg dược liệu đã được tán mịn, thêm 30ml hỗn hợp dung môi
methanol-acid hydrocloric (100:1), đun hồi lưu cách thuỷ trong 30 phút, lọc lấy
dịch chiết methanol. Làm như vậy thêm 2 lần nữa với thể tích hỗn hợp dung môi
tương ứng là 30ml và 20ml.
1.3.3 Phương pháp chiết theo DĐ Trung Quốc 97 [32].
Cân khoảng 0,lg dược liệu đã được tán mịn, chuyển vào bình định mức
100ml, thêm 95ml hỗn hợp dung môi methanol-acid hydrocloric (100:1), đun hổi
lưu trên bếp cách thuỷ ở 60°c trong 15 phút, để yên qua đêm, lắc siêu âm trong
30 phút, thêm methanol vừa đủ 100ml, lọc thu được dịch chiết.


8

1.4. Một sô phương pháp đã được áp dụng đê định lượng alcaloid toàn phần,
berberin và palmatin trong Hoàng liên.
1.4.1. Phương pháp cân.
Dựa trên tính chất của berberin có phản ứng tạo tủa phức với aceton. Do
đó, sau khi chiết kiệt berberin bằng cồn sẽ tạo tủa với kali iodid. Tủa berberiniodid được phân tán đều trong nước nóng sau đó thay đổi pH của môi trường để
chuyển berberin về dạng base rồi cho phản ứng với aceton tạo ra tủa phức
berberin-aceton. Lọc lấy tủa, cân tủa berberin-aceton thu được và đo thể tích dịch
lọc từ đó tính ra lượng berberin đã tham gia phản ứng [9].
Tuy nhiên, trên thực tế không chỉ có berberin cho kết tủa với kali iodid và
aceton nên phương pháp định lượng này không hoàn toàn là định lượng berberin.
Hơn nữa, nếu áp dụng phương pháp này để định lượng berberin trong Hương liên
hoàn thì cần một lượng mẫu thử lớn (khoảng 100 viên) mà lại có sai số lớn do
phải qua nhiều lần kết tủa, lọc và rửa tủa.
1.4.2. Phương pháp quang p h ổ tủ ngoại.
Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại cũng đã được dùng để định lượng
alcaloid toàn phần trong bột Hoàng liên. Phương pháp này dựa trên định luật
Lambert-Beer: Mật độ quang của dung dịch một chất ở một bước sóng xác định tỉ

lệ thuận với nồng độ và bề dày của lớp dung dịch đem đo [13], [16], [46].
D =k.l.c
Trong đó:

(1)

k là hệ số hấp thụ.

c là nồng độ.
1 là bề dày của lớp dung dịch đem đo.

c = 1% (kl/tt), 1 = lcm thì D = k được gọi là hệ số hấp thụ riêng, ký
hiệu là E (1%,1 cm). Như vậy khi c tính theo nồng độ phần trăm (kl/tt), l tính
bằng cm thì:
D = E (1%, 1 c m ). c . 1 (2)
Khi


9

Theo DĐ Trung quốc 88 [30], dịch chiết alcaloid toàn phần sau khi được
tinh chế qua cột nhôm oxyd sẽ được đo quang ở bước sóng 345 nm. Hàm lượng
alcaloid toàn phần sẽ được tính theo berberin lấy E(l% , 1 cm) = 728.
Phương pháp này ít được áp dụng để định lượng alcaloid trong Hoàng liên
do trên thực tế rất khó rửa giải được toàn bộ alcaloid ra khỏi cột nhôm oxyd. Hơn
nữa, đây chỉ là phương pháp xác định một cách tương đối hàm lượng alcaloid
toàn phần trong Hoàng liên dựa vào giá trị E(l%, 1 cm). Phương pháp này khó
cho kết quả lặp lại, sai số lớn.
Phương pháp sắc ký lóp mỏng kết hợp với phương pháp đo quang còn gọi
là phương pháp densitomet để định lượng berberin trong các chế phẩm đông dược
cũng thường được sử dụng [28], [31], [43]. Trong phương pháp này, sau khi triển
khai sắc ký lóp mỏng, các vết trên sắc ký đồ sẽ được quét bằng một chùm sáng
có bước sóng xác định. Ánh sáng khuếch tán phản xạ trở lại sẽ được đo bằng
thiết bị cảm quang của máy quét. Máy densitomet có thể đặt ở chế độ hấp thụ
hoặc huỳnh quang tuỳ thuộc vết của chất cần phân tích có khả năng hấp thụ ánh
sáng tử ngoại hoặc ánh sáng nhìn thấy hay có khả năng phát quang khi bị kích
thích. Để định lượng berberin trong Hoàng liên, dung môi để triển khai sắc ký
lớp mỏng thường là:
Benzen-ethyl acetat-methanol-isopropanol-nước (6:3:1,5:1,5:0,3)Benzen-ethyl acetat-methanol-isopropanol-amoniac (12:6:3:3:1).
n-Butanol-acid acetic-nước (7:1:2).
Sau khi triển khai sắc ký lớp mỏng sẽ tiến hành đo cường độ phát quang

của vết berberin so sánh với cường độ phát quang của vết berberin chuẩn đã biết
hàm lượng từ đó sẽ tính được hàm lượng berberin trong mẫu thử. Phương pháp
này cho kết quả với sai số lớn thường từ ± 10% đến ± 15%.


10

1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp phân
tích hoá lý dùng để tách, định tính và định lượng các thành phần trong hỗn hợp
dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với hai pha luôn tiếp xúc nhưng không
trộn lẫn với nhau: pha tĩnh (được bao bên ngoài chất mang và nhồi trong cột sắc
ký) và pha động (dung môi rửa giải). Pha động cùng với mẫu thử được bơm qua
cột dưới áp suất cao, các chất cần phân tích sẽ di chuyển theo pha động qua cột
với tốc độ khác nhau tu ỳ theo ái lực của chúng với hai pha và dẫn đến sự tách các
chất. Sự tách này đạt được là do quá trình phân bố, hấp thụ hoặc trao đổi
ion...[15], [20].
Các chất sau khi ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện là
detector. Tuỳ theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp.
Detector hay được sử dụng nhất là detector

uv (phát hiện chất cần phân tích dựa

vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại hoặc ánh sáng nhìn thấy của chất cần
phân tích ở một bước sóng xác định). Đường cong rửa giải sau một qúa trình sắc
ký được gọi là sắc ký đổ, nó thường có dạng như hình 1.
tignaỉ

Hình 1: Giản đồ sắc ký hai chất 1 và 2.

11

t0 (Thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống
sắc ký.
tR(Thời gian lưu): Thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vào cột
cho đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
tR (Thời gian lưu thực) = tR - 10.
§t (Độ lệch chuẩn): Độ rộng nửa píc tại các điểm uốn tương ứng.
Cũ0 5

(Độ rộng píc ở nửa chiều cao) = 2,354ôt.

cob: Độ rộng đáy píc.
Thời gian lưu tR là thông tin về mặt định tính của các sắc đổ, nó là một
hằng số đối với một cấu tử đã cho khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi.
Để đặc trưng cho một chất, thuận lợi hơn, người ta dùng hệ số dung lượng k . k
được tính theo công thức:

_ [r_ _ [r_{o _ Ịr_
'o

(3)

'o

to

Trên thực tế k nằm trong khoảng từ 2-5 là tốt nhất, các giá trị k lớn hơn
chỉ dẫn đến sự doãng píc, độ nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài.

Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá tri kkhác nhau và
được đánh giá thông qua thừa số chọn hay hệ số chọn lọc a:
to - t n
a = h.
— =
tn - t n
k,

( k 2> ki) (4)

Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết trên cột
(N). Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức:
-

“

2
= 16

N =

A

-

-2
= 5,54

^0,5

( 5)


12

Để đặc trưng cho mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký người ta
thường sử dụng độ phân giải R giữa 2 píc cạnh nhau. Độ phân giải giữa 2 píc (píc
số 1 và số 2) được tính theo công thức sau:
£ _ 2(tRl - tRx) _ Ụ77(fft2
ũ ) b , l + ũ > b,2

)

(6)

^0,5.1 + í y 0,5.2

Trong thực tế: R = 0,75 hai píc không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.
R = 1,0 hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%.
R = 1,5 hai píc tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%.
Độ phân giải phụ thuộc hệ số k, (hệ số dung lượng của cấu tử ra sau), độ
chọn lọc a và số đĩa lý thuyết N của cột thông qua phương trình:
R = JẼ .i a z l x J l r.
4
a
1+ k 2

(7)

Như vậy, để tăng độ phân giải R ta có thể tăng N (dùng cột dài hơn hoặc

giảm tốc độ dòng pha động); tăng k’2 (bằng cách thay đổi thành phần pha động);
tăng a (bằng cách thay loại pha tĩnh hoặc thay đổi thành phần pha động).
Ngày nay phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được ứng dụng ngày
càng rộng rãi trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc nói chung và kiểm nghiệm thuốc
đông dược nói riêng. Một số tác giả đã dùng các dung môi hữu cơ như methanol
[22], [32], [33], [36], [44], ethanol [3], [21] ở môi trường acid hoặc trung tính để
chiết alcaloid từ bột Hoàng liên và các thuốc đông dược có chứa Hoàng liên rồi
tiến hành định lượng berberin hoặc berberin và palmatin bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao. Trong các tài liệu chúng tôi đã tham khảo, các tác giả đã
nêu lên một số chương trình sắc ký sau đây để phân tích các alcaloid của bột
Hoàng liên.
*DĐ Nhật [36], Wang,

c. M. và cộng sự [40] đã nêu qui trinh sắc ký gồm

các điều kiện sau đây để định lượng berberin trong Hoàng liên:


13

- Cột sắc ký: Cột thép không gỉ đường kính trong 4-6 mm được nhồi
bởi hạt silicagel đã được octadecylsilan hoá có đường kính 5-10 ịim.

- Nhiệt độ cột: 45°c.
- Pha động: Hoà tan 3,4 g kali dihydrophosphat và 1,7 g natri lauryl
sulfat trong 1000 ml hỗn hợp dung môi nước và acetonitril (1:1).
- Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lưu của
berberin khoảng 10 phút.
- Detector ƯVỞ bước sóng 345 nm.
^Lin, S. J. và cộng sự [27] đã sử dụng chương trình sắc ký sau đây để xác

định berberin và palmatin trong chế phẩm thuốc đông dược Sann-Joong-KueyJian-Tang.
- Cột sắc ký: Cosmosil 5 C18-MS (15 cm X 4,6 mm).
- Chạy gradient dung môi với pha động acid phosphoric 0,03% và
acetonitril thay đổi từ tỷ lệ 9:1 đến 11:9 trong 50 phút.
- Tốc độ dòng 1 ml/phút.
- Detector u v ở bước sóng 254 nm.
* Một chương trình sắc ký sau đây cũng được nêu để định lượng berberin
clorid trong viên nang Zhimei Miedi [26].
- Cột sắc ký: Cột TSKgel-80TS (25 cm X 4,6 mm).
- Pha động: Natri Dihydrophosphat 50 mM-acetonitril-methanol
(55:30:20).
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.
- Detector u v 346 nm.
* Wang, S. D., Song, B. s. đã xác định hàm lượng berberin trong dung dịch
của cốm Shenshu hoà tan trong nước bằng phương pháp HPLC với chương trình
sắc ký sau đây [41].


- Cột sắc ký: cột Hypersil BDS C18 (5 ịim, 25 cm X 4,6 mm).
- Pha động: Acid phosphoric 40 mM-acetonitril (29:21).
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
- Detector u v 349 nm.
* Chương trình sắc ký sau đây cũng được dùng để định lượng berberin.
- Cột sắc ký: Hibar® RT 250-4 Lichrosorb® RP SelectB, 5 |_im. (Cat.
No. 1.19608).
- Pha động: Acetonitril-1,85 mM acid tartric trong 10 mM SDS
(55:45).
- Tốc độ dòng 1 ml/phút.
- Detector u v 340 nm.
* Lu, P., Zheng, J.H. [29] đã nêu lên chương trình sắc ký sau đây để định

lượng berberin trong Hoàng liên.
- Cột sắc ký: Cột sắc ký pha đảo CS-1000 (25 cm X 4,6 mm).
- Pha động: Acetonitril-đệm phosphat pH = 5,2 (11:9).
- Tốc độ dòng 1 ml/phút.
- Detector u v 254 nm.
* Để xác định các alcaloid benzylisoquinolin chương trình sắc ký sau đây
đã được sử dụng:
- Cột sắc ký: LiChro CAR.T® 250-4 Aluspher® RP SelectB, 5 |Lim
(Cat. No. 1.51318).
- Pha động: A: Methanol.
B: Natri hydroxyd 0,025 mol/1.
- Gradient dung môi: 0 phút: 80% B; 0 - 5 phút: 40% B; 5 - 15 phút:
40% B; 15 - 18 phút: 80% B.


- Tốc độ dòng 1 ml/phút.
- Detector
*

uv 285 nm.

Zeng, X. J. [45] đã sử dụng chương trình sắc ký sau đây để định lượng

berberin trong huyết tương:
- Cột sắc ký: ịi-Bondapak C18, 10 Ịj.m (30 cm

X

3,9 mm).

- Pha động: Acetonitril - acid phosphoric 0,02 M (9 : 11).
- Tốc độ dòng 1 ml/phút.
- Detector u v 346 nm.


16

Chương 2: Đ ố i TƯỢNG, THIÊT BỊ, NỘI DƯNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u .
2.1.ĐỐÌ tượng nghiên cún.
- Mẫu Mj là mẫu bột Hoàng liên đạt tiêu chuẩn chất lượng DĐ Việt Nam I
do Công ty Dược phẩm Yên Bái cung cấp. Mẫu này được dùng để khảo sát xây
dựng phương pháp định tính, định lượng đổng thời berberin và palmatin trong bột
Hoàng liên trên máy HPLC.
- Mẫu M, là bột Hương liên hoàn tự tạo, được chế theo công thức viên
Hương liên hoàn của Công ty Dược phẩm Yên Bái từ các nguyên liệu đạt tiêu
chuẩn chất lượng đã đăng ký do Công ty cung cấp. Mẫu M7 có các thành phần
sau:
-Hoàng liên

8g.

- Vân mộc hương 8g.
- Sa nhân

0,2g.

- Đinh hương

0,2g.

-H ồi

0,lg.

- Quế

0,lg.

- Tá dược

vừa đủ 20g tương đương với 240 viên.

Hỗn hợp trên được trộn đều, sấy khô, tán mịn, rây qua rây 0,25 mm.
Mẫu M, được dùng để khảo sát ảnh hưởng của các thành phần khác trong
Hương liên hoàn đến quá trình chiết tách và quá trình sắc ký định tính và định
lượng đồng thời berberin và palmatin trong viên Hương liên hoàn.
Trong quá trình nghiên cứu, hai mẫu M[ và M2 được tiến hành song song
có so sánh kết quả để đánh giá sự ảnh hưởng của các thành phần khác tới quá
trình định tính và định lượng berberin và palmatin trong viên Hương liên hoàn.


17

- Mẫu M3 là mẫu có thành phần tương tự như mẫu M t nhưng không chứa
Hoàng liên. Mẫu M3 dùng để khảo sát ảnh hưởng của các thành phần khác trong
công thức đến quá trình sắc ký tại bước sóng phát hiện berberin và palmatin.
- Ba mẫu Hương liên hoàn do Công ty Dược phẩm Yên Bái sản xuất hiện
đang lưu hành trên thị trường có số kiểm soát:

+ 010400

+ 040800
+101200
Tiến hành định tính và định lượng đồng thời berberin và palmatin trong ba
mẫu này bằng phương pháp HPLC đã xây dựng.
2.2. Thiết bị và hoá chất
2.2.1. Thiết bị.
- Máy lắc siêu âm Transonic T700 (CHLB Đức).
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Bio-tek Kontron - Detector u v hoặc diode
array (Pháp).
- Cân phân tích Mettler AB204, độ chính xác 0,1 mg (Thuỵ sĩ).
- Máy quang phổ UV-VIS Hewlett Packard (Mỹ).

- Nồi cách thuỷ.
- Các dụng cụ thuỷ tinh cần thiết khác.
Tất cả các thiết bị trên đã được hiệu chuẩn và kiểm định theo đúng tiêu chuẩn
ISO/IEC 17025.
2.2.2. Hoá chất.
- Chuẩn làm việc palmatin clorid.
- Chuẩn làm việc berberin clorid.
- Methanel-P.A.
/ £
"o \
- Acid hydrocloric P.A.

xT;/Ch0 ftZr


18

- Kali dihydrophosphat p.A.
- Natri laurylsulfat p. A.
- Acetonitril dùng cho HPLC.
- Thuốc thử Mayer pha theo DĐ Việt Nam II, tập 3 [12].
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.
2.3.1. Nghiên cứu phương pháp chiết xuất berberin và palmatỉn từ dược liệu
Hoảng liên và viên Hương liên hoàn.
2.3.1.1. Khảo sát các phương pháp chiết theo Lu, p. và cộng sự [29], DĐ Trung
Quốc 1997, DĐ Nhật 1996 và phương pháp chiết lạnh bằng lắc siêu âm trên hai
mẫu M ị và M2.
2.3.1.2. Đề xuất phương pháp chiết berberin và palmatin từ dược liệu Hoàng liên
(mẫu M ị ) và bột Hương liên hoàn tự tạo (mẫu M2).
a. Đối với dược liệu Hoàng liên (mẫu Mj).
Cân chính xác khoảng 0,07 g bột Hoàng liên đã được nghiền mịn và rây
qua rây 0,25 mm vào một bình nón nút mài 100ml. Chiết 3 lần, mỗi lần dùng 25
ml hỗn hợp dung môi methanol-acid hydrocloric (100:1) bằng cách đun hồi lưu
trên cách thuỷ 30 phút. Gộp các dịch chiết, làm bay hơi trên cách thuỷ tới khô.
Cắn được chiết tiếp bằng nước nóng 5 lần, mỗi lần dùng 15 ml. Lọc và gộp các
dịch chiết, làm bay hơi trên cách thuỷ tới khô. cắn được hoà tan và chuyển vào
bình định mức 50 ml bằng methanol , thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua
giấy lọc cỡ 0,45 (am, thu được dung dịch thử .
b. Đối với mẫu Hương liên hoàn tự tạo (mẫu M,).
Cân chính xác một lượng bột mẫu Hương liên hoàn tự tạo có chứa khoảng
0,07 g Hoàng liên vào bình nón nút mài 100 ml. Chiết 3 lần, mỗi lần dùng 25 ml
hỗn hợp dung môi methanol-acid hydrocloric (100:1) bằng cách đun hồi lưu trên
cách thuỷ 30 phút. Gộp các dịch chiết, làm bay hơi trên cách thuỷ tới khô. cắn


19

được chiết tiếp bằng nước nóng 5 lần, mỗi lần dùng 15 ml. Lọc và gộp các dịch
chiết, làm bay hơi trên cách thuỷ tới khô. cắn được hoà tan và chuyển vào bình
định mức 50 ml bằng methanol , thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua giấy
lọc cỡ 0,45 |im, thu được dung dịch thử .

Sơ đồ chiết xuất berberỉn và palmatin từ dược liệu Hoàng liên và bột
Hương liên hoàn tự tạo.