Bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone có trong hạt đậu nành bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA HÓA
----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH SÁU HỢP CHẤT ISOFLAVONE
CÓ TRONG HẠT ĐẬU NÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC
KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - HPLC

Sinh viên thực hiện
Lớp
Chuyên ngành
Khóa
GVHD

:
:
:
:
:

Võ Văn Hùng
14CHP
Hóa phân tích – Môi trường
2014 - 2018
TS. Bùi Xuân Vững

Đà Nẵng, 04/2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA HÓA
----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH SÁU HỢP CHẤT ISOFLAVONE
CÓ TRONG HẠT ĐẬU NÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC
KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - HPLC

Sinh viên thực hiện
Lớp
Chuyên ngành
Khóa
GVHD

:
:
:
:
:

Võ Văn Hùng
14CHP
Hóa phân tích – Môi trường
2014 - 2018
TS. Bùi Xuân Vững

Đà Nẵng, 04/2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên : Võ Văn Hùng
Lớp:

: 14CHP

1. Tên đề tài
Bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone có trong hạt đậu nành bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC
2. Mục đích đề tài
 Khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định sáu hợp chất isoflavone từ dịch
chiết bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao -HPLC.
 Khảo sát các quy trình xử lý mẫu để xác định isoflavone bằng phương
pháp HPLC.
 Xác định sáu hợp chất isoflavone trong hạt đậu nành bằng phương pháp
HPLC.
3. Thời gian thực hiện
 Ngày nhận đề tài: 01 tháng 01 năm 2018.
 Ngày bảo vệ: 27 tháng 04 năm 2018.
4. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Bùi Xuân Vững
5. Phạm vi thực hiện

Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng, địa chỉ:
459 Tôn Đức Thắng, phường Hòa Khánh Nam, quận Liên Chiểu, Tp. Đà Nẵng.
Chủ nhiệm khoa

Giáo viên hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ tên)

(Ký và ghi rõ họ tên)


- Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho khoa ngày….tháng….năm 2018
- Kết quả điểm đánh giá .......
Đà Nẵng, ngày …. tháng…… năm 2018
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(Ký và ghi rõ họ tên)


MỤC LỤC
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ . 1
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐẬU NÀNH ................................................................... 1
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm ........................................................................................... 1
a) Nguồn gốc .................................................................................................................... 1
b) Đặc điểm ....................................................................................................................... 1
1.1.2. Thành phần hóa học trong đậu nành........................................................................ 2
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ISOFLAVONE ............................................................... 3
1.2.1. Nguồn gốc Isoflavone.............................................................................................. 3
1.2.2. Thành phần hóa học, tính chất, cấu trúc của isoflavone.......................................... 4
1.2.3. Tác dụng của isoflavone trong phòng và điều trị bệnh ........................................... 7
a) Tác dụng trên chuyển hóa của xương............................................................................ 7

b) Tác dụng trên tim mạch ................................................................................................ 7
c) Nâng cao chất lượng cuộc sống của phụ nữ .................................................................. 8
d) Tác dụng phụ có thể gặp với isoflavone đậu nành ........................................................ 8
e) Ứng dụng của isoflavone ............................................................................................... 8
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ..................................... 9
1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nước ..................................................................................... 9
a) Tại Hàn Quốc ..............................................................................................................10
b) Tại Australia ................................................................................................................11
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước....................................................................................11
1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC .........................12
1.4.1. Khái niệm ..............................................................................................................12
1.4.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc ký .....................................................................12
1.4.3. Phân loại sắc ký hấp phụ .......................................................................................13
1.4.4. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ ..................................................................14
a) Thời gian lưu thực t’R ..................................................................................................15
b) Hệ số dung lượng K’ ...................................................................................................15
c) Độ chọn lọc α ..............................................................................................................15
d) Số đĩa lý thuyết ............................................................................................................15
e) Độ phân giải ................................................................................................................16
f) Hệ số không đối xứng ..................................................................................................17
1.4.5. Hệ thống HPLC .....................................................................................................17


a) Bình đựng dung môi ....................................................................................................18
b) Bộ phận khử khí .........................................................................................................19
c) Bơm cao áp ..................................................................................................................19
d) Bộ phận tiêm mẫu .......................................................................................................19
e) Cột sắc ký ....................................................................................................................19
f) Đầu dò ..........................................................................................................................20
g) Bộ phận ghi tín hiệu ....................................................................................................21

h) Thiết bị in dữ liệu ........................................................................................................21
1.4.6. Phương pháp chọn điều kiện sắc ký ......................................................................21
a) Lựa chọn pha tĩnh ........................................................................................................21
b) Lựa chọn pha động ......................................................................................................22
1.4.7. Các bước tiến hành sắc ký .....................................................................................23
a) Chuẩn bị dụng cụ và máy móc ....................................................................................23
b) Chuẩn bị dung môi pha động ......................................................................................24
c) Chuẩn bị mẫu đo HPLC ..............................................................................................24
d) Cách vận hành thiết bị .................................................................................................24
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 26
2.1. Nguyên liệu hạt đậu nành .........................................................................................26
2.2. Hóa chất và dụng cụ, thiết bị ...................................................................................26
2.2.1. Hóa chất .................................................................................................................26
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................................26
2.3. Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích ...................................................................................28
2.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................28
2.4.1. Khảo sát phương pháp trích ly isoflavone ............................................................28
a) Quy trình công nghệ chiết isoflavone trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp
chiết lắc thông thường .....................................................................................................29
b) Phương pháp trích ly isoflavone bằng phương pháp lắc có hỗ trợ siêu âm ...............30
2.4.2. Phương pháp định tính, định lượng isoflavone bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu
năng cao - HPLC .............................................................................................................31
a) Khảo sát các điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC để phân tích isoflavone ...............31
b) Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động ............................................................................32
c) Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính ...........................................................................33
d) Phân tích định tính isoflavone .....................................................................................33


e) Phân tích định lượng isoflavone ..................................................................................33
2.4.3. Khảo sát độ lặp lại của phép đo .............................................................................34

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................... 36
3.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động ..............................................................36
3.2 Kết quả khảo sát các mẫu hạt đậu nành có isoflavone theo thành phần pha động
của hệ 1. ...........................................................................................................................37
3.3 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính. ...........................................................40
3.3.1. Kết quả đo dãy dung dịch chuẩn STD1- STD5 .....................................................40
3.3.2. Xây dựng đường chuẩn .........................................................................................41
3.4. Khảo sát độ lặp lại của phép đo ................................................................................44
3.5. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) ...........................................46
3.6 Kết quả định tính isoflavone trong mẫu dịch bã .......................................................47
3.7 Kết quả đo mẫu thực..................................................................................................49
3.7.1. Kết quả đo dịch hạt chiết bằng cồn 800 .................................................................49
3.7.2. Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp siêu âm ...............50
3.7.3. Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc .......................50
3.7.4. Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc kết hợp siêu
âm ....................................................................................................................................51
3.8. Tính toán hàm lượng isoflavone có trong mẫu hạt đậu nành bằng phương pháp
đường chuẩn ....................................................................................................................52
3.8.1. Mẫu dịch hạt chiết bằng cồn 800 ...........................................................................52
3.8.2. Mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp siêu âm..................................53
3.8.3. Mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc .........................................54
3.8.4. Mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc kết hợp siêu âm ...............55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................................. 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................59


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

HPLC

High-performance liquid chromatography (Sắc ký
lỏng hiệu năng cao)

DMSO

Dimethyl sulfoxit có công thức (CH3)2SO.

PTFE

Polytetrafloetylen (nhựa teflon)
Association of Official Analytical Chemists có

AOAC

CHD

nghĩa là Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống.
Coronary heart disease (bệnh động mạch vành )

MeCN

Acetonitrile có công thức hóa học CH3CN.

EtOH

Etanol, ancol etylic

MeOH

Metanol, ancol metylic

ACN

Acetonitrile có công thức hóa học CH3CN.

STD

Standard có nghĩa là dung dịch chuẩn

SD

Standard deviation (độ lệch chuẩn)
Relative standard deviation (độ lệch chuẩn tương

RSD

đối)

LOD

Giới hạn phát hiện (limit of detector)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. 1. Cây đậu nành (nguồn: tác giả) ........................................................................ 1
Hình 1. 2. Hình ảnh hạt đậu nành (nguồn: tác giả) ......................................................... 2

Hình 1. 3. Hình ảnh giống đậu nành Đ2101 (nguồn: tác giả) ......................................... 2
Hình 1. 4. Cấu trúc hóa học của isoflavones .................................................................. 4
Hình 1. 5. Cấu trúc hóa học của các aglucon .................................................................. 4
Hình 1. 6 Cấu trúc hóa học của các - Glucozit ............................................................. 5
Hình 1. 7 No- GMO Soy isoflavone ................................................................................ 8
Hình 1. 8. Calcium 600+ vitamin D3 with soy isoflavone .............................................. 9
Hình 1. 9. Active- Meno .................................................................................................. 9
Hình 1. 10. Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải ...................................... 13
Hình 1. 11. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B. ............................... 13
Hình 1. 12. Sắc ký đồ của chất A và chất B. ................................................................. 14
Hình 1. 13. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách peak của hai chất A và B . 15
Hình 1. 14. Cách tính hệ số không đối xứng của peak. ................................................. 17
Hình 1. 15. Các thiết bị trong hệ thống HPLC .............................................................. 18

Hình 2. 1. Hạt và bột đậu nành khô ............................................................................... 26
Hình 2. 2 . Thiết bị khuấy và thiết bị li tâm. ................................................................. 27
Hình 2. 3. Thiết bị lọc chân không và thiết bị cô quay chân không .............................. 27
Hình 2. 4. Máy lắc và thiết bị sấy .................................................................................. 27
Hình 2. 5. Tủ lạnh và thiết bị cất nước .......................................................................... 27
Hình 2. 6. Thiết bị HPLC. ............................................................................................. 28
Hình 2. 7. Sơ đồ quy trình chiết lắc isoflavone dạng cao chiết từ hạt đậu nành ........... 29
Hình 2. 8. Quy trình chiết isoflavone bằng phương pháp lắc có hỗ trợ siêu âm trong
phòng thí nghiệm. .......................................................................................................... 30


Hình 3. 1. Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 1 .................................................. 36
Hình 3. 2. Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 2 .................................................. 36
Hình 3. 3. Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 3 .................................................. 37
Hình 3. 4. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi của thành phần pha động theo hệ 1. ................ 37
Hình 3. 5. Sắc ký đồ mẫu cao hạt đậu nành .................................................................. 38

Hình 3. 6. Sắc ký đồ mẫu dịch hạt đậu nành chiết bằng cồn 80% ................................ 38
Hình 3. 7. Sắc ký đồ mẫu hạt khô.................................................................................. 39
Hình 3. 8. Sắc ký đồ mẫu cao bã đậu nành.................................................................... 39
Hình 3. 9. Sắc ký đồ mẫu dịch bã đậu nành .................................................................. 40
Hình 3. 10. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Daidzin. ......... 42
Hình 3. 11. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Glycitin. ......... 42
Hình 3. 12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ genistin. ......... 43
Hình 3. 13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Daidzein ......... 43
Hình 3. 14. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Glycitein. ....... 43
Hình 3. 15. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Genistein. ....... 44
Hình 3. 16. Sắc ký đồ isoflavone trong mẫu dung dịch chuẩn ...................................... 48
Hình 3.17. Sắc ký đồ isoflavone trong mẫu dịch chiết bằng cồn 800 ............................ 48
Hình 3. 18. Sắc ký đồ mẫu dịch hạt chiết bằng etanol 800 ............................................ 49
Hình 3. 19. Sắc ký đồ mẫu hạt khô chiết theo AOAC với quy trình xử lý mẫu bằng
phương pháp siêu âm ..................................................................................................... 50
Hình 3. 20. Sắc ký đồ mẫu hạt khô chiết theo AOAC với quy trình xử lý mẫu bằng
phương pháp lắc ............................................................................................................ 51
Hình 3. 21. Sắc ký đồ mẫu hạt khô chiết theo AOAC với quy trình xử lý mẫu bằng
phương pháp lắc kết hợp siêu âm .................................................................................. 52


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. 1. Thành phần hóa học của đậu nành ................................................................. 3
Bảng 1. 2. Danh sách của các isoflavones . ..................................................................... 5
Bảng 1. 3 Lực rửa giải của một số dung môi ................................................................ 23

Bảng 2. 1.Nồng độ các chất chuẩn làm việc (µg/ml). ................................................... 33

Bảng 3. 1. Kết quả đo chuẩn STD1 ............................................................................... 40
Bảng 3. 2. Kết quả đo chuẩn STD2 ............................................................................... 40

Bảng 3. 3. Kết quả đo chuẩn STD3 ............................................................................... 41
Bảng 3. 4. Kết quả đo chuẩn STD4 ............................................................................... 41
Bảng 3. 5. Kết quả đo chuẩn STD5 ............................................................................... 41
Bảng 3. 6. Tóm tắt kết quả đường chuẩn của 6 hợp chất isoflavone ............................ 44
Bảng 3. 7. Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với Daidzin. .......................................... 45
Bảng 3. 8. Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với Glycitin ........................................... 45
Bảng 3. 9. Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với Genistin. ......................................... 45
Bảng 3. 10. Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với Daidzein ....................................... 45
Bảng 3. 11. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Glycitein. .................................... 46
Bảng 3. 12. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu Genistein. .................................... 46
Bảng 3. 13. Kết quả LOD và LOQ ............................................................................... 47
Bảng 3. 14. Kết quả đo dịch hạt chiết bằng cồn 800..................................................... 49
Bảng 3. 15. Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp siêu âm .... 50
Bảng 3. 16. Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc............ 51
Bảng 3. 17. Kết quả đo mẫu hạt khô chiết theo AOAC bằng phương pháp lắc kết hợp
với siêu âm ..................................................................................................................... 52


Bảng 3. 18 . Kết quả hàm lượng isoflavone có trong mẫu dịch hạt chiết bằng etanol 800
....................................................................................................................................... 53
Bảng 3. 19. Kết quả hàm lượng isoflavone có trong 1g mẫu hạt khô chiết theo AOAC
bằng phương pháp siêu âm ............................................................................................ 54
Bảng 3. 20. Kết quả hàm lượng isoflavone có trong 1g mẫu hạt khô chiết theo AOAC
bằng phương pháp lắc .................................................................................................... 55
Bảng 3. 21. Kết quả hàm lượng isoflavone có trong 1g mẫu hạt khô chiết theo AOAC
bằng phương pháp lắc kết hợp siêu âm ........................................................................ 56


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy TS. Bùi

Xuân Vững, đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình viết báo cáo tốt nghiệp.
Em chân thành cảm ơn quý thầy, cô trong khoa Hóa học, Trường Đại Học Sư
Phạm- Đại học Đà Nẵng đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm em học tập.
Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá
trình nghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời một cách
vững chắc và tự tin.
Cuối cùng, cho em gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong hội đồng bảo vệ tốt
nghiệp đã dành thời gian quý báu của mình để đọc và nhận xét khóa luận của
em.Trong quá trình làm bài báo cáo khó tránh khỏi sai sót, rất mong nhận được ý kiến
đóng góp của thầy, cô để bài báo cáo của em được hoàn thiện hơn.
Đà Nẵng, ngày 20 tháng 04 năm 2018
Sinh viên thực hiện


LỜI MỞ ĐẦU
Isoflavone là hợp chất polyphenolic, có nguồn gốc từ phytoestrogen thực vật.
Isoflavone là hoạt chất có cơ chế hoạt động và chức năng gần giống như nội tiết tố
nữ estrogen ở người, vì thế các nhà khoa học gọi là estrogen thảo mộc (plant
estrogen).
Isoflavone rất nhiều chức năng có lợi cho cơ thể con người, duy trì tuổi thanh
xuân cho phụ nữ, giảm được ung thư vú, ung thư cổ tử cung, giảm được hàm lượng
cholesterol, phòng tránh được các bệnh về tim mạch, loãng xương, giảm được các
triệu chứng mãn kinh như bốc hỏa, đổ mồ hôi, trầm cảm...Cho nên isoflavone được
bổ sung vào trong các thực phẩm chức năng để cải thiện sức khỏe của con người.
Nguồn nguyên liệu để sản xuất isoflavone rất phong phú như hạt ngũ cốc, rau
quả, nhưng đậu nành là nguồn nguyên liệu chủ yếu bởi vì hàm lượng isoflavone
trong đậu nành khá cao đặc biệt trong đậu nành nảy mầm. Cùng với hàng ngàn
dược liệu quý có ở Việt Nam, đậu nành là một trong những dược liệu quý, đậu
nành đã được biết đến là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao vì chứa hàm lượng
protein cao hơn bất kỳ loại nông sản nào. Trong đậu nành còn chứa rất nhiều

khoáng chất, các sinh tố B đặc biệt là các hóa chất thảo mộc có khả năng ngăn ngừa
trị liệu bệnh tật.
Điều này làm các nhà khoa học say mê nghiên cứu là khám phá ra các hóa thảo
mộc có trong đậu nành và những ứng dụng của chúng trong lĩnh vực y khoa trị liệu,
trong đó các isoflavones là loại hóa chất thảo mộc mang lại nhiều ứng dụng. Đồng
thời, với mong muốn đóng góp một phần vào kho tư liệu của nhà nước, chính vì
vậy mà em tiến hành thực hiện đề tài: “Bước đầu xác định sáu hợp chất
isoflavone có trong hạt đậu nành bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC”


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐẬU NÀNH [3]
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm










a) Nguồn gốc
Giới : Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Fabales
Họ: Fabaceae
Phân họ: Faboideae

Chi: Glycine
Loại: G.max

Hình 1. 1. Cây đậu nành (nguồn: tác giả)

Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành (tên khoa học Glycine max (L) Merrill) là
loại cây họ Đậu (Fabaceae) giàu hàm lượng protein, trên thế giới có 1000 loại đậu
tương với nhiều đặc điểm khác nhau, hạt đậu nành có giá trị dinh dưỡng và kinh tế
rất cao. Quả đậu dài có nhiều lông vàng, mỗi quả có từ 1-4 hạt, thông thường có 2-3
hạt. Hạt hình cầu hay hình bầu dục, có màu sắc thay đổi tùy theo giống cây trồng
(màu vàng, đen, nâu, xanh). Trọng lượng một hạt đậu tương thay đổi từ 20400mg/hạt.
b) Đặc điểm
 Hình dạng: hạt đậu nành có nhiều hình dạng khác nhau từ tròn tới thon và dẹt.
 Màu sắc: vàng xanh, xám, nâu hoặc đen và các màu trung gian. Phần lớn màu
vàng, loại đậu nành màu vàng là loại tốt nên thường được ưa chuộng.
 Kích thước: có 3 loại, to là loại 1000 hạt nặng 300g trở lên, trung bình là loại
1000 hạt nặng 100 - 300g, nhỏ là loại 1000 hạt nặng dưới 150g.
 Cấu trúc hạt đậu nành gồm 3 thành phần:
+ Vỏ (chiếm 8%) là lớp ngoài cùng có chức năng bảo vệ phôi khỏi nấm
và chống nhiễm vi khuẩn trong quá trình tồn trữ, có nhiều màu khác nhau nhưng đặc
trưng cho từng loại giống thường có màu vàng hay màu trắng. Màu sắc của hạt thay
đổi tùy theo giống và là đặc điểm để phân biệt giống, vỏ hạt chứa sắc tố anthocyanin
tùy theo hàm lượng sắc tố này mà hạt có 4 màu khác nhau: vàng, nâu, xanh, đen.

1


+ Phôi ( chiếm 2%) là phần sinh trưởng của hạt khi lên mầm, chứa hai lá mầm
và có chức năng dự trữ dinh dưỡng. Ngoài ra, phôi có 3 bộ phận khác: rễ mầm, trụ
dưới lá mầm và trụ trên lá mầm.

+ Nhân (hay tử diệp chiếm 90%) gồm 2 lá mầm tích trữ lượng liệu của hạt,
chiếm phần lớn khối lượng hạt, chứa lượng đạm và dầu cao nhất trong toàn hạt.

Hình 1. 2. Hình ảnh hạt đậu nành (nguồn: tác giả)
 Giống đậu nành Đ2101- tại địa bàn Quảng Nam, huyện Đại Lộc:
+ Thời gian gieo trồng trung bình (90-100 ngày), có khả năng sinh trưởng phát triển
tốt, cứng, chống chịu sâu, bệnh tốt, thích hợp với gieo trồng cho vụ Xuân (gieo từ
tháng 11 âm lịch đến tháng 2) và vụ Đông.
+ Có số quả/ cây nhiều từ 38-42 quả và có khối lượng hạt lớn (170-185 gam), hạt
màu vàng đẹp, có chất lượng hạt khá (protein 41,0% và lipit 19,9%).

Hình 1. 3. Hình ảnh giống đậu nành Đ2101 (nguồn: tác giả)
1.1.2. Thành phần hóa học trong đậu nành

2


 8% nước

 35-45% chất đạm với đủ các loại
amino acid cần thiết (isoleucin,

 5% chất vô cơ

lysin, methionin, pheny lalanin,

 15-25% glucose

tryptophan, valin)

 15-20% chất béo

 Các vitamin A, B1, B2, D, E, F,
các enzyme, sáp nhựa, cellulose.

 Nhiều sinh tố, khoáng chất, Ca,
Fe, Mg, P, K, Na, S

Hạt đậu nành là thành phần có giá trị sử dụng cao nhất vì nó không những
chứa đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết mà còn tồn tại các hóa thảo mộc có tác dụng
phòng ngừa và điều trị bệnh đặc biệt là các căn bệnh thời đại như: bệnh ung thư, các
bệnh liên quan đến tim mạch.
Thành phần và cấu trúc của từng thành phần trong hạt đậu tương phụ thuộc
vào nhiều yếu tố, bao gồm giống, mùa vụ, vùng địa lí, và môi trường. Thành phần
tổng quát của đậu nành được trình bày trong bảng dưới đây.
Bảng 1. 1. Thành phần hóa học của đậu nành
Thành phần

Tỷ lệ khối

Tỷ lệ phần trăm (%)

lượng
Protein

Lipit

Cacbonhydate

Tro

Lá mầm

90

43

23

43

5

Vỏ

8

9

1

86

4.3

Trụ dưới lá mầm

2

41

11

43

4.4

Nguyên hạt

100

40

20

35

4.9

1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ISOFLAVONE
1.2.1. Nguồn gốc Isoflavone
Isoflavone có nguồn gốc phytoestrogen thực vật thuộc nhóm các hợp chất
flavonoid. Chúng là các hợp chất phenolic, có cấu trúc và sự vận hành giống như
estrogen ở người, vì thế còn được gọi là estrogen thảo mộc. Trong tự nhiên, các
isoflavone được thấy có nhiều trong các loại thực vật như: các loại đậu khác nhau,
3


cỏ ba lá đỏ, cỏ linh lăng, củ sắn dây... trong đó hàm lượng cao nhất là ở đậu nành
và các thực phẩm có chứa đậu nành [10].

Ở cây đậu nành, isoflavone có trong toàn bộ các phần: hạt, lá, cuống, mầm và
rễ. Trong hạt đậu nành thì phôi có hàm lượng isoflavone cao nhất.
1.2.2. Thành phần hóa học, tính chất, cấu trúc của isoflavone
Isoflavone là các chất hữu cơ thuộc nhóm polyphenolic (các chất có nhiều vòng
phenyl) có liên quan với các flavonoid (isoflavone và flavonoid khác nhau ở vị trí
gắn của vòng benzen) và nó có nhiều lợi ích cho sức khỏe [10], [3].
Cấu trúc cơ bản của isoflavone gồm 2 vòng benzen: A và B nối với dị vòng
pyron C.
B
A

C

Hình 1. 4. Cấu trúc hóa học của isoflavones [1]
Isoflavone trong hạt đậu nành tồn tại ở dạng tự do (aglucon) và dạng liên kết
(glucosid), bao gồm: daidzin, genistin, glycitin, các malonyl và axetyl tương ứng
của chúng, trong một số trường hợp chúng có mặt ở cả 4 dạng hóa học với mỗi
dạng có chứa ba đồng phân và tạo nên 12 loại cụ thể:
1. Aglycones (daidzein, genistein và glycitein)

Hình 1. 5. Cấu trúc hóa học của các aglucon
2. -glycosides (daidzin, genistin và glycitin)

4


Hình 1. 6 Cấu trúc hóa học của các - Glucozit
3. Các malonyl-glucosides (malonyl-daizin, malonyk-genistin và malonylglycitin)
4. Acetyl-glucosides (acetyl-daidzin, acetyl-genistin, và acetyl-glycitin)
Cấu trúc hóa học của các isoflavone của 4 nhóm trên được cho ở bảng 1.2 bởi

tác giả Mortensen cùng các cộng sự.
Bảng 1. 2. Danh sách của các isoflavones [1],[3].
Tên

R1

R2

R3

Daidzein

H

H

H

Glycitein

H

OCH3

H

Genistein

OH

H

H

Daidzin

H

H

Glucosyl

Glycitin

H

OCH3

Glucosyl

Genistin

OH

H

Glucosyl

H

H

H

OCH3

Acetyl hoặc
Manolyl daidzin
Acetyl hoặc

5

Glucosyl-COCH3 hoặc
Glucosyl-COCH2COOH
Glucosyl-COCH3 hoặc


Manolyl glycitin
Acetyl hoặc
Manolyl genistin

Glucosyl-COCH2COOH
OH

H

Glucosyl-COCH3 hoặc
Glucosyl-COCH2COOH

Có hai loại isoflavone quan trọng trong đậu nành là daidzein và genistein, hợp

chất này có cấu trúc hóa học gần giống kích thích tố nữ estrogen. Còn được gọi là
estrogen thực vật (phytoestrogen). Estrogen thực vật có tác dụng tương tự như
estrogen tự nhiên nhưng yếu hơn.
Genistin và daidzin là những phân tử tương đối lớn, tan tốt trong nước, tính
phân cực cao, nên khó hấp thu qua ống tiêu hóa. Muốn cho dễ hấp thu và trở nên có
giá trị sinh học, phải thủy phân chúng thành các aglycon, tức làm mất thành phần
glycozit trong phân tử. Muốn vậy, cần có xúc tác các enzym đặc hiệu là
glycosidese. Ống tiêu hóa của người không tạo được glycosidase, nên cơ thể không
thể thủy phân được isoflavone và isoflavone chưa có giá trị sinh học.
Ngược lại, một số tạp khuẩn định cư trong ruột sẽ tạo glycosidase cần cho quá
trình thủy phân nêu trên, giúp cho sự hấp thụ các isoflavone.Các aglycon sẽ hấp thu
ở ruột non. Nồng độ đỉnh của aglycon trong máu chỉ đạt được 4-6 giờ sau khi uống
chất chiết xuất từ hạt đậu nành, tức là khi các glycozit đã được thủy phân qua xúc
tác enzym của tạp khuẩn tại ruột.
Lactobacillus sporogenes là vi khuẩn chính sản xuất glycosidase giúp cân bằng
tạp khuẩn ruột, xúc tác cho thủy phân daidzin và genistin sang daidzein và
genistein có hoạt tính “phytoestrogen”.
Cùng với tác dụng hiệu quả tổng hợp của các hợp chất trong đậu nành khi dùng
làm thực phẩm, người ta cho rằng isoflavone giúp làm giảm nguy cơ ung thư ngực,
ung thư ruột, các nghiên cứu trên động vật đã chứng minh sử dụng các sản phẩm
đậu tương đã ức chế được ít nhất 5% khả năng ung thư.
Nhiều nghiên cứu cho thấy đậu nành chứa nhiều isoflavone và được coi là thực
phẩm gia tăng nữ tính và bảo vệ phụ nữ giảm chứng bệnh như: tim mạch, rối loạn
tiền mãn kinh, ung thư và loãng xương... nên đậu nành còn được mệnh danh là
“thần dược” của phụ nữ.
6


1.2.3. Tác dụng của isoflavone trong phòng và điều trị bệnh [3], [5]
Nghiên cứu cho thấy những tác dụng có lợi của isoflavone có trong hạt đậu

nành trên các triệu chứng vận mạch ở tuổi mãn kinh: isoflavone trong đậu nành làm
giảm cường độ bốc hóa, giảm số lần làm đổ mồ hôi đem, mang lại lợi ích hiển
nhiên nâng cao chất lượng sống của phụ nữ mãn kinh. Isoflavone đậu nành không
gây thay đổi có ý nghĩa về FSH hoặc về độ dày của màng trong tử cung, không
thấy tăng các tác dụng phụ estrogen không mong muốn.
a) Tác dụng trên chuyển hóa của xương
Nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ gãy xương do loãng xương ở phụ nữ châu Á
thấp hơn hẳn so với ở các nước phương Tây. Sự khác biệt này có liên quan tới sử
dụng nhiều thức ăn chế từ đậu nành. Hiệu lực của isoflavone đậu nành trên quá
trình dinh dưỡng của xương ở phụ nữ sau mãn kinh đã cho thấy tăng có ý nghĩa về
mật độ khoáng ở xương.
Hiệu lực isoflavone đậu nành trên chuyển hóa của xương cũng được khẳng
định trong các nghiên cứu lâm sàng khác.
Isoflavone còn làm giảm nguy cơ loãng xương nhờ ức chế được hoạt tính của
hủy cốt bào, nên có tác dụng hiệp đồng chống tiêu xương nhờ hoạt tính estrogen
của thuốc này.
b)Tác dụng trên tim mạch [5]
Chế độ dinh dưỡng giàu đậu nành sẽ làm giảm nguy cơ bệnh động mạch vành
(CHD). Isoflavone đậu nành có những tác dụng khác nhau chống rối loạn lipit- máu
ở người mãn kinh, có thể cắt nghĩa được sự giảm các nguy cơ tim mạch. Đậu nành
và chiết xuất của đậu nành cũng có những tác dụng khác có lợi cho tim mạch, đã
được sơ kết bởi nhóm các chuyên gia Hội Mãn kinh Bắc Mỹ:
 Làm giảm huyết áp tâm trương
 Làm giảm cholesteron toàn phần, giảm cholesteron “xấu”, giảm triglyserid...
 Chống tiểu cầu
 Ngăn chặn sự tiến triển của các mảng vữa xơ
 Cải thiện tính đàn hồi động mạch

7

 Chống oxy hóa, loại bỏ các gốc tự do, đối kháng với tác hại của sự
lipoperoxy hóa của lecithin và của LDl- cholesterol sản sinh ra các sản phẩm
cuối cùng có hại, vì các sản phẩm có ái lực rất cao với thành động mạch và
gây ra những mảng vữa xơ.
Ngoài ra isofalvone còn có các tác dụng trên các chức năng nhận thức có tác
dụng thuận lợi trong điều trị sự suy giảm nhận thức và sa sút trí tuệ ở phụ nữ cao
tuổi.Vì vậy có thể suy ra là phytoestrogen cũng có thể có các lợi ích tương tự.
c) Nâng cao chất lượng cuộc sống của phụ nữ
Làm giảm cường độ bốc hỏa, mất ngủ, trầm cảm, khô âm đạo trong thời kì mãn
kinh. Giảm số lần đổ mồ hôi đêm, giảm tích mỡ bụng, chống da nhăn, sạm, giảm
khô xơ tóc.
Nâng cao chất lượng của da: chống oxy hóa, làm làn da mịn màng, mềm mại,
linh hoạt. Chống lão hóa: isoflavone đậu nành ngăn ngừa sự suy giảm chức năng
buồng trứng sớm của phụ nữ, do đó trì hoàn sự xuất hiện của mãn kinh, làm chậm
quá trình lão hóa. Ngăn ngừa được ung thư vú ở phụ nữ.
d) Tác dụng phụ có thể gặp với isoflavone đậu nành
Đậu nành và isoflavone của đậu nành dung nạp tốt, loại trừ một vài trường hợp
hiếm gây rối loạn nhẹ đường tiêu hóa. Người dị ứng với rau đậu cũng có thể bị dị
ứng với thức ăn chế biến từ đậu nành (sữa đậu nành, đậu phụ, bột đậu nành,...)
e) Ứng dụng của isoflavone
Isoflavone được bổ sung dùng làm dược phẩm chức năng để chống lão hóa,
chống ung thư, làm đẹp, cân bằng nội tiết tố nữ thời mãn
kinh...
Một số thực phẩm chức năng như:
- Tinh chất mầm đậu nành No- GMO soy isoflavone: được
làm từ đậu nành không biến đổi gen, cung cấp isoflavone
cho phụ nữ tuổi tiền mãn kinh, giảm nguy cơ tim mạch, ung
thư... Mỗi viên No-GMO SOY isoflavone có chứa:
+ Daidzin và daidzein : 12mg

+ Glycitin và glycitein: 7 mg
+ Genistin và genistein : 2,5 mg

Hình 1. 7 No- GMO Soy
isoflavone
8


- Thuốc bổ cho phụ nữ calcium 600+ vitamin D3 with soy isoflavones bổ sung
thêm isoflavone cho phụ nữ. Hai viên có chứa 1200 mg canxi, 40 IU vitamin D và
50 mg isoflavone đậu nành.
- Active- memmo là một thực phẩm chức năng có bổ sung isoflavone. Đây là hợp
chất giống estrogen, giúp cân bằng nội tiết tố nữ,duy trì tuổi thanh xuân...Trong mỗi
viên active-meno có bổ sung 50 mg isoflavone và ngoài ra sản phẩm còn có vitamin
B1, B12, B6.

Hình 1. 8. Calcium 600+ vitamin D3 with soy
Hình 1. 9. Active- Meno

isoflavone

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC
1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc
Hiện nay, trên thế giới việc nghiên cứu chiết isoflavone từ đậu nành rất phổ
biến và đang được quan tâm bởi những tác dụng tuyệt vời mà hợp chất này mang
lại. Nước và ethanol là 2 dung môi được nhiều tác giả sử dụng để chiết xuất
isoflavone vì tính thân thiện với môi trường và không độc hại của chúng. Để chiết
tách được isoflavone ta cần phải lựa chọn được dung môi trích ly: đó là các dung
môi hòa tan được các hợp chất cần trích ly. Isoflavone là các hợp chất phân cực nên
chủ yếu sử dụng dung môi phân cực.

Nhiều tác giả nghiên cứu chiết xuất isoflavone từ đậu nành sử dụng các dung
môi khác nhau như: methanol, ethanol, acetonitrile hoặc với dimethyl sulfoxide
(Barne et al 1994; Lin và Giusti, 2005; Luthuria et al... 2007). Tuy nhiên, ứng dụng
trong công nghiệp thì ethanol và nước vẫn là dung môi ưa thích vì ý nghĩa môi
trường và có lợi sức khỏe cho người tiêu dùng.
Các tài liệu công bố khác cũng thường sử dụng một số dung môi như: MeCN,
EtOH, MeOH, ACE,...Trong đó một số nghiên cứu đã so sánh và cho kết quả:
9


Theo nghiên cứu của Eldrige (1982) sử dụng dung môi MeOH và EtOH;
etylacetate và MeCN với đậu nành tách béo để trích ly isoflavone. Theo đánh giá
này 80% MeOH sẽ cho hiệu quả trích ly isoflavone là cao nhất .
Một nghiên cứu đi tiên phong của Murphy (1981) đã so sánh những dung môi
khác nhau như: MeOH, ACE, MeCN và chloroform –MeOH kết quả đã chỉ ra rằng
với dung môi tinh khiết thì nó sẽ làm tăng hiệu quả trích ly tổng hàm lượng
isoflavone và theo nghiên cứu này thì MeCN cùng với nước hoặc acid thì cho hiệu
quả trích ly cao hơn các dung môi còn lại.
Năm 1990 Viện ung thư quốc gia Mỹ đã xem xét vai trò của đậu nành trong
phòng bệnh ung thư và xác định ở đậu nành có 5 nhóm chất chống ung thư. Trong
đó người ta đặc biệt chú ý đến tác dụng chống ung thư của isoflavone, một nhóm
hóa chất gần như không tồn tại trong các thực phẩm khác ngoài đậu tương. Một
trong các isoflavone của đậu nành được nghiên cứu nhiều nhất trong 7-8 năm qua
là genistein. Hơn 50 công trình nghiên cứu của các trường đại học danh tiếng trên
thế giới đã chỉ ra rằng genistein có khả năng ngăn chặn sự phát triển của khối u.
Bên cạnh ngăn cản sự hình thành các mạch máu mới (một điều kiện tiên quyết để
khối u phát triển), genistein còn ức chế các men (enzim) trong các loại tế bào ung
thư, và do đó nó được coi là chất có khả năng phòng chống nhiều ung thư khác
nhau.
a) Tại Hàn Quốc

Các nhà khoa học đã thực hiện nghiên cứu so sánh thành phần isoflavone trong
phôi, lá mầm, vỏ hạt và hạt đậu nành. Trong quá trình nghiên cứu, các khoa học gia
nhận định, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tối ưu
nhất để phân tách isoflavone từ các mẫu thí nghiệm. Quá trình phân tách được thực
hiện như sau:
Chín mẫu đậu nành sử dụng trong thí nghiệm có cỡ hạt đa dạng từ trung bình
đến lớn, trọng lượng 25-40g/100 hạt. Điều kiện chăm sóc và gieo trồng các mẫu tốt,
thu hoạch vào vụ mùa 2004 tại Hàn Quốc, sau đó cất giữ, bảo quản trong kho và
đem phân tích vào năm 2005. Mẫu được sơ bộ qua máy nghiền để tách riêng các
thành phần: phôi, mầm, vỏ hạt. Các mẫu được để khô, làm sạch, sau đó nghiền
thành bột mịn. Trộn 2 gram bột mẫu với 10ml axetonitrile (ACN) và 2ml HCl
0.1N. Hỗn hợp được để trong 2h ở nhiệt độ phòng trước khi đem lọc qua giấy lọc
10


Whatman. Sau khi lọc kiệt, dịch cô được để lạnh khô ở -40

rồi hòa tan lại trong

10ml metanol 80% là lọc qua tia lọc 0,40 m.
Phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp dựa theo phương pháp đã được thực hiện bởi
Wang và Murphy (1994) và Kim, Jung, Ahn và Chung (2005).Hệ thống sắc ký lỏng
hiệu năng cao được sử dụng để nghiên cứu gồm: máy sắc lỏng cao áp hãng
Shimadzu, sử dụng detector photodiot array phân giải cao ( hãng SPD M 10A) cùng
với lắp cột sắc kí 250mm x 4,6mm I.D x 5

, quá trình dò bằng dectector UV

254nm.
Bộ tổng hợp dung môi linear HPLC gradient, sử dụng pha động gồm dung môi

A ( 0,1% glacial axetic axit trong nước cất) và dung môi B (0,1% glacial axetic axit
trong ACN ).Bơm 20

mẫu vào máy sắc ký lỏng cao áp. Qúa trình tách các peak

tốt nhất khi dung môi B tăng từ 15% đến 35% trong thời gian 60 phút, giữ ở 35%
trong 5 phút, và trở về 15% trong 5 phút với tốc độ dòng 1ml/phút. Tổng thời gian
phân tách một mẫu trong khoảng 85 phút, sau đó chuyển sang mẫu kế tiếp.
Cả dung môi và nước cất sử dụng trong sắc ký lỏng cao áp HPLC phải đạt độ
tinh khiết 99,9% và đã hút chân không.
b) Tại Australia
Một nhóm các nhà khoa học cũng đã sử dụng thiết bị HPLC để phân tích sự
thay đổi thành phần isoflavone trong các sản phẩm chế biến từ đậu nành.
Ngoài phương pháp HPLC để phân tách và xác định thành phần isoflavone
trong đậu nành, bằng việc kết hợp các phương pháp phân tích khác nhau, các nhà
khoa học đã tách và xác định được hầu hết các thành phần hoạt chất chứa trong đậu
nành.
1.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc
So với thế giới thì việc tiến hành nghiên cứu, tận dụng nguồn nguyên liệu từ
công nghiệp thực phẩm vẫn còn hạn chế. Đặc biệt việc nghiên cứu chiết tách
isoflavone từ hạt đậu nành vẫn chưa được quan tâm chú trọng khi mà hằng năm có
rất nhiều địa phương trồng đậu nành.
Việc nghiên cứu chiết tách isoflavone ở trong nước cũng đã có một vài nghiên
cứu nhưng người ta tiến hành khai thác hoạt chất quý này ở các loại thực vật: sắn
dây, cỏ ba lá, cỏ linh lăng...và trong đó có đậu nành là nguồn nguyên liệu giàu
isoflavone nhất. Theo tác giả Đỗ Hoa Viên (2004) đã tiến hành tách chiết
11