KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT DNA

KỸ THUẬT
TÁCH CHIẾT
DNA


NHÓM 1:
- Huỳnh Lộc Nhung
- Nguyễn Thị Huyền Trang
- Nguyễn Thị Phương
Oanh


P1: Giới thiệu về kỹ thuật, nguyên tắc tiến hành
1. Giới thiệu về kĩ
thuật.
-DNA
(
Acid
Deoxyribose Nucleic)
là một đại phân tử
được cấu thành từ các
đơn phân là nucleotid.


Trong cơ thể , tất cả các tế bào
có nhân đều chứa phân tử
DNA. Phân tử này này mang
toàn bộ thông tin di truyền của
cá thể
Nguồn thông tin di truyền đó được ổn định nhờ hoat động tự sao chép
của DNA theo nguyên tắc “bán bảo tồn”.

 Thông qua hoạt động của các bộ máy tế bào , nguồn thông tin này được
chuyển :
DNA

mRNA

Protein


Sinh học phân tử đã phát triển các kĩ thuật di truyền trên DNA
vào nghiên cứu và chẩn đoán một số bệnh. Để thực hiện kĩ
thuật này đòi hỏi phải có nguồn nguyên liệu DNA đảm bảo cả
về chất và lượng.

Tách chiết DNA là khâu đầu tiên , cơ
bản và rất quan trọng trong các qui trình
thao tác DNA.


MỤC ĐÍCH
Tìm ra một số kĩ thuật phù hợp nhất với
các tiêu chuẩn về: chất lượng DNA , hàm
lượng DNA, thời gian tiến hành, chi phí
thực hiện và mức độ độc hại đói với người
thực hiện.


2. Nguyên lý của kĩ thuật tách chiết
DNA

Tách chiết DNA là kĩ thuật cơ bản trong
hầu hết các phòng thí nghiệm phân tử, di
truyền và sinh học nói chung.
 Phân tử DNA sau tách chiết cần đảm bảo
được số lượng và chất lượng để đáp ứng
được các phân thức sau đó.


Hiện nay trên thị
trường có sẵn rất nhiều
bộ kít tách chiết DNA
khá tiện dụng:


- Việc nắm rõ nguyên lí tách chiết DNA là khá qua trọng để
giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cách thưc hoạt động của bộ kit,
giải quyết vấn đề khi có việc xảy ra.
- Cho đến nay đã có rất nhiều quy trình tách chiết DNA được
đưa ra và báo cáo thành công bởi các nhà nghiên cứu. Đới với
mỗi loại mô, tế bào quy trình tách chiết sẽ có thể khác nhau.


Nguyên lí tách chiết DNA từ tế bào vẫn gồm các bước cơ bản sau:
• Bước 1: phá vỡ nguyên liệu ban đầu( tề bào, mô) để mở tế bào và giải phóng acid
nucleic ( DNA và RNA ) ( nghiền trong nito lỏng và hòa trong đêm chiết)
• Bước 2: bổ sung các chất chống các chất hoạt hóa enzyme ADNase và làm biến tính
các phân tử protein, dịch hữu cơ,...
• Bước 3: tách DNA khỏi các tạp chất khác bằng máy ly tâm.
• Bước 4: kết tủa, rửa và hòa tan DNA (rửa bằng dung dịch cồn, hòa tan trong TE hoặc
nước cất).

Nguyên liệu tách chiết DNA:
những tế bào có nhân ( tế bào ở
dạng tươi sống hoặc đã chết...)
 Phá vỡ màng tế bào bằng biện
pháp cơ học hoặc hóa học.
 DNA tách ra thường bị gãy có
chiều dài khoảng 20Kb đến
200Kb.
 Do DNA gãy nhiều chỗ nên vẫn
còn đại diện đầy đủ gen của bộ
gen. Tuy thế nếu DNA bị gãy
nhiều quá, quá ngắn có thể, hạn


Phần 2: Các bước tiến hành
1. Dụng cụ và hóa chất

EPPENDORF

MICROPIPET


Máy ủ nhiệt

Tủ hút khí độc


Tủ cấy vô

trùng

Nồi hấp tiệt
trùng

Tủ lạnh gồm: tủ
mát và tủ âm
sâu (-20℃ và
-70℃)


Máy đo
pH

Máy Vortex
Máy li tâm


Nguyên tắc:
- Các phân tử khác nhau sẽ lắng với vận tốc
khác nhau khi chịu lực tác động của lực ly
tâm.
- Tùy thuộc vào khối lượng và tỉ trọng của
các phân tử vật chất mà người ta chia hai
loại li tâm:
 Ly tâm phân đoạn: dùng phân tách các
phần tử vật chất khác nhau dựa vào khối
lượng của chúng.

Các hóa chất thường
dùng:
1.EDTA:

khi màng
bị phá vỡ, một loạt các
chất được giải phóng
ra dung dịch, trong số
chúng có các loại
enzym thủy phân acid
nucleic thành những
mảnh vụn, bởi vậy
dùng EDTA để ức chế
hoạt động đó.


2.TRIS: để điều
chỉnh độ pH

3. CTAB: là hóa chất

dùng trong chiết suất
acid nucleic có hiệu
quả cao và được sử
dụng phổ biến.


Ethanol và Isopropanol
+ Ethanol: thường được dùng trong môi trường dung dịch có lực ion , hay
nồng độ muối cao, trong điều kiện như vậy acid nuleid dễ dàng bị kết tủa , sự

kết tủa của acid nucleid sẽ đạt hiệu quả cao hơn nếu được xử lí trong môi
trường lạnh.
+ Isopropanol: được dùng để kết tủa acid nucleid trong môi trường không
cần có muối , tỉ lệ lượng isopropanol mãu theo thể tích là 1:1.

Nước cất và TE:Acid nucleic:

+ có thể hòa tan trong nước cất khử trung hoặc dung dịch TE . Acid Nucleic
sẽ được bảo quản tốt hơn , nếu nó được hòa tan trong dung dịch TE,vì dung
dịch này chứa Tris và EDTA.


2/ Các phương pháp tách chiết
2.1/ Quy trình tách chiết DNA bằng máu
ngoại vi


- Lấy máu tĩnh mạch cho vào ống đã có sẵn EDTA 0,4M, trộn đều để máu
không đông. Mẫu máu được bảo quản ở 4℃ cho tới lúc tiến hành kỹ thuật.
-Cho 5ml dúng dịch đệm phá hồng cầu vào ống máu trộn nhiều lần, ly
tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút. Bỏ dịch nỗi, giữ lại cặn tủa tế bào
màu trắng. Mục đích chủ yếu là để phá hủy hồng cầu, tách riêng bạch
cầu. Có thể làm nhiều lần cho đến khi cặn tế bào có màu trắng sạch.
-Làm tan cặn tủa bằng cách dùng máy lắc.
-Cho tiếp vào ống chứa cặn tủa tế bào 900 µl đệm phá bạch cầu, phá vỡ
tế bào bằng máy lắc trong 5 phút. Sản phẩm có thể dùng tách chiết tiếp
DNA hoặc bảo quản ở 4℃ trong vài tuần.
-Cho thêm vào ống 0,1mg proteinase K lắc đề bằng máy lắc trong 5 phút.
- Ủ 50 µl trong 2 giờ, 15 phút lắc một lần.
- Cho thêm 300 µl NaCl bão hòa 6M, lắc đều bằng máy lắc trong 5-10

phút.


- Ly tâm 2500 vòng /phút trong 10 phút.
- Loại bỏ cặn tủa protein, chuyển dịch nổi chứa DNA qua ống
khác.
- Cho nhẹ nhàng ethanol tuyệt đối vào ống có dịch nổi chứa
DNA, thể tích
ethanol gấp 2 lần thể tích dịch nổi.
- Nghiên ống nhẹ nhàng cho đến khi xuất hiện tủa DNA.
- Chuyển tủa sang ống Eppendorf đã có sẵn 200 µl TE, lắc
nhẹ.
- Để sản phẩm ở 37℃ trong 2-3 giờ cho đến khi tủa DNA tan
hoàn toàn.
- Kiểm tra chất lượng DNA bằng cách chạy điện di.
- Bảo quản DNA ở nhiệt độ 4℃, -20℃ hoặc -80℃ tùy thời
gian cần giữ DNA ngắn hay dài.


2.2/ Quy trình tách chiết truyền thống

Nguyên lý
tách chiết
DNA


Bước 1: Phá màng tế bào, màng nhân.
Nghiền tế bào, mô trong dung dịch chất tẩy (SDS) và proteinase để
phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường
đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.

- Chất tẩy là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các
phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng.
- Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion
hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn.


Bước 2: Loại protein
Sau khi phá vỡ tế bào, DNA sẽ được trộn lẫn với các thành phần khác của
tế bào chủ yếu là protein trong dung dịch. Việc quan trọng lúc này là tách
DNA ra khỏi thành phần protein của tế bào. Để thực hiện bước này người
ta chủ yếu sử dụng hỗn hợp Phenol/ Chloroform. Phenol-Cloroform không
tan trong nước nhưng có khả năng làm biến tính protein. Do đó, protein
sẽ bị tủa khi gặp Phenol. Trong khi đó DNA thì không bị tủa bởi phenol
nên vẫn tan trong nước. Khi ly tâm phenol/chloroform nặng sẽ lắng xuống
dưới, protein tủa sẽ nằm tại ranh giới của nước và phenol, còn DNA thì
nằm lại trong pha nước ở phía trên. Thu pha nước chứa DNA này để thực
hiện các bước tiếp theo.