Nghiên cứu triển khai kỹ thuật sắc ký định lượng đồng thời acid eicosapentaenoic và acid docosahexaenoic trong một số viên nang mềm

BỘ G IÁO DỤC VÀ ĐÀ O TẠO
TRƯ Ờ NG Đ Ạ I HỌC

BỘ Y TÊ

D ược

HÀ NỘI

đ à o th a n h b ìn h

NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI KỸ THUẬT SẮC KÝ KHÍ
ĐỊNH LƯỢNG Đồ NG THỜI ACID EICOSAPENTAENOIC
vÀ ACID DOCOSAHEXAENOIC TRONG
MỘT SỐ VIÊN NANG Mề M
LUẬN VĂN THẠC s ĩ D ư ợ c HỌC

C huyên ngành: K iểm nghiệm thuốc và Độc chất
M a số : 60 73 15

Người hướng dẫn khoa học:
PG S. TS. Trịnh Văn Lẩu

C
m

ã-í/b^ừv
HÀ N Ộ I - 2 0 0 5

i i

íf


LÒI CẢM ON
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.Trịnh Văn Lâu đã
tận tinh hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt
quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Viện Kiểm nghiệm,
tập thể cán bộ phòng Đông Dược - Viện Kiểm nghiệm, ThS. Phạm
Thị Giảng, ThS. Nguyễn Tuấn Anh, ThS. Nguyễn Đức Toàn đã
quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành nhiệm vụ học
tập và nghiên cứu trong thời gian qua.
Xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu nhà
trường, cảm ơn Phòng Đào tạo Sau đại học và Bộ môn Phân Tích
Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện tốt cho tôi trong thời
gian học tập tại trường.
Tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo

sở Y tế tỉnh

Ninh Binh, Ban lãnh đạo Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm Mỹ
phẩm tỉnh Ninh Bình đã tạo điều kiện cho tôi được học tập nâng
cao kiến thức.
Cuối cùng xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên
khích lệ, giúp đỡ tôi tận tình.
Hà nội, ngày 25 tháng 12 năm 2005.
Đ à o T h a n h B ìn h


MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VlẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG s ố LIỆU
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỂ

1

PHẨN 1: TỔNG QUAN

3

1.1. Tổng quan về acid béo .

3

1.1.1. Đặc điểm cấu trúc, tính chất của acid béo .

3

1.1.2. Tiêu hoá và hấp thu acid béo .

4

1.1.3. Vai trò của acid béo và lipid đối với cơ thể.

5

1.2. Tổng quan về EPA và DHA.

5

1.2.1. Nguồn gốc EPA và DHA.

5

1.2.2. Tính chất, công thức của EPA và DHA.

7

1.2.3. Vai trò của EPA và DHA đối vói cơ thể.

8

1.2.4. Một sô' chế phẩm chứa EPA và DHA.

10

1.3. Cơ sở lý thuyết của sắc ký khí.

13

1.3.1. Các đại lượng đặc trưng cho quá trình sắc ký.

13

1.3.2. Thiết bị sắc ký khí.

16

1.3.3. Phương pháp định lượng và tính kết quả trong sắc ký khí.

16

1.4. Các phương pháp định tính, định lượng acid béo.

18

1.4.1. Sắc ký lóp mỏng.

18

1.4.2. Chuẩn độ acid-base.

18

1.4.3. Ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

18

1.4.4. Quang phổ hồng ngoại (IR).

20

1.4.5. Sắc ký khí (GC).

21

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU.

24


2.1. Đôi tượng nghiên cứu.

24

2.2.1. Dụng cụ.

24

2.2.2. Hoá chất.

24

2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.

25

2.3.1. Lựa chọn kỹ thuật tạo dẫn xuất.

25

2.3.2. Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn.

26

2.3.3. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng EPA, DHA.

26

2.3.4. Thẩm định phương pháp đã xây dựng.

27

2.3.5. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả.

29

PHẨN 3: KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN.

30

3.1. Lựa chọn kỹ thuật tạo dẫn xuất.

30

3.2. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng thời EPA,

30

DHA.
3.2.1. Khảo sát chương trình nhiệt độ của cột.

30

3.2.2. Khảo sát tốc độ dòng khí mang.

35

3.2.3. Khảo sát lựa chọn nội chuẩn thích hợp.

35

3.3. Thẩm định phương pháp đã xây dựng.

39

3.3.1. Định tính EPA và DHA.

39

3.3.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký.

44

3.3.3. Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng.

45

3.3.4. Xác định giới hạn định lượng.

48

3.3.5. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp.

52

3.3.6. Khảo sát độ đúng của phương pháp.

53

3.4. Bàn luận.

55

3.5. Áp dụng phưoỉng pháp đã xây dựng để định lượng EPA và DHA

56

trong một sô viên nang mềm.
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT.

58

TÀI LIỆU THAM KHẢO.

61

PHỤ LỤC


DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
CHD

Bệnh m ạch vành (coronary heart disease)

DHA

A cid docosahexaenoic

ELSD

D etector tán xạ ánh sáng bay hơi (evaporative

light

scattering detection).
EPA

A cid eicosapentaenoic

FID

D etector ion hoá ngọn lửa (flam e ionization detector)

GC

Sắc ký khí (gas chrom atography)

GC-M S

Sắc

ký

khí

khối

phổ

(gas

chorm atography

m ass spectrom eter)
GSC

Sắc ký khí - rắn (gas solid chrom atography)

GLC

Sắc ký khí - lỏng (gas liquid chrom atography)

HD L

L ipoprotein tỷ trọng cao (high density lipoprotein)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (high

perform ance liquid

chrom atography)
LDL

Lipoprotein tỷ trọng thấp (low density lipoprotein)

LOD

Giới hạn phát hiện (lim it of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (lim it o f quantitation)

PU FA

A cid béo không no nhiều nối đôi (polyunsaturated fatty
acids)


DANH MỤC CÁC BẢNG số LIỆU
Ký hiệu
Bảng ỉ . ỉ

Nội dung
Một sô'acid béo trong tự nhiên

Trang
4

Bảng 1.2 Một sô'chê'phẩm viên nang mềm có chứa EPA và DHA.

11

Bảng 3.1

Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống.

45

Bảng 3.2

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của EPA và DHA.

46

Bảng 3.3 Kêt quả khảo sát giới hạn phát hiện.

49

Bảng 3.4 Kết quả xác định RSD(%) của tỷ lệ diện tích píc của EPA và

50

DHA ở giới hạn định lượng.
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp.

53

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp.

54

Bảng 3.7 Một số kết quả định lượng áp dụng phương pháp đã xây dựng.

57


DANH MỤC CÁC HÌNH
Nội dung

Ký hiệu

Trang

Hình 3.1

Đường biểu diễn các chương trình nhiệt độ đã khảo sát.

33

Hình 3.2

Sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp EPA và DHA khdũ sát

33

theo chương trình 1.
Hình 3.3

Sắc ký đồ của mẫu chuẩn hổn hợp EPA và DHA khảo sát

34

theo chương trình 8.
Hình 3.4

Sắc kỷ đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp EPA và DHA khảo sát

34

theo chương trình 9.
Hình 3.5

Sắc ký đồ của mẩu chuẩn hỗn hợp EPA và DHA có nội chuẩn

37

methyl tricosanoic.
Hình 3.6

Sắc ký đồ của mầu nội chuẩn methyl behenate.

37

Hình 3.7

Sắc ký đồ của mẩu chuẩn hỗn hợp EPA và DHA có nội chuẩn

38

methyl behenate.
Hình 3.8

Sắc kỷ đồ của mẫu thử UBB® ALASKA FISH OIL Omega-3

38

có nội chuẩn methyl behenate.
Hình 3.9

Sắc kỷ đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp EPA và DHA.

40

Hình 3.10

Sắc kỷ đồ của mẫu thử viên nang mềm UBB® ALASKA FISH

41

OIL Omega-3.
Hình 3.11

Sắc ký đồ của mẩu chuẩn hỗn hợp EPA và DHA với detector

42

khối p h ổ MS-QP5050A.
Hình 3.12

Sắc kỷ đồ so sánh mảnh phổ của các píc EPA, DHA và

43

methyl behenate với thư viện phổ.
Hình 3.13

Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính của EPA.

47

Hình 3.14

Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính của DHA.

47

Hình 3.15

Sắc ký đồ xác định giới hạn phát hiện của EPA.

51

Hình 3.16

Sắc ký đồ xác định giới hạn phát hiện của DHA.

51

Hình 3.17

Sắc ký đồ khảo sát RSD(%) của EPA và DHA ở giới hạn định

52

lượng.


ĐẶT VÂN ĐỂ
Acid eicosapentaenoic (EPA) và acid docosahexaenoic (DHA) là các
acid béo không no nhiều nối đôi, được biết đến như là chất có tác dụng bảo vệ
tim m ạch và làm giảm nguy cơ phát triển bệnh m ạch vành. Các acid béo này
có tác dụng làm giảm cholesterol và triglycerid trong m áu giúp ngăn ngừa
được các bệnh tim m ạch, bệnh béo phì, DHA còn có vai trò rất quan trọng cấu
tạo nên m ô não, chất xám và võng mạc m ắt [22_.
H iện nay các nhà bào chế đã nghiên cứu và sản xuất ra nhiều chế phẩm
có chứa EPA và D H A trong đó có dạng viên nang m ềm nhằm mục đích ngăn
ngừa bệnh tim m ạch, cao huyết áp, xơ vữa động m ạch, làm bền vững thành
m ạch. Ngoài ra, các sản phẩm này còn có tác dụng bổ não, cung cấp dưỡng
chất cho tế bào chất xám của não, dinh dưỡng mô võng mạc mắt.
Kỹ thuật sắc ký khí đang được sử dụng khá phổ biến để xác định hàm
lượng acid béo trong thực phẩm , dược phẩm vì có ưu điểm là chọn lọc và độ
chính xác cao.
ở Việt N am hiện nay chưa có tài liệu pháp quy nào quy định phương
pháp xác định hàm lượng đồng thời EPA và D H A trong viên nang m ềm
om ega-3. Trong khi đó, các thuốc loại này khi nhập khẩu vào Việt N am tuy có
đưa ra tiêu chuẩn để kiểm tra chất lượng trong hồ sơ đăng ký, nhưng thực tế
việc kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất đưa ra gặp khó khăn. M ặt
khác, hiện nay m ột số công ty dược trong nước đang nghiên cứu sản xuất viên
nang m ềm om ega-3 và đăng ký để luu hành trên thị trường. Vì vậy, cần phải
nghiên cứu m ột phương pháp định lượng EPA và DHA có tính khả thi, cho kết
quả chính xác và độ chọn lọc cao nhằm tăng cưòỉng quản lý chất lượng từ khâu
sản xuất đến lun thông thuốc. X uất phát từ yêu cầu thực tế trên đây, chúng tôi

tiến hành thực hiện đề t à i : “N ghiên cứu triển khai kỹ thuật sắc ký khí định


lượng đồng thời acid eicosapentaenoic (EPA) và acid docosahexaenoic
acid (DH A) trong một sô viên nang m ềm ”.
M ục tiêu của công trình là:
X ảy dựng phư ơng ph á p định tính, định lượng đồng thời EPA và DH A
trong các viên nang m ềm đủ tin cậy, nhanh chóng, thuận tiện, có chọn lọc,
độ chính xác và độ dún g cao. Q ua đó, các cơ sở phân tích và các cơ sở sản
xuất có thể áp dụng để kiểm tra chất lượng loại thuốc này, hay xây dựng tiêu
chuẩn chất lượng sản phẩm.
Để thực hiện được m ục tiêu trên, nội dung của luận văn sẽ gồm có các
phần sau:
+ N ghiên cứu xây dựng chương trình sắc ký thích hợp cho phép tách để
định tính và định lượng hai thành phần EPA và DH A trong viên nang mềm.
+ Thẩm định phương pháp đã xây dụmg.
+ Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng m ột số viên nang
m ềm om ega-3 có chứa hai thành phần hoạt chất trên.


PHẨN 1 : TỔNG QUAN
1.1. T Ổ N G Q U A N VỂ A C ID BÉO .
1.1.1. Đ ặc điểm cấu trúc, tính chất của acid béo.
A cid béo là những m ono carboxylic có số carbon chẩn, hầu hết acid béo
trong tự nhiên đều là sản phẩm thuỷ phân của lipid. Trong m áu, acid béo được
gắn chủ yếu vào album in huyết thanh.
- Chuỗi hydrocarbon của acid béo có từ 4 đến 36 carbon, có thể no hay
không no.
- Danh pháp đơn giản của m ỗi acid béo biểu thị độ dài của chuỗi và số
liên kết đôi. Vị trí của liên kết đôi được biểu hiện bằng số mũ của A (delta).

Vị trí của các liên kết đôi cách đều nhau, thông thường ở
béo có m ột liên kết đôi và thêm A'^,

đối với các acid

đối với các acid béo có nhiều liên kết

đôi. Các liên kết đôi này hầu như không bao giờ liên hợp (-CH=CH-CH=CH-)
m à cách nhau bởi m ột nhóm m ethylen (-CH =CH -CH 2-CH=CH-). Trong tự
nhiên, các liên kết đôi của hầu hết acid béo không no đều có cấu hình cis.
O m ega-3 là danh pháp không chính thức của các acid béo không no nhiều nối
đôi m à vị trí của nối đôi đầu tiên cách nhóm -C H 3 là 3 carbon.
- Tính chất lý học của acid béo phụ thuộc độ dài của chuỗi carbon và
mức độ không bão hoà của acid béo . V í dụ, điểm chảy của acid béo tăng theo
độ dài của chuỗi và giảm theo số liên kết đôi [5], Những acid béo thường gặp
nhất được nêu trong bảng 1 . 1 .


4
B ảng 1.1. M ột s ố acid béo trong tự nhiên.
Công thức

Tên hệ thống

Tén thông thường

CH,(CH2),„C00H

n-Dodecanoic acid

Lauric acid

C H ,(C H 2 ),2C 00H

n-Tetradecanoic acid

Myristic acid

CH ,(CH 2) i4COOH

n-Hexadecanoic acid

Palmitic acid

CH3(CH2) i,C O O H

n-Octadecanoic acid

Stearic acid

CH3(CH2) isC O O H

n-Eicosanoic acid

Arachidic acid

CH3(CH2)22C00H

n-Tetracosanoic acid

Lignoceric

CH,(CH2),CH=CH(CH2)7C00H

Palmitoleic acid

CH,(CH2)7CH=CH(CH2)7C0 0 H

Oleic acid

CH,(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7C0 0 H

a-Linoleic acid

CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)vCOOH

Linolenic acid

CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)3C0 0 H

Arachidonic acid

1.1.2. Tiêu hoá và hấp thu acid béo.
Trong cơ thể, acid béo là m ột thành phần của lipid, thường tồn tại dưới
dạng ester. Khi thuỷ phân giải phóng ngoài alcol và acid béo còn có các thành
phần khác (acid phosphoric, các o se...)- Lipid trong thức ăn hầu hết ở dưới
dạng triglycerid. Triglycerid có acid béo không no và m ạch ngắn dưới 10
carbon dễ tiêu hoá và hấp thu hơn.
Trong m iệng, lipid không bị thay đổi vì trong nước bọt không có enzym
phân giải lipid. Trong dạ dày lipid có thể bị phân huỷ do trong dịch vị có một

lượng nhỏ lipase, trong điều kiện lipid đã được nhũ tương, pH không quá acid,
lipase dạ dày có thể thuỷ phân m ột phần triglycerid. Sự thuỷ phân triglycerid
do enzym lipase đảm nhiệm , lipase do tuyến tuỵ tiết ra, được hoạt hoá bởi acid
m ật, có tác dụng thuỷ phân liên kết ester của acid béo và glycerol trong
triglycerid. Lipase tách các acid béo khỏi triglycerid với tốc độ khác nhau tuỳ
thuộc vị trí acid béo trong phân tử triglycerid.


ở cơ, các acid béo bị oxy hoá để giải phóng năng lượng, ở tổ chức mỡ
các acid béo lại được ester hoá thành triglycerid dự trữ [6 ].
1.1.3. Vai trò của acid béo và lipid đối với cơ thể.
Các acid béo và lipid có vai trò rất quan trọng đối với cơ thể người, acid
béo là m ột trong những thành phần quan trọng cấu tạo nên lipid. Lipid có hai
vai trò chính là cung cấp, dự trữ năng lượng và tham gia cấu tạo tế bào. Khả
năng cung cấp năng lượng của lipid lớn hơn glucid và protid. N ăng lượng giải
phóng do quá trình oxy hoá cho phép tổng hợp ra ATP. M ột gam triglycerid
phân giải đến cùng giải phóng 9,3 Kcal, còn m ột gam glucid hay protid phân
giải chỉ giải phóng 4,1 Kcal.
Lipid dự trữ chủ yếu là triglycerid ở tổ chức m ỡ dưới da. M ô m ỡ đóng
vai trò ngăn nhiệt ở những tổ chức dưới da và xung quanh m ột số cơ quan, còn
các lipid không phân cực lại có tác dụng cách điện cho phép truyền nhanh các
sóng khử cực theo trục sợi thần kinh. Tổ chức thần kinh có hàm lượng lipid rất
cao. Phức hợp lipoprotein là thành phần quan trọng của m àng tế bào và ty thể
ở bào tương, đồng thời cũng là phưoỉng tiện vận chuyển lipid trong máu.
Lipid tham gia cấu tạo tế bào, m àng nhân, m àng các tiểu thể trong tế
bào và có m ặt trong bào tương. D ạng lipid này thường là lipid phức tạp và chủ
yếu là phospholipid và có hàm lượng tương đối ổn định khoảng 10 % trọng
lượng khô của tổ chức. Bình thưòìig, lượng lipid dự trữ có thể cung cấp năng
lượng cho cơ thể hoạt động nhẹ từ 20-35 ngày.
K iến thức hoá sinh về lipid giúp ta hiểu rõ hơn nhiều vấn đề quan trọng

trong lĩnh vực y dược học như hội chứng béo phì, xơ vữa động m ạch cũng như
vai trò của acid béo có nhiều liên kết đôi trong vấn đề dinh dưỡng và chữa
bệnh [5], [6 ],
1.2. T Ổ N G Q U A N VỂ EPA VÀ DHA.
1.2.1. N guồn gốc EPA và DH A.


Dầu cá là nguồn cung cấp trực tiếp hai loại om ega-3 EPA và DHA.
O m ega-3 là những acid béo không no nhiều liên kết đôi (hay còn gọi acid béo
không tạo cholesterol). Nguồn thực phẩm cơ bản có chứa acid béo om ega-3 là
trong các loại cá có chất béo sống ở nơi rất sâu của đại dương như ; cá hổi, cá
trích, cá m òi, cá ngừ, cá thu. Tiền thân của om ega-3 là acid alpha linolenic
(A LA ), đó là acid béo thiết yếu m à cơ thể người không thể tổng hợp được.
A cid

alpha

linolenic

là

nguyên

liệu

thô

để

tổng

hợp

thành

acid

docosahexaenoic (DHA) và acid eicosapentaenoic (EPA) trong khi acid
linoleic là nguyên liệu thô để tổng hợp thành acid arachidonic (AA).
Thành phần của dầu cá, ngoài các acid béo còn có các vitam in A, D và
các nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự sinh trưởng và chuyển hóa của cơ thể
như Phospho, Brom, lo d ... dưới dạng hữu cơ. Kết quả của các nhà nghiên cứu
ở Nga, Mỹ , Pháp đã xác định thành phần của dầu cá chứa các chất béo lỏng
khoảng 70% và chất béo đặc ở nhiệt độ thường khoảng 30%. Các acid béo
thường tồn tại ở dạng glycerid là hỗn hợp - mono, - di, - triesters của acid béo
với glycerol [ 1 ].
Các acid béo thường có trong dầu cá [34]:
Acid palm itic (C | 6H 3402)
A cid stearic (C 18H 36O 2)
A cid oleic (C 18H 34O 2)
A cid alpha-linolenic (Ci8:3n-3)
Acid m orotic (C|g;4n-3)
A cid arachidonic (C 20-4 n - 3 )
A cid eicosatetraenoic (C 2o:4 n - 3 )
A cid eicosapentaenoic (C 2o:5 n - 3 )
Acid heineicosapentaenoic (C 2i:5 n- 3 )
Acid clupanodonic (C 22:5 n- 3 )
Acid docosahexaenoic (C 22:6 n- 3 )

1.2.2. Tính chất, công thức của EPA và DH A.
Hồn hợp om ega-3 có chứa EPA và D H A trong dầu cá là chất lỏng màu
vàng nhạt, hầu như không tan trong nước, rất dễ tan trong aceton và heptan,
hơi tan trong ethanol [34].
I.2 .2 .I. A cid eicosapentaenoic (EPA) [27].
Là acid béo không no có các nối đôi ở các vị trí 5, 8,11, 14, 17.
- Tên khoa học: (all-cỉs) Eicosa - 5,8,11,14,17 - pentaenoic acid
(EPA; C 20: 5n-3)
- Công thức phân tử:

C 20H 30O 2.

- Trọng lượng phân tử: 302,45.
- Chỉ số khúc xạ:

= 1,49865.

- Công thức cấu tạo:

.C O O H

'^CHj

I.2.2.2. Acid docosahexaenoic (D H A ) [27].
Là acid béo không no có các nối đôi ở các vị trí 4, 7, 10, 13, 16, 19.
- Tên khoa học: ịall-cis) D ocosa - 4, 7, 10, 13, 16, 19 - hexaenoic acid
(DHA; C22: 6n-3)
- Công thức phân tử:

Q 2H 32O 2.

- Trọng lượng phân tử; 328,49.
- Chỉ số khúc xạ:

= 1,5017


- Công thức cấu tạo:

1.2.3. Vai trò của EPA và D H A đối với cơ thể.
- V ai trò của EPA v à DH A với bệnh tim mạch: EPA và D H A được
coi là chất bảo vệ tim m ạch (cardio-protective) vì acid béo này có tác dụng
làm giảm cholesterol và triglycerol trong m áu, giúp ngăn ngừa các bệnh về
tim m ạch, nhờ đó làm giảm nguy cơ nhồi m áu cơ tim. Các nghiên cứu chứng
tỏ rằng khi ăn với liều lượng Ig/ngày hỗn hợp chứa EPA và DH A làm giảm
nguy cơ mắc bệnh tim m ạch, cải thiện tình trạng bệnh tật, làm giảm nguy cơ
phát triển bệnh m ạch vành (CHD - coronary heart disease). Tổ chức Y tế thế
giới (W H O) thì khuyên cáo nhu cầu về om ega-3 như sau: nhu cầu ALA từ
0,8g đến l,lg /n g à y , nhu cầu EPA + DH A từ 0,3g đến 0,5g/ngày. Không chỉ
với EPA và D H A m à các acid béo có nhiều dây nối đôi (PUFApolyunsaturated fatty acids) om ega-3 cũng có tác dụng tương tự. Các
eicosanoid có nguồn gốc từ EPA có đặc tính sinh học khác biệt với các
eicosanoid có nguồn gốc từ acid arachidonic (AA) [7], [28],
Khi thử trên lâm sàng các chất này làm giảm rõ rệt các nồng độ
triglycerid và LD L - cholesterol ở huyết tương, đồng thời có sự tăng H D L cholesterol [16]. LDL - cholesterol là lipoprotein tỷ trọng thấp vận chuyển
cholesterol tới m ô và tương tác receptor - LD L trên m àng tế bào. Các hạt LDL
được tế bào thâu tóm , cholesterol được dùng làm nguyên liệu tổng hợp steroid
tham gia thành phần m àng tế bào. Còn H D L - cholesterol là lipoprotein vận


chuyển cholesterol từ tế bào ngoại vi về gan và thải ra ngoài qua đường mật.

N ên trong vữa xơ động m ạch, HDL có vai trò bảo vệ, nghĩa là lượng HDL
càng cao thì nguy cơ vữa xơ động m ạch càng thấp. Hiện nay, cơ chế của tác
dụng làm giảm cholesterol và triglycerol trong m áu chưa hoàn toàn được biết
rõ, rất có thể là do ức ch ế các quá trình tổng hợp L D L - cholesterol [6],[31].
Chính vì vậy EPA và DHA được dùng trong trường hợp ngăn ngừa bệnh
tim m ạch, cao huyết áp, xơ vữa động m ạch, làm bền vững thành m ạch và ức
chế tạo thành m ảng xơ vữa động mạch.
- V ai trò của D H A trong sự phát triển của não bộ: D H A là m ột trong
những thành phần chính cấu tạo nên mô não, chất xám và võng m ạc mắt.
Trong tổ chức não có cấu tạo phần lớn là lipid và hoạt động của não phụ thuộc
phần lớn vào các chức năng thông qua m àng tế bào lipid. DHA chiếm tới 40%
trong lipid của tế bào não và 60% trong lipid của tổ chức võng m ạc, vì vậy
DHA là chất dinh dưỡng đặc biệt trong giai đoạn cuối của thai kỳ, đối với trẻ
đang phát triển và những người có biểu hiện suy giảm chức năng não.
DHA thường dùng cho các trường hợp ngăn ngừa và điều trị các bệnh
liên quan đến việc phá huỷ cấu trúc tế bào não và m ắt như bệnh Alzheim er,
thoái hoá võng m ạc, hiện tượng có đốm trong võng m ạc, chứng rối loạn trí
nhớ, m ất tập trung và sa sút trí tuệ do thoái hoá hoặc do hoạt động trí óc kéo
dài, căng thẳng [7], [22].
- Vai trò của D H A đối với sức khoẻ và sự phát triển của trẻ [7]: Vai
trò của DHA rất cần thiết cho sự phát triển hoàn hảo của hệ thần kinh của trẻ
nhỏ, nếu thiếu DH A trong quá trình phát triển, trẻ sẽ có chỉ số thông minh
(IQ) thấp. Qua nghiên cứu theo dõi trẻ 8-9 tuổi, người ta thấy trẻ được bú sữa
mẹ và chế độ ăn đủ D H A có chỉ số IQ cao hơn 8,3 điểm và tỷ lệ chậm phát
triển hệ thần kinh thấp hơn những trẻ không được bú sữa mẹ.
Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế th ế giới, số lượng DHA cần thiết
cho cơ thể là 35-75 m g/ngày. Các bà mẹ m ang thai và trẻ sơ sinh, trẻ nhỏ rất


10

cần bổ xung DHA, ch ế độ ăn của người mẹ trước và trong khi có thai rất quan
trọng đối với tình trạng dự trữ acid béo không no cần thiết cho trẻ. Đặc biệt
trong 3 tháng cuối, trung bình m ột ngày thai nhi cần 2 ,2 gram các acid béo
không no cho sự phát triển của hệ thần kinh và m ạch m áu. Trẻ sinh non và trẻ
sơ sinh đòi hỏi phải cung cấp đủ DHA, bởi chúng không có khả năng chuyển
tiền tố DHA từ dầu thực vật hay các thức ăn thay thế sữa mẹ khác sang DHA.
- Vai trò của EPA v à D H A đối với bệnh ung thư vú: Theo các tài liệu
[12], [14], [30], [32] thì khoa nghiên cứu bệnh dịch học tiết lộ rằng phụ nữ
N hật Bản, người thường ăn m ột chế độ ăn ít chất béo nhưng với lượng cá
nhiều thì có tỷ lệ ung thư vú thấp hơn so với những phụ nữ ở N am Mỹ và ở
Châu Âu. Những quan sát này đã được chứng tỏ bởi các nghiên cứu rằng, các
acid béo om ega-3 đặc biệt là EPA và DHA, thì có thể ngăn chặn sự tăng
trưởng của các khối u còn các acid béo om ega -6 có trong dầu ngũ cốc, dầu
thực v ậ t... có thể đẩy m ạnh sự tăng trưỏìig của các khối u. Om ega-3 giữ vai
trò bảo vệ chống lại căn bệnh ung thư vú bằng cách ngăn chặn sự phát triển
của các tác nhân có hại.
1.2.4. M ột số ch ế phẩm chứa EPA và DHA.
Các chế phẩm có chứa EPA và D H A được bào chế dưới dạng viên nang
m ềm , trong các ch ế phẩm này ngoài hai thành phần chính là EPA và DHA còn
có thêm thành phần là chất chống oxy hoá như vitam in E...
Theo các tài liệu và khảo sát thực tế của chúng tôi trên thị trường dược
phẩm , hiện nay có nhiều biệt dược m à trong thành phần có chứa EPA và
DHA. M ột số biệt dược đã được nhập khẩu vào Việt Nam và đang lưu hành
trên thị trưòỉng, m ột số ch ế phẩm có chứa EPA và D H A được tổng hợp trong
bảng 1 .2 .


11

B ản g 1.2. M ột sô c h ế phẩm viên nang m ềm có chứa EPA và DH A.
STT
1

2

Tên thuốc và
biêt dươc
UBB® ALASKA
FISH OIL
OMEGA-3
NATURAL
LIFE OMEGA3

Thành phần

Nơi sản xuất

EPA 180 mg

Baxco

DHA 120 mg

Pharmaceutical USA.

Vitamin E 1 UI

SDK: VN- 7533-03

Dầu cá thiên nhiên 1000 mg

Lifetime Health

trong đó:

Product Australia

EPA 180 mg
DHA 120 mg
Vitamin E (D - a - tocoferol) 6
mg

3

POWER
BRAIN

Dầu cá mòi tinh khiết (27%

Deawon pharma Co.

DHA và 5% EPA) 233, 765 mg

Ltd. Korea

Brewer’s yeast

77 mg

Gingko biloba extract 1,75 mg

4

5

DEEP BLUE
NATURAL
ALASKA FISH
OIL
MAXEPA

Egg Lecithin

5,25 mg

Green tea

7 mg

EPA 180 mg

Robinson Pharma

DHA 120 mg

USA.

Vitamin E 6 mg

SDK: VN-6387 - 02

Dầu tự nhiên thịt cá 1000 mg
trong đó:
EPA 180 mg,
DHA 120 mg)
Alpha-tocoferol acetate 2UI.

6

OMEGA-3
FISH OIL

Dầu cá hồi tinh khiết 1000 mg

Công ty cổ phần dược

trong đó:

phẩm OPC

EPA 180 mg
DHA 120 mg


12

Vitamin E 1 UI.
7

OMEGA EPA™

EPA 60 mg
DHA 40 mg
GLA (y-linolenic acid) 15 mg
Vitamin E 15 UI.

8

EPA-DHA
6 : 1™

Dầu cá thiên nhiên 1 g
EPA 500 mg
Vitamin E 10 UI

9

EPA-DHA Extra
Strength®

Dầu cá thiên nhiên 1 g
EPA 300 mg
DHA 200 mg
Vitamin E 10 UI

10

EPA-DHA
Complex®

Dầu cá thiên nhiên 1 g
EPA 180 mg
DHA 120 mg
Vitamin E 9 UI

11

OMEGA-3

EPA 360 mg

Công ty dược vật tư y

DHA 240 mg

tế Phú Yên.

Vitamin E 9 UI
Tá dược vừa đủ
12

NATURAL
DEEP SEA
FISH OIL
OMEGA-3

Dầu cá thiên nhiên 1000 mg

Sirio Pharma Co.,

trong đó:

Ltd. Germany.

EPA 180 mg
DHA 120 mg
Vitamin E 1 UI


13

1.3. C ơ SỞ LÝ T H U Y ẾT CỦA SẮC K Ý KHÍ.
N ăm 1952, bài báo đầu tiên về m áy sắc ký khí được công bố bởi Jam es
và M artin, sau đó kỹ thuật này phát triển trong những năm 60. Từ đó đến nay
kỹ thuật sắc ký khí dần được hoàn thiện và phát triển mạnh.
Sắc ký khí là m ột kỹ thuật tách trong đó pha động là chất khí (khí
m ang) và pha tĩnh chứa trong cột là m ột chất rắn hoặc m ột chất lỏng phủ chất
m ang dạng rắn có tính trơ hoặc m ột lớp film lỏng phủ đều trên thành phía
trong cột. Kỹ thuật sắc ký khí dựa trên cơ chế hấp phụ hoặc phân bố. Tuỳ
thuộc bản chất pha tĩnh chia thành hai loại sắc ký khí: sắc ký khí rắn và sắc ký
khí lỏng [2], [3],
- Sác ký khí - rắn (G SC - G as solid chrom atography): GSC là sắc
ký khí trong đó pha tĩnh là chất hấp phụ rắn. Cơ chế tách là quá trình hấp phụ
và phản hấp phụ của chất phân tích trên pha tĩnh. Quá trình này phụ thuộc vào
áp suất hơi và mức độ tương tác của chất tan và pha tĩnh.
- Sắc ký khí - lỏng (G LC - G as liquid chrom atography): GLC là sắc
ký khí trong đó pha tĩnh là m ột lớp chất lỏng được phủ lên bề m ặt tiểu phân
chất m ang dạng rắn hoặc là m ột lớp film m ỏng được phủ lên thành phía trong
của cột. Cơ chế tách dựa trên sự tương tác hoặc hoà tan khác nhau của chất tan

trong pha tĩnh.
Các chất sau khi ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện là
detector. Tuỳ theo bản chất của chất cần phân tích m à sử dụng detector thích
hợp. Đường cong rửa giải sau m ột qúa trình sắc ký được gọi là sắc ký đồ [3].
1.3.1. Các đại lượng đặc trưng cho quá trình sắc ký.
1.3.1.1. Thời gian lưu (Í r).
Thời gian lưu tp, (phút) là thời gian cần thiết nhất định để m ỗi cấu tử di
chuyển từ nơi tiêm m ẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho píc trên sắc đồ.
Nếu m ỗi phân tử của hỗn hợp có mức độ hấp phụ hoặc hoà tan vào pha tĩnh


14

khác nhau, hay ái lực của m ỗi phân tử với pha tĩnh khác nhau thì thời gian lưu
của chúng sẽ khác nhau [4], [8 ],
to là thời gian lưu của m ột chất không bị lưu giữ, nghĩa là tốc độ di
chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của phân tử khí. Thời gian
lưu Iq còn gọi là thời gian chết.
Thời gian hiệu chỉnh t \ được tính theo công thức:
t

R

~

Thời gian lưu

t ịỊ

^

t g

là thông tin về m ặt định tính của các sắc đồ, nó là một

hằng số đối với m ột cấu tử đã cho khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không
đổi.
1.3.1.2. H ệ sô dung lưọTig (k ’).
Để đặc trưng cho sự rửa giải, tốc độ di chuyển của m ột chất, thuận lợi
hơn người ta dùng hệ số dung lượng k ’. Thường tính k ’ theo công thức:
_

Ị_R_

_

^0

~ ^0

^0

____ ị

_

^0

G iá trị k ’phụ thuộc vào bản chất hoá học của các chất, vào bản chất, số
lượng và diện tích bề m ặt của pha tĩnh, nhiệt độ cột và tốc độ của khí m ang,

mức độ tương tác với pha tĩnh.
T rên thực tế, k ’ nằm trong khoảng từ 1-5 là tốt nhất, các giá trị k ’ lớn
hơn dân đến sự doãng píc, độ nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài, k ’ thấp
tương ứng với chất bị rửa giải ở thời điểm gần với thời điểm bơm m ẫu và do
đó làm giảm khả năng tách [3], [4].
1.3.1.3. T ốc độ di chuyển tỷ đôi hai chất.
H ai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị k ’ khác nhau
và được đánh giá thông qua thừa số chọn lọc hay hệ số chọn lọc a :
( k 2 > k ',)


15

Để tách riêng hai chất, cần có a > 1, thường dùng a trong khoảng 1,05
đến 2,0. Giá trị a càng lớn hai chất càng tách ra khỏi nhau, nhưng với a quá
lớn thời gian phân tích sẽ kéo dài [3 .
I.3 .I.4 . Đĩa lý thuyết [33].
Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết trên cột
(N) và chiều cao của đĩa lý thuyết (H).
- Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức:
N = LL

= 16

ổ.

(0,

= 5,54

íy,0,5

Trong đó;
Ir : thời gian lưu
Wg : chiều rộng píc ở đáy píc.
Wq 5 : chiều rộng píc đo ở nửa chiều cao của đỉnh.
- Chiều cao của đĩa lý thuyết (H) được tính theo công thức:
N

Trong đó:
L: chiều dài cột
N: số đĩa lý thuyết của cột.
I.3 .I.5 . Độ phân giải (R) [8].
Để đặc trưng cho mức độ tách của hai chất trên m ột cột sắc ký người ta
thường sử dụng độ phân giải R giữa 2 píc cạnh nhau. Độ phân giải giữa 2 píc
(píc số 1 và số 2 ) được tính theo công thức sau:
R=
^ 0, 5.1 + ‘^ 0,5.2

Khi:

R = 0,75 hai píc không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.
R = 1,0 hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%.
R = 1,5 hai píc tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%.


16

Độ phân giải phụ thuộc hệ số kj (hệ số dung lượng của cấu tử ra sau),
độ chọn lọc a và số đĩa lý thuyết N của cột thông qua phương trình:

R

=

a -\
a

X -

X-

k'2
1 + Ẩ:2

1.3.2. T hiết bị sắc ký khí.
M áy sắc ký khí bao gồm: N guồn cung cấp khí, buồng tiêm m ẫu, cột,
detector, bộ khuyếch đại, m áy tích phân và xử lý kết quả.
- Khí: K hí m ang là khí tinh khiết có thể là He, H 2, N 2, hay Ar tuỳ thuộc
detector, cột và yêu cầu tách, thực tế thường dùng khí N 2. K hí bổ trợ thường
dùng H 2 và không khí.
-

Cột: Cột có vai trò quan trọng nhất trong phép phân tích sắc ký nói

chung, có nhiều dạng cột tách khác nhau. Người ta chia cột làm hai loại là cột
nhồi và cột m ao quản. Trên thực tế hiện nay, trong phân tích dược phẩm
thường sử dụng cột m ao quản.
- D etector. Là bộ phận phát hiện các chất, có nhiều loại detector khác
nhau, nhưng phổ biến trong phân tích dược phẩm là detector ion hoá ngọn lửa

(Flam e Ionisation D etector - FID). Là m ột trong những detector có độ nhạy
cao, đây là detector không đặc hiệu (phát hiện được tất cả các chất), rất hay
được sử dụng, nhưng detector FID sử dụng thích hợp nhất cho các chất chứa
carbon. Khi sử dụng detector FID cần có khí bổ trợ H 2 và không khí [4], [8 ].
1.3.3. Phương pháp định lượng và tính kêt quả trong sắc ký khí.
1.3.3.1. Phương pháp phần trăm diện tích (chiều cao) pic.
Tính toán hàm lượng chất chưa biết ( Q ) dựa trên diện tích (chiều cao)
píc của nó tính theo phần trăm tổng diện tích của tất cả các píc trên sắc ký đồ.
V í dụ, dùng phương pháp này khi định lượng tinh dầu [4].
1.3.3.2. Phương pháp ngoại chuẩn.


17

Dựa trên cơ sở so sánh mẫu thử và m ẫu chuẩn được phân tích trong
cùng điều kiên . Kết quả được tính toán dựa trên mẫu chuẩn đã biết trước nồng
độ hoặc suy ra từ đường chuẩn [8 ]. N ồng độ chất chưa biết Q được tính theo
công thức:
DT,
X c,
DT,
Trong đó: DT^ và DT^: diện tích (chiều cao) của píc thử và của píc chuẩn.
Q : nồng độ chất chuẩn.
I.3.3.3. Phương pháp nội chuẩn,
Cho thêm vào m ẫu chuẩn và m ẫu thử cùng m ột lượng chất đã biết gọi là
nội chuẩn, chất nội chuẩn được rửa giải gần với cấu tử phân tích. N ồng độ chất
chưa biết Cx được tính toán dựa trên tỷ số giữa diện tích pic (hoặc chiều cao
pic) của chất cần phân tích và nội chuẩn [3], [8 ].
Nồng độ chất chưa biết Q được tính theo công thức:
DT, / DT^c

Cx=

X

Cc

DT(- / DTj^(Trong đó:
DT^ ,DTc và DT^c: diện tích (chiều cao) pic của chất thử, chất chuẩn
và chất nội chuẩn.
Q : nồng độ chất chuẩn
Đ ặc điểm:
Là phương pháp cho kết quả chính xác nhất.
Không đòi hỏi các píc phụ được phát hiện.
Phải tìm được nội chuẩn thích hợp.
Nồng độ m ẫu phải chính xác.
Yêu cầu của chất nội chuẩn:
Không có trong thành phần của m ẫu thử.
Gần giống chất phân tích về mặt hoá học.

t,/é ' 6^


18

N ồng độ tương tự m ẫu thử.
Rửa giải gần cấu tử phân tích.
V

-

On định về sắc ký, độc lập, píc tinh khiết.
1.4. CÁC PH Ư Ơ NG PH Á P Đ ỊN H T ÍN H , Đ ỊN H LƯỢ NG A C ID BÉO .
1.4.1. Sắc ký lớp m ỏng.
Sắc ký lớp m ỏng có thể áp dụng để định tính m ột số acid béo, sử dụng
chất hấp phụ là kỉeselguhr G (TT). Làm ẩm bản m ỏng khô bằng cách đặt trong
bình có lớp dung m ôi dày 5m m là hỗn hợp parafin lỏng - ether dầu hoả (điểm
sôi 50° - 70°) (10 : 90). Chấm riêng biệt lên bản m ỏng 3|il m ỗi dung dịch đã
được chuẩn bị. Sử dụng hỗn hợp nước - acid acetic băng ( 1 : 9 ) làm dung m ôi
khai triển sắc ký và tiến hành triển khai sắc ký khoảng 8 cm tính từ điểm
chấm . Sau khi lấy bản m ỏng ra khỏi bình, làm khô bản m ỏng ở 110°c trong
10 phút, đặt bản m ỏng vào bình hơi iod bão hoà. Sau m ột thời gian, xuất hiện
các vết từ m àu nâu đến nâu vàng. Lấy bản m ỏng ra, để yên trong vài phút cho
đến khi m àu nâu trên nền bản m ỏng biến mất. Phun thuốc thử hồ tinh bột
(TT). Các vết m àu xanh xuất hiện, các vết này có thể chuyển thành m àu nâu
khi để khô và lại chuyển thành m àu xanh sau khi phun nước. Đ ịnh tính các
acid béo dựa vào giá trị Rf [34].
1.4.2. C huẩn độ acid-base.
Phương pháp này xác định lượng acid béo tự do có trong dầu, với chất
chuẩn độ là dung dịch N aO H 0,1N trong m ôi trường alcol được trung tính hoá
bởi N aO H 0,1N với chỉ thị phenolphtalein. Trong quá trình định lượng bình
được giữ trong nước ấm ở nhiệt độ 60 - 6 5 °c và thỉnh thoảng lắc cho đến khi
xuất hiện m àu hồng bền vững ở lớp alcol. Căn cứ lượng N aO H 0,1N đã phản
ứng để tính lượng acid béo tự do có trong dầu. Phương pháp này được áp dụng
để xác định tỷ lệ phần trăm của acid béo tự do trong m ẫu [9].
1.4.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (H PLC ).