KLTN PHÂN LOẠI và ĐỊNH DANH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ
KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC
VẬT Ở VƢỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2003-2007
Sinh viên thực hiện: PHAN TRUNG HẬU

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**************************

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ
KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC
VẬT Ở VƢỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN

Giáo viên hƣớng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

PGS.TS. BÙI VĂN LỆ

PHAN TRUNG HẬU

ThS. KIỀU PHƢƠNG NAM

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các
thầ y cô, các anh chị và các bạn. Em xin gửi lời cảm ơn chân thà nh đế n:
PGS.TS Bùi Văn Lê ̣ , người đã tâ ̣n tin
̀ h hướng dẫn và ta ̣o mo ̣i điề n kiê ̣n để
em thực hiê ̣n khóa luâ ̣n này .
Thạc sĩ Kiều Phương Nam , là người thầy hết lòng tận tụy tuyền đạt những
kinh nghiệm quí báo trong suốt quá trình làm đề tài. Em xin cảm ơn thầy rất nhiều!
Quý thầy cô bộ môn công nghệ sinh học, cùng các thầy cô trường Đại học
Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã chỉ dạy và truyền đạt cho chúng em những
kiến thức quý báu suốt 4 năm học qua.
Em cảm ơn anh Bình cùng toàn thể các

bạn sinh viên năm tư trường ĐH

Khoa ho ̣c Tự nhiên , ĐH Mở luôn sẵn sàng giúp đỡ và đô ̣ng viên tôi những lúc gă ̣p
khó khăn trong đề tài.

Cảm ơn tất cả các thành viên lớp CNSH 29 và các ba ̣n thân đã cùng tôi chia
sẻ những nỗi buồn vui những năm đa ̣i ho ̣c.
Và trên hết , con cảm ơn ba má , và các anh chị đã luôn chăm lo , ủng hộ, tin
tưởng và khích lệ con những lúc khó khăn nhất để con có thể vững bước trên con
đường đã chọn.
Tháng 9/2007
Phan Trung Hậu

iii


TÓM TẮT
Đề tài “Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích
sinh trƣởng thực vật ở vƣờn quốc gia Cát Tiên” được thực hiện tại trại thực
nghiệm sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí
Minh từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007.
Kết quả:
- Phân lập và làm thuần được 75 chủng vi sinh vật từ vườn Quốc Gia Cát
Tiên. Trong đó có 45 chủng trên môi trường chọn lọc MMS (khoáng MS+1%
methanol) và 30 chủng trên môi trường chọn lọc MSo (môi trường MS loại bỏ các
thành phần chứa nitrogen).
- Sàng lọc qua 2 hệ thống (khả năng tác động lên chồi thuốc lá trong điều kiện
in vitro và khả năng kích thích hạt nảy mầm của hạt đậu xanh trong điều kiện in
vivo), chúng tôi chọn lọc được 9 chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh
trưởng trên thực vật bao gồm: 6012a, 6019a, 6019b, 6021a, 6027a, ON16a, ON20a,
ON28a và ON29b.
Kết quả định danh:
Chủng 6012a và 6027a được định danh tới cấp độ giống là vi khuẩn thuộc chi
Methylobacterium. Riêng chủng 6012a có thể là một loài mới.
Các chủng 6019a, 6019b, 6021a, ON16a, ON20a, ON28a, ON29b là nấm men

và có đặc điểm tương đồng với các giống nấm men sau:
- Các chủng 6019b, ON16a, ON20a, ON29b có điểm tương đồng với giống
Pichia.
- Chủng 6019a có điểm tương đồng với giống Cocidiascusc.
- Chủng 6021a có điểm tương đồng với giống Rhodotorula.
- Chủng ON28a có điểm tương đồng với giống Endomycopsis.

iv


MỤC LỤC
CHƢƠNG..................................................................................... ...............TRANG
Trang tựa ................................................................................................................... i
Lời cảm ơn .............................................................................................................. iii
Tóm tắt .................................................................................................................. iv
Mục lục ................................................................................................................... v
Danh sách các chữ viế t tắ t ..................................................................................... viii
Danh sách các hình ................................................................................................. ix
Danh sách các sơ đồ và biểu đồ .............................................................................. xi
Danh sách các bảng ................................................................................................ xii
Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ............................................... Error! Bookmark not defined.
1.1. Đặt vấn đề .......................................................... Error! Bookmark not defined.
1.2. Mục tiêu ............................................................. Error! Bookmark not defined.
1.3. Yêu cầu............................................................... Error! Bookmark not defined.
Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................... Error! Bookmark not defined.
2.1. Vườn Quốc gia Cát Tiên ................................... Error! Bookmark not defined.
2.2. Sơ lược sự tương tác giữa vi sinh vật và thực vật ........... Error! Bookmark not
defined.
2.2.1 Phân nhóm vi sinh vật tương tác với thực vật dựa vào bản chất của sự
tương tác.................................. ....................................................................................7

2.2.1.1. Các vi sinh vật ức chế tác hại của mầm bệnh lên thực vật............ ...... Error!
Bookmark not defined.
2.2.1.2. Vi sinh vật gia tăng dinh dưỡng cho cây ..... Error! Bookmark not defined.
2.2.2. Vi khuẩn sản xuất các chất kích thích lên sự sinh trưởng ở thực vật...... Error!
Bookmark not defined.
2.3. Các phương pháp định danh vi sinh vật ............. Error! Bookmark not defined.
2.3.1. Phương pháp truyền thống .............................. Error! Bookmark not defined.

v


2.3.1. Phương pháp hiện đại ...................................... Error! Bookmark not defined.

vi


Chƣơng 3: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP ........... Error! Bookmark not defined.
3.1. Thời gian và địa điểm......................................... Error! Bookmark not defined.
3.2. Vật liệu ............................................................... Error! Bookmark not defined.
3.2.1. Mẫu thí nghiệm ............................................... Error! Bookmark not defined.
3.2.2. Thiết bị dụng cụ .............................................. Error! Bookmark not defined.
3.2.3. Hóa chất .......................................................... Error! Bookmark not defined.
3.2.3.1. Môi trường phân lập và làm thuần vi sinh vật biến dưỡng methyl
(MMS)……………….. ............................................. Error! Bookmark not defined.
3.2.3.2. Môi trường chọn lọc vi sinh vật cố định nitơ (MSO) . Error! Bookmark not
defined.
3.2.3.3. Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn (CMS) Error! Bookmark not defined.
3.2.3.4. Các môi trường khác .................................... Error! Bookmark not defined.
3.3. Phương pháp thí nghiệm .................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.1. Phân lập và làm thuần ..................................... Error! Bookmark not defined.

3.3.1.1. Lấy mẫu và tăng sinh mẫu: .......................... Error! Bookmark not defined.
3.3.1.2. Phân lập chọn lọc ......................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.1.3. Giữ giống
... ………………………………………………………………….Error! Bookmark
not defined.
3.3.2. Định tính .......................................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.2.1. Khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng kiện in
vitro và in vivo ........................................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.2.2. Xử lý thống kê .............................................. Error! Bookmark not defined.
3.3.2.3. Quan sát hình thái......................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.3. Định danh vi khuẩn ......................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.3.1. Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa .... Error! Bookmark not
defined.
3.3.3.2. Đặc điểm sinh lý........................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.3.3. Đặc điểm sinh hóa ........................................ Error! Bookmark not defined.

vii


3.3.3.4. So sánh tính tương đồng di truyền dựa trên hệ số Jascard ................. Error!
Bookmark not defined.
3.3.3.5. Phân tích trình tự rDNA 16S. ....................... Error! Bookmark not defined.
3.3.4. Định danh nấm men ........................................ Error! Bookmark not defined.
3.3.4.1. Khảo sát các đặc điểm hình thái nấm men ... Error! Bookmark not defined.
3.3.4.2. Xác định một số đặc tính sinh hóa của nấm men ....... Error! Bookmark not
defined.
Chƣơng 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .................. Error! Bookmark not defined.
4.1. Kết quả phân lập và làm thuần ........................... Error! Bookmark not defined.
4.2. Kết quả sàng lọc các chủng có khả năng tương tác với thực vật. .............. Error!
Bookmark not defined.

4.2.1. Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng thực vật của các chủng VSV trong
điều kiện in vitro ....................................................... Error! Bookmark not defined.
4.2.2. Khảo sát khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt giống .... Error! Bookmark
not defined.
4.3. Định danh vi sinh vật ......................................... Error! Bookmark not defined.
4.3.1. Kết quả quan sát hình thái ............................... Error! Bookmark not defined.
4.3.2. Định danh vi vi khuẩn.................................................................................... 59
4.3.2.1. Kết quả khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa......................... 59
4.3.2.2. Phân tích trình tự rDNA 16S .......................................................................70
4.3.3. Định danh nấm men .......................................................................................77
4.3.3.1. Quan sát các đặc điểm hình thái nấm men ..................................................77
4.3.3.2. Các đặc điểm sinh lí, sinh hóa .....................................................................80
Chƣơng 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ....................... Error! Bookmark not defined.2
5.1

Kết luận .................................................... Error! Bookmark not defined.2

5.2

Đề nghị ....................................................... Error! Bookmark not defined.

viii


TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………….. ………….85
PHỤ LỤC

ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Bp

Base pair

EDTA

Ethylene-Diamine-Tetraacetic-Acid

MS

Murashige và Skoog, 1962

CMS

Môi trường bổ sung 2% cao thịt và 2% casein

MMS

môi trường Methanol Minerol Salts

Gram (-)

Gram âm

Gram (+)

Gram dương

PPFM

Pink-Pigment Facultative Methylotrophic

PCR

Polymerase chain reaction

MSo

Môi trường khoáng MS không có nitrogen

DNA

Deoxyribonucleotide Acid

Taq

Tag polymerase

LDC

Lysine decarboxylase

PHB

Poly-beta-hydroxybutyrate

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1: (A) Quá trình chuyển hóa hợp chất 1 carbon ở vi
khuẩn biến dưỡng methyl; (B) Khuẩn lạc Methylobacterium
từ cỏ ba lá trên môi trường phân lập .......................................................................... 6
Hình 2.2: Phổ tương tác cố định đạm trên thực vật ................................................. 10
Hình 2.3: Azospirillum brasilense bề mặt của rễ lúa ............................................... 11
Hình 3.1: Chu trình nhiệt của các phản ứng PCR .................................................... 41
Hình 4.1: Kết quả tương tác của các chủng vi sinh vật lên
chồi thuốc lá sau 2 tuần ............................................................................................. 49
Hình 4.2: Sự hình thành mô sẹo ở chồi thuốc lá khi bổ sung
chủng 6027a .............................................................................................................. 49
Hình 4.3: Kết quả tương tác của 2 chủng vi sinh vật ON16a (A),
ON29b (B) lên chồi thuốc lá ..................................................................................... 52
Hình 4.4: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của chúng
6012a so với đối chứng sau 2 ngày. .......................................................................... 55
Hình 4.5: Kết quả khảo sát khả năng kích hạt nảy mầm của chủng
ON20a so với đối chứng. .......................................................................................... 57
Hình 4.6: Hình thái tế bào qua kính hiển vi vật kính 100X. ..................................... 60
Hình 4.7: Khảo sát ngưỡng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn
6012a và vi khuẩn 6027a........................................................................................... 63
Hình 4.8: Kết quả thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR của hai chủng
vi khuẩn. .................................................................................................................... 66
Hình 4.9: Kết khảo sát khả năng cố định nitơ của hai chủng 6012a
và 6027a. ................................................................................................................... 67
Hình 4.10: Kết quả định tính PHB của chủng 6012a dưới kính hiển
vi huỳnh quang bươc sóng 460nm. ............................................................................. 68
Hình 4.11: DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn...................................................... 71

ix

Hình 4.12: Sản phẩm PCR với cặp mồi (2F, 2R)...................................................... 72
Hình 4.13: Sản phẩm PCR với cặp mồi (27F, 1525R).............................................. 73
Hình 4.14: Sản phẩm PCR với cặp mồi (520F, 920R).............................................. 74
Hình 4.15: Mối quan hệ phát sinh loài của chủng 6012a với tất cả
các chủng chuẩn của các loài Methylobacterium đã và sẽ công
bố trong năm 2007 dựa trên trình tự rDNA 16S nguyên vẹn ................................... 76

x


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ
TRANG
Sơ đồ 3.1: Quy trình thí nghiệm ............................................................................ 24
Biểu đồ 4.1: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên
chiều cao và chiều dài rễ cây thuốc lá trên môi trường MS ................................... 47
Biểu đồ 4.2: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên trọng
lượng tươi và trọng lượng khô cây thuốc lá trên môi trường MS .......................... 48
Biểu đồ 4.3: So sánh ảnh hưởng của vi sinh vật lên chiều cao và
chiều dài rễ cây thuốc lá trên môi trường MSo ..................................................... 51
Biểu đồ 4.4: So sánh ảnh hưởng của vi sinh vật lên trọng lượng tươi và
trọng lượng khô cây thuốc lá trên môi trường MSo .............................................. 51
Đồ thị 4.1: Đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610nm và
mật độ tế bào .......................................................................................................... 61
Đồ thị 4.2: Đường cong tăng trưởng của 2 chủng vi khuẩn phân lập được ........... 61
Biểu đồ 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của hai
chủng vi khuẩn trên môi trường dịch thể CMS sau 3 ngày nuôi cấy ..................... 62
Biểu đồ 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của hai chủng vi
khuẩn trên môi trường dịch thể CMS sau 3 ngày nuôi cấy .................................... 62

xi


DANH MỤC CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả trong bộ thử nghiệm
sinh hóa IDS 14GNR ............................................................................................... 37
Bảng 4.1: Khảo sát khả năng tương tác thực vật của các chủng vi sinh
vật biến dưỡng methyl trên môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962) ............... 47
Bảng 4.2: Kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng của các chủng
vi sinh vật trên chồi thuốc lá nuôi cấy in vitro trong môi trường MSo .................... 50
Bảng 4.3: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của các chủng
vi sinh vật biến dưỡng methyl ................................................................................... 53
Bảng 4.4: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của các
chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường MSo...................................................... 55
Bảng 4.5: Bảng thống kê các đặc điểm hình thái của các chủng
vi sinh vật có khả năng tương tác với thực vật ......................................................... 58
Bảng 4.6: Các đặc điểm hình thái cơ bản của 2 chủng vi khuẩn ............................. 60
Bảng 4.7: Đặc điểm biến dưỡng carbon của hai chủng 6012a và 6027a .................. 64
Bảng 4.8: Bảng kết quả thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR và
hoạt tính Catalase……………………………………………………………………66
Bảng 4.9: Bảng tổng kết các đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa
của 2 chủng vi khuẩn................................................................................................. 69
Bảng 4.10: Nồng độ và độ tinh sạch DNA bộ gen của chủng
phân lập được ghi nhận qua máy đo Nanodrop ........................................................ 71
Bảng 4.11: Hệ số tương đồng di truyến của chủng 6012a với các loài
Methylobacterium sp. đã được công bố .................................................................... 75
Bảng 4.11: Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men .......................................... 78
Bảng 4.12: Khả năng lên men đường glucose .......................................................... 80

Bảng 4.13: Khả năng đồng hóa nguồn carbon và đồng hóa nitrat ............................ 80

xii


1

Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1
1.1 Đặt vấn đề
Từ xưa đến nay, năng suất cây trồng luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của
mọi nền nông nghiệp. Do đó đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng nhằm cải
thiện năng suất cũng như tăng cường sức đề kháng của cây trồng với mầm bệnh
trong đó phổ biến nhất là sử dụng thuốc trừ sâu và phân bón hoá học. Tuy nhiên các
biện pháp này còn rất nhiều hạn chế như: gây ô nhiễm môi trường, thoái hoá đất và
ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ con người. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ
thuật, các biện pháp và xu hướng mới đã ra đời với mục tiêu xây dựng một nền
nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường mà vẫn đạt năng suất cao. Bên
cạnh đó, gần đây nhiều công bố khoa học cho thấy tiềm năng sử dụng tương tác có
lợi giữa vi sinh vật với cây trồng để kích thích sinh trưởng ở thực vật, trong đó các
vi sinh vật có khả năng cố định nitrogen và biến dưỡng methyl đang thu hút được
rất nhiều sự quan tâm.
Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng vi sinh vật này được
biết đến thông qua cơ chế cố định đạm hoặc sự sản sinh các hợp chất sinh học như
các phytohormone, vitamin và cả một số loại enzyme có khả năng ức chế sự phát
triển của mầm bệnh qua đó kích thích sinh trưởng của cây chủ. Chính bởi những ưu
điểm này mà việc tìm ra các chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng
thực vật đang là một hướng đi đầy tiềm năng. Đặc biệt trong điều kiện nước ta là
một trong những quốc gia có đa dạng sinh học phong phú với các khu bảo tồn thiên

nhiên còn hoang dã, thì tiềm năng tìm thấy các chủng vi sinh vật có ích trên là rất
lớn.


2
Trên những cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài:
“ Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sinh
trƣởng thực vật ở vƣờn Quốc gia Cát Tiên”.
1.2 Mục tiêu
 Phân lập và tuyển chọn những vi sinh vật có đặc tính tương tác thực vật để
ứng dụng trong nông nghiệp.
 Định danh để tìm kiếm các loài mới.
1.3 Yêu cầu
 Phân lập và làm thuần được một số chủng vi sinh vật có khả năng biến
dưỡng methyl và cố định nitrogen ở vườn Quốc gia Cát Tiên.
 Khảo sát để chọn lọc những vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật từ
những chủng phân lập được.
 Bước đầu định danh các chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng
thực vật dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và sinh học phân
tử.


3

Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2
2.1 Vƣờn Quốc gia Cát Tiên [23]
Vườn Quốc gia Cát Tiên (VQGCT) nằm trên vùng chuyển tiếp từ cao nguyên
xuống đồng bằng qua địa phận ba tỉnh: huyện Cát Tiên, Bảo Lâm (tỉnh Lâm Đồng);

Bù Đăng (tỉnh Bình Phước); Vĩnh Cửu, Tân Phú (tỉnh Đồng Nai). Chính vì thế
vườn có nhiều dạng địa hình: từ núi cao, sườn dốc, đồi nhấp nhô cho đến thềm sông
bằng phẳng, nhiều thác ghềnh, suối lớn và những vùng đầm lầy ngập nước. VQGCT
cách thành phố Hồ Chí Minh 150km với tổng diện tích là 73878 ha, tài nguyên
thiên nhiên phong phú, đa dạng và là một trong những Vườn Quốc gia lớn nhất Việt
Nam.
 Hệ thực vật
Vườn Quốc gia Các Tiên có nhiều dạng sinh cảnh: rừng nguyên sinh và thứ
sinh trên đất thấp ưu thế bởi các loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae); rừng nửa
rụng lá nguyên sinh và thứ sinh trên đất thấp ưu thế bởi các loài Lagertroemia sp.
đất ngập nước ngọt và trảng cỏ ngập nước theo mùa ưu thế bởi các loài Saccharum
sp. rừng ngập lụt ưu thế bởi các loài Hydrocarpus sp. xen lẫn Ficus benjamina và
các kiểu sinh cảnh thứ sinh như rừng tre nứa, trảng cỏ... Hệ thực vật đã ghi nhận
1362 loài thực vật bậc cao có mạch, trong số đó có 34 loài có tên trong "Sách Đỏ"
Việt Nam và nhiều loài cây gỗ có giá trị như gõ đỏ, xoay, cẩm lai, giáng hương quả
to
 Hệ động vật


4
Theo thống ghi nhận 77 loài thú, 318 loài chim, 58 loài bò sát, 26 loài ếch
nhái, 130 loài cá. Trong số đó có các loài thú lớn quý hiếm và một số loài có nguy
cơ đe doạ tuyệt chủng toàn cầu như tê giác Java, bò tót, voi Châu Á, cá sấu nước
ngọt (Crocodylus siamensis); một số loài chim đặc hữu như gà so cổ hung
(Arborophila davidi), gà tiền mặt vàng (Polyplectron germani), một số loài chim
nước quý hiếm như quắm cánh xanh (Pseudibis davisoni), ngan cánh trắng (Cairina
scutulata), già đẫy nhỏ (Leptoptilos javanicus). Đối tượng bảo tồn là rừng cây họ
Dầu, các hệ sinh thái đặc thù, các loài tê giác, cá sấu, bò tót, các loài chim đặc hữu.
VQGCT thực sự là kho bách khoa toàn thư sống cho công tác nghiên cứu thế giới tự
nhiên

2.2 Sơ lƣợc sự tƣơng tác giữa vi sinh vật và thực vật
Các vi khuẩn tương tác với thực vật rất đa dạng về giống loài và cơ chế tương
tác với thực vật. Những vi khuẩn này là một bộ phận quan trọng trong quá trình
phát triển của thực vật. Mặc dù các nghiên cứu về vi khuẩn tương tác thực vật chủ
yếu tập trung vào các vi sinh vật gây bệnh trên thực vật và các vi sinh vật cố định
nitơ. Tuy nhiên, mối quan tâm về sự đa dạng của các vi sinh vật kích thích sinh
trưởng thực vật đã và đang gia tăng. Và thực tế trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh
vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật, nhưng chúng chỉ chiếm một tỷ lệ
nhỏ trong quần thể vi sinh vật. Những vi sinh vật này có vai trò quan trọng trong
nông nghiệp hay môi trường. Những tiến bộ kỹ thuật trong sinh thái và di truyền vi
sinh vật đã và đang phát hiện ra nhiều loài vi sinh vật có ích, có tác động tích cực
lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Đồng thời cũng làm sáng tỏ các cơ chế
tương tác giữa thực vật và vi sinh vật, làm nền tảng cho việc ứng dụng các vi sinh
này vào cuộc sống [18].
Các vi sinh vật tương tác với thực vật không chỉ bao gồm các vi sinh vật tiền
nhân (Prokaryote) mà nó còn cả các vi sinh vật nhân thực (Eukaryote):
+ Prokaryote là thành phần chiếm đa số của hầu hết các quần thể vi sinh vật
trong thực vật. Các prokaryote này, thường là vi khuẩn có thể hiện diện với mật độ


5
lên tới 109 tế bào trên 1 gram mô rễ. Nếu nuôi cấy chúng trên môi trường chọn lọc
có thể đạt 1010 tế bào trên 1 gram sinh khối thực vật [18].
+ Eukaryote bao gồm nấm sợi, nấm men, tảo, protozoa và các tuyến trùng
thường tập trung với mật độ thấp hơn các prokaryote. Một thí dụ rõ ràng là các vi
sinh vật cộng sinh trên rễ có thể đạt lượng tế bào trên 1 gram mô rễ là: 10 6-109 tế
bào vi khuẩn, 107 xạ khuẩn, 105-106 tế bào nấm men, 103 đối với tảo, 102-103 đối
với protozoa. Bacteriophage và các loại virus cũng là thành viên của quần thể này,
chúng có thể tìm thấy trong đất với mật độ 108-109 tế bào trên một gram đất [6].
Vi sinh vật tương tác thực vật có thể phân nhóm dựa vào nơi cư trú, và bản

chất tác động của chúng lên thực vật.
Phân nhóm dựa vào nơi cư trú bao gồm
Các vi sinh vật biểu sinh (epiphyte): bao gồm các vsv cộng sinh ở vùng rễ
(Rhizosphere) và vsv cộng sinh trên bề mặt lá (Phyllosphere). Phần lớn các vi sinh
vật biểu sinh tương tác thực vật sống bằng các chất dinh dưỡng thoát ra trên bề mặt
cây. Ví dụ vùng rễ thường tiết ra nhựa keo (dịch nhày) chứa: Hydrat
polysaccharide, acid hữu cơ, vitamin, và amino acid, đó là điều kiện tối ưu đối với
một giá thể mà vi sinh vật cần cho sự sinh trưởng và phát triển. Nhựa keo được bao
bọc bởi nước, và như thế giúp làm môi trường thủy giải tốt đối với rễ và vi sinh vật
vùng rễ phát triển [16].
Ở vùng lá, nguồn thức ăn cho các vi sinh vật là dịch lá tiết ra. Trong nhóm vi
sinh vật vùng lá thì vi khuẩn biến dưỡng methyl tùy ý (Pink-pigmented facultatively
methylotrophic, PPFM) chiếm tỉ lệ lớn và nó được phân bố trên nhiều loại cây.
[14]. Chúng sử dụng nguồn carbon là nguồn methanol do cây tiết ra từ quá trình
phân hủy các pectin có methyl. Nhờ khả năng sử dụng nguồn thức ăn khác thường
này, PPFM có thể loại bỏ các chất độc này khỏi mô thực vật, và có chỗ cư ngụ trên
lá. Các PPFM sử dụng nguồn carbon, và các khoáng chất từ cây chủ, đồng thời
tham gia vào các quá trình sinh hóa chuyển hóa quan trọng của cây chủ [19] (Hình
2.1).


6
Đa số các vi sinh vật này không làm thay đối sự sinh trưởng và sinh lý của cây. Do
đó, phần lớn vi sinh vật tương tác thực vật có một tương tác hội sinh
(commensalisti) với cây chủ.

Hình 2.1: (A) Quá trình chuyển hóa hợp chất 1 carbon ở vi sinh vật biến dưỡng
methyl
(B) Khuẩn lạc Methylobacterium từ cỏ ba lá trên môi trường phân lập [20]
Các vi sinh vật nội sinh (endophytic)

Các vi sinh vật nội sinh (endophytic) là các vi sinh vật sống bên trong mô thực
vật sống và không gây hại tới cây chủ. Chúng được phân lập từ bề mặt mô hay chiết
xuất từ mô thực vật. Mặc dù, các loại nấm endophytic đã được nghiên cứu rộng rãi
trong khi các vi khuẩn endophytic thì chưa, các vi khuẩn này vẫn thu hút được sự
quan tâm nhờ vào tiềm năng sử dụng của chúng trong nông nghiệp.
Các vsv nội sinh được phân lập từ nhiều loại mô và cây khỏe mạnh.
Kobayashi và Palumbo (2000) đã biên soạn một danh sách 55 giống và 144 loài
endophytic phân lập từ rễ, thân, hoa, hạt, quả của nhiều loài thực vật [14].


7
2.2.1 Phân nhóm vi sinh vật tƣơng tác với thực vật dựa vào bản chất của sự
tƣơng tác [16]
Theo bản chất của sự tương tác thì các vi sinh vật tương tác được chia làm 2
nhóm: nhóm vi sinh vật có lợi cho thực vật và nhóm vi sinh vật gây bất lợi cho thực
vật.
Các vi sinh có lợi chiếm ưu thế là các vi sinh vật kích thích sự sinh ở thực vật
sinh trưởng. Việc tìm hiểu và xác định các cơ chế này rất khó khăn do sự đa dạng
của các cơ chế. Đối với các vi sinh vật cố định đạm, sự kích thích sinh trưởng chỉ
thấy rõ khi cây sống trên vùng đất nghèo đạm. Đến nay khả năng kích thích sinh
trưởng thực vật đến nay được hiểu theo 4 con đường chính
- Gia tăng lượng các chất dinh dưỡng ở dạng dễ sử dụng cho cây
- Sản xuất các phytohormone kích thích sinh trưởng thực vật
- Tăng cường ảnh hưởng có lợi của các tương tác cộng sinh
- Giảm tác động có hại của các mầm bệnh.
2.2.1.1 Các vi sinh vật ức chế tác hại của mầm bệnh lên thực vật: thường được
tìm thấy ở các vi sinh vật nội sinh. Các vi sinh vật nội sinh bảo vệ cây khỏi sự tấn
công của các mầm bệnh bằng các cơ chế sau:
Cạnh tranh về nơi ở và dinh dƣỡng
Các endophyte thuộc nhóm này có khả năng sinh sản rất nhanh chóng, chúng

vượt qua số lượng các mầm bệnh trong cây và ức chế sự sinh sản cũng như dinh
dưỡng của mầm bệnh. Ví dụ điển hình trong trường hợp này là một số loại nấm
men. Sự sinh sản bằng cách nảy chồi khiến nấm men nhân lên số lượng một cách
nhanh chóng và khiến sự nảy mầm của các bào tử B. cinerea hoàn toàn bị ức chế.
Sự tổng hợp các loại hợp chất thứ cấp
Trong nhiều nghiên cứu người ta nhận thấy các vi sinh vật nội có sự sản sinh
ra các loại hợp chất thứ cấp có hoạt tính của kháng sinh do đó chúng có khả năng ức
chế và tiêu diệt một số loại nấm bệnh.
Như trường hợp của 2 loại kháng sinh tự nhiên do Sporothrix floccolosa sản
xuất ra là: heptadeceonic và methyl-hepadecenoic acid có khả năng kháng khuẩn và


8
kháng một số loại nấm như: B. cinerea, Fusarium oxysporum sp. Urquhart và Punja
(2002) cũng đã tinh chế một ester acid béo với hoạt tính kháng nấm từ Tilletiopsis
pallescens.
Enzyme phân hủy vách tế bào [16]
Nhiề u nghiên cứu cho thấ y , các vi sinh vật tương tác thực vật có khả năng sản
sinh ra các loa ̣i enzyme phân hủy thành lysis của tế bào các loa ̣i mầ m bê ̣nh như

:

enzyme chitinase, β-1,3-glucanase...
Mô ̣t số loa ̣i nấ m men như Pichia anomala, P. membranifaciens,R. glutinis, C.
laurentii, A. pullulans, Tilletiopsis albescens, tạo β-1,3-glucanase chố ng la ̣i các loa ̣i
nấ m gây bê ̣nh trên lá và trên quả như : A. niger, Sphaerotheca fuliginea, P. xanthii
(Urquhart, 1994; Castoria, 1997; Jijakli và Lepoivre 1998; Castoria và cô ̣ng sự ,
2001; Masih và Paul 2002). Trong công trình của Madhaiyan và cộng sự (2004)
cũng đã chứng tỏ mối tương quan giữa khả năng kháng bệnh của cây lúa khi xử lý
với vi khuẩn Methylobactreium sp. và sự gia tăng polyphenol oxidase trong cây

[16].
Kích thích phản ứng phòng vệ ở cây chủ
Sự cảm ứng

này liên quan đế n viê ̣c sản xuấ t mô ̣t số hơ ̣p chấ t như

phenylalanine ammonia lyase phytoalexin, peroxidase và ethylene trong mô tế vào
thực vâ ̣t.
2.2.1.2 Vi sinh vật gia tăng dinh dƣỡng cho cây [16]
Khả năng cố định nitơ (biến đổi nitơ thành amonia) chủ yếu giới hạn trong giới
prokaryotes nhưng đa dạng giữa các giống vi khuẩn. Nằm trong số gần 100 loại cố
định nitơ (diazotrophic), chỉ có một vài loại có tính chuyên biệt cao, các tương tác
mật thiết có thể tạo một cơ quan mới hay một cơ quan có cấu trúc giống với cơ quan
của cây chủ. Tương tác đạt cực đại khi chúng chuyển sang cố định nitơ cho cây chủ,
theo đó cung cấp một lượng dinh dưỡng cho cây chủ. Ngược lại cây chủ cũng giúp
bảo vệ vi khuẩn khỏi điều kiện môi trường và cung cấp các hợp chất giàu năng
lượng cho hoạt động cố định nitơ. Các vi sinh vật cố định đạm bao gồm vi khuẩn
cộng sinh trên cây họ đậu, các vi sinh vật tự do cố định đạm, các vi khuẩn lam…


9
 Vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đậu
Nghiên cứu điển hình nhất về tương tác cộng sinh giữa vi khuẩn và thực vật là
tương tác giữa vi khuẩn tạo nốt sần trên rễ và các cây họ đậu. Các cây thuộc họ này
bao gồm: đậu hòa lan, đậu nành, đậu lăng và cỏ linh lăng cũng như các loại cỏ trinh
nữ, cây keo…
Ngày nay, các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn cộng sinh được phân loại thành
vài giống, và các loài chuyên biệt nhất thuộc giống Rhizobium, Sinorhizobiu,
Mesorhizobium, Bradyrhizobium.
Hầu hết các vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đậu đều tạo ra nốt sần trên rễ (các

nốt sần này là những tín hiệu cho thấy có sự tương tác giữa vi khuẩn và cây trồng).
Và trong sự đáp ứng này, có sự sản xuất các phân tử tín hiệu
lipochitooligosaccharide thường được gọi là các nhân tố Nod. Các nhân tố Nod
khiến các sợi rễ xoắn lại, hạn chế sự thủy phân của thành tế bào bên trong các nốt
xoắn, sự lõm vào của màng plasma, sự lắng đọng của vật liệu tạo vách tế bào mới
tạo ra dòng xâm nhiễm. Chúng giữ vai trò như một đường ngõ đi vào mô cây. Vi
khuẩn phân chia bên trong các dòng này khi chúng phát triển xuyên qua nhiều lớp
vỏ tế bào trong rễ. Một số loài vi khuẩn cộng sinh cây họ đậu khác lại xâm nhập vào
cây thông qua các lỗ hổng ở biểu bì và di chuyển xuống vùng gian bào của rễ, có
hoặc không có sự hình thành các dòng xâm nhiễm.
Ở một vài loài cây chủ như là cỏ linh lăng và đậu hà lan, vi khuẩn gây ra sự
phân chia trực phân bên trong vỏ tế bào và gây nên các nốt sần bất định (các nốt sần
này tiếp tục kéo dài phụ thuộc vào sự liên tục của mô phân sinh ở đỉnh); ở các cây
chủ khác như đậu nành, vi khuẩn gây ra sự phân chia trực phân của vùng bên ngoài
lớp vỏ tế bào và dẫn đến sự hình thành nốt sần bất định. Ở hai trong số 3 phân họ
cây họ đậu (Mimosoideae và Papilionoideae), vi khuẩn di chuyển từ dòng xâm
nhiễm vào trong tế bào chất của tế bào cây chủ bằng cơ chế nhập bào (endocytosis).
Nó cho phép vi khuẩn được bao bọc bởi màng tế bào thực vật. Các vi khuẩn ở trong
vùng gian bào và nội bào này được gọi là các bacteroid, phân chia cho đến khi
chúng chiếm đầy tế bào cây chủ và phân hóa thành dạng giàu nitrogenase, enzyme


10
quan trọng để cố định nitơ. Trong phân họ Caesalpinoideae, các vi khuẩn không rời
khỏi trong dòng xâm nhiễm thay vào đó, các dòng xâm nhiễm phân nhánh cho đến
khi nó chiếm đầy tế bào chủ. Sự cố định nitơ chỉ xảy ra khi nồng độ oxi tự do trong
nốt sần đủ thấp để cho phép kích hoạt enzyme nitrogenase. Protein liên kết oxy
leghemoglobin ở thực vật (có chức năng liên quan tới hemoglobin, giữ vai trò làm
giảm lượng oxy khi xử dụng oxy để hô hấp).
Ngoài ra còn có các các sinh vật nội bào cố định đạm không hình thành nốt

sần (diazotrophic endophyte) đã được phân lập từ một số loại cây thân thảo như:
bắp, lúa, mía đường, lúa mì…ví dụ điển hình về vi khuẩn nội bào cố định đạm là
Gluconacetobacter diazotrophicus (trước đây là Acetobacter diazotrophicus),
Herbaspirillum spp ở cây mía, Alcaligenes, Azospirillum, Bacillus, Enterobacter, ,
Klebsiella, Pseudomonas và Rhizobium trên lúa và bắp (James, 2000). Khi chủng
các loại vi khuẩn nay lên rễ, chúng sẽ xâm nhiễm vào rễ và nhiều khi là vào hệ
thống mô mạch tạo thành các quần thể vi sinh vật trong vùng gian bào và có thể đạt
nồng độ 101- 107 tế bào trên 1 gram trọng lượng tươi [16].
 Vi sinh vật tự do cố định nitơ
Đây là các loại vi khuẩn tương tác thực vật cố định đạm nhưng không xâm
nhập vào một loại cây chủ theo hướng cộng sinh chuyên biệt.
1. Vi sinh vật cộng sinh cƣ trú ở vùng gian bào
(Endosymbionts)
Ví dụ: vi khuẩn cộng sinh gây nốt sần trên rễ cây họ đậu
2. Vi sinh vật cƣ trú ở vùng ngoại bào
Sự gia
tăng độ
mật
thiết của
các
tƣơng
tác

(Ectosymbionts)
Ví dụ: tương tác giữa vi khuẩn lam và một số loài thực vật
bậc thấp
3. Vi sinh vật bên trong mô cây chủ (Endophytes)
Ví dụ: Herbaspirillum sp. ở cây mía đường
4. Vi sinh vật chỉ sống trên bề mặt cây
Ví dụ: Azospirillum và Klebsiella

Hình 2.2: Phổ tương tác cố định
đạm trên thực vật [16].


11
Hầu hết các prokaryote cố định nitrogene sống trạng thái tự do. Sự cố định
nitrogen ở vùng rễ phổ biến hơn do việc cố định nitrogen cần năng lượng lớn, và
vùng rễ cây là vùng giàu carbohydrate.
Các loài Azospirillum là những loài cố định nitrogen đầu tiên được phân lập từ
rễ cây và nó có các đặc tính tốt nhất của các loài sinh vật cố định đạm tương tác
thực vật. Không giống các sinh vật nội sinh cố định đạm như Gluconacetobacter
diazotrophicus và Herbaspirillum sp. (nội sinh bắt buộc), Azospirillum sp. là nhóm
nội sinh không bắt buộc. Chúng vừa sống được cả nội sinh và trên vùng rễ.

Hình 2.3. Azospirillum brasilense bề mặt
của rễ lúa [20]

Bên cạnh nitrogen thì phosphate là loại dinh dưỡng khoáng thứ hai ảnh hưởng
nhiều lên sinh trưởng của cây. Lượng phosphate trong đất rất dồi dào nhưng phần
lớn đều ở dạng chưa hòa tan. Nhiều loài vi sinh vật rễ có thể hòa tan các phosphate
vô cơ bằng cách tiết ra các acid hữu cơ, như gluconic acid và 2-ketogluconic acid,
hay có thể khoáng hóa phosphate vô cơ bằng cách tiết enzyme ngoại bào
phosphatases. Một số loài vi khuẩn khác sản xuất các hợp chất hữu cơ (gọi là
siderophore) các chất này kết hợp với Fe3+, khiến nó dễ chuyển đổi thành dạng dễ
sử dụng hơn (Fe2+) [16].